DE60026363T2

DE60026363T2 - Elektroforetische trennungsvorrichtung und zugehöriges verwendungsverfahren

Info

Publication number: DE60026363T2
Application number: DE60026363T
Authority: DE
Inventors: Zhao-WuXiamen University Tian; Hua-ShuiXiamen University Lin; Yong-LiangXiamen University Zhou
Original assignee: Xiamen University; INST BIOMEDICAL ENGINEERING IB; INSTITUTE FOR BIOMEDICAL ENGINEERING IBMT
Current assignee: Xiamen University; INST BIOMEDICAL ENGINEERING IB; INSTITUTE FOR BIOMEDICAL ENGINEERING IBMT
Priority date: 2000-10-25
Filing date: 2000-10-25
Publication date: 2006-11-09
Anticipated expiration: 2020-10-26
Also published as: EP1328798B1; US7294247B1; WO2002035223A1; DE60026363D1; EP1328798A1

Description

Fachgebiet
Die Erfindung betrifft eine elektrophoretische Trennvorrichtung, einen Trennkanal mit mindestens einer Einlaß- und einer Auslaßöffnung am Anfang und am Ende des Kanals und einer Elektrode im Bereich der Einlaßöffnung und einer Elektrode im Bereich der Auslaßöffnung umfassend. Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur elektrophoretischen Trennung unter Benutzung der Vorrichtung.
Stand der Technik
Ein Großteil des Fortschrittes in der modernen Medizin, im Umweltschutz sowie in der Materialentwicklung und -herstellung kann den Fortschritten, die in chemisch-analytischen Systemen erzielt wurden, zugeschrieben werden. Diese chemisch-analytischen Systeme ermöglichen die Trennung, Identifizierung, Charakterisierung und Quantifizierung unterschiedlicher chemischer Stoffe bzw. Stoffklassen. Das Trennen der Komponenten eines Probengemisches ist ein Schlüsselprozeß in einem analytischen Verfahren. Die Komponenten, die auf diese Art und Weise getrennt werden, können jede für sich individuell identifiziert und quantifiziert werden.
Die Elektrophorese trennt chemische Komponenten eines Gemisches, das aus diesen Komponenten zusammengesetzt ist, auf der Grundlage der für die Komponenten spezifischen Wanderungsgeschwindigkeit entlang eines Trennweges, wenn ein elektrisches Feld über dem und in Richtung des Trennweges angelegt ist. Eine große Anzahl biologischer oder chemischer Moleküle/Makromoleküle tragen in wäßrigen Lösungen bei einem geeigneten pH-Wert elektrische Ladungen (sie sind elektrisch geladen): Zum Beispiel sind Proteine amphotere Moleküle, wobei ihre Ladung von positiv bis negativ variiert, je nach Art des Proteins und dem Wert des pH. Elektrophoretische Trennverfahren basieren auf unterschiedlichen Beweglichkeiten der einzelnen Komponenten des Probengemisches im Elektrophoresemedium, wenn ein elektrisches Feld angelegt wird. Die elektrophoretische Beweglichkeit jeder einzelnen Komponente wird durch die Geschwindigkeit, welche die jeweilige Komponente in einem vorgegebenen, externen, elektrischen Feld annimmt, beschrieben und entspricht dem Verhältnis, das aus der Ladung der Komponente und seinem Reibungswiderstand gebildet wird. Die Probe wird als eine schmale Zone im Trennweg abgesetzt. Die Wanderung der Komponente wird durch das Anlegen des elektrischen Feldes gestartet. Jede einzelne Komponente wandert gemäß ihrer eigenen spezifischen Geschwindigkeitskonstante entlang des Trennwegs und bildet ein sogenanntes Band. Jedes Band kann durch ein Maximum charakterisiert werden, bei der die Konzentration der jeweiligen Komponente am größten ist, und durch eine Bandbreite, die den Abstand zwischen Meßpunkten auf beiden Seiten des Maximums darstellt, an denen die Konzentration unter einen bestimmten Schwellenwert fällt. Die Breite der Probenzone, die das Resultat der Auftragung der Probe ist, und die nachfolgende Diffusion tragen zu den Breiten der elektrophoretischen Bänder bei.
Im Allgemeinen sind die folgenden Leistungskriterien für elektrophoretische Trennverfahren von Bedeutung.

• Auflösung. Zwei Komponenten werden üblicherweise als getrennt betrachtet, wenn sich ihre Wanderungsabstände stärker unterscheiden als die Summe der Halbwertsbreiten ihrer elektrophoretischen Bänder.
• Nachweisgrenze. Die untere Nachweisgrenze einer Komponente in einer gegebenen Probe nimmt mit der Breite seines separierten Bandes ab. Je schmaler demzufolge das Band ist, desto höher ist die Konzentra tion der getrennten Komponente im Band und desto besser kann ihr Nachweis gelingen.
• Geschwindigkeit und Durchsatz. Der Durchsatz ist proportional zur Anzahl parallel durchgeführter Trennungen, zum Beispiel in einer Anordnung mit mehreren Trennkanälen, und umgekehrt proportional zur Zeit, die für eine Trennung erforderlich ist.
• Nützlichkeit, Umsetzbarkeit und Kosteneffektivität. Die Miniaturisierung der CE (Capillary Electrophoresis = Kapillarelektrophorese), zum Beispiel im Chip-Format, kann diese Kriterien (REF) erfüllen. Diese Kriterien sind für Alltags- und Routineanwendungen („Point-of-Care" und „Point-of-Use") der CE von Bedeutung.

Das Verschmälerung der Bandbreite der getrennten Komponenten trägt wesentlich zur Erfüllung der Kriterien in Bezug auf hohe Auflösung und niedrige Nachweisgrenze bei. Zwei Hauptfaktoren bestimmen die Breite des elektrophoretischen Bandes, die Ausbreitung der aufgetragenen Probenzone und die Verbreiterung derselben aufgrund der Diffusion während der Elektrophorese. Das Volumen der aufgetragenen Probenlösung, das für den Nachweis der betreffenden Komponenten erforderlich ist, bestimmt die Breite der Probenzone. Die meisten in der Praxis verwendeten Proben, zum Beispiel in der Medizin oder in der Umwelt- und Bioprozessüberwachung, sind hinsichtlich der Konzentration begrenzt, das heißt, es handelt sich um Proben, bei denen die Menge der zu analysierenden Komponenten durch ihre Konzentration in der Probe und nicht durch das verfügbare Probenvolumen begrenzt ist.
In der Regel erfordern hochauflösende und empfindliche elektrophoretische Trennungen in konzentrationslimitierten Proben einen (Vor-)konzentrierungsschritt. Eine Aufgabenstellung, die dieser Erfindung zu Grunde liegt, ist die zweckmäßige Realisierung des Konzentrierungsschrittes in einer miniaturisierten Kapillarelektrophoresevorrichtung mit Hilfe eines entsprechenden Verfah rens. Bisher wurden die Konzentrierungsschritte durch Verwendung diskontinuierlicher Elektrophoresemedien im Trennkanal erreicht, zum Beispiel in der Polyacrylamid-Disk-Elektrophorese, in der eine Probe an der Grenze zwischen unterschiedlichen Gelen und Puffern (REF) konzentriert wird. Diskontinuierliche Elektrophoresemedien können in der Kapillarelektrophorese nur durch mühselige und zeitraubende Arbeitsschritte verwirklicht werden, und nur einmal für jede Probe.
Die Kapillarelektrophorese ist eine weit verbreitete, gut etablierte, analytische Trenntechnik für biowissenschaftliche und pharmazeutische Analysen, Umwelt- und Lebensmittelanalysen und andere chemische Analysen. In der Kapillarelektrophorese wird eine Probe in ein Trägermedium durch Injektion eingebracht, in dem die einzelnen Komponenten mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten in einem angelegten elektrischen Feld entlang des Trennweges mit dem Ergebnis wandern, daß die Probe in ihre Komponenten aufgetrennt wird. Die getrennten Komponenten werden in der Regel mit Hilfe eines Detektors erfaßt, der an den Kapillartrennweg angekoppelt ist (zum Beispiel ein optischer Detektor zum Nachweis der Fluoreszenz). Herkömmliche Instrumente zur Hochleistungskapillarelektrophorese (HPCE) sind mit aus der Schmelze gezogenen Silikat-Kapillaren ausgestattet, die einen Innendurchmesser von 25 bis 75 μm und eine Länge von bis zu 1 m aufweisen, wobei elektrische Spannungen von 10 bis 30 kV angelegt werden. Spezielle Oberflächenmodifikationen, wie z.B. Beschichtungen, werden genutzt, um die Trennleistung zu verbessern. Ein typisches Trennverfahren dauert etwa 5 bis 30 Minuten.
Mit mikromechanischen Verfahren hergestellte, miniaturisierte Kapillarelektrophorese-Chips wurden erstmals 1992 vorgestellt (siehe A. Manz, D.J. Harrison, E.M.J. Verpoorte, J.C. Fettinger, A. Paulus, H. Ludi, H.M. Widmer, J. Chromatogr. 593 (1992) S. 253). Trennungen, zum Beispiel von fluoreszierenden Farbstoffen (siehe D.J. Harrison, A. Manz, Z. Fan, H. Ludi, H.M. Widmer, Anal. Chem. 64 (1992) S. 1926; siehe auch S.C. Jacobson, R. Hergenroeder, L.B. Koutny, R.J. Warmack, J.M. Ramsey, Anal. Chem. 66 (1994), S. 1107), von fluoreszenz-markierten Aminosäuren (siehe D.J. Harrison, K. Fluri, K. Seiler, Z. Fan, C.S. Effenhauser, A. Manz, Science 161 (1993) S. 895; C.S. Effenhauser, A. Manz, H.M. Widmer, Anal. Chem. 65 (1993) S. 2637; S.C. Jacobson, R. Hergenroeder, A.W. Moore, J.M. Ramsey, Anal. Chem. 66 (1994) S. 4127) und von Metall-Ionenkomplexen (S.C. Jacobson, A.W. Moore, J.M. Ramsey, Anal. Chem. 67 (1995) S. 2059) haben gezeigt, daß die Trennungsgeschwindigkeit solcher Vorrichtungen um mehr als eine Größenordnung erhöht werden kann. Aus diesem Grunde sind miniaturisierte Kapillarelektrophorese-Chips zur schnellen Analyse biologischer Proben genutzt worden, zum Beispiel zur Trennung von DNA-Restriktionsfragmenten (A.T. Wooley, R.A. Mathies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) S. 11348; S.C. Jacobson, J.M. Ramsey, Anal. Chem. 68 (1996) S. 720), von Fragmenten aus DNA-Sequenzen (A.T. Wooley, R.A. Mathies, Anal. Chem. 67 (1995) S. 3676), von PCR-Produkten (siehe S.C. Jacobson, J.M. Ramsey, Anal. Chem. 68 (1996) S. 720) und von kurzen Oligonukleotiden (C.S. Effenhauser, A. Paulus, A. Manz, H.M. Widmer, Anal. Chem. 66 (1994) S. 2949).
Die Miniaturisierung hat auch die Integration der elektrophoretischen Trennung in Gesamtanalysesysteme (μ-TAS; „Micro Total Analysis Systems" oder in „Labor-auf-dem-Chip"-Lösungen zum Ziel.
Die Miniaturisierung der Kapillarelektrophorese ist nicht nur aus der Sicht einer hohen Trennleistung sondern auch im Hinblick auf Aspekte der Wirtschaftlichkeit, wie z. B. eine kostengünstige Herstellung, die Möglichkeit des Betriebs durch Einsatz von nicht ausgebildetem Personal und die höchst zuverlässige Durchführung des Verfahrens, vielversprechend.
Eine elektrophoretische Trennvorrichtung sowie ein elektrophoretisches Trennverfahren werden in der US-Patentschrift 5,296,114 offenbart. Die Vorrichtung umfaßt einen Trennkanal, der grundsätzlich in Form einer geschlossenen Schleife, zum Beispiel in Form eines Quadrats, konstruiert ist. An jeder Ecke des Quadrats ist mindestens eine Öffnung mit einer Elektrode angebracht. Eine der Trennung zu unterwerfende Probe wird durch eine Zuführöffnung in den Trennkanal eingebracht, der mit einem elektrolytischen Trägermedium gefüllt ist. Die gelöste Probe wandert unter der Wirkung eines elektrischen Feldes durch den Kanal hindurch, der mit den Elektroden, die sich in den Bereichen der Öffnungen befinden, bestückt ist. Die Probe wird durch das elektrische Feld in einzelne Komponenten aufgetrennt. Das elektrische Feld wird im Kanal mit unterschiedlichen Potentialen durch Herstellen einer Verbindung zwischen den Elektroden, die in den Bereichen der Öffnungen positioniert sind, und einer Spannungsquelle erzeugt. Aufgrund der Tatsache, daß der Trennkanal im Quadrat geführt wird, ist eine Anordnung einer Vielzahl von Trennkanälen in enger Packung auf einem Trägersubstrat nicht möglich. S. Park et al. (Analytical Chemistry, Vol. 67, Nr. 5 (1995) S. 911–918) offenbaren eine elektrophoretische Vorrichtung, die einen Trennkanal umfaßt, der in zwei Abschnitte unterteilt ist, die vermittels einer Verbindung, die aus einem festen, ionen-leitenden Material besteht, in Serie aneinander gekoppelt sind.
Zusammenfassend wird festgestellt, daß noch keine miniaturisierte CE-Trennvorrichtung offenbart wurde, die eine schmale Bandbreite der getrennten Komponenten im Falle einer konzentrationslimitierten Probe in angemessener Art und Weise erreicht. Aus diesem Grunde ist dieses die Aufgabe der beschriebenen Erfindung.
Beschreibung der Erfindung
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur schnellen und bequemen, äußerst leistungsfähigen und kostengünstigen elektrophoretischen Trennung in komplexen Proben bereitzustellen. Eine gute Trennleistung soll durch die Verwirklichung der Probenkonzentrierung in einem elektrophoretischen Kanal erreicht werden, der mit einem homogenen Medium gefüllt ist, was zu schmalen elektrophoretischen Bandbreiten führt.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, die Trennvorrichtung mit Hilfe der Chip-Technologie auf Chip-Systemen zu miniaturisieren. Sowohl die Benutzung der Vorrichtung als auch die Handhabung des elektrophoretischen Trennverfahrens sollen einfach und sicher sein.
Die Lösung der Aufgabe wird in Anspruch 1 offenbart, der eine elektrophoretische Trennvorrichtung beschreibt, die auch zum Zwecke der Analyse eingesetzt werden kann. Anspruch 14 umfaßt ein elektrophoretisches Trennverfahren unter Benutzung der erfinderischen Vorrichtung. Merkmale, die die erfinderische Idee von Anspruch 1 und 14 verbessern, werden sowohl in den abhängigen Ansprüchen als auch in der gesamten Offenbarung mit Bezug auf die Ausführungsformen beschrieben, die in den Zeichnungen dargestellt sind.
Eine erfinderische elektrophoretische Trennvorrichtung, beispielhaft einen Trennkanal mit mindestens einer Einlaß- und einer Auslaßöffnung am Anfang und am Ende des Kanals und einer Elektrode im Bereich der Einlaßöftnung und einer Elektrode im Bereich der Auslassöffnung umfassend, ist dadurch gekennzeichnet, daß der besagte Trennkanal in mindestens zwei Abschnitte unterteilt ist, die in Serie über ein Verbindungsglied miteinander gekoppelt sind. Dieses Verbindungsglied stellt zugleich ein elektrisches Verbindungsmittel bereit, das aus einem festen, ionenleitenden Material besteht, das den besagten Kanal von einem Reservoir trennt, das seitlich neben dem Kanal angeordnet ist und eine Elektrode bereithält.
Das Problem einer geringen elektrophoretischen Trennleistung wird im Falle konzentrationslimitierter Proben, insbesondere bei Anwendung der miniaturisierten CE, durch die Erfindung übewrunden, die ein diskontinuierliches elektrisches Feld in der Richtung des Trennkanals erzeugen kann, der mit einem homogenen Medium gefüllt ist. Der Elektrophoresekanal besteht aus mehreren, mindestens aus zwei Kanalabschnitten (n ≥ 2), die mit n – 1 Verbindungsgliedern zwischen n Kanalabschnitten in Serie angeordnet sind. Um unterschiedliche elektrische Felder in den aufeinander folgenden Kanalab schnitten zu erzeugen, werden Elektroden im Bereich der Verbindungsglieder angebracht. Um Störungen durch elektrochemische Reaktionsprodukte und durch Gasblasenbildung im Trennkanal zu vermeiden, werden diese Elektroden durch Einführen eines festen, ionen-leitenden Materials, das eine Membran zwischen dem Elektrophoresekanal und einer Phiole bildet, die seitlich neben dem Kanal angebracht ist, vom Elektropohresekanal getrennt. Jede Phiole wird mit einer Elektrode bestückt und mit einem geeigneten Elektrolyt gefüllt. Nach dem Anschluß der Elektroden, die sich in der Phiole befinden, an eine Gleichstromspannungsversorgung können die Puffer-Ionen des Elektrolyten durch die ionen-leitende Membran hindurch zwischen dem Medium der Phiole und dem Medium des Trennkanals ausgetauscht werden. Durch die Wahl einer geeigneten Membran wird die Passage von Ionen, die aus der zu analysierenden Probe stammen, aufgrund der Selektivität der Membran verhindert. Folglich wird eine nur ionische Verbindung am Verbindungsglied des Trennkanals sichergestellt.
Das Trennverfahren wird in mehreren Schritten durchgeführt. Vor Beginn der Trennung der komplexen Probengemische wird die Probe durch Injektion vollständig in den ersten Kanalabschnitt eingebracht, wo sich eine breite Probenzone ausbilden kann, deren Bandbreite im idealen Fall die Länge des gesamten ersten Kanalabschnittes einnehmen kann, das heißt, den Zwischenraum von der Einlaßöffnung bis zum ersten Verbindungsglied. Der zweite Abschnitt des Trennkanals, der auf den ersten Kanalabschnitt folgt, beschreibt den Verlauf des Trennkanals vom ersten Verbindungsglied bis zur Auslaßöffnung, falls nur zwei Kanalabschnitte vorhanden sind. Anderenfalls gibt es mehrere Verbindungsglieder im Verlauf des Trennkanals.
Im ersten Schritt oder in der Anfangsperiode werden über dem ersten und dem zweiten Kanalabschnitt unterschiedliche elektrische Felder angelegt. Alle Komponenten des Probengemisches wandern vom ersten Abschnitt in den zweiten Abschnitt hinein, wobei sie das Verbindungsglied passieren. Da das Verhältnis, das durch Division des über dem ersten Kanalabschnitt angelegten elektrischen Feldes mit dem über dem zweiten Kanalabschnitt angelegten Feld gebildet wird, eine Zahl R1 ergibt, die größer als 1 ist, wird die Bandbreite jeder Komponente zusammengeschoben und folglich bei Vorliegen des gleichen Verhältnisses R1 konzentriert. Die Trennung unterschiedlicher Komponenten erfolgt gemäß den Unterschieden in der elektrophoretischen Beweglichkeit, und, insbesondere im Falle der erfindungsgemäßen Vorrichtung, gemäß der unterschiedlichen Beweglichkeit jeder Spezies im jeweiligen Kanalabschnitt. Der erste Schritt oder die Startperiode wird beendet, wenn die gesamte Probenzone vom ersten Kanalabschnitt in den zweiten Kanalabschnitt hineingewandert ist.
Im zweiten Zeitabschnitt werden alle Spezies vom elektrischen Feld angetrieben und bewegen sich vom zweiten Kanalabschnitt in einen dritten Kanalabschnitt, wobei diese durch ein zweites Verbindungsglied hindurchtreten. Da das Verhältnis, das durch Division des elektrischen Feldes im zweiten Kanalabschnitt mit dem elektrischen Feld des dritten Kanalabschnittes gebildet wird, eine Zahl R2 (im Allgemeinen kleiner als R1) ist, die größer als 1 ist, wird die Länge der Bandenzone einer jeden Spezies im Allgemeinen zusammengeschoben und erneut durch das Verhältnis R2 konzentriert, wobei eine weitere Auftrennung in unterschiedliche Spezies erfolgt. Der zweite Zeitabschnitt ist beendet, wenn sich die gesamte Probenzone vom zweiten Abschnitt in den dritten Kanalabschnitt hineinbewegt hat. Es wird darauf hingewiesen, daß die elektrischen Felder in jedem Kanalabschnitt von Zeitabschnitt zu Zeitabschnitt und von Kanalabschnitt zu Kanalabschnitt variiert werden können.
Für die Analyse von komplexeren Systemen können weitere Kanalabschnitte und Zeitabschnitte eingerichtet werden, die den vorher genannten Zeitabschnitten ähnlich sind, um gegebenenfalls eine verbesserte Auflösung zu erhalten und die Grenze der nachweisbaren Konzentration herabzusetzen.
Am Ende der Elektrophorese werden die elektrischen Felder abgeschaltet, und es wird ein Bild des Trennmusters (Bandenmuster) von einer CCD-Kamera unverzüglich aufgenommen und in einem Computer ausgewertet. Alternativ kann eine zeitabhängige Überwachung der Elektrophorese durch optisches Aufzeichnen an einem oder vielen Punkten des Trennkanals ausgeführt werden.
Kurzoffenbarung der Zeichnungen
Die Erfindung wird ohne Einschränkung der allgemeinen erfinderischen Idee mit Bezug auf die Ausführungsformen beschrieben, die in den folgenden Zeichnungen dargestellt sind:
1 Schematische Darstellung einer elektrophoretischen Trennvorrichtung,
2a–d Teilansichten einer miniaturisierten elektrophoretischen
Trennvorrichtung und
3a,b,c Zeichnungen, welche die Ausführungsformen unterschiedlicher Verbindungsglieder zeigen.
Ausführungsformen der Erfindung
In 1 ist eine elektrophoretische Trennvorrichtung C dargestellt, die mit dem Elektrophoresekanal Ch ausgestattet ist, der aus mehreren in Serie angeordneten Abschnitten S_n (zum Beispiel n = 3 oder 4) besteht, die wiederum über n – 1 Verbindungsglieder J_n–1, die zwischen n Abschnitten eingebaut sind, in Verbindung stehen. Der einteilige Kanal wird vorteilhafterweise mit der Einlaß- und Auslaßöffnung 1 bzw. 2, die sich an den Enden befinden, ausgestattet. Eine aufzutrennende Probe wird durch eine Zuführöffnung (die zum Beispiel mit dem Einlaß (1) identisch ist) in ein elektrophoretisches Trägermedium injiziert. In den Kanalabschnitten werden mit Hilfe der Elektroden, die im Bereich der Einlaß- und Auslaßöffnungen und an den Verbindungsgliedern zwischen den Kanalabschnitten angebracht sind, unterschiedliche elektrische Felder erzeugt.
Um elektrochemische Reaktionen und Gasblasenbildung im Trennkanal Ch zu verhindern, werden die elektrischen Felder im Kanal dadurch erzeugt, daß unter Verwendung ionen-leitender Materialien 3, die zum Beispiel als eine Membran zwischen dem Kanal Ch und einem Behälter 4, der neben dem Kanal positioniert ist, ausgebildet sind, besagte Behälter mit einer Elektrode 5 bestückt sind, die mit Hilfe von Verbindungsleitungen 6 direkt mit Spannungsquellen verbunden werden können und mit einem geeigneten Elektrolyten als Quelle für Ionen gefüllt sind, wobei ein Austausch der Ionen mit den Puffer-Ionen im Elektrophoresekanal möglich ist. Die Trennung der Spezies und die Verschmälerung und Verdichtung der Probenzonen finden aufgrund der unterschiedlichen Beweglichkeiten der Spezies in den aufeinanderfolgenden Kanalabschnitten statt, in denen unterschiedliche elektrische Felder induziert wurden. Es ist der Zweck der Erfindung, ein leistungsfähiges Elektrophoreseverfahren für die Hochleistungskapillarelektrophorese (HPCE) bereitzustellen, das die besonderen Vorzüge von auf chip-basierten Systemen (zum Beispiel Geschwindigkeit, niedrige Betriebsspannung) mit einer verbesserten Trennschärfe, Nachweisgrenze und kostengünstigen Herstellung kombiniert.
Zur Herstellung eines Elektrophorese-Chips, der auf der erfinderischen Idee basiert, werden Elektrophoresekapillaren Ch mit Hilfe mikrotechnischer Verfahren, z. B. unter Anwendung von Ätztechnologien oder Mikroform/Heißprägeverfahren, in einen Basiskörper B (Wafer) aus Glas, z. B. aus einem Pyrex-Wafer, aus SiO₂ oder Polymer, wie z. B. PMMA, PC usw., bestehend, hineingearbeitet (siehe 2a). In einem Abdeckteil L (siehe 2b) werden elektrolytführende Kapillaren E mit mikromechanischen Methoden hergestellt, die senkrecht zu den Elektrophoresekapillaren Ch im Basiskörper (Wafer) angeordnet sind. Außerdem sind Einlaß- und Auslaßöffnungen als Bohrungen im Abdeckteil E sowohl an den Enden der Elektrolytkapillaren O als auch an den Positionen S, die mit den Enden der Elektrophoresekanäle zusammenpassen, sobald beide Teile, nämlich die Abdeckung L und der Basiskörper zusammengefügt werden, hergestellt (siehe 2c). Die ionen-leitende Membran M, z. B. eine Polymer-Membran, die zur Trennung der in Form von Kapillaren ausgebildeten Elektrophoresebahn von den Elektrolyt enthaltenden Phiolen notwendig ist, wird sandwich-artig durch Klemmen, Kleben oder andere Verbindungsverfahren zwischen dem Basiskörper B und der Abdeckung L angebracht (siehe 2d). Schließlich werden die Elektrophoresekanäle durch Einschneiden eines Loches in die ionen-leitende Membran geöffnet. Die Elektrophoresekanäle werden mit einem Elektrophoresemedium und der Elektrolytkanal mit einem entsprechenden Elektrolyt gefüllt.
Zum Betrieb wird der Chip in das Elektrophoresesystem eingebracht, in dem Elektroden (zum Beispiel aus Platin) durch die Elektrodenöffnungen in die Behälter mit Elektrolytmedium hineingetaucht werden. Schläuche, zum Beispiel zur Probeninjektion und zur Abfallentsorgung, werden mit den Einlaß- und Auslaßöffnungen des Elektrophorese-Chips verbunden.
Um unterschiedliche elektrische Ströme und elektrische Felder in den aufeinanderfolgenden Abschnitten zu generieren, müssen elektrische Ströme an den Verbindungsgliedern fließen. Um Störungen durch elektrochemische Reaktionsprodukte und Gasblasenbildung im Trennkanal zu vermeiden, werden diese elektrischen Verbindungen durch Einführen eines festen, ionen-leitenden Materials in Form einer Membran zwischen dem Elektrophoresekanal und jeder Phiole, die neben dem Kanal von diesem getrennt angeordnet ist, hergestellt. Diese Phiolen werden mit Elektroden versehen und mit einem geeigneten Elektrolyten gefüllt. Durch Verbinden der in den Phiolen befindlichen Elektroden mit einer Gleichstrom-Spannungsquelle kann der Ionen-Austausch zwischen der Phiole und dem Trennkanal durch Passieren des selektiv durchlässigen Materials am Verbindungsglied stattfinden. Auf diese Weise wird eine elektrische und nur ionische Verbindung am Verbindungsglied geschaffen. Die Länge der Verbindungsglieder in axialer Richtung entlang der Kanalrichtung ist kürzer (im Allgemeinen viel kürzer) als diejenige der Kanalabschnitte.
Ein Teil der nicht leitenden Wand des Kanals wird am Verbindungsglied durch ein ionen-leitendes Material ersetzt, um eine elektrische und nur ionische Verbindung zwischen dem Kanal und der Phiole sicherzustellen.
Die Form des elektrophoretischen Mediums auf der Innenseite der Wand des Kanals ist üblicherweise in jedem Kanalabschnitt ein langer Zylinder. Die Form der Schnittstelle zwischen dem Ionen-Leiter und dem elektrophoretischen Medium am Verbindungsglied sollte üblicherweise einen glatten Übergang der zylindrisch geformten, elektrophoretischen Medien in die aufeinander folgenden Kanalabschnitte erlauben. Die Form der Schnittstelle zwischen dem Ionen-Leiter und dem elektrophoretischen Medium am Verbindungsglied könnte in der Umgebung des elektrophoretischen Mediums einem Viereck oder einem kreisförmigen Ring, wie in 3a dargestellt (oder einigen Teilen eines Ringes (3b und 3c)), entsprechen.
Die obere linke Skizze stellt eine Draufsicht, die obere rechte Skizze eine Seitenansicht eines CE-Chips dar, wie in 2 dargestellt, jedoch mit dem Unterschied, daß er mehrere ionen-leitende Membranen M aufweist, welche die Elektrophoresekapillaren Ch senkrecht zu ihren Ausbreitungsrichtungen durchqueren. Eine Übersicht zeigt in 3a die Art der Anordnung der Membran M innerhalb des CE-Chips. An jeder Verbindungsstelle J_n umgibt die Membran M die Elektrophoresekapillare Ch vollständig und ist mit einer Phiole oder einem Elektrolytbehälter 4 verbunden.
In alternativen Ausführungsformen, die in den 3b und 3c dargestellt sind, ist die Membran M mit dem Kanal Ch nur nach Art eines Teils eines Ringes verbunden. 3b stellt eine Elektrophoresekapillare Ch dar, die durch einen Ionen-Leiter M in Form eines kleinen Kanals mit mehreren Elektrolytbehältern 4 verbunden ist.
3c zeigt in mehreren Skizzen die Ausgestaltung des Verbindungsprinzips, das in 3b entsprechend einer Realisierung auf einem CE-Chip dargestellt ist. Die Referenzzahlen, die in 3c angegeben sind, entsprechen den Referenzzahlen, die in allen zuvor beschriebenen Figuren verwendet wurden.
Die vorstehend beschriebene Erfindung ermöglicht bei geringen Kosten eine bessere Leistung im Hinblick auf elektrophoretische Anforderungen. Die Vorrichtung ist geradezu für die Routine-Analytik (Point-of-Use-Analytik) und die Vor-Ort-Diagnostik (Point-of-Care-Diagnostik) ausgelegt, wodurch sich kostengünstige Hochleistungskapillarelektrophorese-Vorrichtungen auszeichnen, die Einweg-Chips oder wiederverwendbare Elektrophoresechips, zum Beispiel als ein integriertes Steckmodul eines generell einsetzbaren Elektrophoresesystems, welches eine Handhabung von Fluiden, die Trennung, den Nachweis, den Datenabruf und die Dateninterpretation beinhaltet, einschließen.
Mögliche Anwendungen betreffen die Serumelektrophorese in Krankenhauslaboratorien und in allgemeinärztlichen Laboratorien zur Unterstützung einer schnellen Diagnose (Vor-Ort-Diagnose) oder den DNA-Fingerabdruck zur schnellen und zuverlässigen Überführung von Verdächtigen auf dem Gebiet der forensischen Medizin (Routine-Analytik). Die Umwelt und Biotechnologie betreffende Prozeßüberwachung sind andere Anwendungsgebiete von Feldanwendungen der Elektrophoreseanalysen.
Geringen Herstellungskosten, die beim Einsatz von Einweg-CE-Chips erwünscht sind, kommt die Mikrosystemtechnologie in Kombination mit alternativen Materialien, wie Polymeren, entgegen. Die hohe Trennleistung derartiger preiswerter Vorrichtungen wird durch das vorgestellte, neuartige Elektrophoreseverfahren sichergestellt, das sich durch seine Einfachheit und durch die Nutzbarmachung der besonderen Vorteile auszeichnet, die von chip-basierten Systemen bereitgestellt werden.

1: Einlaßöffnung
2: Auslaßöffnung
3: Membran, ionen-leitendes Material
4: Behälter, Phiole
5: Elektrode
6: Verbindungsglied
S_n: Abschnitt
J_n: Verbindungsglied
C: Trennvorrichtung
Ch: Kanal
L: Abdeckung
B: Basiskörper
E: Kapillare
M: Membran

Claims

Eine elektrophoretische Trennvorrichtung, umfassend einen Trennkanal (Ch) mit mindestens einer Einlaß- und einer Auslaßöffnung am Anfang und am Ende des Kanals und einer Elektrode im Bereich der Einlaßöffnung und einer Elektrode im Bereich der Auslaßöffnung, wobei der Trennkanal in mindestens zwei Abschnitte (S_n) unterteilt ist, die durch ein Verbindungsglied (J_n) miteinander in Serie gekoppelt sind, das ein elektrisches Verbindungsmittel bereitstellt, wobei das Verbindungsglied aus einem festen, ionen-leitenden Material besteht, das den Kanal von einem Behälter trennt, der neben dem Kanal getrennt angeordnet und mit einer Elektrode ausgestattet ist, und wobei das ionen-leitende Material eine rein ionische Verbindung zwischen dem Trennkanal und dem Behälter bereitstellt, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden sowohl an den Einlaß- als auch den Auslaßöffnungen sowie am Verbindungsglied mit einer Spannungsquelle derart verbunden sind, daß entlang den Kanalabschnitten unterschiedliche elektrische Felder zur Trennung aufgebaut werden können.
Die elektrophoretische Trennvorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Trennkanal neben den Einlaß- und den Auslaßöffnungen an der Verbindungsstelle zusätzliche Öffnungen zum Einführen des ionen-leitenden Materials bereitstellt.
Die elektrophoretische Trennvorrichtung nach Anspruch 2, wobei das feste, ionen-leitende Material eine Membran darstellt.
Die elektrophoretische Trennvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Trennkanal wie eine Kapillare ausgebildet ist, die einen Ka pillardurchmesser im Bereich von 0,1 μm bis 1 mm und eine Länge von 5 mm bis 200 mm aufweist.
Die elektrophoretische Trennvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Trennkanal Kanalwände aufweist, die innen mit einem Polymer-Dünnfilm oder einem adsorbierten Film beschichtet sind.
Die elektrophoretische Trennvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Trennkanal mit einem Elektrophoresemedium gefüllt ist oder gefüllt werden kann, das eine Flüssigkeit oder ein Gel darstellt.
Die elektrophoretische Trennvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der besagte Behälter eine Phiole ist, die getrennt neben dem Kanal angeordnet und mit einer Elektrode ausgestattet ist.
Die elektrophoretische Trennvorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Phiole mit einem Elektrolyten als Quelle für Ionen gefüllt ist oder gefüllt werden kann, die mit Ionen des Elektrophoresemediums im Kanal austauschbar sind.
Die elektrophoretische Trennvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Spannungsquellen Gleichspannungsquellen sind.
Die elektrophoretische Trennvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die elektrophoretische Trennvorrichtung miniaturisiert ist und mindestens zwei Teile umfaßt, einen Basiskörper und eine Abdeckung, wobei der Baskörper mindestens einen Trennkanal in Form einer Elektrophoresekapillare enthält und die Abdeckung die Einlaß- und Auslaßöffnung und mindestens einen Behälter trägt.
Die elektrophoretische Trennvorrichtung nach Anspruch 10, wobei das ionen-leitende Material zwischen der Abdeckung und dem Basiskörper geklemmt ist und die Elektrophoresekapillare vom Behälter trennt.
Die elektrophoretische Trennvorrichtung nach Anspruch 10 und 11, wobei der Basiskörper und die Abdeckung sowie das leitende Material wie ein CE-Chip angeordnet und durch Kleben, Klemmen oder Verbinden zusammengefügt sind.
Die elektrophoretische Trennvorrichtung nach Anspruch 1 bis 12, wobei zahlreiche Trennkanäle parallel in Form einer Anordnung angeordnet sind.
Verfahren zur elektrophoretischen Trennung einer Probe unter Benutzung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, umfassend die folgenden Schritte: – Injektion einer Probe durch die Einlaßöffnung in den ersten Abschnitt des Trennkanals, der mit einem Elektrophoresemedium gefüllt ist, – Trennen der Probe entlang des Trennkanals durch Anlegen unterschiedlicher elektrischer Felder in den Abschnitten, um zu bewirken, daß die Bestandteile der Probe durch den Trennkanal wandern.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Probe ein komplexes Substanzgemisch in flüssiger Form ist und nach der Injektion den gesamten oder fast den gesamten ersten Abschnitt ausfüllt.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei die Trennung durch Anlegen elektrischer Felder nur in den jeweiligen Abschnitten des Trennkanals in einem oder mehreren Zeiträumen ausgeführt wird, um zu bewirken, daß die Bestandteile der Probe von einem Abschnitt in den nächsten wandern.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei ein Zeitraum dann beendet wird, wenn der betreffende, am langsamsten wandernde Probenbwestandteil (μ_T) nach Passieren des jeweiligen Verbindungsgliedes in den nächsten Abschnitt eingetreten ist oder wenn der betreffende, am schnellsten wandernde Bestandteil (μ_L) das Ende des nächsten Abschnittes erreicht hat.
Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei während eines ersten Trennzeitraums das Verhältnis zwischen den elektrischen Feldern E₁ und E₂ in den Abschnitten 1 und 2 eine Zahl R₁ ist, die nicht kleiner als 1 ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei während der folgenden Trennzeiträume das Verhältnis zwischen den elektrischen Feldern E_n und E_n+1 in den Abschnitten n und n + 1 eine Zahl R_n ist, die nicht kleiner als 1 ist.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei die Trennung kontinuierlich ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 14 und 19, wobei die elektrischen Felder E_n in den aufeinander folgenden Abschnitten n entlang des Trennkanals angelegt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 21, wobei das Trennmuster optisch aufgezeichnet wird.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Trennergebnis durch Aufzeichnen einer optischen „Momentaufnahme" des Trennmusters erfaßt wird.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Trennergebnis durch kontinuierlich zeitabhängiges, optisches Überwachen an einem oder an mehreren Punkten des Trennkanals aufgezeichnet wird.