DE3888878T2

DE3888878T2 - Leitfähigkeitsdetektor in einer Säule, zur elektrokinetischen Trennung in einer Mikrosäule.

Info

Publication number: DE3888878T2
Application number: DE3888878T
Authority: DE
Inventors: Xiao-Hua Huang; Joseph Pang; Richard N Zare
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1987-06-17
Filing date: 1988-06-17
Publication date: 1994-07-28
Anticipated expiration: 2008-06-18
Also published as: EP0295942B1; JPH01158342A; CA1339779C; DE3888878D1; EP0295942A3; JP2000046798A; ATE104053T1; JPH10185870A; JP3011914B2; EP0295942A2

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Teilchendetektoren. Insbesondere betrifft sie einen Detektor zur Erkennung des elektrokinetischen Durchlaufes winziger Mengen von Teilchen vorbei an einem Referenzpunkt in einer Mikrosäule.

Beschreibung von Hintergrunddokumenten

Es wurden mehrere analytische Verfahrensweisen entwickelt, bei denen eine Flüssigkeitsprobe so durch eine mit enger Bohrung versehene Mikrosäule geführt wird, daß die verschiedenen in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen Teilchen und Inhaltsstoffe nach Größe, Form, Füllmenge, Viskosität, Beweglichkeit, Polarität, Reaktion zwischen Lösungsmittel und gelöstem Stoff oder dergleichen voneinander getrennt und/oder isoliert werden. Zwei dieser Verfahrensweisen, die mit Füllkörpersäulen arbeiten, sind die Isotachophorese und die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie. Ein weiteres Verfahren von zunehmender Bedeutung ist die elektrokinetische Trennung (allgemein auch als "Trennung durch offene Kapillar-Elektrophorese" oder "Trennung durch Kapillarzonenelektrophorese" bezeichnet).
Bei elektrokinetischer Trennung ist es wie bei jedem Trennverfahren notwendig, daß eine Einrichtung vorhanden ist, die den Durchlauf von Teilchen oder Inhaltsstoffen durch die Säule und/oder die Ankunft der Teilchen oder Inhaltsstoffe an einem festgelegten Punkt in der Säule erkennt, nachdem die Trennung erfolgt ist. Bekanntlich beruht eine große Vielzahl von Detektoren darauf, daß sich irgendeine von vielen Änderungen in den Eigenschaften einstellen kann, wenn die Teilchen oder Inhaltsstoffe durch den Erkennungsbereich laufen. Bei diesen Änderungen kann es sich zum Beispiel um eine Änderung in den optischen Eigenschaften (z. B. auf UV-Strahlung, sichtbarem Licht oder Infrarotstrahlung basierende Detektoren sowie mit dem Brechungsindex arbeitende Detektoren), um eine Änderung der elektrischen Eigenschaften (z. B. auf der Leitfähigkeit oder dem Widerstand basierende Detektoren) oder um eine Änderung handeln, die durch eine elektrochemische Reaktion entsteht (z. B. bei amperometrisch, coulometrisch oder potentiometrisch arbeitenden Detektoren).
Die vorliegende Erfindung betrifft einen verbesserten elektrischen Detektor zur Verwendung in elektrokinetischen Trennsystemen mit Mikrosäulen. Elektrische Detektoren können von elektrochemischen Detektoren unterschieden werden. Bei elektrochemischen Detektoren werden elektrische Wirkungen infolge chemischer Veränderungen genutzt, die sich ergeben, wenn ein Teilchen oder ein Inhaltsstoff in den Erkennungsbereich gelangt. Elektrische Detektoren reagieren auf Veränderungen in der Leitfähigkeit des Stromes oder auf Änderungen des Widerstandes, die sich ergeben, wenn Teilchen oder Inhaltsstoffe in den Erkennungsbereich gelangen. Bei elektrischen Detektoren wird nicht unbedingt eine chemische Reaktion ausgelöst oder benötigt.
Bei jedem elektrokinetischen Trennverfahren mit Mikrosäule und bei jeder dieser Verfahrensweisen mit Detektoren ist man bestrebt, die Empfindlichkeit zu erhöhen. Das kann dazu führen, daß kleinere Proben verwendet werden oder in den Proben kleinere Spurenbestandteile erkannt werden können.
Eine Reihe von Fachleuten hat sich mit einer Vielzahl von hochempfindlichen Detektoren für kleine Volumina zum Einsatz an verschiedenen Arten von Säulen befaßt. So haben zum Beispiel Jorgenson et al. (Knecht, L. A., Guthrie, E. J. und Jorgenson, J. W., Anal. Chem., 1984, 56, 479-82; St. Claire, R. L., III, und Jorgenson, J. W., J. Chroma- tor. Sci., 1985, 23, 186-91) einen an der Säule angebrachten elektrochemischen Detektor für eine offene Kapillarsäule mit 15 um Innendurchmesser gebaut. In diesem System war die Arbeitselektrode eine Kohlenstoffaser von 5 um oder 9 um, die mit einem Mikropositionierer in das Ende der Kapillarsäule eingesetzt worden war. Adler et al. (Adler, J. F., Fielden, P. R. und Clark, A. J. Anal. Chem., 1984, 56, 985-988) beschrieben einen kombinierten, auf der Leitfähigkeit und der Dielektrizitätskonstanten beruhenden Detektor. Dieser Detektor lieferte gleichzeitige Messungen dieser beiden Eigenschaften innerhalb einer einzigen Meßzelle. Der Detektor wurde in Ionenchromatographiesystemen eingesetzt. Es wurde eine Erkennungsgrenze von 40 ppb Chlorid angegeben. Bei diesem System wurde ein Paar konischer Elekroden als Meßzelle verwendet. Doury-Berthod et al. (Doury-Berthod, M., Giarnpoli, P., Pitsch, H., Sella, C. und Poitrenaud, C. Anal. Chem., 1985, 57, 2257-2263) legten eine theoretische Beschreibung der Doppelsäulenchromatographie mit Leitfähigkeitserkennung vor. Deren Analyseergebnis scheint die Summe des konduktometrischen Beitrags von gelöstem Stoff und Eluierungsmittel zu sein. Kaniansky et al. (Kaniansky, D., Koval, M. und Stankoviansky, S. J. Chromatoqr., 1983, 267, 67-73) verwendeten Drähte von 0,01 mm aus einer Pt-Ir-Legierung als Elektroden bei der Isotachophorese. Die Kapillarsäulen maßen nicht mehr als 0,1 mm und bestanden aus Fluorpolymeren (PTFE, FEP). Die Drähte wurden erhitzt und durch die Wände der Kapillarsäule geschoben. T. Tsuda hat auch die Verwendung eines handelsüblichen, außerhalb der Kapillarsäule befindlichen Leitfähigkeitsdetektors zur Analyse kleiner, positiv geladener Metallionen beschrieben (Suzuken Memorial Foundation 3, 33 (1984)).
Mehrere Abhandlungen von Mikkers et al. (Mikkers, F.E.P., Everaerts, F. M. und Peek, J. A. F., J. Chromatogr., 1979, 168, 317-332; Mikkers, F. E. P., Everaerts, F. M. und Verheggen, Th. P. E. M., J. Chromatogr. 1979, 169, 1-10; Mikkers, F. E. P., Everaerts, F. M. und Verheggen, Th. P. E. M., J. Chromatogr. 1979, 169, 11-20) erwähnten alle die Leitfähigkeitsdetektoren zur Isotachophorese bei der Kapillarsäulenelektrophorese auf der Basis der Arbeiten von Everaerts und seinen Kollegen (Everaerts, F. M. und Verheggen, Th. P. E. M., J. Chromatogr., 1972, 73, 193-210; Everaerts, F. M. und Verheggen, Th. P. E. M., J. Chromatogr., 1974, 91, 837-851; Everaerts, F.M. und Rommers, P.J., J. Chromatogr., 1974, 91, 809-818; Everaerts, F.M., Geurts, M.' Mikkers, F.E.P. und Verheggen, Th. P. E. M. J. Chromatogr., 1976, 119, 129-155; Kaniansky, D. und Everaerts, F. M. J. Chromatogr., 1978, 148, 441-446; Everaerts, F. M., Beckers, J. L. und Verheggen, Th. P.E.M. "Isotachophoresis: Theory, Instrumentation and Applications" (Isotachophorese: Theorie, Geräteausstattung und Anwendung), 1976, Elsevier, New York, S. 136). Die Vorrichtung von Everaerts bestand aus Kapillarröhrchen aus Glas oder Polytetrafluorethylen (PTFE) mit einem Innendurchmesser von 0,4 bis 0,6 mm und einem Außendurchmesser von 0,7 bis 1 mm. Bei zwei Blöcken von Kapillarröhrchen wurde je eines ihrer Enden in einem Block befestigt, so daß die beiden Blöcke zusammengespannt werden konnten. Vor dem Zusammenspannen wurden zwei Scheiben aus 0,005 mm dickem isolationsmaterial, auf die auf beiden Seiten Platin aufgestäubt worden war und die durch eine Scheibe aus reinem isolationsmaterial voneinander getrennt waren, so gebohrt, daß sie in ihrer Mitte eine Bohrung bildeten, die mit dem Innendurchmesser der Kapillarsäulen übereinstimmte. Diese Scheiben wurden zwischen den beiden Blöcken untergebracht, die dann so zusammengespannt wurden, daß es zu keinem Auslaufen kam.
Bocek et al. (Foret, F., Deml., M., Kahle, V. und Bocek, P., Electrophoresis 1986, 7, 430-432) entwickelten eine Leitfähigkeitsmeßzelle für die Kapillarzonenelektrophorese. Sie verwendeten Kapillarsäulen mit etwa 0,3 mm Innendurchmesser. Platinelektroden wurden in einen Polyesterblock eingegossen, der einen Kanal mit einem kreisförmigen Querschnitt gleich dem Innendurchmesser der Kapillarsäule aufwies. Größere Öffnungen in den Enden des Blocks paßten fest mit Stücken der eingesetzten Kapillarsäulen zusammen. Es ist wichtig festzuhalten, daß sich sowohl in den Zellen von Everaerts als auch in denen von Bocek die Elektroden außerhalb der Kapillarsäule befanden, und daß die Innenfläche des Röhrchens aus Glas oder aus Polytetrafluorethylen nicht kontinuierlich war. Diese Unterbrechungen in der Innenfläche des Röhrchens können in Säulenelektrophorese- oder Isotachophoresesystemen von besonderer Wichtigkeit sein. In diesen Systemen werden beachtliche Spannungen an die Säule gelegt. Jede Vergrößerung der Querschnittsfläche der Säule oder jede Unterbrechung in der Säulenfläche können zu Störungen der Strömung führen. Dadurch kann sich die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit von Ergebnissen vermindern. Dieses Problem wird insbesondere dann akut, wenn man versucht, Säulen mit immer kleinerem Querschnitt und mit immer höheren Durchlaufspannungen zu verwenden. Ein weiteres Problem entsteht, wenn sich der Querschnitt am Detektor infolge von totem oder leerem Volumen erhöht, wodurch sich die Empfindlichkeit des Detektors verringern kann. Aus diesen Gründen haben wir festgestellt, daß es bei diesen Einstellungen am vorteilhaftesten ist, eine Innenfläche vorzusehen, die so kontinuierlich wie möglich ist und keine Unterbrechungen oder keine Querschnittsvergrößerung aufweist.
In DE-B-1598930 (von 1966) wird ein Meßzellensystem mit einer Zelle beschrieben, bei dem eine feste Meßelektrode und eine Referenzelektrode zum Einsatz kommen, das sich besonders für "Mikrochromatographie" eignet. In der Beschreibung wird nicht angedeutet, daß ein solches System, in dem die Elektroden längs der Kapillarsäulenbasis angeordnet sind, für Elektrophoresesysteme geeignet wäre.

FORMULIERUNG DER ERFINDUNG

Nunmehr wurde ein verbesserter Leitfähigkeitsdetektor für elektrokinetische Trennsysteme mit Mikrosäulen entwickelt.
Gemäß der Erfindung wird eine elektrokinetische Trennzone geschaffen, umfassend eine zylindrische Säule mit einem Innendurchmesser von weniger als 500 um und mindestens eine an der Säule angebrachte Leitfähigkeitsmeßelektrode, die bündig mit der Innenwand der Säule abschließt oder sich durch eine Seitenwand der Säule in den Säulenkanal erstreckt und im Innern des Säulenkanals endet, und eine Einrichtung zum Anlegen eines wirksamen elektrokinetischen Potentials entlang des Säulenkanals und durch die Trennzone hindurch.
Mit der Erfindung wird auch ein Verfahren zur elektrokinetischen Trennung und Messung geschaffen, bei dem die zu trennende Probe unter dem Einfluß eines angelegten wirksamen elektrokinetischen Potentials entlang des Säulenkanals einer elektrokinetischen Trennzone geführt wird, die aus einer zylindrischen Säule mit einem Innendurchmesser von weniger als 500 um und mindestens einem Paar von Leitfähigkeitsmeßelektroden besteht, wobei mindestens eine der Elektroden eine an der Säule angebrachte Leitfähigkeitsmeßelektrode ist, die bündig mit der Innenwand der Säule abschließt oder sich durch eine Seitenwand der Säule in den Säulenkanal erstreckt und im Innern des Säulenkanals endet; wobei das elektrokinetische Potential längs des Säulenkanals und durch die Trennzone hindurch angelegt wird; und wobei die Leitfähigkeit zwischen jedem Paar von an der Säule angebrachten Leitfähigkeitsmeßelektroden oder zwischen einem Paar von Leitfähigkeitsmeßelektroden gemessen wird, von denen eine die an der Säule angebrachte Leitfähigkeitsmeßelektrode ist.
Dieser Leitfähigkeitsdetektor ist dadurch gekennzeichnet, daß er an der Säule angebracht ist, das heißt, daß er seine Basis an der Säule selbst hat, wobei die Säule eine größte innere Querschnittsabmessung von 500 um oder weniger, vorzugsweise von 200 um oder weniger und noch mehr bevorzugt von 100 um oder weniger aufweist, und daß er eine oder mehrere Meßelektroden umfaßt, die in geeigneter Weise eine größte Querschnittsabmessung aufweist/aufweisen, die dem 0,01fachen bis 0,75fachen der maximalen Innenabmessung der Säule entspricht, wobei diese Elektroden direkt an der Säule angeordnet sind, indem sie entweder durch die Wand der Säule geführt oder mit und in Kontakt mit dem Austrittsende der Säule befestigt werden und dadurch in Verbindung mit dem Analytenstrom stehen, während sie eine kontinuierliche Wandfläche und keine Vergrößerung der Querschnittsfläche gegenüber dem Flüssigkeitsstrom aufweisen.
Bei einer Ausführungsform besitzt dieser Leitfähigkeitsdetektor eine einzelne an der Säule angebrachte Elektrode, die an oder unmittelbar angrenzend an das Austrittsende der Säule angeordnet ist. Bei dieser Ausführungsform ist die zweite Elektrode mit einem elektrischen Anschluß an das Flüssigkeitsaustrittsvolumen versehen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform weist dieser Leitfähigkeitsdetektor ein Paar oder mehrere Paare von an der Säule angebrachten Leitfähigkeitsmeßelektroden auf, und diese Elektrodenpaare sind direkt parallel zueinander an der Mikrosäule angeordnet, um das Potential zwischen den Elektroden und die damit einhergehenden elektrochemischen Reaktionen zu minimieren.
In weiteren Aspekten werden mit dieser Erfindung verbesserte Trennsysteme geschaffen, in denen diese Detektoren in Kombination mit elektrokinetischen Trennsystemen zum Einsatz kommen.
Die Erfindung gibt weiterhin ein Verfahren an zur Herstellung eines an der Säule angebrachten Leitfähigkeitsdetektors zur elektrokinetischen Trennung, umfassend die folgenden Schritte:
a) Herstellen von einer oder mehrerer Zugangsbohrungen durch eine zylindrische Säule mit einem Innendurchmesser von weniger als 500 um, vorzugsweise von weniger als 200 um und noch mehr bevorzugt von 25 bis 80 um;
b) Einsetzen einer Elektrode in die bzw. in jede hergestellte Bohrung; und
c) die bzw. jede Elektrode wird dauerhaft mit der Säule versiegelt, so daß die bzw. jede Elektrode bündig mit der Wand der Säule abschließt oder sich durch eine Seitenwand der Säule in den Säulenkanal erstreckt und im Innern des Säulenkanals endet. Dies umfaßt ein verbessertes Verfahren zur Herstellung mehrerer Ausführungsformen eines solchen Leitfähigkeitsdetektors durch Laserbohren der Mikrosäule zur Positionierung der Meßelektroden und zur Erzielung der gewünschten Positioniergenauigkeit und Ausrichtung der Elektroden.
Die Leitfähigkeitsdetektoren gemäß dieser Erfindung sind äußerst empfindlich und können dadurch in der Analytlösung leitfähigkeitsverändernde Stoffe bei Konzentrationen von weniger als 10 7 Mol pro Liter erkennen. Sie weisen sehr kleine Meßvolumina auf, was es ihnen in Verbindung mit ihren minimalen Totvolumina und hohen Empfindlichkeiten ermöglicht, eine sehr geringe Anzahl von Ionen oder anderen Inhaltsstoffen zu erkennen.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

In dieser ausführlichen Beschreibung der Erfindung wird auf die beiliegenden Zeichnungen Bezug genommen, in denen gleiche Teile mit gleichen Bezugszeichen versehen sind.
Fig. 1 ist eine Querschnittsdarstellung eines mit Flüssigkeit gefüllten Röhrchens, die das elektroosmotische Pumpverfahren veranschaulicht.
Fig. 2 ist eine Querschnittsdarstellung eines mit Flüssigkeit gefüllten Röhrchens, das das Verfahren zur elektrokinetischen Trennung und den Einsatz eines Detektors gemäß dieser Erfindung in einem solchen Verfahren veranschaulicht.
Fig. 3 ist eine Querschnittsdarstellung eines Leitfähigkeitsmeßdetektors mit zwei Elektroden gemäß der vorliegenden Erfindung.
Fig. 4 ist ein vergrößerter Querschnitt durch den Elektrodenbereich des in Fig. 3 dargestellten Detektors.
Fig. 5 ist ein schematisches Blockschaltbild einer Art einer Vorrichtung zum Einsatz des in den Fig. 3 und 4 dargestellten Detektors mit zwei Elektroden.
Fig. 6 ist ein elektrisches Schaltbild, das eine Form einer Meßschaltung zeigt, die sich zur Messung der von den Detektoren gemäß dieser Erfindung ausgesendeten Signale eignet.
Fig. 7 entspricht Fig. 4 und ist ein weiterer vergrößerter Querschnitt durch den Elektrodenbereich einer alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Detektors, die jedoch nur eine einzige an der Säule angebrachte Elektrode aufweist.
Fig. 8 entspricht Fig. 5 und veranschaulicht die Verwendung des Detektors mit nur einer Elektrode von Fig. 7.
Fig. 9 ist eine Querschnittsdarstellung einer alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Detektors.
Fig. 10 ist eine Querschnittsdarstellung durch eine weitere alternative Ausführungsform des erfindungsgemäßen Detektors.
Die Fig. 11, 12, 13a und 13b sowie 14 sind fünf repräsentative Elektropherogramme, die mittels der vorliegenden Erfindung erzielte und erkannte Trennungen darstellen.

Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

Mit der vorliegenden Erfindung werden an der Säule angebrachte Leitfähigkeitsmeßdetektoren zum Einsatz in elektrokinetischen Trennsystemen mit Mikrosäulen geschaffen. Der Gebrauch der Elektroosmose zum Pumpen von Flüssigkeiten wurde zuerst 1974 von Pretorius et al. beschrieben (J. Chromatogr., 99, 23). Bei diesem Verfahren steht ein Flüssigkeitsstrom in Kontakt mit einer festen Oberfläche unter dem Einfluß eines tangential einwirkenden elektrischen Feldes. Der Flüssigkeitsstrom ist ein elektroosmotischer Strom, der auf die Entstehung einer elektrischen Doppelschicht an der Grenzfläche zwischen Feststoff und Flüssigkeit zurückzuführen ist, wodurch es zur Aufladung der gesamten Flüssigkeit kommt. Dieses Transportverfahren läßt sich mit Bezug auf Fig. 1 sichtbar machen. In Fig. 1 ist eine doppelte offene Mikrosäule oder ein eben solches Röhrchen 10 mit kleiner Bohrung in einem Aufriß-querschnitt dargestellt. Das Röhrchen ist mit einer leitfähigen Flüssigkeit 11 gefüllt, die hierin manchmal als "Trägerelektrolyt" bezeichnet wird. Die Wand des Röhrchens 10 enthält positive Ionen 12. (Je nach dem Material des Röhrchens 10 könnte die Ladung statt dessen auch negativ sein.) Die positiven Ionen 12 ziehen die Anionen 13 aus der leitfähigen Flüssigkeit 11 an und bauen eine elektrische Doppelschicht 13 auf. Diese vorzugsweise Anziehung von Anionen an die Wand führt zu einer positiven Ladung mit Nettoüberschuß im Körper der Flüssigkeit 11. Somit bewegt sich die postiv geladene Flüssigkeit zur Kathode hin, wenn ein elektrisches Potential, wie zum Beispiel das in Fig. 1 dargestellte Potential von 30 kV, zwischen den Elektroden 15 und 15 angelegt wird, die an den Enden der im Röhrchen 10 enthaltenen Säule der Flüssigkeit 11 angeordnet sind.
Das elektrokinetische Trennverfahren beruht auf dem soeben beschriebenen elektroosmotischen Effekt und auf dem Differentialeffekt des elektrischen Feldes auf die Bewegung von gelösten Stoffen oder suspendierten Teilchen im flüssigen Medium in Abhängigkeit von deren positiver, neutraler oder negativer Ladung. Diese miteinander verbundenen Wirkungen lassen sich mit Bezug auf Fig. 2 sichtbar machen. Fig. 2 ist eine Kopie von Fig. 1, jedoch mit verschieden geladenen Inhaltsstoffen 18 und 19 in der Flüssigkeit 11. Der kationische Inhaltsstoff 18 wird elektrophoretisch zur Kathode 16 hin gezogen. Der anionische Inhaltsstoff 19 wird elektrophoretisch von der Kathode 16 abgestoßen. Wie in Figur 2 zu sehen ist, und wie es gewöhnlich der Fall ist, besitzt die Flüssigkeit 11 eine Geschwindigkeit, die höher ist als die elektrophoretischen Geschwindigkeiten der in Lösung befindlichen Inhaltsstoffe, so daß sich alle Inhaltsstoffe, wie zu sehen ist, in der Richtung der elektroosmotischen Strömung bewegen, jedoch mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten. Wenn sich diese Inhaltsstoffe 18 und 19 bzw. auch ungeladene Inhaltsstoffe durch den aus den Elektroden 21 und 22 bestehenden Detektor bewegen, d. h. zwischen diesem hindurch, dann ändern sie die zwischen diesen beiden Elektroden gemessenen Leitfähigkeitseigenschaften, was sich nach der Differenz zwischen dem Hintergrund und der Probe richtet.
Die Elektroden 21 und 22 weisen mehrere Eigenschaften auf, die zu der hohen Empfindlichkeit der vorliegenden Detektoren führen. Eine Eigenschaft besteht darin, daß die beiden Elektroden an der Säule angebracht sind. Das heißt, daß sie ein untrennbarer Bestandteil der Säule sind und keine getrennte Detektoreinheit darstellen. Die zweite Eigenschaft besteht darin, daß die beiden Elektroden zumindest bündig mit den Wänden des Röhrchens 10 abschließen, so daß der durch die Säule strömenden Flüssigkeit 11 eine kontinuierliche Innenfläche geboten wird. Mit "zumindest bündig" ist gemeint, daß die Elektroden entweder bündig abschließen oder sich in den Flüssigkeitsstrom erstrecken. Sie werden nicht aus der Strömung herausgezogen. In Fig. 2 sind die Elektroden mit ihren Enden bündig, flach abgeschnitten und liegen senkrecht zu ihrer Achse. Eine dritte Eigenschaft besteht darin, daß die beiden Elektroden auf der gleichen Ebene senkrecht zur Achse der Mikrosäule angeordnet sind. Dadurch minimiert sich das Potential zwischen den Elektroden auf Grund dessen, daß das elektrokinetische Potential an die Säule angelegt ist, und dadurch minimieren sich die elektrochemischen Reaktionen an den Elektroden. Eine vierte Eigenschaft besteht darin, daß die Mikrosäule einen Innendurchmesser oder eine maximale Querschnittsabmessung von weniger als 500 um, vorzugsweise von weniger als 200 um und noch mehr bevorzugt von etwa 25 bis etwa 80 um aufweist, und daß die Elektroden einen Durchmesser aufweisen, der gleich dem 0,01fachen bis 0,75fachen und insbesondere dem 0,01fachen bis etwa dem 0,60fachen dieses Innendurchmessers oder dieser maximalen Querschnittsabmessung ist. Diese Abmessungen schmälern nicht die den elektrokinetischen Trennungen mittels Mikrosäule innenwohnende hohe Auflösung. Eine fünfte Eigenschaft besteht darin, daß die Elektroden 21 und 22 aus einem leitfähigen Material wie Kohlenstoff oder einem unter den im Elektrolyt anzutreffenden Bedingungen reaktionsträgen Metall bestehen, zum Beispiel aus Platin, Platin und Iridium, Gold, Silber, nichtrostendem Stahl und dergleichen.
In einer alternativen Ausführungsform der Detektoren gemäß dieser Erfindung, die unter Bezugnahme auf die Fig. 7 und 8 beschrieben wird, kann der Detektor eine an der Säule angebrachte Elektrode aufweisen, wobei die zweite Elektrode durch den Flüssigkeitsaustrittsbehälter gebildet wird. Bei dieser Ausführungsform besitzt die einzelne an der Säule angebrachte Elektrode alle die soeben aufgezählten Eigenschaften, natürlich unter der Maßgabe, daß sie sich diametral entgegengesetzt zur anderen Elektrode befindet.
Das Einsetzen der Elektroden in den Detektor durch die Wand der Säule hindurch ist eine Vorgang, der relativ präzise erfolgen muß. Das läßt sich erreichen, indem man die Zugangsbohrungen in der Säule 10 präzise bohrt, zum Beispiel mit einem Laserbohrer oder einem Ionenstrahlbohrer, oder sie durch Elektroerosion, chemisches Ätzen oder dergleichen einbringt und auf eine Größe bringt, die geeignet ist, die Elektroden sowie minimale, jedoch geeignete Mengen an Klebstoff oder Dichtungsmasse aufzunehmen. Es können auch noch weitere Verfahren zum Einbringen der Bohrung angewandt werden, zum Beispiel das HF-Ätzen (bei Säulen aus Glas oder anderen anorganischen Silikaten) oder andere chemische Ätzverfahren bei Säulen aus organischem Material. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Zugangsbohrungen auf eine Größe gebohrt, die im Durchmesser 5 bis 25 um größer ist als der Durchmesser der einzusetzenden Elektrode, wobei die Elektroden in diese Bohrungen eingesiegelt werden. Im allgemeinen werden Epoxidharze, Klebstoffe aus Cyanoacrylat und ähnliche Materialien, die gegenüber den üblicherweise verwendeten, überwiegend wäßrigen Trägerflüssigkeiten reaktionsträge sind und an den Elektroden und an der Wand der Säule fest haftende Verklebungen ergeben, zum Einsiegeln der Elektroden in ihre Position an der Säule verwendet.
Die Meßelektrode gemäß dieser Erfindung ist an einer Mikrosäule 10 an deren anderem Ende angeordnet, d. h. an deren Ende, an dem der abzutrennende Inhaltsstoff zuletzt vorbeiläuft. Diese Mikrosäule 10 sollte eine Länge aufweisen, die so wirksam ist, daß dadurch die gewünschte Trennung eines Inhaltsstoffs unter den angewandten Bedingungen der elektrokinetischen Trennung erreicht wird. Es ist darauf hinzuweisen, daß die Zeit, die eine Probe braucht, um durch die Säule zu laufen, und die Strecke, über die die verschiedenen Inhaltsstoffe voneinander getrennt werden, um so länger sind, je länger die Säule ist. Bei elektrokinetischen Trennungen erfolgt gleichzeitig eine Bandverbreiterung, so daß sich die Auflösung nicht dadurch verbessern kann, daß Länge zugegeben wird. Diese Faktoren weisen darauf hin, daß es hinsichtlich der Länge der Mikrosäule praktische Grenzen gibt. Gute Ergebnisse werden zum Beispiel mit Säulenlängen von nicht mehr als etwa 5 cm erreicht. In ähnlicher Weise wird bei vielen routinemäßigen Analyseneinstellungen bei Säulenlängen von mehr als einigen Metern die Zeit für den Transport durch eine Säule unangemessen lang. Im allgemeinen werden Säulenlängen von etwa 10 cm bis etwa 200 cm und insbesondere von etwa 40 cm bis 150 cm bevorzugt. Natürlich können auch längere und kürzere Säulen, zum Beispiel bis zu 4 oder 5 Metern Länge oder bis auf etwa 5 cm herunter in Kombination mit den Detektoren gemäß dieser Erfindung verwendet werden. Auf Grund ihrer einfachen Konstruktion werden Säulen mit einem kreisförmigem Querschnitt bevorzugt, d. h. Säulen von der Art der Kapillarröhrchen.
Die Mikrosäule ist aus einem Material hergestellt, das die Eigenschaften aufweist, daß es beständig ist und seine physische Unversehrtheit unter den Bedingungen der elektrokinetischen Trennungen bewahrt. Zu diesen Eigenschaften gehören die Verträglichkeit mit dem Trägerelektrolyten, eine starke Nichtleitfähigkeit, so daß es nur eine unbedeutende Elektrizitätsmenge leitet und nur eine unbedeutende Wärme erzeugt, wenn das elektrokinetische Potential an dasselbe angelegt wird, und die Fähigkeit, an seiner Innenfläche eine positive oder negative Ladung anzunehmen.
Es können anorganische Materialien verwendet werden, wie zum Beispiel Quarz, Glas und Quarzglas, und organische Materialien, wie zum Beispiel Teflon (Polymere aus Polytetrafluorethylen und fluoriertem Ethylen/Propylen), Polychlortrifluorethylen, Aramid, Nylon (Polyamid), Polyvinylchlorid, Polyvinylfluorid, Polystyrol, Polyethylen, Polycarbonat und dergleichen.
Wie hierin erläutert, wird eine elektroosmotische Strömung erreicht, wenn die Innenfläche der Mikrosäule aufgeladene Inhaltsstoffe führt oder adsorbiert. Die Innenfläche der Mikrosäule kann so verändert werden, daß sich ihre Ladung ändert, indem die Oberfläche zum Beispiel mit einer sauren Flüssigkeit in Berührung gebracht wird, so daß mehr positive Ladungen hineinkommen, oder indem die Oberfläche mit einem basischen Material in Berührung gebracht wird, so daß mehr negative Ladungen hineinkommen, oder indem die Oberfläche mit einem Silylierungsmittel in Berührung gebracht wird, so daß sich die Anzahl der Ladungen verringert (bezüglich einer Beschreibung der Verwendung eines Trimethylsilans zur Verminderung der Ladungsdichte an den Wänden eines Engkanal-Elektrophoresebereichs und damit zur Veränderung des Transports durch den Bereich siehe Analytical Chemistry, 53, Nr. 8, Juli 1981, 1298). Andere in Fachkreisen bekannte Verfahren zur Modifizierung der Oberfläche lassen sich ebenfalls anwenden.
Was die Fig. 3 und 4 zusätzlich zu Fig. 2 betrifft, so veranschaulichen die Fig. 3 und 4, daß der Detektor von Fig. 2 in ein Konstruktions-Endstück 30 für die Mikrosäule 10 eingebaut werden kann. In Fig. 3 sind die Elektroden 21 und 22 als an die Verbindungsleitungen 31 und 32 angeschlossen dargestellt, die zum Anschluß an das (nicht dargestellte) Leitfähigkeitsmeßgerät dienen. Das Endstück 30, wie es in Fig. 3 dargestellt ist, enthält eine Anzahl zusätzlicher Bestandteile, die für die Praxis der Erfindung nicht notwendig sind, dem Endstück jedoch seine Strukturfestigkeit verleihen und eine ausgezeichnete Verfahrensweise zur Konstruktion einer praktischen Vorrichtung zur Umsetzung der Erfindung veranschaulichen.
Diese Bestandteile enthalten ein flexibles Stützrohr 34, das vom Endstück 30 der Mikrosäule ausgeht und ein Zerbrechen der Säule verhindern soll. Dieses Rohr besteht typischerweise aus einem Kunststoff, wie zum Beispiel aus Teflon oder dergleichen. Die Auflagen 35 und 36, die das Rohr bei der Herstellung zentrieren, bestehen normalerweise auch aus einem Kunststoff. Die Körperteile 37, 39 und 40 des Endstücks werden im allgemeinen um die anderen Endstückbestandteile herum gegossen, so daß sie diese umgeben und sie biegesteif halten. Die Kappe 41 ist dazu geeignet, das Endstück 30 in einer Elektrophorese- oder Elektrokinesevorrichtung zu positionieren.
Eine solche Vorrichtung ist schematisch in Fig. 5 dargestellt. Die Vorrichtung umfaßt ein Kapillarrohr 10 aus Quarzglas, das typischerweise eine Gesamtlänge von 75 cm und einen Innendurchmesser von 50 um besitzen könnte. Das Kapillarrohr ist mit einem flüssigen Trägerelektrolyten gefüllt und schließt im Endstück 30 ab, das einen Detektor gemäß dieser Erfindung enthält, wie er in Fig. 3 zu sehen ist. Ein Speisebehälter 51 und ein Ablaufbehälter 52 enthalten ebenfalls einen Trägerelektrolyten, so daß das mit Flüssigkeit gefüllte Kapillarrohr 10 eine kontinuierliche flüssige und elektrische Verbindung zwischen denselben bildet. Von einer Stromquelle 54 wird durch Leiter 57 und 59 und Elektroden 55 und 56, die mit dem Elektrolyten in den Behältern 51 und 52 in Berührung stehen, eine wirksame elektrokinetische Spannung angelegt, so daß ein vollständiger elektrischer Stromkreis entsteht.
Bei der durch die Stromquelle 54 in der Probe in der Säule 10 angelegte Spannung sollte es sich um eine Spannung handeln, die so wirksam ist, daß sie eine erkennbare elektrokinetische Bewegung ohne übermäßige Erwärmung auslöst. Spannungen unter etwa 1000 Volt sind im allgemeinen zu niedrig, und Spannungen über etwa 100 kV kommen im allgemeinen in herkömmlichen Hochspannungsstromanlagen nicht vor. Auf Grund dieser praktischen Grenzen werden Spannungen von etwa 3 kV bis etwa 90 kV und insbesondere von etwa 5 kV bis etwa 60 kV bevorzugt. Die Richtung, in der sich die elektrisch geladenen Inhaltsstoffe und der geladene Trägerelektrolyt bewegen, wird von der Polarität des elektrischen Potentials bestimmt. Aus Sicherheitsgründen wird vorzugsweise so viel wie möglich vom Analysesystem an Erde gelegt. In Fig. 5 ist zum Zwecke der Veranschaulichung eine Spannung von 30 kV angegeben. Die Innenfläche der Säule 10 ist so ausgestattet, daß sie Ionen anzieht, zum Beispiel negative Ionen (Anionen) und damit die Entstehung einer diffusen Doppelschicht bewirkt und ihrerseits eine reine positive Ladung an den Körper des Trägerelektrolyten in der Säule 10 anlegt. Wird das Potential von 30 kV durch die Elektrode 55 an die Flüssigkeit im Abflußbehälter 51 angelegt, so kann es bewirken, daß diese positiv geladene Flüssigkeit elektroosmotisch aus der Säule 10 in den Behälter 52 abgezogen wird, und kann zusätzlichen Elektrolyten aus dem Behälter 55 in die Säule 10 abziehen.
Ein typischer Stromfluß ist 10-100 uA stark. Bei typischen elektrokinetischen Systemen beträgt die Lineargeschwindigkeit der Flüssigkeit durch das Kapillarrohr 10 etwa 0,2 bis etwa 5 mm pro Sekunde.
Das Kapillarrohr 10 läuft durch den Detektor 30, der aus den beiden Elektroden besteht, wie dies in den Fig. 1 bis 4 zu sehen ist. Die Ausgangssignale des Detektors 30, die sich als Funktion des zwischen den beiden Elektroden bewegten Materials verändern, werden durch die Leitungen 31 und 32 zum Leitfähigkeitsmeßgerät 61 geführt, dessen Ausgangssignale durch die Leitung 62 zu einem Bandschreiber 63 geleitet werden. Es ist darauf hinzuweisen, daß diese Ausgangssignale gespeichert oder in anderer Weise verarbeitet werden können, zum Beispiel in einem Computer.
Bei Gebrauch wird eine Probe in das Kapillarrohr 10 eingespritzt. Das kann erfolgen, indem eine Probe mechanisch oder durch Schwerkraft auf die Säule gespritzt oder das Eintrittsende des Kapillarrohrs 10 in die im Behälter 64 befindliche Flüssigkeitsprobe getaucht, die Leitung 57 mit der Elektrode 65 verbunden und eine kurze Zeit lang, wie zum Beispiel 5 bis 10 Sekunden, die Hochspannung bei einer elektrokinetisch wirksamen Spannung, wie zum Beispiel bei etwa 6 kV, eingeschaltet wird. Dadurch wird bewirkt, daß ein vorbestimmter 1 bis 5 mm langer "Stopfen" der Probe in die Säule 10 eingesaugt wird. Auf diese Probe läßt man dann die Trennkräfte der Elektrokinese einwirken, indem man das Eintrittsende in den Trägerelektrolyten im Behälter 51 bringt und den vollständigen Stromkreis durch die Elektrode 55 herstellt, um dann die verschiedenen Inhaltsstoffe zur Erkennung im Detektor gemäß dieser Erfindung voneinander zu trennen.
Die von den Detektoren gemäß dieser Erfindung gemessenen Leitfähigkeitswerte müssen in eine lesbare Form umgewandelt und angezeigt oder anderweitig genutzt werden. Fig. 6 ist eine schematische Darstellung einer Art eines Wechselstrom- Leitfähigkeitsmeßgeräts, welches ein lesbares Leitfähigkeitssignal erzeugen kann, wenn es mit den Elektroden zum Einsatz kommt. Diese Meßschaltung ist eine Modifikation des von Everaerts et al. in "Isotachophoresis . . . " , oben bei 148 erläuterten Meßgeräts. Bei diesem Stromkreis werden integrierte Eingangsschaltungen mit hoher Impedanz, z. B. LF351 und LF355, verwendet. Ein Transformator 69 wird als galvanischer Isolator zwischen den Meßelektroden, die nicht dargestellt sind und ein hohes Gleichstrom-Erdungspotential besitzen, und der elektronischen Schaltung verwendet. Die Schwingungsfrequenz ist auf 3,5 kHz eingestellt, obwohl auch andere Frequenzen verwendet werden können. Ein Tiefpaßfilter ist zur Minimierung des elektronischen Rauschens im Anschluß an den Stromkreis eingesetzt. Die Ausgangssignale des Leitfähigkeitsmeßgerätes werden verstärkt (Verstärkungsfaktor: 10 oder 20), ehe sie zu einem Mikrocomputer zur Anzeige entweder auf einem Bildschirm oder auf einem Drucker weitergeleitet werden.
Bei einer alternativen Ausführungsform besitzt der Detektor der vorliegenden Erfindung eine einzelne an der Säule angebrachte Elektrode und wirkt durch den elektrischen Kontakt mit der Flüssigkeit im Abflußbehälter und bildet dadurch die zweite Elektrode. Diese Ausführungsform ist in den Figuren 7 und 8 dargestellt. Der Detektor 70 von Fig. 7 umfaßt die Mikrosäule 10, wie weiter oben beschrieben, mit einer einzelnen an der Säule angebrachten Elektrode 21. Diese Elektrode ist sehr nahe am Ende der Säule 10 angeordnet. Die Strecke L ist vorzugsweise ähnlich der größten Abmessung des Querschnitts der Säule, z. B. dem Durchmesser bei Säulen mit kreisförmigem Querschnitt. Vorzugsweise beträgt die Strecke L 500 um oder weniger, und noch mehr bevorzugt beträgt L 300 um oder weniger. Dadurch minimiert sich das Gleichstrompotential, das an der Elektrode 21 entsteht, da dieses Potential eine direkte Funktion der Strecke L ist.
Wird der Detektor 70 in ein elektrokinetisches Gesamt- Trennsystem auf genommen, wie zum Beispiel in das in Fig. 8 dargestellte System 80, dann kann man die gleiche Anordnung verwenden, die unter Bezugnahme auf Fig. 5 beschrieben (und demgemäß in Fig. 8 gekennzeichnet) ist, nur daß eine zusätzliche Elektrode 81 vorhanden ist. Diese Elektrode steht in Kontakt mit der Flüssigkeit im Behälter 52. Diese Flüssigkeit steht ihrerseits in Kontakt mit dem offenen Ende der Säule 10 und schafft damit einen vollständigen elektrischen Stromkreis zur Messung der Leitfähigkeit. Als Alternative könnte die zweite Elektrode durch den Anschluß an die Elektrode 56 geschaffen werden. In dieser Anordnung tritt eine Erkennung ein, wenn das Teilchen oder der Inhaltsstoff in den Bereich der Säule zwischen der Elektrode 21 und dem Ende der Säule kommt, d. h. wenn es sich im Bereich "L", befindet. Sobald das Teilchen oder der Inhaltsstoff in das Bruttovolumen des Behälters 52 gelangt, ist sein Vorhandensein nicht erkennbar.
An einer gegebenen Säule zur elektrokinetischen Trennung kann mehr als ein Paar Meßelektroden gemäß dieser Erfindung vorhanden sein. Es können zum Beispiel zwei oder noch mehr Paare von Elektroden verwendet werden. Dadurch können Mehrfachablesungen vorgenommen werden, wenn Teilchen an verschiedenen Stellen an der Säule vorbeilaufen. Dadurch wiederum werden Einstellungen an den Detektorstromkreisen und dergleichen ermöglicht, um die Leistung des Detektors zu optimieren. Bei Bedarf könnten auch mehrere einzelne Elektroden verwendet werden.
Was Fig. 9 betrifft, so ist darin eine Säule mit zwei Paar an der Säule angebrachten Elektroden 91 und 92 sowie 93 und 94 dargestellt. Wie schon weiter oben erläutert, sind diese Elektroden zumindest bündig mit der Oberfläche des Rohres 10. Die Elektroden 91 und 92 erstrecken sich in den Flüssigkeitsstrom und rufen in der Säule kein Totvolumen hervor. Die Elektroden 93 und 94 sind ähnlich, besitzen jedoch eine Isolierschicht 95 und 96 auf ihren zylindrischen Oberflächen, so daß nur ihre Enden mit der Flüssigkeit in Berührung kommen und Änderungen der Leitfähigkeit erkennen. Bei dieser Anordnung sind Nachweisverfahren von hoher Empfindlichkeit möglich.
Was Fig. 10 betrifft, so ist darin eine Säule mit einem Paar an der Säule angebrachter Meßelektroden 101 und 102 zu sehen. Die Elektroden 101 und 102 sind angrenzend an das Austrittsende 100 der Mikrosäule 10 angeordnet und werden dort mittels des geformten Klebestreifens 106 festgehalten. Die Elektroden 101 und 102 sind auf ihren seitlichen Oberflächen mit elektrischen Isolatoren 104 und 105 beschichtet, so daß die Leitfähigkeit allein zwischen ihren Enden gemessen wird. Diese Anordnung der an der Säule angebrachten Elektrode angrenzend an das Ende der Säule erbringt den Vorteil der einfachen Konstruktion und der Haltbarkeit.

Einsatzmöglichkeiten der Detektoren

Die Detektoren der vorliegenden Erfindung und die Analysesysteme, mit denen sie arbeiten, können zum Nachweis geladener und ungeladener Inhaltsstoffe und Teilchen in Lösung benutzt werden. Die flüssige Phase der Lösungen ist leitend und ist eine elektroosmotisch pumpbare Trägerflüssigkeit. Eine Flüssigkeit läßt sich elektroosmotisch pumpen, wenn sie ein Elektrolyt ist, das heißt, wenn sie genug elektrisch geladene Inhaltsstoffe enthält oder befördert, um einen elektrischen Strom zu leiten. Typische Trägerflüssigkeiten, die sich elektroosmotisch pumpen lassen, enthalten zum Beispiel mindestens etwa 0,0005 Mol pro Liter ionischer Inhaltsstoffe und vorzugsweise etwa 0,001 bis etwa 10 Mol pro Liter ionischer Inhaltsstoffe. Durch derartige Pegel ergeben sich angemessene Geschwindigkeiten der elektrokinetischen Übertragung. Am häufigsten basiert die Trägerflüssigkeit auf Wasser oder auf einem Mischsystem aus wäßrigen und organischen Flüssigkeiten. Ein Mischsystem kann dazu dienen, bei der Löslichmachung oder der Suspendierung organischer Zielmaterialien zu helfen, die in Wasser allein nur eine begrenzte Löslichkeit aufweisen. Eine rein organische Flüssigkeit, die zum Leiten von Elektrizität in der Lage ist, läßt sich ebenfalls verwenden. Als repräsentative Materialien, die sich im Trägerelektrolyten einsetzen lassen, gelten Wasser und eine Lösungsmittelmischung, bestehend aus Wasser, dem ein oder mehrere mit Wasser mischbare organische Materialien beigemischt ist/sind, wie zum Beispiel niedere Alkansäuren (d. h. solche mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen) wie Essigsäure, Propionsäure, Chloressigsäure und dergleichen; niedere primäre und sekundäre Alkylamine wie Methylamin, niedere Alkohole wie Ethanol, Methanol und Propanol; niedere Polyole wie die niederen Alkandiole; Stickstoff, der Flüssigkeiten wie Acetonitril, Pyridin, Piperidin und Chinolin enthält; niedere Ketone wie Aceton und Methylkethylketon; niedere Alkylamide wie Dimethylformamid, N-Methyl- und N-Ethylformamid, N-Ethylacetamid und dergleichen. Bei jeder dieser Flüssigkeiten kann die Trägerflüssigkeit zugesetzte ionische Materialien enthalten, wie zum Beispiel Salze, Chelate und andere Komplexverbindungen, Säuren, Basen, Puffersubstanzen und dergleichen.
Oberflächenaktive Stoffe oder andere Materialien, die die Micellenbildung begünstigen, können ebenfalls aufgenommen werden. Oft verwendet man vorzugsweise zugesetzte ionische Inhaltsstoffe, die Zwitterionen bei dem pH-Wert sind, bei dem die Flüssigkeit durch den elektrokinetischen Kanal läuft. Zu repräsentativen Materialien gehören Alkalimetall- und Erdalkalimetall- sowie Übergangsmetallsalze anorganischer Säuren; ähnliche Salze organischer Säuren, Ammoniumsalze und Salze organischer Basen solcher Säuren; Halogensäuren, organische Säuren sowie andere Säuren; Metallsäuren und -hydroxide, Amine und andere Basen und dergleichen. Zu typischen Zwitterionen gehören Aminosäuren und die von der Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, vertriebenen Good's- Puffersubstanzen. Diese zugesetzten ionischen oder ionisierbaren Materialien können im allgemeinen nach Belieben aus diesen umfangreichen Klassen ausgewählt werden, solange sie sich mit den anderen Bestandteilen der Probe und mit dem Trägerelektrolyten vertragen, da ihre Hauptaufgabe darin besteht, die Leitfähigkeit des Trägerelektrolyten zu erhöhen.
Die Inhaltsstoffe oder Teilchen, die sich mit den Detektoren gemäß dieser Erfindung nachweisen lassen, können praktisch unbegrenzt aus den Materialien ausgewählt werden, die in der Trägerflüssigkeit suspendiert oder gelöst werden können. Zu diesen Materialien können einfache Ionen wie Natrium-, Kalium-, Lithium-, Selen-, Beryllium-, Kupfer-, Silber-, Eisen- und Magnesiumionen gehören, dazu Chorid, Bromid, Ammoniumsulfat-, nitrat, -phosphat und dergleichen bis hin zu viel komplizierteren Materialien, wie diese oft von biologischer oder ökologischer oder chemischer Bedeutung sind.
Die Ziel-Inhaltsstoffe können somit Makromoleküle sein, wie z. B. Polyaminosäuren, d. h. Polypeptide und Proteine, Polysaccharide; Nucleinsäuren und Oligonucleotide wie RNS, DNS und DNS-Fragmente sowie Kombinationen derselben. Zu solchen Kombinationen oder Strukturen gehören Bakterien, Viren, Chromosomen, Gene, Mitochondrien, Zellkerne, Zellmembranen und dergleichen.
Die große Vielzahl von Proteinen und Polypeptiden ist nach ähnlichen Strukturmerkmalen eingeteilt, nach Proteinen mit speziellen biologischen Funktionen, nach Proteinen, die bei speziellen Mikroorganismen, insbesondere bei krankheitserregenden Mikroorganismen vorkommen, usw.
Die folgenden Klassen sind Klassen von strukturverwandten Proteinen: Prosamine, Histone, Albumine, Globuline, Skleroproteine, Phosphoproteine, Mucoproteine, Chromoproteine, Lipoproteine, Kernproteine, Glykoproteine, Proteoglycane, nichtklassifizierte Proteine, z. B. Somatotropin, Prolaktin, Insulin und Pepsin.
Es gibt natürlich zahlreiche potentielle Zielproteine, die dich im menschlichen Plasma finden und klinisch wichtig sind; dazu gehören: Präalbumin, Albumin, a&sub1;-Lipoprotein, thyroxinbindendes Globulin, Gc-Globulin (Gc 1-1, Gc 2-1, Gc 2-2), Klinesterase, Myoglobin, Transferrin, Fibrinogen, Immunglobulin G (IgG), Immunglobulin A (IgA), Immunglobulin M (IgM), Immunglobulin E (IgE) oder qE-Globulin (qE), Komplementfaktoren, Blutgerinnungsfaktoren, Peptid- und Proteinhormone, zu denen zum Beispiel das Nebenschilddrüsenhormon (Parathormon), Insulin, Glucagon, Somatotropin (Wachstumshormon), follikelstimulierendes Hormon, luteinisierendes Hormon (interstitielles zellstimulierendes Hormon), Gonadotropin, Sekretin und Gastrin gehören.
Weitere makromolekulare Zielmaterialien von Bedeutung sind Mucopolysaccharide und Polysaccharide, die von Mikroorganismen hergeleitet oder in diesen vorhanden sind, zum Beispiel in coliformen Bakterien, Salmonellen, Shigellen, proteus-Arten, pasteurellen, Brucellen, aeroben sporenbildenden Bazillen, anaeroben sporenbildenden Bazillen, Mycobakterien, Actinomycetes (pilzähnlichen Bakterien), Spirochäten, Mycoplasmen und dergleichen.
Zu anderen Ziel-Inhaltsstoffen können gehören: Rickettsien (bakterienähnliche Parasiten), Chlamydien, Pilze und Viren einschließlich Adenoviren, Pockenviren, Myxoviren, Reoviren der Typen 1-3, Hepatitisviren und Tumorviren; Narkotika, Metaboliten, pestizide, Schadstoffe und dergleichen. Zu ihnen gehören auch die Alkaloide wie Morphinalkaloide (Morphin, Codein, Heroin, Kokain, Benzoylecgonin usw.), Ergot-Alkaloide, Stetoidalkaloide und ähnliche. Andere Narkotika von Bedeutung sind Steroide, zu denen auch die Östrogene und Androgene gehören; Andrenocorticosteroide; Gallensäuren; kardiotonische Glycoside und Aglycone, zu denen Digoxin und Digoxigenin gehören; die Barbiturate, z. B. Phenobarbital und Secobarbital; Aminoalkylbenzole, zu denen die Amphetamine gehören; Cannabinol und Tetrahydrocannabinol, Vitamine, Prostaglandine, Antibiotika, Nucleoside und Nucleotide.
Zu einer weiteren Gruppe von Zielverbindungen gehören Aminosäuren und Kleinpeptide einschließlich der Polyiodothyronine, z. B. Thyroxin, und Triiodothyronin, Oxytocin, Adrenocorticotropin, Angiotensin, Met- und Leu-Inkephalin sowie deren Metabolite und Derivate.
Die Erfindung wird weiter veranschaulicht durch die nun folgenden Beispiele. Diese werden vorgestellt, um beispielhafte Verfahren zur Ausführung dieser Erfindung darzustellen, und sind nicht als den Umfang derselben einschränkend zu verstehen.

BEISPIELE 1 UND 2

Es wurden zwei verfahrensgekoppelte Leitfähigkeitsmeßzellen konstruiert, indem Platindrähte durch sich diametral gegenüberstehende Bohrungen in Kapillarrohren aus Quarzglas mit einem Innendurchmesser von 50 um oder 75 um hindurch befestigt wurden (Polymicro Technology, Inc., Phoenix, AZ und SGE, Austin, TX). Diese Bohrungen mit 40 um Innendurchmesser wurden mit einem computergesteuerten CO&sub2;-Laser hergestellt. Unter einem Mikroskop wurden zwei Platindrähte mit 25 Mikrometer Durchmesser (California Fine Wire Co., Grover City, CA) sich genau gegenüberliegend in die Bohrungen gebracht, um die Potentialdifferenz zwischen diesen Elektroden zu minimieren, wenn eine hohe elektrische Feldstärke angelegt wird. Die Drähte wurden so positioniert, daß sich Innenflächen ergaben, die kontinuierlich waren. Verflüssigtes Polyethylenglykol (PEG) (Molekulargewicht 1000, J. T. Baker Chemical Co.) wurde so auf den um die Elektroden herum liegenden Bereich aufgebracht, daß diese zeitweilig festgehalten wurden. Sobald das flüssige Polyethylenglykol fest geworden war, wurde es sorgfältig von der Außenfläche des Kapillarrohres entfernt. Dann wurde ein Epoxidharz (Miller Stephenson 907) benutzt, um die Elektroden fest im Kapillarrohr zu versiegeln. An die Platinelektroden wurden Drähte (Drahtwickel #30, Digital Inc.) angelötet, und die gesamte Leitfähigkeitsmeßzelle wurde in einem Plexiglasmantel versiegelt. Die vollständige Konstruktion der Leitfähigkeitsmeßzellen entspricht den Fig. 2 bis 4.
Die Leitfähigkeitsmeßzellen dienten dann dazu, die Leitfähigkeit von Lösungen zu messen, als diese durch eine elektrokinetische Trennzone geleitet wurden, wie dies in Fig. 5 zu sehen ist. Dazu wurde ein Wechselstrom-Leitfähigkeitsmeßgerät verwendet, wie in Fig. 6 dargestellt. Die Schwingungsfrequenz wurde auf 3,5 kHz eingestellt. Im Anschluß an den Stromkreis wurde ein Tiefpaßfilter eingesetzt, um das elektronische Rauschen zu minimieren. Die Ausgangssignale des Leitfähigkeitsmeßgeräts wurden verstärkt: (Verstärkungsfaktor: 10 oder 20), ehe sie auf eine Datenerfassungsplatte (DT2801, Data Translation, Inc., Marlborough, MA) in einem IBM-Mikrocomputer XT zur Anzeige weitergeleitet wurden.
Die Proben wurden entweder durch 5 Sekunden anhaltende Elektromigration bei 5 kV oder durch eine 30 Sekunden anhaltende Schwerkraftströmung eingeleitet, wobei sich ein Ende des Kapillarrohres um 10 cm höher befand als das andere. Das geschätzte Einspritzvolumen betrug bei der Elektromigration etwa 10 nL und beim Einspritzen durch Schwerkraft etwa 5 nL. Das Kapillarrohr wurde nach jedem Lauf mit einer Pufferflüssigkeit ausgespült.
Proben, die Ionen enthielten, wurden in einer Pufferlösung gelöst, die aus 20 mM Morpholinethansulfonsäure (MES) bestand, die durch Histidin auf einen pH-Wert von 6,1 eingestellt worden war. Alle Chemikalien wurden von Sigma (St. Louis, MO) bezogen und ohne weitere Reinigung eingesetzt. Serumproben wurden ebenfalls getestet. Diese wurden vom Stanford University Medical Center erworben und nach Bedarf mit Pufferlösung verdünnt. Die verdünnten Serumproben wurden mit einer Filtermembran (Toyo Soda, Japan) in einer Zentrifuge vom Protein befreit.

ERGEBNISSE UND BEWERTUNG

Fig. 11 veranschaulicht die Trennung und den Nachweis von Rb&spplus;, K&spplus;, Na&spplus; und Li&spplus; durch Elektrophorese. Die Konzentration jedes Ions beträgt 2·10&supmin;&sup5; M. Das Signal-Rausch-Verhältnis beträgt bei dieser Konzentration 400. Die Nachweisgrenze für Li&spplus; wird auf der Basis eines Signal-Rausch-Verhältnisses von 2 mit etwa 10&supmin;&sup7; errechnet. Das effektive Nachweisvolumen beträgt etwa 30 pL, basierend auf der Bestimmung der Zellkonstanten (Querschnittsfläche der Elektroden, geteilt durch den Abstand zwischen denselben), die durch Messen der Leitfähigkeit einer bekannten Lösung von KCl und unter Einsatz des Literaturwertes der spezifischen Leitfähigkeit für diese Lösung erfolgte. Bei dieser Volumenschätzung wird angenommen, daß die Elektroden um 50 Mikrometer (dem Innendurchmesser des Kapillarrohres) voneinander getrennt sind. Der erzielte Wert stimmt innerhalb eines Faktors von 1,5 mit dem geometrischen Volumen auf der Basis der Querschnittsfläche der Elektroden und des Abstands zwischen denselben überein. Daraus ergibt sich, daß die tatsächlich nachweisbare Menge 10&supmin;¹&sup8; Mol beträgt, was etwa 10&sup6; Ionen entspricht. Die Verweildauer jedes Ions ist annähernd proportional zu dem Kehrwert seiner Beweglichkeit. Alle in Fig. 11 dargestellten Spitzen sind "positiv", d. h. wenn jedes dieser Ionen an den Detektorelektroden vorbeiläuft, dann sind deren Leitfähigkeiten größer als die Grundleitfähigkeit der Pufferlösung und erscheinen als positive Abweichungen über der Grundlinie. Somit stellen die Flächen der Spitzen die Beweglichkeitsunterschiede zwischen den Ionen in der Nachweiszone und das Zählion (Histidin) des Elektrolyten dar. Man kann auch "negative" Spitzen feststellen, die negative Abweichungen von der Grundlinie darstellen. Diese treten auf, wenn ein Inhaltsstoff mit geringerer Leitfähigkeit als der Grundleitfähigkeit an den Meßelektroden vorbeiläuft.
Der Bereich der Spitzen steht in linearer Beziehung zur Ionenkonzentration. Auf 18 Konzentrationsstufen von Li&spplus; wurde über drei Größenordnungen von 0,0025 mM bis 2,0 mM eine Korrelations- und Regressionsanalyse vorgenommen. Auf jeder Konzentrationsstufe wurde drei Läufe nacheinander ausgeführt. Es wurde festgestellt, daß die Spitzenbereiche von Li&spplus; mit einem Korrelationsfaktor von 0,993 linear über den gesamten untersuchten Bereich verliefen. Ähnliche Ergebnisse wurden für Na&spplus; erzielt.
In Fig. 12 ist ein Elektropherogramm zu sehen, das die Trennung von Tetramethylammonium, Triethylamin, Arginin und Histidin zeigt. Da K&spplus;, das als Zählion in der Pufferlösung dient, eine größere Beweglichkeit besitzt als die Bestandteile der Probe, sind die Spitzen "negativ", d. h. sie ragen unter die Grundlinie. Dieser Wert veranschaulicht, daß man dieses Verfahren anwenden kann, um einige organische Kationen abzutrennen. Indem man die Pufferbedingungen ändert, kann man auch organische Anionen nachweisen.
Eine Probe normalen menschlichen Serums wurde in ähnlicher Weise analysiert, und die Ergebnisse sind in Fig. 13a dargestellt. Die erste Spitze ist K&spplus;, und die sehr breite zweite Spitze ist Na&spplus;. Daß die Spitze gekappt wurde, ist auf die Sättigung der Elektronik zurückzuführen, weil die Na&spplus;-Konzentration im Serum so hoch ist (etwa 140 mM). Infolgedessen werden Ca²&spplus; und Mg²&spplus;, die eine Beweglichkeit nahe der von Na&spplus; aufweisen, durch die große Na&spplus;- Spitze verdeckt. Fig. 13b ist ein Elektropherogramm einer Serumprobe von einem Patienten mit Lithium-Therapie. Sie beweist, daß die dritte Spitze (Li&spplus;) von der Na&spplus;- Spitze vollkommen aufgelöst wird. Das deutet darauf hin, daß sich dieses Verfahren gut bei der klinischen Überwachung von Patienten anwenden läßt, die eine Lithiumtherapie erhalten.
Dieser neuartige Leitfähigkeitsdetektor besitzt mehrere vorteilhafte Eigenschaften. Er ermöglicht die Kontrolle der Abweichung des Abstands längs des Kapillarrohres zwischen den Elektroden von weniger als 10 Mikrometer. Das heißt, daß die Potentialdifferenz zwischen den beiden Elektroden in einem elektrischen Feld von 300 V/cm auf weniger als 0,3 V minimiert werden kann. Durch dieses Merkmal werden alle an den Elektroden eintretenden elektrochemischen Reaktionen fast vollständig beseitigt. Ein weiterer Vorteil dieser Strukturform ist, daß auf Grund der sehr kleinen Querschnittsfläche der Elektroden eine ausgezeichnete Auflösung ermöglicht wird. Es existiert im wesentlichen kein Totvolumen im Detektor, und das Nachweisvolumen ist sehr klein. Dieses System läßt sich nicht nur zum Nachweis geladener Teilchen einsetzen, sondern kann auch alle neutralen Substanzen erkennen, die sich mittels Elektrophorese abtrennen lassen. Da die Änderung der Leitfähigkeit ein elektrisches Signal ist, läßt sich dieses ohne weiteres mit einem Datenerfassungssystem koppeln. Die Anordnung ist sowohl hinsichtlich der Kosten als auch hinsichtlich der Energie wirtschaftlich. Die Kosten für alle zur Konstruktion der Leitfähigkeitsmeßzelle und der ihr zugehörigen Schaltungen notwendigen Materialien sind sehr bescheiden, und die erforderliche Elektroenergie beträgt nur ein paar Watt, die von einem Batteriesystem geliefert werden könnten. Daher kann man das gesamte System sehr leicht als tragbare Einrichtung gestalten. Tatsächlich spricht seine geringe Größe dafür, daß es ohne weiteres für die Probennahme in vivo ausgelegt werden kann. Die Empfindlichkeit dieses Detektors ist für ein nichtoptisches System recht bemerkenswert.

BEISPIEL 3

Es wurde unter Einsatz des Detektors von Fig. 7 und Fig. 8 mit einer einzelnen Elektrode im Kapillarrohr und mit der anderen Elektrode außerhalb des Kapillarrohrs eine elektrophoretische Trennung in einer Kapillarzone ausgeführt. Dazu wurde ein 73,5 cm langes Kapillarrohr aus Quarzglas mit einem Innendurchmesser von 75 um verwendet. Die an der Säule angebrachte Elektrode war etwa 150 um vom äußeren Ende des Kapillarrohres entfernt. Die Probe enthielt die Aminosäure und Arginin mit einer Konzentration von 5·10&supmin;&sup4; M in 10 mM HEPES-Puffer (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure) mit einem pH-Wert von 7,5. Zum Einbringen der Probe in das Kapillarrohr erfolgte eine 5 Sekunden anhaltende elektrokinetische Einspritzung bei 5 kV. Der Trennvorgang wurde bei 24 kV und 3 Mikroampere ausgeführt.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Fig. 14 dargestellt, in der die Kurve auf dem Schreiberpapier die vom Detektor gemäß der Erfindung erkannten Leitfähigkeitsänderungen darstellt. Die Probe wurde etwa zum Zeitpunkt 0 eingespritzt. Die negative Spitze bei einer Zeit von 4,2 Minuten stellt den neutralen Ursprungspunkt dar, während die positive Spitze bei 5,5 Minuten das Chloridion darstellt.

Claims

1. Elektrokinetische Trennzone umfassend eine zylindrische Säule mit einem Innendurchmesser von weniger als 500 um m und mindestens eine an der Säule angebrachte Leitfähigkeitsmeßelektrode, die bündig mit der Innenwand der Säule abschließt oder sich durch eine Seitenwand der Säule in den Säulenkanal erstreckt und im Inneren des Säulenkanals endet, und eine Einrichtung zum Anlegen eines wirksamen elektrokinetischen Potentials entlang des Säulenkanals und durch die Trennzone hindurch.

2. Elektrokinetische Trennzone nach Anspruch 1, umfassend mindestens ein Paar von Leitfähigkeitsmeßelektroden, wobei mindestens eine der Elektroden eine an der Säule angebrachte Elektrode ist, die bündig mit der Innenwand der Säule abschließt oder sich durch eine Seitenwand der Säule in den Säulenkanal erstreckt und im Inneren des Säulenkanals endet.

3. Elektrokinetische Trennzone nach Anspruch 1 oder 2, bei der die Säule einen Innendurchmesser von 25 bis 200 um besitzt.

4. Elektrokinetische Trennzone nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der jede an der Säule angebrachte Elektrode einen Durchmesser besitzt, der dem 0,01- bis 0,75fachen des größten Innendurchmessers der Säule entspricht.

5. Elektrokinetische Trennzone nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die an der Säule angebrachte(n) Elektrode(n) innerhalb von 500 um des Austrittsendes der Säule angeordnet ist (sind).

6. Elektrokinetische Trennzone nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Einrichtung zum Anlegen eines wirksamen elektrokinetischen Potentials in der Lage ist, ein Potential zwischen 3 kV und 90 kV anzulegen.

7. Elektrokinetische Trennzone nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend ein Paar an der Säule angebrachter Leitfähigkeitsmeßelektroden.

8. Elektrokinetische Trennzone nach Anspruch 7, bei der das Paar Elektroden auf einer einzigen Ebene senkrecht zur Achse der Säule angebracht ist.

9. Elektrokinetische Trennzone nach Anspruch 7 oder 8, bei der das Paar an der Säule angebrachter Elektroden an das Austrittsende der Säule angrenzt.

10. Elektrokinetische Trennzone nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend eine Vielzahl von Paaren von an der Säule angebrachten Leitfähigkeitsmeßelektroden.

11. Elektrokinetische Trennzone nach Anspruch 10, bei der eines der Paare von an der Säule angebrachten Elektroden an das Austrittsende der Säule angrenzt.

12. Elektrokinetische Trennzone nach Anspruch 10 oder 11, bei der jedes einzelne Paar von an der Säule angebrachten Leitfähigkeitsmeßelektroden längs der Achse der Säule angeordnet ist, wobei die Elemente von jedem Paar in einer einzigen Ebene senkrecht zur Achse der Säule liegen.

13. Elektrokinetische Trennzone nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend eine einzelne an der Säule angebrachte Leitfähigkeitsmeßelektrode.

14. Elektrokinetische Trennzone nach Anspruch 13, bei der die einzelne an der Säule angebrachte Elektrode an das Austrittsende der Säule angrenzt.

15. Elektrokinetische Trennzone nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der jede an der Säule angebrachte Elektrode sich durch die Säulenwand erstreckt.

16. Elektrokinetische Trennzone nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die an der Säule angebrachte Elektrode bündig mit der Wand abschließt.

17. Elektrokinetische Trennzone nach einem der Ansprüche 1 bis 15, bei der sich jede an der Säule angebrachte Elektrode durch die Wand erstreckt und im Inneren der Säule endet.

18. Elektrokinetische Trennzone nach Anspruch 17, bei der jede an der Säule angebrachte Elektrode, die sich durch die Wand erstreckt, auf mindestens einem Abschnitt ihrer sich ins Innere der Säule erstreckenden Seitenfläche isoliert ist.

19. Elektrokinetische Trennzone nach einem der Ansprüche 1 bis 18, bei der die Säule aus Quarz, Glas oder Quarzglas besteht.

20. Verfahren zur elektrokinetischen Trennung und Messung, bei dem die zu trennende Probe unter dem Einfluß eines angelegten wirksamen elektrokinetischen Potentials entlang des Säulenkanals einer elektrokinetischen Trennzone geführt wird, die aus einer zylindrischen Säule mit einem Innendurchmesser von weniger als 500 um und mindestens einem Paar von Leitfähigkeitsmeßelektroden besteht, wobei mindestens eine der Elektroden eine an der Säule angebrachte Leitfähigkeitsmeßelektrode ist, die bündig mit der Innenwand der Säule abschließt oder sich durch eine Seitenwand der Säule in den Säulenkanal erstreckt und im Inneren des Säulenkanals endet; wobei das elektrokinetische Potential längs des Säulenkanals und durch die Trennzone hindurch angelegt wird; und wobei die Leitfähigkeit zwischen jedem Paar von an der Säule angebrachten Leitfähigkeitsmeßelektroden oder zwischen einem Paar von Leitfähigkeitsmeßelektroden gemessen wird, von denen eine die an der Säule angebrachte Leitfähigkeitsmeßelektrode ist.

21. Verfahren nach Anspruch 20, bei dem die an der Säule angebrachte Elektrode bündig mit der Wand abschließt.

22. Verfahren zur Herstellung eines an der Säule angebrachten Leitfähigkeitsdetektors zur elektrokinetischen Trennung, umfassend die folgenden Schritte:

a) Herstellen von einer oder mehreren Zugangsbohrungen durch eine zylindrische Säule mit einem Innendurchmesser von weniger als 500 um, vorzugsweise weniger als 200 um, und noch mehr bevorzugt von 25 bis 80 um;

b) Einsetzen einer Elektrode in die bzw. in jede hergestellte Bohrung; und

c) die bzw. jede Elektrode wird dauerhaft mit der Säule versiegelt, so daß die bzw. jede Elektrode bündig mit der Wand der Säule abschließt oder sich durch eine Seitenwand der Säule in den Säulenkanal erstreckt und im Inneren des Säulenkanals endet.

23. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem die Säule aus Quarzglas besteht und die Zugangsbohrungen mit einem Laserbohrer hergestellt werden.

24. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem die Zugangsbohrungen durch Laserbohren, Ionenstrahlbohren, Elektroerosion oder chemisches Ätzen hergestellt werden.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, bei dem die Elektroden einen Durchmesser besitzen, der dem 0,01- bis 0,75fachen, vorzugsweise dem 0,01- bis 0,60fachen des Innendurchmessers der Säule entspricht, und bei dem die Zugangsbohrungen in einer Größe hergestellt werden, daß ihr Durchmesser um 5 bis 25 um größer ist als der Durchmesser der darin eingesetzten Elektrode.