DE2508844C2

DE2508844C2 - Einrichtung zur trägerfreien kontinuierlichen Ablenkungselektrophorese

Info

Publication number: DE2508844C2
Application number: DE2508844A
Authority: DE
Inventors: Kurt Prof Dr. 8033 Krailling Hannig; Hanns Dipl.-Phys. 8126 Hohenpeißenberg Wirth
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1975-02-28
Filing date: 1975-02-28
Publication date: 1984-06-14
Also published as: DE2508844A1; US4061560A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Einrichtungen zur tr gerfreien, kontinuierlichen Ablenkungselektrophorese, bei welchem ein r umlich eng begrenzter Strom eines in Fraktionen zu trennenden Probengemisches in eine d nne Schicht einer Pufferl!sung eingef hrt wird, die durch eine von zwei planparallelen W nden begrenzte Trennkammer str!mt, eine elektrische Spannung an die Pufferschicht angelegt wird, die in dieser ein quer zur Str!mungsrichtung und parallel zu den Trennkammerw nden verlaufendes elektrisches Trennfeld erzeugt. Die getrennten Fraktionen werden durch eine stromabw rts von der Probeneinf hrungsstelle angeordnete Analysenvorrichtung erfasst, wobei sowohl das Geschwindigkeitsprofil der Pufferstr!mung zwischen den Trennkammerw nden, als auch Elektroosmoseeffekte infolge des Zeta-Potentials der Trennkammerw nde des Str!mungsquerschnitts der Fraktionen sichelartig zu verformen streben. Der Temperaturgradient in der Pufferschicht entsprechend der Temperatur der Trennkammerw nde und der Joule'schen W rme, die in der Pufferschicht in Abh ngigkeit von der Wahl der angelegten elektrischen Spannung und der Leitf higkeit der Pufferl!sung entsteht, in Kombination mit der Str!mungsgeschwindigkeit der Pufferschicht in der Trennkammer und dem Zeta-Potential der Trennkammerw nde werden so eingestellt, dass sich die durch den Temperaturgradienten, die Str!mungsgeschwindigkeit der Pufferl!sung und des Zeta-Potentials der Trennkammerw nde ergebenden Verformung...U.S.W

Description

sentlich behindern. Die streifenförmigen Membranen 28 haben jeweils an dem dem Trennkammerspalt 12 abgewandten Rand eine Dichtleiste 30 und an dem dem Trennkammerspalt zugewandten Rand eine Reihe von warzenartigen Vorsprüngen, die als Abstuidshalter dienen und eine Kommunikation der Flüssigkeit im Trennkammerspalt mit der den Elektrodenkammern abgewandten Seite der Membranen zulassen. Die Elektrodenkammern sind in einen Flüssigkeitskreislauf 34 eingeschaltet, in dem durch eine Pumpe 36 ein Elektrolyt zur Elektrüdenspülung umgewälzt wird.

Der Trennkammerspalt liegt in einem vorzugsweise offenem Pufferströmungsweg 42, der von einem Kammerpuffervorratsgefäß 41 gespeist wird und eine Pumpe 44 enthält In den Pufferströmungsweg 42 kann über eine Dosierpumpe 46 ein zusätzlicher Elektrolyt aus einem weiteren Vorratsgefäß 48 (oder mehreren wahlweise anschließbaren Vorratsgefäßen) kontrolliert eingespeist werden. Die Trennkammer hat ferner noch einen Probeneinlaß 50, durch den in üblicher Weise eine Probensubstanz in den Trennspalt einführbar ist. An dem dem Probeneinlaß entgegengesetzten Ende der Trennkammer 10 befindet sich ein nur schematisch angedeuteter Analysator 52, der mit Schläuchen verbundene Entnahmeöffnungen für die verschiedenen Fraktionen enthält und in üblicher Weise ausgebildet sein kann und/oder ein optisches Nachweissystem enthält.

Die Trennkammer kann mit nicht dargestellten Vorrichtungen zur Thermostatisierung versehen sein, wie sie z. B. in den DE-PS 14 42 414 und 14 42 416 beschrieben sind.

Die Einspeisung des Elektrolyten dient zur Beeinflussung der Trennkammerwand-Potentiale /V, die sich nämlich nicht nur durch die bekannte Beschichtung der Kammerwände sondern auch durch Zusätze zum Elektrolyten beeinflussen lassen, z. B. in dem man einfach der in die Trennkammer eingeführten Pufferlösung über die Dosierpumpe eine genau einstellbare und regulierbare Menge bestimmter Ionen zuführt, so daß der beste Trenneffekt erzielt wird.

Zur Erzeugung der das Zeta-Potential und/oder die elektrische Leitfähigkeit der Pufferlösung beeinflussenden Ionen kann man der Pufferlösung der die verschiedensten Elektrolyten zusetzen. Als Ionen zur Beeinflussung des Zeta-Potentials haben sich insbesondere Aluminiumionen, Bariumionen, Lanthanionen und Thoriumionen in 10—⁴—10—⁶ molarer Lösung bewährt, um nur einige wenige Beispiele für solche Ionen zu nennen. Geeignete Verbindungen sind z. B. die Chloride der erwähnten Elemente. Auch durch geeignete Kombination anionischer und kationischer Puffersubstanzen kann das ζ-Wandpotential in gewünschter Weise verändert bzw. eingestellt werden. Solche vorzugsweise verwendeten Substanzen sind:

Triäthanolamin — Trispuffer (Tris(hydroxymethyl) aminomethan), Phophat-Puffer, HEPES (N-2-Hydroxyäthylpiperazin-Näthansulfosäure) — Borat-Puffer u. a.

Die Lösungen werden bezüglich pH-Wert und Konzentration (10—¹ —10—³ molar) auf die für die Trennung geeigneten Verhältnisse eingestellt.

Da die Elektrodenkammern 23 jeweils durch eine großflächige Ionenaustauscher-Membrane 28 in elektrischer Verbindung mit dem Trennkammerspalt 12 stehen, lassen sich die elektrischen Parameter bei der beschriebenen Apparatur in weiten Grenzen einstellen. Dies und die Möglichkeit der Beeinflussung des Zeta-Potentials und/oder der Leitfähigkeit der Pufferlösung durch Einspeisen eines Elektrolyten mittels der Anord-

nung 46—48 ermöglichen es, die Arbeitsbedingungen rasch und genau so einzustellen, daß für eine gewünschte Fraktion optimale Auflösung erreicht wird.

Der Analysator enthält vorzugsweise eine Reihe eng benachbarter Photodioden, wie es in F i g. 2 bei 35 angedeutet ist Die im Trennspalt separierten Fraktionen der Probe werden mit Hilfe einer Lichtquelle 37 mit Kondensoroptik möglichst homogen durchleuchtet und die Lichtquelle in die Eintrittsluke eines Objektivs abgebildet, das die einzelnen Fraktionen mit möglichst großer Schärfentiefe auf die Photodiodenanordnung 35 abbildet Die einzelnen Photodioden sind jeweils mit entsprechenden Stufen eines Schieberegisters gekoppelt (gegebenenfalls über eine tastbare Torschaltung, so daß in den Stufen des Schieberegisters jeweils Signale speicherbar sind, die der auf die zugehörigen Photodioden fallenden Strahlungsintensität entsprechen. Die Photodioden können mit dem Schieberegister zu einer integrierten Schaltung (z. B. Ladungsverschiebeschaltung) vereinigt sein.

Zur Auswertung des Anaiysenergebnisses werden die im Schieberegister gespeicherten Signale durch entsprechende Verschiebeimpulse sequentiell herausgelesen und man erhält dabei eine Folge von Impulsen mit Amplituden entsprechend den Absorptionseigenschaften der jeweiligen Flüssigkeitsbereiche im Trennkammerspalt 12 zwischen der Lichtquelle 37 und den jeweiligen Photodioden 35. Diese Impulsfolge kann direkt oder nach Umcodierung telemetrisch übertragen, auf einem Sichtgerät dargestellt oder anderweitig registriert werden.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Einrichtung zur trägerfreien kontinuierlichen Ablenkungselektrophorese mit einer Trennkammeranordnung, die einen durch zwei planparailele Wände begrenzten Trennkammerspalt und zwei beidseits des Trennkammerspaltes angeordnete, jeweils eine Elektrode enthaltende Elektrodenkammern, die vom Trennkammerspalt durch eine ionendurchlässige Membrane getrennt sind, enthält, ferner mit einer Vorrichtung zum Einführen einer Probe in den Trennkammerspalt, einer Vorrichtung zum Erzeugen einer Pufferlösungsströmung im Trennkammerspalt und einer Vorrichtung zur Analyse von getrennten Fraktionen der Probe, dadurch gekennzeichnet, daß die ionendurchlässigen Membranen (28) im wesentlichen parallel za den Trennkammerwänden (14,16) verlaufen.

2. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Membranen (28) im wesentlichen in der Ebene der einen Trennkammerwand (16) so angeordnet sind, daß ihre eine Seite an den Trennkammerspalt (12) und die andere an die zugehörige Elektrodenkammer (22) angrenzt

3. Einrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß jede Membrane an dem dem Trennkammerspalt abgewandten Rand durch eine Dichtleiste (30) bezüglich der anderen Trennkammerwand (14) abgedichtet und am anderen Rand über Ab-Standshalter (32), welche eine Flüssigkeitsverbindung zwischen dem Trennkammerspalt (12) und der erwähnten einen Seite der Membrane zulassen, an der erwähnten, anderen Trennkammerwand (14) abgestützt ist.

4. Einrichtung nach Anspruch 1,2 oder 3, gekennzeichnet durch eine Anordnung (46,48) zum kontrollierten Einspeisen einer Zusatzflüssigkeit in die in den Trennkammerspalt (12) eintretende Pufferlösung.

5. Einrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Anordnung zum kontrollierten Einspeisen einer Zusatzflüssigkeit eine Dosierpumpe (46) und einen Flüssigkeitsvorrat (48) enthält.

6. Einrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Flüssigkeitsvorrat einen Elektrolyten mit Ionen mindestens eines der Elemente Aluminium, Barium, Lanthan oder Thorium enthält.

7. Einrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Analysator eine auf der einen Seite des Trennkammerspaltes (12) angeordnete Lichtquelle (37) sowie eine auf der anderen Seite des Trennkammerspaltes angeordnete, sich quer zur Strömungsrichtung erstrekkende Reihe (35) von Photodioden enthält, die jeweils mit einer entsprechenden Stufe eines Schieberegisters so gekoppelt sind, daß die verschiedenen Stufen jeweils Signale entsprechend der auf die zugehörigen Photozellen fallenden Strahlungsleistung speichern, und daß das Schieberegister mit einer Abfrageanordnung zum seriellen Herauslesen der gespeicherten Signale gekoppelt ist.

8. Einrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrodenkammern (22) in einem Flüssigkeitskreislauf (42) liegen.

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Einrichtung gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.

Bei der trägerfreien, kontinuierlichen Ablenkungselektrophorese hängt die Trennschärfe von einer Reihe von Parametern ab, die bei verschiedenen Trennaufgaben verschieden sein können. So ist es beispielsweise aus der Veröffentlichung von Allen Strickler und Terry-Sacks in »Preparative Biochemistry« 3 (3) 269—277 (1973) bekannt, daß man die durch das Geschwindigkeitsprofil der Pufferströmung verursachte sichelartige Verformung des Strömungsquerschnitts einer vorgegebenen Fraktion durch entsprechende Einstellung des Zeta-Potentials der Trennkammerwände kompensieren kann, so daß für diese Fraktion ein quer zur Strömungsrichtung eng begrenzter Querschnitt des Probenstromfadens und damit eine optimale Trennschärfe erreicht wird. Die Einstellung des Zeta-Potentials erfolgt im bekannten Falle durch entsprechende Beschichtung der Trennkammerwände. Auch elektrische Parameter, wie die Spannung zum Erzeugen des trennenden Querfeldes spielen eine wesentliche Rolle.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Einrichtung zur trägerfreien, kontinuierlichen Ablenkungselektrophorese anzugeben, bei der eine schnelle und bequeme Einstellung von Parametern, die das Trennergebnis beeinflussen, möglich ist.

Diese Aufgabe wird bei einer Einrichtung der eingangs genannten Art erfindungsgemäß durch das kennzeichnende Merkmal des Anspruchs 1 gelöst.

Weiterbildungen und vorteilhafte Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Einrichtung sind Gegenstand von Unteransprüchen.

Da bei der vorliegenden Einrichtung die Elektrodenkammern jeweils durch eine relativ großflächige Ionenaustauscher-Membrane in elektrischer Verbindung mit dem Trennkammerspalt stehen, lassen sich die elektrischen Parameter der Einrichtung in weiten Grenzen einstellen. Dies und die Möglichkeit der Beeinflussung des Zeta-Potentials und/oder Leitfähigkeit der Pufferlösung durch Einspeisung eines Elektrolyten gemäß den in den Unteransprüchen unter Schutz gestellten Weiterbildungen der Einrichtung ermöglichen es, die Arbeitsbedingungen rasch und genau so einzustellen, daß für eine gewünschte Fraktion eine optimale Auflösung erreicht wird.

Im folgenden werden Ausführungsbeispiele der vorliegenden Einrichtung unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert. Es zeigt

F i g. 1 eine schematische Draufsicht auf ein Ausführungsbeispiel einer Einrichtung gemäß der Erfindung und

Fig.2 einen Querschnitt in einer Ebene IH-111 der Fig. 1.

Die in F i g. 1 schematisch und in F i g. 2 im Schnitt dargestellte Apparatur enthält eine Trennkammer 10 mit einem Trennspalt 12, der durch zwei nahe benachbarte, parallele Wände 14,16 begrenzt ist, die durch eine Glasplatte 18 bzw. einen Trennkammerkörper 20 aus isolierendem Kunststoff gebildet werden. Der Trennkammerkörper 20 enthält zwei langgestreckte, parallele Elektrodenkammern 22, die jeweils eine Elektrode 24 aufnehmen. Die Elektroden 24 sind im Betrieb an eine nicht dargestellte Spannungsquelle angeschlossen. Zur Trennung der Flüssigkeiten in den Elektrodenkammern 22 und dem Trennkammerspalt 12 sind jeweils Membranen 28 vorgesehen, die im wesentlichen parallel zu den Trennkammerwänden verlaufen, ionendurchlässig sind und das Fließen eines elektrischen Stromes nicht we-