DE69912284T2

DE69912284T2 - Zelle für elektrochemilumineszenz mit potentialfreien reaktionselektroden

Info

Publication number: DE69912284T2
Application number: DE69912284T
Authority: DE
Inventors: Andreas East Molesey MANZ; Arun Chiswick ARORA
Original assignee: Imperial College of Science Technology and Medicine
Current assignee: Imperial College of Science Technology and Medicine
Priority date: 1998-07-10
Filing date: 1999-07-12
Publication date: 2004-08-19
Anticipated expiration: 2019-07-13
Also published as: WO2000003233A1; CA2336896A1; DE69912284D1; GB9815042D0; EP1097371B1; EP1097371A1; AU4919199A; US6696020B1; ATE252730T1

Description

Die Elektrochemolumineszenz (ECL) ist ein hochspezifisches und empfindliches Erfassungsprotokoll, welches in einem weiten Bereich analytischer Reaktionen verwendet wird. Diese können Bioassays (Bioproben bzw. -Untersuchungen) in der klinischen Diagnostik und Screening mit hohem Durchsatz bzw. hoher Geschwindigkeit für die Entdeckung von Arzneimitteln umfassen.
Man nimmt an, daß bei der ECL die Emission von Licht von der Lösung in der Nähe der Elektrodenoberfläche ausgeht, wo die regierende Substanz (alternativ erzeugt an der Elektrodenoberfläche über eine Serie von Potentialstufen zu dem Oxidations- und Reduktions-Diffusionsplateau) durch Elektronenübertragung rekombiniert, und so zu einem angeregten Lumineszenszustand führt.
Man hat allgemein gefunden, daß das ECL-Spektrum sehr gut mit dem Lösungslumineszenzspektrum für die betreffende Substanz korreliert.
Ein Beispiel des der ECL zugrundeliegenden Prozesses ist schematisch in 1 der beigefügten Figuren dargestellt. Sowohl Tris(2,2'-bipyridyl) Ruthenium (II) (TBR – ebenfalls in 2 dargestellt als Ru(bpy₃)) als auch Tripropylamin (TPA) werden in wäßriger Lösung an einer Anodenfläche 10 einer Elektrode 40 oxidiert. Das TPA ist instabil und wird nahezu augenblicklich entprotonisiert, um TPA' zu bilden. Anschließende Elektronenübertragen zwischen TPA' und TBR⁺ Molekülen führt zu der Bildung von DPA (Dipropylamin) und TBR-Molekülen im angeregten Zustand (TBR*), die dann unter Strahlung über optische Emission bei einer Wellenlänge von 610 nm in den Grundzustand relaxieren. Bei dieser Reaktion wird, obwohl TPA verbraucht wird, das TBR rezykliert.
Die Anordnung, die in 1 dargestellt ist, ist ein sogenanntes bipolares Elektronenmodell. In dieser Anordnung sind zwei Endelektroden 20, 30 mit einer Stromversorgung verbunden, wobei die elektrische Verbindung zwischen ihnen durch Leitung durch den wäßrigen Elektrolyten bereitgestellt wird. Andere dazwischenliegende Elektroden (von denen eine, nämlich die Elektrode 40, in 1 dargestellt ist) sind nicht direkt (d. h. über Verdrahtung) mit der Stromversorgung verbunden, sondern funktionieren statt dessen als eine Anode an einer Fläche und eine Kathode auf der anderen. So funktionieren jeweils zwei benachbarte Elektroden und die dazwischenliegende Lösung als eine Reaktoreinheit, wobei die Gesamtvorrichtung eine Reihenschaltung derartiger Reaktoreinheiten bildet. Diese Anordnung wird in dem Buch „Electrochemical Reactor Design" von D. J. Pickett, Elsevier Scientific Publishing Company, 1979 beschrieben, und der chemische Vorgang wird in dem Artikel „Sub-Microlitre Electochemiluminescence Detector – A Model for Small Volume Analysis Systeme", A. Arora et al., Analytical Communication, 34, Seiten 393–395, 1997, beschrieben. Dieser Artikel beschreibt auch eine ECL-Erfassungvorrichtung, speziell für den Gebrauch mit kleinen Probenvolumina, wobei die Vorrichtung einen Strömungskanal aufweist, der in einem Acetatblatt eingeschnitten ist, welches zwischen zwei Blöcken aus Poly(methylmethacrylat) oder PMMA sandwichartig aufgenommen ist. Streifen aus Platinfolie sind über dem Strömungskanal mit Hilfe der Sandwichstruktur befestigt für die Verwendung als die Elektroden. Weitere Elektrochemolumineszenzreaktoreinrichtungen sind bekannt aus der WO 96/28538 aus der US 5,093,268 .
Die vorliegende Erfindung stellt eine Elektrochemolumineszenzvorrichtung bereit, welche aufweist: ein Reaktionsgefäß, welches so betreibbar ist, daß es eine leitfähige Lösung enthält, Einrichtungen, die dafür ausgelegt sind, ein elektrisches Feld innerhalb zumindest eines Bereiches des Reaktionsgefäßes zu erzeugen, wenn es eine leitfähige Lösung enthält, und wobei zumindest ein Satz von zwei oder mehr Reaktionselektroden in dem elektrischen Feldbereich des Reaktionsgefäßes angeordnet ist, wobei die Reaktionselektroden des zumindest einen Satzes in dem Reaktionsgefäß voneinander entfernt und durch eine Verbindungseinrichtung, welche nicht die leitfähige Lösung in dem Reaktionsgefäß ist, elektrisch miteinander verbunden sind, wobei die Reaktionselektroden dafür ausgelegt sind, bezüglich der Einrichtung zum Erzeugen des elektrischen Feldes potentialfrei (schwebend) zu sein.
Bei einer Vorrichtung gemäß der Erfindung wird ein neuer Typ von Elektrode in der Elektrochemolumineszenztechnik verwendet, nämlich eine schwebende bzw. potentialfreie Elektrode. Dies hat gegenüber früheren Systemen viele Vorteile. Die erdfreien bzw. potentialfreien Elektroden können elektrisch kurzgeschlossen werden und ihre Verwendung ermöglicht komplexe Elektrodenmuster (wie zum Beispiel ausgedehnte ein-, zwei- oder dreidimensionale Elektrodenanordnungen), die in sehr kleinem physikalischen bzw. räumlichen Maßstab aufgebaut werden können und so ermöglichen, daß die Erfassungsvolumina sehr klein sind, während dennoch verwertbare Lichtemissionswerte bereitgestellt werden.
Mögliche Verwendungen dieser Technik und der Vorrichtung umfassen Immunoassays, DNA-Bindungsassays, Assays auf Rezeptorbasis, zellbasierte Assays, als Detektor in der Flüssigchromatographie, für die Elektrophorese, Elektrochromatographie in der klinischen Diagnose, Umweltanalysen und pharmazeutische und chemische Forschungsanalysen.
Die potentialfreien Elektroden, die oben beschrieben wurden, sind bezüglich der Einrichtungen zur Bereitstellung eines elektrischen Feldes potentialfrei bzw. schwebend (nicht auf definiertem Potential). Vorzugsweise weist die Vorrichtung erste und zweite Versorgungselektroden auf, die mit einer elektrischen Stromversorgung verbindbar sind, wobei die Versorgungselektroden bezüglich des Reaktionsgefäßes relativ zueinander so angeordnet sind, daß ein elektrischer Strom zwischen den Elektroden durch eine leitfähige Lösung in dem Reaktionsgefäß fließen kann, wobei die eine oder mehreren Reaktionselektroden in dem Reaktionsgefäß in einem Stromflußpfad zwischen den Versorgungselektroden angeordnet sind.
Die Reaktionselektroden sind elektrisch schwebend bzw. erdfrei. D. h., sie sind nicht direkt mit den Stromversorgungselektroden verbunden, abgesehen auf dem Weg über ihre Umgebung, wie zum Beispiel eine leitfähige Lösung in dem Gefäß. Die Reaktionselektroden können auch hydrostatisch schwebend bzw. schwimmend sein, könnten bezüglich des Gefäßes befestigt sein oder können unbefestigt sein, jedoch von der Art, daß sie sinken.
Es werden nun Ausführungsformen der Erfindung lediglich anhand von Beispielen beschrieben, und zwar unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen, von denen:
1 eine früher vorgeschlagene, bipolare elektrochemische Strömungszelle veranschaulicht,
2 schematisch eine elektrochemische Strömungszelle gemäß einer Ausführungsform der Erfindung veranschaulicht,
3 schematisch eine betriebsbereite Konfiguration für die Strömungszelle nach 2 zeigt,
4 ein schematischer Querschnitt durch einen Kanal in der Strömungszelle nach 2 ist,
5 ein schematischer Querschnitt durch einen Kanal in einer alternativen Ausführungsform der Strömungszelle nach 2 ist,
6 schematisch den Stromfluß durch die potentialfreien Elektroden in der Strömungszelle nach 2 veranschaulicht,
7 schematisch Kationen- und Anionen-Flüsse in der Strömungszelle nach 2 zeigt,
8 schematisch Stromflüsse i₁ und i₂ durch die Lösung bzw. die Elektroden in der Strömungszelle nach 2 zeigt,
9 schematisch den Vorgang der Oxidation von Ruthenium veranschaulicht, welcher an der Anode erfolgt,
10 schematisch die Konzentration von Ruthenium in der Nernstschen Diffusionsschicht an der Anode zeigt,
11 schematisch einen äquivalenten elektrischen Schaltkreis zeigt,
12 eine Kurve der Spannungsvariation über dem Abstand zwischen den potentialfreien Elektroden ist,
13 eine Kurve der Spannungsvariation gegenüber der Zeit für eine strömende Lösung ist,
14 eine Kurve der Spannungsvariation gegenüber der Zeit für eine nicht-strömende Lösung ist,
15 eine Kurve der Lichtintensität gegenüber der Strömungsrate ist,
16 eine Kurve der Lichtintensität gegenüber einer angelegten Spannung ist,
17 eine schematische Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform ist,
18 eine schematische Seitenansicht einer weiteren Ausführungsform ist,
19a schematisch ein DNA-Bindungsassay in einer direkten Erfassungsanordnung zeigt,
19b schematisch ein DNA-Bindungsassay in einem indirekten Erfassungsformat zeigt,
20 eine Ausführungsform zeigt, welche induktive Erzeugung eines elektrischen Feldes in einem Reaktionsgefäß zeigt.
In der folgenden Beschreibung (wenn auch nicht in den Ansprüchen) soll der Begriff „schwebend" so verstanden werden, daß er bedeutet „hydrostatisch und elektrisch schwebend", es sei denn der Zusammenhang schließt dies eindeutig aus.
In den im folgenden zu beschreibenden Ausführungsformen werden schwebende bzw. erdfreie Platin-(Pt)-Elektroden, welche in einem elektrischen Feld angeordnet sind, verwendet, um die Elektrochemolumineszenz aus der Reaktion von Tris(2,2'-bipyridyl) Ruthenium (II) Dichloridhexahydrat (TBR) und Tripropylamin (TPA) zu erzeugen. Insbesondere wird die Spannung, die erforderlich ist, um Ru²⁺ zu R³⁺ auf der Oberfläche der Arbeitselektrode zu oxidieren, durch Bereitstellung von erdfreien Elektroden in dem Strömungskanal der Lösung und Anlegen einer Gleichspannung zwischen dem Einlaß und dem Auslaß des Kanals bereitgestellt.
Die erdfreien Elektroden können beispielsweise ein loses Stück Metalldraht, Metallpartikel, eine Schicht einer Metallfolie usw., sein. Grundsätzlich existiert die Technik, die erforderlich ist, um einen Gegenstand schwebend zu machen, seit Jahrtausenden so daß es ohne weiteres innerhalb eines standardmäßigen Gestaltungsvorgangs durch einen Fachmann liegt, eine Elektrodenanordnung zu erzeugen, welche in der Lage ist, in einer Flüssigkeit zu schweben bzw. zu schwimmen. Um Zweifel auszuschließen wird man auch erkennen, daß der Begriff „schweben" bzw. „schwimmen" nicht angibt, um wieviel ein Objekt unterhalb der Oberfläche der Flüssigkeit liegt, offensichtlich hängt dies von der Auslegung und der Natur des schwebenden Gegenstandes ab. In der Tat ist es selbstverständlich nicht erforderlich, daß irgendein Teil des Körpers der Elektrode über die Flüssigkeitsoberfläche hervorsteht. Die Elektroden können in der Suspension schweben bzw. schwimmen, in ähnlicher Weise, wie ein Unterseeboot in einer bestimmten Tiefe unter der Oberfläche des Meeres schwimmen kann.
Die Elektroden können aus einem einzelnen Metall oder aus einem anderen elektronischen Leiter hergestellt sein, sie können aus einer Legierung oder einer beschichteten Struktur ausgebildet sein.
Eine PMMA-Strömungszelle mit Pt-Elektroden wurde als ein Prototyp aufgebaut und ist schematisch in 2 wiedergegeben.
Die Strömungszelle ist aus Bahnen aus PMMA 100, 110 gebildet, die sandwichartig zusammengelegt sind (in der Zeichnung sind sie aus Gründen der Klarheit getrennt dargestellt). In eine PMMA-Bahn, die Bahn 100, ist ein Kanal 120 eingraviert.
Ein Lösungseinlaß 130 enthält eine Platin-Elektrode 140, die mit einer Stromversorgung (nicht dargestellt) verbunden ist, und als eine Anode wirkt. In ähnlicher Weise enthält ein Auslaß 150 eine Platin-Elektrode 160, die ebenfalls mit der Stromversorgung verbunden ist und die als eine Kathode wirkt. Ein Probeneinspritzanschluß 170 steht ebenfalls mit dem Kanal in Verbindung und ermöglicht die Injektion von zu testenden Proben.
Zwei schwebende bzw. potentialfreie Platen-Elektroden 180 sind vorgesehen, die entlang des Kanals in einer Strömungsrichtung beabstandet sind. Diese Elektroden sind durch einen Metalldraht (nicht dargestellt) miteinander kurzgeschlossen. Sie können an dem Kanal befestigt oder bezüglich des Kanals lose sein (in anderen Ausführungsformen können sie bezüglich des Kanals fixiert sein, so daß sie zwar elektrisch schweben bzw. potentifrei sind, jedoch nicht hydrostatisch schwebend).
Einige besondere Spezifikationen der PMMA-Strömungszelle sind die folgenden:
Kanallänge zwischen Kathode und Anode: 67 mm
Kanalbreite: 1 mm,
Kanalhöhe: 0,1 mm,
Breite der erdfreien Pt-Elektroden: 1 mm,
Abstand zwischen Pt-Elektroden: 6 mm,
angelegte Spannung: 15–20 Volt,
Lösungen: 10^–4 bis herab zu 10^–3* molares (2,2'-bipyridyl) Ruthenium-(II)-Chlorid und 5 × 10^–3 molares TPA in einem Phosphatpuffer.
3 zeigt schematisch einen betriebsbereiten Aufbau für die Strömungszelle nach 2.
Die Strömungszelle 200 ist in einem lichtdichten, hölzernen Kasten 210 zusammen mit einer Photomultiplierrohre (PMT) 220 enthalten, die mit einem konventionellen Datensammelschaltkreis 230 verbunden ist. Es werden lichtdichte Fluid- und elektrische Verbindungen bereitgestellt.
Die Anode 140 und die Kathode 160 sind mit einer Gleichstromversorgung 240 verbunden. Der Fluideinlaß 130 ist mit einer Quelle von TPA- und TBR-Lösung 250 über einen Silikonschlauch bzw. ein Silikonrohr 260 verbunden. Der Fluidauslaß 150 ist über einen Silikonschlauch 270 mit einer peristaltischen Pumpe 280 verbunden und führt von dort zu einem Abfallauslaß. Der Probeneinspritzanschluß 170 ist über einen Silikonschlauch bzw. ein Silikonrohr 300 mit der Außenseite des Holzkastens verbunden, so daß die in der Untersuchung befindlichen Proben in die Strömungszelle injiziert werden können.
4 ist eine schematische Querschnittsansicht durch den Kanal 120, welche zwei erdfreie Elektroden 180 zeigt, die durch eine elektrische Verbindung 310 miteinander kurzgeschlossen sind. Der Kanal 120 enthält TBR- und TPA-Lösung.
5 veranschaulicht eine alternative Anordnung von vier Elektroden 180, die in wechselnden Paarungen kurzgeschlossen sind.
Der theoretische Hintergrund hinter der Arbeitsweise der Strömungszelle wird nunmehr beschrieben, und es werden dann einige Ergebnisse über die Leistung von Prototypen einiger Ausführungsformen vorgestellt.
Theoretischer Hintergrund
Wenn entlang des Kanals ein Potential U angelegt wird, so ergibt sich ein Strom i durch den Elektrolyten. Die schwebenden Platin-Elektroden bieten lokal einen alternativen Strompfad, was zwei parallele Ströme i₁ (Lösung) und i₂ (Platin-Elektroden) entstehen läßt, wie es schematisch in 6 dargestellt ist.
7 zeigt schematisch die Vorgänge, welche den Stromfluß verursachen. In der Lösung hat man die Summe aller Ströme von Anionen in Richtung der Anode und aller Kationen in Richtung der Kathode. In dem Platin-Elektrodenkurzschluß wird der Strom durch Elektronen getragen.
Faradaysche Vorgänge an den Schnittstellen bzw. Übergängen von Elektrode und Lösung wandeln die elektrischen ionischen Ströme in elektronische Ströme um. 7 zeigt, daß die potentialfreie bzw. schwebende Elektrode, welche der Anode am nächsten liegt, reduziert wird und damit sich wie eine Kathode verhält. Das entgegengesetzte Phänomen tritt an der anderen schwebenden Elektrode auf, was sie zu einer (oxidierenden) Anode macht.
Die Potentialprofile bzw. -verläufe in der Lösung und an den Platin-Elektroden, die sich aus dem Stromtransport ergeben, sind in 8 für einen stationären Zustand dargestellt. In 8 kennzeichnet die mit „x" markierte Achse die Position in Längsrichtung entlang des Lösungskanals, d. h. in einer Richtung parallel zu der Kurzschlußverbindung zwischen den beiden Elektroden. In der Lösung ist der Gradient des Potentials linear aufgrund des gleichförmigen Ohmschen Widerstands der Lösung. Der Strompfad der Elektroden hat einen internen Potentialabfall von im wesentlichen null und steile Gradienten des Potentials an den Grenzflächen mit der Lösung.
Der gesamte Ohmsche Widerstand des Kanals R_Ω [Ω] ist eine Funktion der Ströme aller Ionenarten.
wobei R, T und F ihre übliche Bedeutung haben (R ist die Gaskonstante, T ist die Temperatur und F ist die Faradaysche Konstante), z ist die Ionenladung, c[mol m^–3] die Konzentration der Art, D [m²s^–1] ist die Diffusionskoeffiziente, I [m] die Kanallänge und A [m²] die Querschnittsfläche des Kanals.
In dem Platinmetall und im Kurzschluß ist der Potentialgradient vernachlässigbar. Steile Potentialgradienten existieren jedoch an den Schnittstellen mit der Lösung. Diese Gradienten gehören zu den Überpotentialen η_mz der Masseübertragung und zu den Standardpotentialen E⁰, die für die Faradayschen Reaktionen auftreten.
Wenn wir annehmen, daß i₂ < < i₁. so ist die elektrische Potentialdifferenz zwischen den beiden Pt-Elektroden
wobei I [m] die Kanallänge und d_Pt der Abstand zwischen den Platin-Elektroden ist. Im stationären Zustand gilt: (ηmt + E0)1 + (ηmt + E0)2 = ΔUPt.
An den Schnittstellen zwischen Lösung und Elektroden treten diejenigen Faradayschen Reaktionen auf, für welche die Potentialdifferenz zwischen Elektroden und Lösung ihr Standardpotential E⁰ überschreitet (man beachte, daß das durchschnittliche Potential des Pt gegenüber dem lokalen Potential der Lösung bestimmt wird durch die Chemie der Lösung und irgendwo zwischen etwa +1 und –1 Volt liegt). Mögliche Faradaysche Prozesse an der schwebenden Kathode und der schwebenden Anode in dem System mit entsprechenden Standardpotentialen E⁰ sind:
Anode:
Kathode:
Die Standardpotentiale E⁰ für eine Anzahl möglicher Reaktionen sind schematisch in 9 wiedergegeben. Die für die Rutheniumverbindungen gegebenen Werte gelten für Lösungen in Acetonitril, unter Verwendung einer Ag-Elektrode als Referenz und sie können ein wenig abweichen, wenn sie gegenüber Ag/AgCl ausgedrückt werden.
Man kann erkennen, daß (bei pH = 7) die Oxidation von [Ru(bp)₃]²⁺ bei einem Potential über demjenigen der anodischen Wasserelektrolyse auftritt. Oxidation von Wasser und Sauerstoffproduktion ist jedoch an einer Platin-Elektrode kinetisch langsam und tritt in nennenswertem Maß nur bei Potentialen auf, die höher als die für die Ru-Oxidation. [Ru(bp)₃]³⁺ kann daher bei einer Pt-Elektrode in wäßriger Lösung erzeugt werden.
Die Reduktion von [Ru(bp)₃]²⁺ tritt bei einem solchen negativen Potential auf, daß eine kathodische Wasserelektrolyse (und/oder Sauerstoffreduktion) störend wirkt. Daher werden von den Autoren nicht wäßrige Medien verwendet, die in der kathodische DC ECL oder eine AC-ECL praktisch verwenden.
Da [Ru(bpz)₃]²⁺ ein Reduktionspotential von –0,8 Volt hat, ist es für kathodische DC ECL verwendet worden. Eine solche Verbindung ist mit ihrem hohen Oxidationspotential von 1,9 Volt ungeeignet für wäßrige AC ECL.
Die Überpotentiale der Masseübertragung, η_mt [V] an den Schnittstellen bzw. Grenzflächen der Pt-Elektroden und der Lösung sind keine realen elektrischen Potentialgradienten, sondern elektrische Analoga für Konzentrationsgradienten der Substanzen, die an der Elektrode oxidiert oder reduziert werden. In ähnlicher Weise sind die zugehörigen Widerstände gegenüber der Massenübertragung keine realen elektrischen Widerstände, sondern elektrische Analoga für den Widerstand, den das System einem Massentransport in Richtung der Elektrode bietet.
Um Gleichungen für diese Variablen abzuleiten, kann das vereinfachte schematische Bild der Konzentrationsgradienten an der Anode, welches in 10 dargestellt ist, hilfreich sein. Es verwendet das Konzept der stagnierenden Schicht oder Nernst-Diffusionsschicht. Dieses Konzept vereinfacht Berechnungen für strömende oder aufgerührte Lösungen, indem es das parabolische Popiseullsche Strömungsprofil zu einer stationären Lösungsschicht der Dicke δ an der Wand und an dem Strömungsprofil eines Stopfens bzw. Rechtecks im Zentrum bzw. im Massenbereich vereinfacht. Die Dicke δ wird bestimmt durch die Strömungsgeschwindigkeit oder die Umrührungsrate.
Das Überpotential des Massetransfers kann ausgedrückt werden durch den Konzentrationsunterschied zwischen der Elektrodenoberfläche (x = 0) und dem Hauptteil (*) der elektrochemisch aktiven Art. Beispielsweise für die Oxidation einer Substanz R (Ru(II)) oder TPA) an der Anode erhält man
Das Überpotential wächst demnach mit einer zunehmenden Verarmung der elektroaktiven Substanz an der Elektrodenoberfläche an. Der Widerstand gegen Massenübertragung, R_mt [Ω] für die oxidierte Substanz ist
wobei δ [m] die Dicke der Nernstschicht ist. Der Widerstand gegen Massenübertragung kann daher abgesenkt werden, indem δ abgesenkt wird (höhere Lösungsgeschwindigkeit) oder indem die Hauptkonzentration der oxidierten Substanz erhöht wird. Man beachte, daß der Widerstand über den logarithmischen Term stark zunimmt, wenn die Substanz R an der Elektrodenoberfläche verarmt wird. Der Strom durch das Pt kann aus den obigen Gleichungen abgeleitet werden als:
Der Strom kann erhöht werden durch Absenken von δ und durch Erhöhen der Konzentration im Hauptteil der oxidierten Substanz R.
11 zeigt schematisch einen äquivalenten elektrischen Schaltkreis, welcher den Stromtransport im stationären Zustand beschreibt. R_Ω hängt im allgemeinen nicht von dem Strom ab, während R_mt sehr stark stromabhängig ist. Der maximale (begrenzende) Strom durch die schwebenden Elektroden tritt auf, wenn die Oberflächenkonzentration der Amin- und der Rutheniumverbindungen null ist:
Bei diesem Wert wird eine maximale Menge an Licht erzeugt. Es ist interessant theoretisch zu untersuchen, ob das beschriebene System diesen Strom liefern kann. Hierfür ist eine notwendige Bedingung, daß der Gesamtstrom größer als der begrenzende Strom ist. Der Gesamtstrom i ist gleich:
Der Zustand, daß i > i_lim ist, kann demnach ausgedrückt werden als:
Unter der Annahme des schlechtesten Falls, daß der zweite Term auf der linken Seite gleich 2 ist (wenn nur TPA-Ionen beitragen), erhält man:
Mit U = 20 V, δ = 20 μm, 1 = 76 mm und RT/F = 25 mV ist der Term auf der rechten Seite gleich 0,42. Dies bedeutet, daß in dem vorliegenden System der begrenzende Strom möglicherweise nicht erreicht werden kann. Jedoch ist man auf der relativ sicheren Seite, da egen der Anwesenheit des Phosphatpuffers i höher sein wird und weil ein ansehnlicher Strom alles ist, was man braucht und nicht etwa der begrenzende Strom.
Das Potential der Kathode in dem vorliegenden System wird entweder durch Sauerstoffreduktion oder Wasserreduktion festgelegt. In weiteren Ausführungsformen der Erfindung könnte ihr Potential besser eingestellt werden, indem man eine Untergrundkonzentration eines anderen Oxidationsmittels (wie zum Beispiel tertiäre Amine, aliphatische tertiäre Amine, sekundäre Amine oder primäre Amine in Kombination mit Divinylsulfon) anbietet. Die Kathode wirkt dann wie eine Pseudoreferenzelektrode, gegenüber welcher wir das Potential der Anode exakt festlegen können. n dieser Ausführungsform wird keine Referenzelektrode benötigt.
Wirkung des Abstandes auf die Spannung an der schwebenden Elektrode
Die Spannungsdifferenz zwischen den beiden schwebenden Elektroden ist direkt proportional zu dem Abstand zwischen den beiden gegebenen Elektroden und der am Einlaß und Auslaß des Kanals angelegten Spannung. Die beobachtete Spannung in der folgenden Tabelle stützt dieses Argument. Wenn der Abstand zwischen den beiden hydrostatisch und elektrisch schwebenden Elek troden ansteigt, so steigt die Spannungsdifferenz über diesen schwebenden Elektroden an, bis die schwebenden Elektroden die Elektroden am Auslaß und Einlaß berühren. An diesem Punkt ist die an dem Kanal angelegte Spannung dieselbe wie die Spannung, die an der schwebenden Elektrode angelegt wird und die Elektrode hört auf, elektrisch schwebend bzw. potentialfrei zu sein.
Wenn andererseits der Abstand zwischen den schwebenden Elektroden abnimmt, so nimmt auch die Spannung zwischen diesen Elektroden ab. Wenn diese Elektroden über eine externe Verbindung miteinander verbunden sind, so bewirkt dies einen Kurzschluß in der Lösung und an diesem Punkt verhalten sich die Elektroden in Richtung der Anode wie eine Kathode und die Elektrode, welche der Kathode gegenüberliegt, verhält sich wie eine Anode. Wenn diese beiden Elektroden über ein Strommeßgerät verbunden werden, so können die Stromänderungen gemessen werden, was das Fortschreiten der chemischen Reaktion anzeigt. Dieses Experiment ist mit Prototyp-Ausführungen durchgeführt worden und die Ergebnisse für die drei Abstandswerte (19 mm, 10,5 mm und 6,5 mm) sind in 12 wiedergegeben. Das resultierende Licht wird gemessen, um die Konzentration der lichtaussendenden, markierten Analyten zu erfassen.
Zeitliche Stabilität
In der strömenden Lösung ist die Spannung an der schwebenden Elektrode stabil, weil die Lösung in der Nähe der Elektrode sich konstant verändert und eine Art von Gleichgewicht zwischen den oxidierten und reduzierten Arten gebildet wird, was die Spannungsdifferenz an der schwebenden Elektrode stabilisiert.
In einem Zustand ohne Strömung verändert sich die Konzentration der oxidierten und reduzierten Arten in der Lösung in der Nähe bzw. Umgebung der Elektrode sich im Lauf der Zeit, was wiederum die Spannungsdifferenz zwischen den Elektroden verändert. Auch wenn sich diese Arten aufgrund von Diffusion von den Elektroden fortbewegen, so reicht dies nicht aus, um das Gleichgewicht zwischen den oxidierten und reduzierten Arten zu bilden. Daher ist eine stabile Spannung an den potentialfreien Elektroden nur schwer zu erreichen.
13 zeigt Spannungsänderungen zwischen den schwebenden Elektroden im Laufe der Zeit, wenn die Lösung mit 15 μL pro Sekunde strömt. 14 veranschaulicht Veränderungen in der Spannung zwischen den schwebenden Elektroden im Verlauf der Zeit, wenn die Lösung nicht strömt. Man kann leicht erkennen, daß die Spannung viel stabiler ist, wenn die Lösung strömt, so daß bevorzugte Ausführungsformen eine strömende Lösung verwenden.
Die folgende Tabelle liefert eine Kalibrierungskurve für die Konzentration von TBR:
Die Lichterzeugung auf den Oberflächenelektroden nimmt mit der Strömungsrate der TBR/TPA-Lösung zu. Dies liegt daran, daß die Anzahl der Ionen, die an der Oberfläche der Elektroden vorbeilaufen und oxidiert werden, mit der Strömungsrate zunimmt und auch die höhere Strömungsrate die Spannung an der arbeitenden (schwebenden) Elektrode stabilisiert, indem in der Umgebung das Gleichgewicht gebildet wird. Die für die Prototyp-Ausführungsform erhalten Ergebnisse sind in 15 dargestellt.
16 zeigt die Lichtintensität über der am Einlaß und Auslaß der Strömungszelle angelegten Spannung, die man mit der Prototyp-Ausführungsform erhält.
Weitere mögliche Ausführungsformen werden nunmehr unter anderem unter Bezug auf die 17 und 18 beschrieben.
17 ist eine schematische ebene Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform, in welcher ein zweidimensionales Array von beispielsweise 100 × 100 schwebenden Goldelektroden, die jeweils ein Maß von 50 μm × 50 μm × 50 μm haben, zwischen zwei länglichen Anoden 410 und Kathoden 420 Elektroden angeordnet wird, welche mit einer Stromversorgung verbunden werden. Paare der Elektroden, die in Strömungsrichtung voneinander beabstandet sind, werden miteinander kurzgeschlossen, wie es oben beschrieben wurde.
18 geht hierin noch einen Schritt weiter, und zwar mit einer dreidimensionalen Anordnung 430 von Elektroden, welche in einem seitlichen Aufriß dargestellt sind. Weitere schwebende Elektroden 440 des unter Bezug auf 2 beschriebenen Typs sind ebenfalls vorgesehen.
Im allgemeinen können einzelne Elektroden oder ein-. zwei- oder dreidimensionale Arrays von Elektroden verwendet werden. Die Maße der Elektroden sind nicht begrenzt außer durch das speziell in Gebrauch befindliche Reaktionsgefäß, jedoch sind bevorzugte Grenzwerte 50 nm–1 mm in Richtung des elektrischen Feldes und 50 nm–5 cm in anderen Richtungen.
Das Reaktionsgefäß oder Erfassungsvolumen kann ein Kanal sein, wie es in 2 dargestellt ist, kann eine plattenartige Form haben wie in 17, ein Volumen, welches in der Lage ist, ein 3-D-Array von Elektroden zu umfassen, wie es in 18 dargestellt ist, usw. Im allgemeinen kann irgendein Typ eines Volumens, wie zum Beispiel ein Kanal (insbesondere ein Kanal, der auf einem integrierten Chip bereitgestellt wird), eine Mikroviole, eine Kuvette usw. verwendet werden.
Das extern angelegte elektrische Feld kann ein Gleichstromfeld (wie in 2 dargestellt) sein, könnte jedoch auch ein gepulstes Gleichstrom-(DC) oder Wechselstrom-(AC)-Feld sein (letzteres mit oder ohne DC-Komponente). Eine weitere alternative Ausführungsform, welche eine induktive Erzeugung eines elektrischen Feldes verwendet, wird nachstehend unter Bezug auf 20 beschrieben.
Zumindest einige der Elektroden können mit geeigneten Materialien für die Biosensorik oder chemische Sensorik beschichtet werden, wie zum Beispiel mit Thiol verknüpften Antikörpern, DNA-Sonden oder anderen Molekülen, die auf der Oberfläche der Elektroden immobilisiert werden. (Siehe beispielsweise Ramp M. A. et al., Applied Physics Letters, 1998, 72, Nr. 14, Seiten 1781–1783 und Quin D. et al., Topics in Current Chemistry, 1998, 194, Seiten 1–20). Andere Test- oder Analysemittel können in der Lösung vorgesehen werden, wie zum Beispiel mit Ru markierte Kalibriermittel. Insbesondere kann, wenn eine bekannte Menge eines mit Ru-etikettierten Kalibriermittels zusammen mit einer unbekannten Menge eines Analytenmoleküls bereitgestellt wird und man zuläßt, daß eine Untersuchung der Wettbewerbssituation stattfindet, die Menge des unbekannten Analyten abgeschätzt bzw. beurteilt werden.
Jedes standardmäßige Immunoassay, DNA-Hybridisierungsassay, Assay auf Rezeptorbasis, Enzyminhibitorenassay, Protein-Proteinbindungsassay und viele weitere können durch Ersetzen des fluoreszierenden oder radioaktiven Etiketts, die normalerweise in solchen Prozeduren verwendet werden, durch eine ECL-Markierung bzw. -Etikett, beispielsweise Ru(bpy)₃ oder andere bekannte Verbindungen ausgeführt werden. 19a zeigt schematisch ein DNA-Bindungsassay in einem Direkterfassungsformat, wobei die Sonde DNA 500 unmittelbar an die Metalloberfläche gebunden ist und die erfolgreiche Bindung dazu führt, daß eine Ru-Markierung 510, welche nahe an der Elektrode 520 liegt, Licht aussendet.
Alternativ kann die Bindungsstelle 530 von der Elektrode 540 getrennt, jedoch in der Nähe sein, um eine Erfassung eines eingefangenen (gebundenen) oder freigegebenen Materials von der Bindungsstelle zu ermöglichen (siehe 19b).
Diese Bindungsstellen können in ähnlicher Weise wie die in Fodor S. P. A. et al., Science, 251, Seiten 767–773, (1991) angeordnet werden. DNA- oder andere chemische Objekte können gezielt mit einer oder einigen wenigen Elektroden verbunden werden, um ein großes Array von ähnlichen, jedoch nicht identischen Sonden zu erhalten. Eine gegebene Stelle bzw. Position der Erfassung kennzeichnet ein gegebenen Assay bzw. eine gegebene Untersuchung.
Als ein weiteres Beispiel wird eine Kapillare benutzt, die auf einem ebenen Glassubstrat gebildet wird und normalerweise für eine Elektrophoresetrennung verwendet wird, und zwar mit einem integrierten Metallelektrodenarray, welches über dem Kanal bereitgestellt wird. Eine Lichterfassung kann unter Verwendung einer Kamera durchgeführt werden.
Es ist offensichtlich, daß Merkmale dieser verschiedenen Ausführungsformen miteinander kombiniert werden können, beispielsweise kann eine Verteilung von Elektroden von einer Ausführungsform mit einem Reaktionsgefäß von anderen Ausführungsformen kombiniert werden.

Claims

Elektrochemolumineszenzvorrichtung mit: einem Reaktionsgefäß (120, 200), welches so verwendbar ist, daß es eine leitfähige Lösung enthält, Einrichtungen, die dafür ausgelegt sind, ein elektrisches Feld (20, 30, 620) innerhalb zumindest eines Bereiches des Reaktionsgefäßes zu erzeugen, wenn dieses eine leitfähige Lösung enthält, und wobei zumindest ein Satz von zwei oder mehr Reaktionselektroden (180, 400, 430, 440) in dem Bereich des elektrischen Feldes des Reaktionsgefäßes angeordnet ist, wobei die Reaktionselektroden des zumindest einen Satzes in dem Reaktionsgefäß voneinander beabstandet und durch eine von der leitfähigen Lösung in dem Reaktionsgefäß verschiedene Verbindungseinrichtung elektrisch miteinander verbunden sind, wobei die Reaktionselektroden dafür ausgelegt sind, daß sie bezüglich der Einrichtung zum Erzeugen des elektrischen Feldes elektrisch potentialfrei (floating) sind.
Elektrochemolumineszenzvorrichtung nach Anspruch 1, wobei zumindest einige der Reaktionselektroden derart ausgebildet sind, daß sie in oder auf einer leitfähigen Lösung in dem Reaktionsgefäß hydrostatisch schweben bzw. schwimmen.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, mit ersten und zweiten Versorgungselektroden, die mit einer elektrischen Stromversorgung verbindbar sind, wobei die Versorgungselektroden bezüglich des Reaktionsgefäßes und relativ zueinander derart angeordnet sind, daß ein elektrischer Strom zwischen den Elektroden durch eine leitfähige Lösung in dem Reaktionsgefäß fließen kann, wobei die eine oder die mehreren Reaktionselektroden in dem Reaktionsgefäß in einem Pfad des Sromflusses zwischen den Versorgungselektroden angeordnet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2 mit Einrichtungen zum Erzeugen eines magnetischen Wechselfeldes in dem Reaktionsgefäß, um dadurch ein elektrisches Feld innerhalb eines Bereiches des Reaktionsgefäßes einzuschließen.
Vorrichtung nach Anspruch 4, in welcher die Elektroden durch ein an den Elektroden angebrachtes elektrisch leitfähiges Element elektrisch kurzgeschlossen sind.
Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei das Element ein Draht ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei alle Reaktionselektroden in einer Lösung in dem Reaktionsgefäß hydrostatisch schwebend aufgehängt sind.
Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche mit einem 1-, 2- oder 3-dimensionalen Array von Reaktionselektroden.
Vorrichtung nach Anspruch 8, bei welcher Reaktionselektroden in einem oder mehreren Teilsätzen des Arrays miteinander kurzgeschlossen sind.
Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Elektroden Metallteilchen, metallbeschichtete Teilchen oder leitfähige Polymerteilchen sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei welcher die/jede Elektrode ein Metalldraht ist.
Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Reaktionsgefäß einen Einlaß für die Lösung und einen Auslaß für die Lösung hat, und wobei die Vorrichtung eine Strömungseinrichtung hat, um zu bewirken, daß eine Lösung durch das Reaktionsgefäß von dem Einlaß in Richtung des Auslasses strömt.
Vorrichtung nach Anspruch 12, in welcher die Strömungseinrichtung eine Pumpe aufweist.
Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, in welcher das Reaktionsgefäß ein länglicher Kanal ist.
Vorrichtung nach Anspruch 14, in welcher das Reaktionsgefäß ein elektrophoretischer Wanderungskanal ist.
Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, in welcher die/jede Elektrode mit einer Biosensor- oder chemischen Sensorbeschichtung beschichtet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 16, mit einer Mehrzahl von Elektroden, die als zwei oder mehrere Teilsätze von Elektroden angeordnet sind, wobei jeder Teilsatz von Elektroden mit einem entsprechenden Typ einer Sensorbeschichtung beschichtet ist.
Vorrichtung nach irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, mit einem Photomultiplier-Detektor zum Erfassen optischer Emission aus dem Reaktionsgefäß.
Vorrichtung nach Anspruch 2, in welcher die Stromversorgung eine Gleichstromversorgung ist.
Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, mit ersten und zweiten Versorgungselektroden, die mit einer elektrischen Stromversorgung verbindbar sind, wobei die Versorgungselektroden bezüglich des Reaktionsgefäßes und relativ zueinander derart angeordnet sind, daß ein elektrischer Strom zwischen den Elektroden durch eine leitfähige Lösung in dem Reaktionsgefäß fließen kann, wobei die eine oder mehreren Reaktionselektroden in dem Reaktionsgefäß in einem Pfad des Stromflusses zwischen den Versorgungselektroden angeordnet sind.