DE68922576T2 - Vorrichtung zur Kapillartrennung mit einer nach der Trennung durch ein elektrisches Feld unterstützten Mischung. - Google Patents
Vorrichtung zur Kapillartrennung mit einer nach der Trennung durch ein elektrisches Feld unterstützten Mischung.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf chemische Analysesysteme und insbesondere auf ein analytisches Gerät, bei dem Probenkomponenten durch eine differenzielle elektrokinetische Wanderung durch eine Kapillare mit schmalem Durchmesser getrennt werden. Eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Mischung der Probe mit einem anderen Fluid nach der Trennung zu schaffen, um die Identifizierung und Quantifizierung der getrennten Probenkomponenten zu unterstützen. Ein veranschaulichendes Beispiel ist die Zugabe eines fluorogenen markierenden Reagens zu getrennten Proteinkomponenten nach der Trennung und vor der Fluoreszenz-Erfassung.
- Chemische Analysen komplexer organischer Strukturen machten in der Biotechnologie bemerkenswerte Fortschritte möglich. Die Biotechnologie schaffte Techniken zum Herstellen lebenserhaltender Arzneien und anderer Produkte, die andernfalls knapp wären, wenn auf natürliche Quellen zurückgegriffen werden müßte. Außerdem sind vollständig neue medizinische Produkte in Entwicklung, die bisher nicht zu behandelnde Krankheiten aufhalten und heilen können. Die Biotechnologie verspricht neue Produkte für die Landwirtschaft, die die sich ausdehnenden Bevölkerungen der Welt sättigen werden und die die Fähigkeit der für Hungersnöte anfälligen Länder verbessern werden, sich selbst zu ernähren.
- Die chemische Analyse biologischer Proben schließt im allgemeinen die Trennung der Proben in Komponenten zur Identifizierung und zur Quantifizierung ein. Die Kapillarzonenelektrophorese (CZE) ist eines einer Klasse von Verfahren, bei denen die verschiedenen Komponenten in einer Kapillare schmalen Durchmessers mit jeweiligen und verschiedenen Raten derart bewegt werden, daß die Komponenten in unterschiedliche Zonen geteilt werden. Die unterschiedlichen Zonen können in der Kapillare oder außerhalb der Kapillare untersucht werden, indem es ermöglicht wird, daß die Komponenten für eine sequenzielle Erfassung aus der Kapillare heraustreten.
- Bei der CZE wird eine Probe an einem Eingangsende einer sich longitudinal erstreckenden Kapillare eingeführt und zu einem Ausgangsende bewegt. Elektroden unterschiedlichen Potentials an jedem Ende der Kapillare erzeugen die elektrischen Kräfte, die die Probenkomponenten zu dem Ausgangsende der Kapillare bewegen. Diese Bewegung schließt zwei unterschiedliche Komponenten ein, eine aufgrund des elektro-osmotischen Flusses und die andere aufgrund der elektrophoretischen Wanderung.
- Der elektro-osmotische Fluß ist eine Folge der Ladungsakkumulation an der Oberfläche der Kapillare aufgrund der bevorzugten Adsorption von Anionen von der Elektrolyt-Lösung, die den Durchmesser der Kapillare füllt. Die negative Ladung der Anionen ziehen eine dünne Schicht von beweglichen positiv geladenen Elektrolyt-Ionen an, die sich angrenzend an die innere Oberfläche akkumulieren. Das sich longitudinal erstreckende elektrische Feld, das zwischen den Enden der Kapillare mittels der Elektroden angelegt ist, zieht diese positiven Ionen an, so daß sie zu der negativen Elektrode am Ausgangsende der Kapillare bewegt werden. Diese positiven Ionen, hydriert durch Wasser, reißen viskos andere hydrierte Moleküle nicht in der Nähe dieser inneren Wand mit, selbst solche mit neutraler oder negativer Nettoladung. Das Ergebnis ist ein Massenfluß der Probe und der enthaltenen Elektrolytlösung zu dem Ausgangsende der Kapillare hin. Folglich liefert der elektro-osmotische Fluß einen Mechanismus, durch den neutrale und negativ geladene, ebenso wie positiv geladene Moleküle zu einer negativen Elektrode hin bewegt werden können. Typischerweise besitzt eine CZE-Kapillare einen Bohrungsdurchmesser von weniger als 200 um und vorzugsweise von weniger als 100 um, um sicherzustellen, daß die äußeren Moleküle ausreichend mit zentraleren Molekülen in Wechselwirkung treten, um einen elektro-osmotischen Fluß zu bewirken, der über den Querschnitt der Kapillare ziemlich gleichförmig ist.
- Diesem elektro-osmotischem Fluß überlagert ist die bekannte Bewegung geladener Partikel als Reaktion auf ein elektrisches Feld, die gewöhnlich als elektrophoretische Wanderung bezeichnet wird. Die Elektrolytlösung wirkt als das Medium, das es ermöglicht, daß sich das elektrische Feld zwischen den Elektroden durch die Kapillare erstreckt. Positiv geladene Moleküle wandern schneller zu der negativen Elektrode als der mittlere Fluß aufgrund des elektro-osmotischen Flusses. Negativ geladene Moleküle werden von der negativen Elektrode abgestoßen, jedoch wird diese Abstoßung durch den elektro-osmotischen Fluß mehr als kompensiert. Somit bewegen sich auch negativ geladene Probenmoleküle zu der negativen Elektrode, wenn auch langsamer als die positiv geladenen Moleküle. Die neutralen Moleküle bewegen sich mit einer Zwischengeschwindigkeit zu der negativen Elektrode, geregelt von dem elektro-osmotischen Fluß.
- Nach einer ausreichend langen Wanderung durch die Trennkapillare trennen sich die verschiedenen Probenkomponenten aufgrund der differenziellen Bewegungsgeschwindigkeiten als eine Funktion der Spezies-spezifischen Ladung in Bänder oder Zonen. Ein geeignet ausgewählter und angeordneter Detektor kann diese Zonen der Reihe nach erfassen, wenn sie denselben passieren. Die Komponenten können durch die Zeit der Erfassung identifiziert und durch die entsprechende Erfassungsspitzen-Höhe und/die -Fläche quantifiziert werden. In einigen Fällen können die Bänder in getrennten Behältern für einen abgesonderten Identifizierungs- und/oder Quantifizierungs-Prozeß gesammelt werden.
- Es gibt mehrere Typen von Detektoren, die verwendet werden, um Proteine in Kapillartrennungssystemen zu erfassen. Ultraviolett-Absorptions-Detektoren (UV) sind unter den gebräuchlichsten. Andere elektro-magnetische Absorptionsdetektoren könnten verwendet werden. Zusätzlich wurden Chemolumineszenz-, Brechungsindex- und Leitfähigkeits-Detektoren verwendet. Allen diesen Verfahren fehlt die Empfindlichkeit, die erforderlich ist, um viele Spitzen bei der CZE-Protein-Analyse zu erfassen. Eine hohe Empfindlichkeit ist erforderlich, da die Menge der Gesamtprobe begrenzt ist, und der Detektor in der Lage sein muß, Komponenten zu erfassen, die nur einen Bruchteil der Gesamtprobe ausmachen. Begrenzungen der Probenmenge stammen von der Anforderung, daß die Probe in einem Elektrolyt aufgelöst sein muß und daß die Konzentration der Probe gering genug sein muß, um eine Störung des elektrischen Feldes zu vermeiden, die zu einer Verzerrung der getrennten Komponentenzonen führen würde. Die Probenmenge ist ferner durch den Durchmesser der Kapillarbohrung und durch die Notwendigkeit des Begrenzens der Probe anfänglich auf ein relativ kurzes longitudinales Ausmaß begrenzt. Das anfängliche Probenausmaß regelt die minimale Zonenbreite und somit die Fähigkeit des Systems, ähnlich geladene Probenkomponenten aufzulösen.
- Der Detektor muß in der Lage sein, kleine Menge der Komponente in jeder Probenzone zu erfassen. Ein UV-Erfassungssystem steht geringen Konzentrationen und sehr kurzen Beleuchtungsweglängen gegenüber und ergibt typischerweise ein schlechtes Signal/Rausch-Verhältnis. Andere Erfassungsverfahren sind ähnlich begrenzt. Somit gab es, obwohl die CZE beim Trennen von Protein-Komponenten wirksam ist, eine Begrenzung beim Finden eines ausreichend empfindlichen Detektors zum Identifizieren und Quantifizieren der getrennten Komponenten.
- In Verbindung mit der Flüssigkeitschromatographie (LC; LC = Liquid Chromatography), einer Klasse von alternativen Komponententrennungs-Techniken, wurde die Fluoreszenz-Erfassung angewendet. Bei der Flüssigkeitschromatographie leitet eine flüssige "mobile" Phase Komponenten mit verschiedenen Geschwindigkeiten, die sich auf die Einteilung der Komponenten zwischen der mobilen Phase und einer stationären Phase beziehen, durch eine Kapillare. Zonen bilden sich folglich als eine Funktion der Einteilungs-Verhältnisse. Die Zonen können beleuchtet und die resultierende Fluoreszenz erfaßt werden. Wenige Proteine können unter Verwendung ihrer inhärenten Fluoreszenz mit einer ausreichenden Empfindlichkeit erfaßt werden. Jedoch können markierende Reagenzien verwendet werden, um die Proteinfluoreszenz zu verbessern. Ein Hauptvorteil der Verwendung der Fluoreszenz-Erfassung liegt darin, daß die erhöhte Empfindlichkeit, die von kleinen Probenmengen gefordert wird, durch die Verwendung einer sehr intensiven Beleuchtung erreicht werden kann. Folglich verspricht die Fluoreszenz-Erfassung, die mit markierenden Reagenzien verwendet wird, die Fähigkeit zu verbessern, Probenkomponenten zu identifizieren und zu quantifizieren.
- Ungünstigerweise ist die Flüssigkeitschromatographie für eine Trennung von Proteinen mit hoher Auflösung nicht gut geeignet. Während sich die Einteilungsverhältnisse unter den Komponenten unterscheiden, sind die Moleküle jeder Komponente zu einer beliebigen gegebenen Zeit zwischen der mobilen Phase und der stationären Phase geteilt und bewegen sich folglich mit voneinander verschiedenen Geschwindigkeiten. Trotz Mittelungseffekten, die über die Länge der Kapillare auftreten, wird durch die Einteilung eine ausreichende Zonenverbreiterung eingeführt, um eine Trennung von Proteinkomponenten mit einer hohen Auflösung zu verhindern. Da die einzige Quelle der Zonenverbreiterung bei der CZE eine longitudinale Diffusion ist, stellt diese eine näherungsweise zehnfache Verbesserung bei der durch die Zonenbreite begrenzten Auflösung gegenüber der Flüssigkeitschromatographie dar.
- Die Fluoreszenz-Erfassung von Proteinen in Verbindung mit der CZE ist aufgrund einer Anzahl von Gründen nicht verwendet. Wie bei der Flüssigkeitschromatographie ist die Verwendung der Fluoreszenz, die den Proteinen inhärent ist, nicht im allgemeinen anwendbar. Eine Fluoreszenz-Markierung vor der Trennung ist aus mehreren Gründen mit der CZE inkompatibel. Z.B. bewirkt die Markierung von Proteinkomponenten vor der Trennung, daß Moleküle der gleichen Spezies unterschiedliche Ladungen haben. Somit trennt sich eine Komponente in mehrere Spitzen, was die Erfassungen virtuell uninterpretierbar macht. Außerdem werden die Empfindlichkeitsprobleme verschlimmert, da jede Spitze nur einen Bruchteil einer Probenkomponente darstellt.
- Eine Markierung nach der Trennung schließt die Einführung eines fluorogenen markierenden Reagens nach der Trennung und vor der Erfassung ein. Eine Mischung nach der Trennung wird von Van Vliet u.a., "Post-Column Reaction Detection for Open-Tubular Liquid Chromatography Using Laser-Induced Fluorescence", Journal of Chromatography, Vol. 363, Seiten 187-198, 1986, angesprochen. Dieser Artikel offenbart die Verwendung eines Y-Verbinders zum Einführen des Reagens in den Abfluß einer Trennkapillare. Ein Problem bei dem Y-Verbinder ist die unvermeidliche Wirbelströmung, die auftritt, wenn sich die Ströme mit einem schrägen Winkel mischen. Die Wirbelströmung rührt den Probenstrom auf, wobei die Komponentenzonen stark verbreitert werden. Diese Verbreiterung kann bei einem System mit geringer Auflösung tolerierbar sein, jedoch nicht in einem CZE-System mit hoher Auflösung.
- Die Mischung nach der Trennung wird ferner von Weber u.a. in "Peroxyoxalate Chemilumininescence Detection with Capillary Liquid Chromatography" in Analytical Chemistry, Ausg. 59, Seiten 1452-1457, 1987, angesprochen. Weber u.a. offenbaren die Verwendung einer Teflon-Röhre, um die getrennten Probenkomponenten, die aus einer Flüssigkeitschromatographie-Kapillare heraustreten, gepackt mit Siliziumoxid-Partikeln in das Innere einer Mischkapillare zu befördern. Eine ringförmige Lücke zwischen der Teflon-Röhre und der Mischkapillare ist verwendet, um ein Chemolumineszenz-Reagens koaxial zu der Probe, die aus der schmaleren (0,2 mm) Teflon-Röhre austritt, und in die (0,63 mm) Mischkapillare einzuführen. (Es sei bemerkt, daß die Chemolumineszenz bei der Proteinkomponentenerfassung nicht verwendet werden kann). Die Wirbelströmung ist minimiert, da der Reagensfluß schnell genug ist, um einen Hüllfluß zu definieren, der die Probe begrenzt. Ein Problem bei dem Hüllfluß besteht jedoch darin, daß das Mischen langsam stattfindet. Eine ausreichende Mischung des Chemolumineszenz-Reagens mit den Probenkomponenten erfordert somit ein relativ langes Mischintervall und ein großes Mischvolumen, wobei eine Zonenverbreiterung im Verlauf derselben die Auflösung bei dessen Fehlen wesentlich beeinflußt. Während diese Zonenverbreiterung bei dem offenbarten Flüssigkeitschromatographiesystem mit relativ geringer Auflösung tolerierbar sein kann, würde sie die Vorteile des CZE-Systems mit der hohen Auflösung zunichte machen.
- Folglich ist ein Hindernis der Fluoreszenz-Markierung nach der Trennung bei Systemen mit hoher Auflösung das Erreichen eines schnellen, jedoch Wirbelströmungs-armen Mischen des Reagens und der Probe mit kleinem Volumen. Jedoch stehen die CZE und andere elektro-kinetische Trenntechniken einem anderen Hindernis zusätzlich zu der Einführung von Fluoreszenz- Markierungs-Reagenzien, ebenso wie anderen Fluids, nach der Trennung gegenüber. Die Einführung eines Fluids erfordert im allgemeinen Öffnungen und andere Materialinhomogenitäten in den Kapillarwänden, die den Probenweg definieren. Bei einem CZE-Trennsystem, können diese Inhomogenitäten Feldstörungen verursachen, die mit den elektro-osmotischen und anderen elektro-kinetischen Wirkungen in Wechselwirkung treten. Im geringsten Fall verursachen diese Störungen eine Zonenverbreiterung, können jedoch sogar die elektro-kinetische Bewegung der Probenkomponenten teilweise oder vollständig nachteilig beeinflussen.
- Zusammenfassend liefert die CZE eine Trenntechnik, die die Auflösung bietet, die für die Analyse komplexer Proteine nötig ist, der jedoch eine ausreichend empfindliche kompatible Erfassungstechnik fehlt. Die Fluoreszenz-Erfassung liefert einen gewünschten Empfindlichkeitspegel, jedoch war die erforderliche Markierung im Zusammenhang mit der CZE nicht funktionsfähig. Es besteht der Bedarf nach einem System, das die Auflösungsleistung der CZE mit der Erfassungsempfindlichkeit, die mit Fluoreszenz-markierten Proteinen erhältlich ist, kombiniert.
- Die vorliegende Erfindung liefert ein System mit folgenden Merkmalen: einer Probenweg-Einrichtung, die einen sich longitudinal erstreckenden Probenweg definiert, wobei die Probenweg-Einrichtung einen Kapillartrennungsabschnitt aufweist, einen Kapillarmischabschnitt und einen Erfassungsabschnitt, der seriell entlang des Probenweges angeordnet ist, wobei der Trennabschnitt ein Probeneingangsende aufweist; einer Probeneinführungseinrichtung zum Einführen einer Probe mit mehreren Komponenten in den Trennabschnitt an dem Probeneingangsende; einer Erfassungseinrichtung zum Erfassen des Vorliegens einer beliebigen der Probenkomponenten in dem Erfassungsabschnitt, vorausgesetzt eine der Probenkomponenten ist ausreichend mit einem vorbestimmten Erfassungsfluid gemischt; einer elektrischen Feldeinrichtung zum Bewegen der Probenkomponenten in dem Trennabschnitt zu dem Mischabschnitt hin, durch den Mischabschnitt und nachfolgend in den Erfassungsabschnitt, wobei die elektrische Feldeinrichtung eine Elektrodeneinrichtung zum Anlegen eines elektrischen Feldes entlang des Probenweges aufweist; und einer Fluideinführungseinrichtung zum Einführen des Erfassungsfluids in den Mischabschnitt, so daß sich das Erfassungsfluid mit den Probenkomponenten derart mischt, daß das Erfassungsfluid und die Probenkomponenten ausreichend gemischt sind, bevor sie sich in den Erfassungsabschnitt bewegen, so daß die Erfassungseinrichtung das Vorliegen einer beliebigen der Probenkomponenten erfassen kann, und wobei der Mischabschnitt eine innere Oberflächeneinrichtung aufweist, wobei die elektrische Feldeinrichtung elektrische Feldlinien angrenzend zu der inneren Oberflächeneinrichtung aufweist, wobei die Erfassungsfluid-Einführungseinrichtung eine Oberflächenladungsdiskontinuität in der inneren Oberflächeneinrichtung mit sich bringt, wobei die Diskontinuität entlang des Probenweges von mindestens etwa 100 um ein maximales Ausmaß aufweist.
- Das System der vorliegenden Erfindung ermöglicht es, ein Mischfluid nach der Trennung in einen Probenstrom einzuführen. Die Geometrie und die Abmessungen der Einmündung, die diese Einführung ermöglicht, sind derart ausgewählt, daß die elektro-kinetischen Effekte minimal negativ beeinflußt sind. Tatsächlich kann das elektrische Feld synergistisch verwendet sein, um das Diffusionsmischen der Probe und des Mischfluids zu erleichtern, wobei die Zonenverbreiterung minimal gehalten wird. Somit liefert die vorliegende Erfindung eine wirksame Kombination der Auflösungsleistung der CZE-Trennung mit der Erfassungsempfindlichkeit der Fluoreszenz-Erfassung.
- Vorzugsweise ist das Abflußende einer elektro-kinetischen Trennkapillare in eine Mischkapillare eingefügt, wobei eine Überlappungsregion definiert wird. Eine ringförmige Lücke zwischen der äußeren Oberfläche der Trennkapillare und der inneren Oberfläche der Mischkapillare dient als ein Eingang zum Einführen eines fluorogenen markierenden Reagens oder eines anderen Erfassungsfluids. Elektroden sind relativ zu der Trennkapillare und der Mischkapillare angeordnet, so daß sich ein elektrisches Feld von einer positiven Elektrode, über die Bohrung der Trennkapillare, radial um die ringförmige Lücke und durch die Bohrung der Mischkapillare zu einer negativen Elektrode erstreckt. Die ringförmige Lücke besitzt ein ausreichend kleines radiales Ausmaß derart, daß das elektrische Feld von der Lücke nicht wesentlich negativ beeinflußt wird. Folglich werden geladene Moleküle des Trennkapillar-Abflusses entlang des elektrischen Feldes, durch die ringförmige Lücke und durch den Fluß des Mischfluids geführt. Somit ist das elektrische Feld wirksam, um das Diffusionsmischen des Abflusses und des Mischfluids zu erleichtern. Deshalb findet das Mischen schnell und mit minimalen Wirbelströmungen statt, wodurch die Erfassung mit einer wesentlichen Zonenverbreiterung verbessert wird.
- Die Einstein-Gleichung für die Diffusion, x = (2Dt)1/2 errichtet praktische Grenzen für die Durchmesser der Trenn- und der Misch-Kapillare, die für eine ausreichend schnelle Diffusionsmischung erforderlich sind. Der innere Durchmesser des Mischabschnittes der Mischkapillare sollte 200 um nicht überschreiten und der maximale innere Durchmesser der Trennkapillare sollte 100 um nicht überschreiten, so daß die Mischzeiten auf etwa eine Sekunde begrenzt sind. Vorzugsweise sind die inneren Durchmesser relativ ähnlich. Selbstverständlich erfordert dies eine entsprechend dünne Wand für die Trennkapillare in der Region des überlappens. Eine derart dünner gemachte Wand kann durch chemisches Ätzen einer Kapillare auf den gewünschten Umfang erreicht werden.
- Bei der primär interessierenden Anwendung ist hierin das Mischfluid ein fluorogenes markierendes Reagens. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, daß dieses fluorogene Reagens schnell mit dem Probenabfluß bei einer minimalen Spitzenverbreiterung gemischt wird. Das kleine Probenvolumen einer Trennkapillare mit sehr kleinem Durchmesser kann durch die Verwendung einer intensiven Bestrahlung, um die Fluoreszenz zu stimulieren, kompensiert werden. Somit ist das Problem des Konfliktes zwischen der Auflösung und der Empfindlichkeit nahezu überwunden. Diese und andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung bezugnehmend auf die beiliegenden Zeichnungen offensichtlich.
- Fig. 1 ist eine schematische Ansicht eines Kapillarzonenelektrophorese-Systems gemäß der vorliegenden Erfindung.
- Fig. 2 ist ein Graph, der die Detektorausgabe für eine Probe zeigt.
- Fig. 3A ist eine schematische Schnittansicht der Mischeinmündung des Systems von Fig. 1.
- Fig. 3B ist eine Schnittansicht entlang der Linie 3-3 in Fig. 3A.
- Fig. 4 ist eine Schnittansicht der überlappenden Enden einer Trennkapillare und einer Mischkapillare gemäß der vorliegenden Erfindung.
- Fig. 5 ist eine Ansicht ähnlich der in Fig. 3, die die Senkrechten des elektrischen Felds zeigt.
- Fig. 6 ist eine Ansicht ähnlich der von Fig. 5, die die Flußmuster zeigt.
- Fig. 7A bis 7D sind Schnittansichten der überlappenden Enden einer Trennkapillare und einer Mischkapillare gemäß der vorliegenden Erfindung.
- In den Figuren besitzt eine dreistellige Zahl, die auf ein Element der Zeichnungen verweist, als ihre erste Stelle die Nummer der Figur, in der das Element in die nachfolgende Beschreibung eingeführt wird. Z.B. ist das System 100 erstmals bezugnehmend auf Fig. 1 eingeführt und die Einmündung 336 ist erstmals bezugnehmend auf Fig. 3 eingeführt. Dies dient dazu, dem Leser beim Lokalisieren eines Bezugszeichens zu helfen, wenn es nun in der Figur gezeigt ist, auf die sich ein gegebener Abschnitt der folgenden Beschreibung explizit bezieht.
- Ein Kapillarzonenelektrophorese-System (CZE-System) 100 weist eine Hochspannungsquelle 102 auf, eine erste Hochspannungselektrode (104), einen ersten Elektrolytbehälter 106, der eine Lösung des Elektrolyts 108 enthält, eine Trennkapillare 110, ein Misch-T-Stück 112, eine Mischkapillare 114, einen Fluoreszenz-Detektor 116, einen zweiten Elektrolyt- Behälter 118, der ebenfalls ein Elektrolyt 108 enthält, und eine Masseelektrode 120. Das Elektrolyt 108, das ferner den größten Teil der Trennkapillare 110 und der Mischkapillare 114 füllt, dient als ein Medium für das elektrische Feld zwischen den Elektroden 104 und 120. Das gleiche Elektrolyt ist als Lösungsmittelträger für die biologische Probe, die analysiert werden soll, verwendet. Ein Probenbehälter 122, in den eine zweite Hochfrequenzelektrode 124 eingefügt ist, enthält die Probenlösung 126. Ein Reagens-Behälter 128 enthält ein Reagens 130, das zum Mischen mit dem Abfluß der Trennkapillare 110 in der Mischkapillare 114 entlang einer Reagenskapillare 132 zu dem Misch-T-Stück 112 geleitet wird. Der Reagensfluß wird durch einen Druck gesteuert, der an den Reagensbehälter 128 angelegt ist.
- Die Probenlösung 126 kann in die Trennkapillare 110 eingeführt werden, indem das Eingangsende 134 derselben in die Probenlösung 126 eingefügt wird. Die Spannungsquelle 102 wird aktiviert, um ein elektrisches Feld von der Hochspannungselektrode 124, über die Trenn- und die Misch-Kapillare 110 und 114 zu der Masseelektrode 120 einzurichten. Da das Elektrolyt durch einen elektro-osmotischen Fluß zu der Masse-Elektrode 120 hingezogen wird, wird die Probenlösung 126 an dem Eingangsende 134 derselben in die Trennkapillare 110 gezogen. Am Ende des Zeitintervalls, das erforderlich ist, um die geeignete Menge der Probenlösung 126 einzuführen, die etwa 2 Nanoliter sein kann, wird die Spannungsversorgung 102 abgeschaltet.
- Das Eingangsende 134 der Trennkapillare 110 wird dann in den ersten Elektrolytbehälter 108 eingeführt, um die Konfiguration, die in Fig. 1 gezeigt ist, einzurichten. Bei erneuter Aktivierung der Spannungsversorgung 102 induziert das errichtete elektrische Feld einen elektro-osmotischen Fluß. Diesem Fluß überlagert sind relative elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeiten, die von der Größe und dem Vorzeichen der molekularen Ladungen abhängen. Das Ergebnis besteht darin, daß sich jede Probenkomponente mit einer charakteristischen Geschwindigkeit durch die Trennkapillare 110 bewegt. Die verschiedenen Bewegungsgeschwindigkeiten bewirken, daß die Probenkomponenten die Trennkapillare 110 nacheinander in die Mischkapillare 114 verlassen und den Fluoreszenz-Detektor 116 passieren.
- Der Fluoreszenz-Detektor 116 beleuchtet markierte Probenkomponenten in der Misch-Kapillare 114 unter Verwendung eines gut fokussierten, hochintensiven ultravioletten Lichts, wie z.B. einer Quecksilber-Xenon-Bogenlampe oder einem Laser. Der Detektor 116 weist eine Photovervielfacher-Röhre auf, die die resultierende Fluoreszenz-Intensität in einen Photostrom umwandelt, der verwendet wird, um eine Ausgabe der Intensität über der Zeit zu erhalten, wie z.B. die, die in Fig. 2 gezeigt ist. Die Spitzen entsprechen verschiedenen Probenkomponenten, z.B. Wal-Skelett-Muskulatur-Myoglobin (WSM), kohlenstoffhaltige Anhydrase (CAH), β-Lactoglobulin B (BLB) und β-Lactoglobulin A (BLA). Speziell waren die Bedingungen: 0,01 % (Gewicht/Volumen) WSM und CAH, 0,005 % (Gewicht/Volumen) BLA und BLB; Betriebsund Reagens-Elektrolytpuffer 0,05 M-Borat-0,05 M KCI pH 9,5; 5mg o-Phthaldialdehyd (OPA) + 50 uL Mercaptoethanol + 100 uL Ethanol, verdünnt auf 4 mL mit Elektrolytpuffer; Probeneinführung 2 s bei 30 kV; Betriebsspannung 30 kV.
- Die Auflösung, die erforderlich ist, um die WSM- und CAH- Spitzen und die BLA- und BLB-Spitzen aufzulösen, wird teilweise unter Verwendung einer Trennkapillare kleinen Durchmessers erhalten. Ein Bohrungsdurchmesser von 100 um oder weniger ermöglicht es, daß der elektro-osmotische Fluß gleichmäßig über den Kapillar-Durchmesser wirkt und verhindert eine konvektions-induzierte Zonenverbreiterung. Durchmesser kleiner als 100 um können bevorzugt sein, um einen größeren elektrischen Widerstand zwischen den Elektroden 104 und 120 zu liefern. Der größere Widerstand ermöglicht eine größere Spannung für einen gegebenen Strom. Es ist notwendig, den Strom zu begrenzen, um ein Sieden des Elektrolyts zu verhindern. Die höhere Spannung induziert eine schnellere Wanderung. Eine schnellere Wanderung hat eine geringere Zonenverbreiterung aufgrund einer Diffusion (die zeitbezogen ist) zur Folge, ohne die Spitzentrennung zu beeinträchtigen.
- Das kleine Probenvolumen, das unter Verwendung der Trennkapillare 110 kleinen Durchmessers verfügbar ist, macht es möglich, daß nur wenig Material für die Erfassung verfügbar ist. In dem dargestellten Fall sind die Probenproteine in einer Elektrolytlösung verdünnt, und jede Spitze von Fig. 2 stellt nur einen Bruchteil des Proteingehalts der Probe dar. Wenn eine UV-Absorption als das Erfassungsverfahren für die gleiche Probe verwendet wurde, konnten die Komponentenspitzen aufgrund eines Rauschens nicht deutlich von anderen Spitzen unterschieden werden. Ein ähnliches Problem würde gelten, wenn der Fluoreszenz-Detektor sich auf die inhärente Fluoreszenz der Proteine stützen müßte. Wie oben gezeigt ist, ist die Fluoreszenz-Markierung einer Probe vor der Trennung keine lebensfähige Lösung. Folglich liefert die vorliegende Erfindung eine neuartige Einmündung, um eine fluorogene Markierung nach der Trennung zu ermöglichen. Dies geschieht, um eine Zonenverbreiterung zu minimieren, während ein ausreichend starkes Komponentenspitzensignal zur Identifizierung und Quantifizierung der Probenkomponenten ermöglicht wird.
- Die Markierung nach der Trennung wird unter Verwendung der Einmündung 336, die in Fig. 3A gezeigt ist, durchgeführt. Ein Misch-T-Stück 112 aus rostfreiem Stahl besitzt zwei serielle Eingänge 338 und 340 und einen orthogonalen Eingang 342. Die Trennkapillare 110 wird dort von einer ersten Zwinge 344 gehalten, wo sie sich durch den seriellen Eingang 338 erstreckt, während die Mischkapillare 114 dort von einer zweiten Zwinge 346 gehalten wird, wo sie sich durch den zweiten seriellen Eingang 340 erstreckt. Die Reagenskapillare 132 betritt den kurzen orthogonalen Eingang 342 dort, wo sie durch eine dritte Zwinge 348 befestigt ist. Die Quarzglas-Reagenskapillare 132 besitzt einen inneren Durchmesser von 200 um, einen äußeren Durchmesser von 325 um und eine Länge von 70 cm. Unter Verwendung der Richtung des Probenflusses, um eine longitudinale Richtung zu definieren, erstreckt sich entsprechend der vorliegenden Erfindung die Trennkapillare 110 derart in die Mischkapillare 114, daß beide sich longitudinal überlappen, wobei sie eine Überlappungsregion 350 definieren und vorzugsweise konzentrisch sind. Die Überlappungsregion 350 weist einen Ausgangsabschnitt 351 der Trennkapillare 110 und einen Eingangsabschnitt 353 der Mischkapillare 114 auf.
- In der Überlappungsregion 350 ist eine ringförmige dazwischenliegende Lücke 352 definiert, die in Fig. 3B gezeigt ist, die eine fluidmäßige Verbindung zwischen der Reagenskapillare 114 und einem Mischabschnitt 354, der in Fig. 3A gezeigt ist, in der Mischkapillare 114 in der Nähe des Abflußendes 356 der Trennkapillare 110 liefert. Dies ermöglicht, daß das fluorogene Reagens 130 sich nach der Trennung der Probenkomponenten mit dem Trennkapillaren-Abfluß mischt. Nach einem ausreichenden Mischen kann eine Erfassung, das heißt eine Probenbeleuchtung und eine Fluoreszenz-Erfassung, durch ein Erfassungsfenster 358 strömungsmäßig nach dem Mischabschnitt 354 stattfinden.
- Das bevorzugte Ausführungsbeispiel ist detaillierter in Fig. 4 gezeigt. Die Trennkapillare weist eine mittlere elektrophoretische Kapillarbohrung 460 mit einem Durchmesser von 25 um, und eine Quarzglaswand 462, die sich radial von dem Durchmesser von 25 um auf einen Durchmesser von 120 um erweitert, auf. Die Wand 462 der Trennkapillare ist mit einem schützenden Polyimid-Kunststoff-Überzug 464 überzogen, der in der Nähe eines freigelegten Abschnitts 466 der Trennkapillare 110 entfernt wurde. In dem freigelegten Abschnitt 466 verjüngt sich die Quarzglaswand 462 auf einen äußeren Durchmesser von 40 um, was der konstante Durchmesser des Trennkapillaren-Ausgangsabschnitts 351 ist. Der innere Durchmesser der Mischkapillare beträgt dann 50 um.
- Die Trennkapillare 110 wurde durch Modifizieren einer kommerziell erhältlichen Kapillarröhre mit den Dimensionen der Trennkapillare 110, wie in Fig. 4 gezeigt ist, wobei der Kunststoffüberzug 464 an seinem Platz ist, gebildet. Die Modifikation beginnt mit dem Abstreifen des Überzugs über dem Bereich, der der freigelegte Abschnitt 466 wird, und nachfolgendes Ätzen des Ausgangsendes in einem gerührten Bad einer konzentrierten (48%) Fluorwasserstoffsäure. Während des Ätzens fließt Wasser durch die Trennkapillare 110 in Richtung der Ätzlösung, um ein Ätzen der Innenseite zu verhindern.
- Die Mischkapillare 114 besitzt eine Bohrung 470 mit einem inneren Durchmesser von 50 um. Eine Wand 472, die die Bohrung 470 der Quarzglas-Mischkapillare 114 definiert, besitzt einen äußeren Durchmesser von 120 um. Es ist wichtig, daß die Wände der Trenn- und Misch-Kapillaren 110 und 114 aus gleichartigen Materialien bestehen, um die Kontinuität der Oberflächenladung und somit die elektro-kinetischen Effekte über die ringförmige dazwischenliegende Lücke 352 zu verbessern; tatsächlich ist für alle drei Kapillaren 110, 114 und 132 aufgrund der Flexibilität, der Transparenz und der elektrischen Isolation desselben Quarzglas verwendet. Ein Polyimid-Kunststoff-Überzug vergrößert den äußeren Durchmesser auf 150 um. Das Erfassungsfenster 358 kann gebildet werden, indem ein Abschnitt von 1 bis 2 cm des Polyimid- Überzugs 474 weggebrannt wird.
- Günstigerweise bewirkt das elektrische Feld in der Überlappungsregion 350, daß die Probenkomponenten radial über die Flußbahn des Reagens-Fluidflusses divergieren. Das elektrische Feld zwischen der Hochspannungselektrode 104 und der Masseelektrode 102, die in Fig. 1 gezeigt ist, errichtet ein elektrisches Feld 576, Fig. 5, durch die Bohrung 460 der Trennkapillare und die Kapillarbohrung 470, wodurch wirksam ein Weg für die Probenmoleküle definiert ist. Das elektrische Feld divergiert am Mischabschnitt 354 radial und führt somit den Kapillarabfluß 678 radial über den Reagensfluß 680 nach außen und zu der inneren Oberfläche der Mischkapillare, wie in Fig. 6 gezeigt ist. Das Divergieren des Abflusses 678 erleichtert das Diffusionsmischen ohne eine übermäßige Wirbelströmung. Das elektrische Feld 576 unterstützt folglich das Diffusionsmischen ohne die Komponentenspitzen wesentlich zu verbreitern. Demgemäß ist das System 100 für eine Proteinanalyse mit hoher Auflösung gut geeignet.
- Die Verwendung der koaxialen Einmündung bietet ein Mischen des o-Phthaldialdehyd-Reagens (OPA-Reagens) mit den wandernden Probenkomponentenzonen ohne eine übermäßige Zonenverbreiterung. Der Detektor 16 ist über drei Größenordnungen linear und zeigt für Aminosäuren und Proteine Erfassungsgrenzen im Femtogramm-(Attomol)-Bereich. Weitere Details, die sich auf das Trennsystem 100 beziehen, sind in "Instrumentation Detection and Surface Deactivation in Capillary Zone Electrophoresis", von Donald J. Rose, Jr., einer PH. D.-Dissertation, vorgelegt der University of North Carolina at Chapel Hill, (März 1988), beschrieben, wobei diese Dissertation hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist.
- Mehrere alternative Einmündungstypen sind durch die vorliegende Erfindung vorgesehen. Zwei kommerziell erhältliche Kapillare können mit komplementären Abmessungen verwendet werden, um die erfindungsgemäße Einmündung zu bilden, wie in Fig. 7A gezeigt ist. Z.B. kann eine Trennkapillare 782 einen konstanten inneren Durchmesser von 25 um und einen konstanten äußeren Durchmesser von 150 um aufweisen, während die Mischkapillare 784 einen inneren Durchmesser von 200 um besitzt. Bei einem alternativen Ausführungsbeispiel ist das Abflußende 786 einer Trennkapillare 788 verjüngt, um in eine Mischkapillare 790 zu passen, wie in Fig. 7B gezeigt ist, statt eines konstanten äußeren Durchmessers. Experimentelle Ergebnisse zeigen, daß die Kontinuität des elektrischen Feldes verbessert wird und eine Wirbelströmung weiter minimiert wird, indem der Unterschied zwischen den zwei inneren Durchmessern erniedrigt wird. Indem ein äußerer Überzug von einem Abschnitt einer Trennkapillare 792 derart entfernt wird, wie in Fig. 7C gezeigt ist, daß ihr äußerer Durchmesser in der Region des Überlappens 110 4m beträgt, kann eine Mischkapillare 794 mit einem geringeren inneren Durchmesser, z.B. 160 um, verwendet werden.
- Das bevorzugte Ausführungsbeispiel, das zum Vergleich wiederum in Fig. 7D dargestellt ist, lieferte das schnellste und wirksamste Mischen. Es sei bemerkt, daß das bevorzugte Ausführungsbeispiel den minimalen Unterschied zwischen den inneren Durchmessern besaß und folglich den minimalen mittleren Radialabstand der Abflußdispersion. Außerdem waren die Flußraten des Reagens und der Probe bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel am besten angepaßt.
- Die vorliegende Erfindung schafft ferner andere Mischabschnitts-Konfigurationen. Z.B. kann das Mischfluid in eine Lücke zwischen zwei Kapillare eines ähnlichen inneren Durchmessers eingeführt werden, wobei die gegenüberliegenden Enden der Kapillare benachbart sind und sich nicht überlappen. Alternativ kann eine einzelne Kapillare verwendet sein, um sowohl Trenn- als auch Misch-Abschnitte zu schaffen, indem eine Öffnung in der Wand der Kapillare gebildet ist; das Mischfluid kann dann durch die Öffnung in den Probenstrahl eingeführt werden.
- Die Wahl der Markierungen ist durch Beschränkungen der Kompatibilität mit dem Trennprozeß begrenzt. Die meisten fluorogenen Markierungen sind selbst fluoreszent und fügen der Detektorausgabe folglich eine oder mehrere Spitzen hinzu. Um eine falsche Fluoreszenz zu vermeiden, muß das Reagens vollständig reagieren, oder übermäßiges Reagens muß vor der Erfassung entfernt werden. Diese beiden Alternativen sind sehr problematisch. Es ist bevorzugt, fluorogene markierende Reagenzien zu verwenden, die, wie OPA, selbst nicht fluoreszent sind, bis sie mit primären Amin-Funktionen der Proteinmoleküle reagieren.
- Allgemein arbeitet die vorliegende Erfindung am besten, wenn der innere Durchmesser der Trennkapillare kleiner als 100 um und der innere Durchmesser der Mischkapillare kleiner als 200 um ist. Außerdem sollte die Querschnittsfläche der ringförmigen Lücke zwischen ein und viermal der der Trennkapillare sein. Bei dem dargestellten Ausführungsbeispiel beträgt die Querschnittsfläche der Trennkapillare etwa 500 um² und die Querschnittsfläche der ringförmigen dazwischenliegenden Lücke beträgt etwa 700 um², um ein Verhältnis von etwa 1,4 zu ergeben.
- Es gibt zu CZE alternative elektro-kinetische Trenntechniken. Die Kapillar-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese verwendet eine elektrophoretische Wanderung durch eine Gel-Matrix. Eine isoelektrische Kapillar-Fokussierung verteilt Probenkomponenten mittels eines isoelektrischen Punkts in einem pH- Gradienten, der über die Länge einer Kapillare ausgebildet ist. Die Isotachophorese verteilt Probenkomponenten mittels der Beweglichkeit. Die micellare elektro-kinetische Kapillarchromatographie ist eine Form der Chromatographie, die eine "stationäre" Phase verwendet, die einem elektro-osmotischen Fluß unterzogen wird. Alle diese Trenntechniken erfordern ein elektrisches Feld, um eine Bewegung und eine Trennung entlang der Kapillare zu bewirken. Demgemäß schafft die vorliegende Erfindung ohne weiteres den Zusatz eines Erfassungsfluids nach der Trennung in Verbindung mit diesen Verfahren. Die vorliegende Erfindung kann auf andere Kapillar- Trenntechniken angewendet werden, indem ein elektrisches Feld implementiert wird, um das Mischen zu erleichtern, obwohl das elektrische Feld für eine Trennung nicht erforderlich ist.
- Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird nach der Trennung ein fluorogenes markierendes Reagens hinzugefügt, um die Erfassung zu verbessern. Die vorliegende Erfindung umfaßt weitere Erfassungsverfahren und folglich die Einführung von Erfassungsfluids, die für diese Erfassungsverfahren angepaßt sind. Z.B. kann eine Massenspektrometrie verwendet werden, um getrennte Komponenten zu analysieren. Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um ein Erfassungsfluid, speziell ein Trägerfluid, einzuführen, um getrennte Komponenten in ein Massenspektrometer zu bringen. Diese und weitere Variationen und Modifikationen der beschriebenen Ausführungsbeispiele werden durch die vorliegende Erfindung geschaffen, deren Bereich nur durch die folgenden Ansprüche begrenzt ist.
Claims (3)
1. Ein System mit folgenden Merkmalen:
einer Probenweg-Einrichtung, die einen sich
longitudinal erstreckenden Probenweg definiert, wobei die
Probenweg-Einrichtung einen Kapi llartrennabschnitt, einen
Kapillarmischabschnitt (354) und einen
Erfassungsabschnitt (359) aufweist, die seriell entlang des
Probenweges angeordnet sind, wobei der Trennabschnitt ein
Probeneingangsende (134) aufweist;
einer Probeneinführungs-Einrichtung zum Einführen einer
Probe (126) mit mehreren Komponenten in den
Trennabschnitt (110) an dem Probeneingangsende;
einer Erfassungseinrichtung (116) zum Erfassen des
Vorliegens einer beliebigen der Probenkomponenten in dem
Erfassungsabschnitt (359), vorausgesetzt, daß eine der
Probenkomponenten ausreichend mit einem vorbestimmten
Erfassungsfluid (130) gemischt ist;
einer elektrischen Feldeinrichtung zum Bewegen der
Probenkomponenten in dem Trennabschnitt (110) zu dem
Mischabschnitt (354) hin, durch den Mischabschnitt und
nachfolgend in den Erfassungsabschnitt (359), wobei die
elektrische Feldeinrichtung eine Elektrodeneinrichtung
(104) zum Anlegen eines elektrischen Feldes entlang des
Probenweges aufweist; und
einer Fluideinführungs-Einrichtung zum Einführen des
Erfassungsfluids (130) in den Mischabschnitt (354), so
daß sich das Erfassungsfluid mit den Probenkomponenten
derart mischt, daß das Erfassungsfluid und die
Probenkomponenten
ausreichend gemischt sind, bevor sich
dieselben in den Erfassungsabschnitt (359) bewegen, so daß
die Erfassungseinrichtung (116) das Vorliegen einer
beliebigen der Probenkomponenten erfassen kann, und wobei
der Mischabschnitt (336) eine innere
Oberflächeneinrichtung aufweist, wobei die elektrische
Feldeinrichtung elektrische Feldlinien benachbart zu der inneren
Oberflächeneinrichtung einschließt, wobei die
Erfassungsfluid-Einführungseinrichtung auf der inneren
Oberflächeneinrichtung eine
Oberflächenladungs-Diskontinuität bewirkt, wobei die Diskontinuität ein maximales
Ausmaß von höchstens 100 um entlang des Probenweges
aufweist.
2. Ein System gemäß Anspruch 1, bei dem die
Probenweg-Einrichtung folgende Merkmale aufweist:
eine Trennkapillare (110) mit einem Ausgangsabschnitt
(351), der ein Ausgangsende (356) aufweist, und
eine Mischkapillare (114) mit einem Eingangsabschnitt
(353),
wobei sich der Ausgangsabschnitt (351) der
Trennkapillare (110) longitudinal in den Eingangsabschnitt (353)
der Mischkapillare (114) erstreckt, um eine radial
dazwischenliegende ringförmige Lücke (352) zu definieren.
3. Ein System gemäß Anspruch 2 zur Verwendung bei der
Proteinanalyse, bei dem die Trennkapillare (110) einen
nominellen Bohrungsdurchmesser von höchstens 100 um
besitzt, der Ausgangsabschnitt (351) einen äußeren
Durchmesser von höchstens 150 um besitzt und die
Mischkapillare einen nominellen Bohrungsdurchmesser von höchstens
200 um besitzt.
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