JP2711976B2

JP2711976B2 - ゲル電気泳動パターン読み取り装置

Info

Publication number: JP2711976B2
Application number: JP5078569A
Authority: JP
Inventors: 永典奈須; 義隆中村; 仁藤宮; 顕次山本
Original assignee: Hitachi Software Engineering Co Ltd
Current assignee: Hitachi Software Engineering Co Ltd
Priority date: 1993-03-15
Filing date: 1993-03-15
Publication date: 1998-02-10
Anticipated expiration: 2013-02-10
Also published as: EP0616212B1; US6576104B1; EP0616212A1; JPH06265523A; DE69429886T2; DE69429886D1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ゲル電気泳動パターン
読み取り装置に関し、更に詳細には、核酸やタンパク質
を泳動分離した電気泳動パターンを、特殊なレーザ光源
など高価な装置構成を必要とせずに、高い検出感度で読
み取ることができるゲル電気泳動パターン読み取り装置
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来から、生体高分子のタンパク質，核
酸の分画や構造解析には、ゲル電気泳動法による分析手
法が多く用いられる。ゲル電気泳動法は微量な試料を適
切に分析できるため、このゲル電気泳動法が用いられる
場合は、取得できる試料の量が限られている場合が多
く、そのため、分析処理では、特に、確実な高い検出感
度が要求される。

【０００３】従って、従来においては、分析する対象の
試料を放射性同位体で標識し、ゲルにその試料を注入し
て電気泳動を行った後、そのゲルをＸ線フィルムに貼付
て露光し、そのＸ線フィルムを現像し、Ｘ線フィルムに
転写された放射性同位体による露光のパターンを、試料
の電気泳動パターンとして読み取っていた。

【０００４】しかし、放射性同位体は危険であり、取扱
いを厳重に管理しなければならないので、近年において
は、レーザ光源，光学センサ技術，信号処理技術などの
発達により、危険な放射性同位体を用いずに、電気泳動
パターンを検出する蛍光検出法が開発されるに至ってい
る。このような蛍光検出法では、試料を蛍光物質で標識
し、電気泳動した後に、標識した蛍光物質を直接レーザ
光源により励起し、その蛍光パターンを検出することに
より電気泳動パターンを検出する。

【０００５】蛍光検出法による電気泳動パターン読取り
方法に関して、初期に開発された例として、特開昭６１
−１７３１５８号公報に記載されたＤＮＡ配列決定法が
知られている。このＤＮＡ配列決定法による蛍光検出法
について、その概略を説明する。図４および図５は、蛍
光検出法によるゲル電気泳動分離パターン検出方法を説
明する図であり、図４にゲル電気泳動装置の概略のブロ
ック図を示し、図５に蛍光検出部の一部の詳細を示して
いる。

【０００６】図４を参照して、電気泳動装置の装置構成
を説明する。電気泳動装置は、電気泳動を行うためのゲ
ル３１と、ゲル３１を保持する細管３２と、細管３２中
のゲル３１に電界を印加するための上部緩衝液槽３３お
よび下部緩衝液槽３４と、第１の電極３５ａおよび第２
の電極３５ｂと、泳動された試料の蛍光物質を励起する
ための光源３６と、試料から発する蛍光を検出する検出
器３７と、検出器からの電気信号を処理するためのデー
タ処理部３８と、第１の電極および第２の電極の間に泳
動電界を与える電源３９から構成されている。

【０００７】次に、電気泳動装置の動作を説明する。こ
こでは、電気泳動装置において電気泳動分離する対象の
試料はＤＮＡとし、ＤＮＡの電気泳動パターンを読み取
る場合を例として、電気泳動装置の動作を説明する。ま
ず、試料のＤＮＡを蛍光物質で標識する。標識した試料
を上部緩衝液槽３３から細管３２のゲル３１の中に導入
し、電源３９により第１の電極３５ａおよび第２の電極
３５ｂの間に数ｋボルトから１０ｋボルトの程度の泳動
電圧を印加する。ＤＮＡの場合は、負の電荷を有してい
るため、第２の電極３５ｂのプラス電極に引かれて移動
する。移動してきた試料は、光源３６の位置に達する。
この位置で光源３６から発光しているレーザビームを受
けて、試料に標識されている蛍光物質が励起され、蛍光
を発光するので、この蛍光を検出器３７により受光す
る。検出器３７は受光した蛍光を電気信号に変換する。
この蛍光の電気信号は、データ処理装置３８に送られ、
データ処理装置３８が電気信号から分子量別に分離され
た試料の配列（電気泳動パターン）を求める。

【０００８】この場合、ゲル３１中の試料の蛍光発光を
受光する検出器３７の動作は、図５の部分横断面図に示
されるように（紙面の上部から紙面に向って）ゲル３１
中を移動してきた試料が、光源３６から発光しているレ
ーザビーム４０の位置に達すると、ここでレーザビーム
４０により、試料のＤＮＡに標識された蛍光物質がゲル
３１中で励起され、蛍光４１を発生するので、検出器３
７は、この蛍光４１をを受光する。検出器３７は受光し
た蛍光４１を、検出器３７の光電子増倍管に導き、光電
子増倍管により電気信号に変換して、データ処理装置３
８に送る。データ処理装置３８では、蛍光４１の強度に
応じてそのピーク位置を求めることにより、分子量別に
分離した試料の配列を求める。

【０００９】試料に標識してある蛍光物質は、ＤＮＡの
場合、その塩基の種類に対応して異なる蛍光波長を持せ
て、１本の細管により同時に４つの核酸のＤＮＡ配列を
特定できるようにする。ここで４色の蛍光をそれぞれに
発光する螢光物質は、具体的には、例えば、イソチオシ
アン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、イソチオシアン酸
ローダミン（ＥＩＴＣ）、イソチオシアン酸テトラメチ
ルローダミン（ＴＭＲＩＴＣ），置換イソチオシアン酸
ローダミン（ＸＲＩＴＣ）などである。このような電気
泳動装置による場合、ＤＮＡの検出感度は、波長４８８
ｎｍまたは５１４ｎｍなどのアルゴンイオンレーザを用
いることにより、放射性同位体を用いた方法とほぼ同様
なレベルの１×１０^-16ｍolレベルを達成している。

【００１０】また、この実施例では、化学反応エネルギ
ーを利用して発光させる場合について簡単に言及してい
るが、ゲルから溶出させて発光物質と反応させ、不要と
なった標識物質を廃棄する方法などが具体的に示されて
いない。実際には、化学発光エネルギー源の供給方法、
発光物質と標識物質との混合方法、更には残留物質によ
るバックグラウンドノイズを防ぐための発光済み標識物
質廃棄方法など装置化に当たっての具体的問題点は多
い。

【００１１】このような電気泳動法による実験は、ＤＮ
Ａの塩基配列決定の他、種々広がりを見せている。例え
ば、遺伝病の診断や犯罪者のＤＮＡ鑑定、親子鑑定など
である。遺伝病の診断では、Single Strand Conformati
on Polymorphism のように、各遺伝病固有の塩基置換に
などにより、特定の条件（例えばＤＮＡの変性状態に微
妙な差がでる温度やペーハーph条件）では、高次構造が
異なってくることを利用し、泳動パターンの違いを見る
ことによって１塩基による違いによる判定が可能になっ
てきている。犯罪者や親子などのＤＮＡ鑑定では、ヒト
によって個体間のＤＮＡのバラつき（多型）があること
を利用して泳動距離に差が出ることを利用して比較を行
っている。

【００１２】このような実験においては、ＤＮＡの塩基
長が１０００塩基以下であることが多く、電気泳動用の
ゲルとしてはポリアクリルアミドゲルが用いられる。ま
た、数千塩基以上の場合には、アゲロースゲルが用いら
れている。また、試料の泳動パターンと標準ＤＮＡ泳動
パターンとの比較を行なうため、平板状のゲル電気泳動
装置を用い、横に並ベて電気泳動を行い、差異を求めて
いた。

【００１３】これらの方法では、ゲルの均一性を安定に
得ることや、泳動時の泳動板の温度を均一に保つ温度管
理など種々の配慮が必要とされる。特に、Ｓｉｎｇｌｅ
ＳｔｒａｎｄＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＰｏｌｙ
ｍｏｒｐｈｉｓｍにおいては、恒温槽を用いた厳密な温
度管理が要求される。このような温度管理は、電気泳動
装置が平板型であり、消費する電力も大きいため発熱が
大きく、装置を更に高価格化、かつ大型化する要因とな
っていた。この点に関しては、キャピラリー型の電気泳
動装置を用いることにより、小型で泳動部の体積が小さ
くなり、このため、管理が容易となる。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】ところで、上述したよ
うな従来の技術の蛍光検出法による電気泳動パターン読
取りを行う電気泳動装置においては、螢光物質の励起波
長に合わせて、特殊なレーザ光源を用いなければなら
ず、電気泳動装置を製造する場合、装置の全体価格に占
めるレーザ光源のコストが大きく、装置価格が割高にな
ってしまうという問題がある。また、レーザ光源から発
する光は、喩えその光が散乱光であっても高いエネルギ
ー密度を有しており、目などに入ると、色弱などの視力
障害や失明などの危険性がある。したがって、レーザ光
源を用いる場合、特にその取り扱いに注意しなければな
らず、レーザ光源を装置に組み込む場合には、その取り
扱いの安全性を考慮した構造として組み込まなければな
らない。このため、更に装置価格が割高になってしまう
という問題がある。

【００１５】本発明は上記のような問題点を解決するた
めになされたものであり、本発明の目的は、安価で取り
扱いの容易なゲル電気泳動パターン読み取り装置を提供
することにある。

【００１６】また、本発明の他の目的は、特殊なレーザ
光源など高価な装置構成を必要とせず、核酸やタンパク
質を泳動分離した電気泳動パターンを、高い検出感度で
読み取ることができるゲル電気泳動パターン読み取り装
置を提供することにある。

【００１７】上述のような目的を達成するため、本発明
のゲル電気泳動パターン読み取り装置は、螢光物質によ
り標識した試料を電気泳動ゲルの入口側から供給する試
料供給手段と、該電気泳動ゲルの入口側と出口側の近傍
に設けた泳動電極に泳動電圧を印加して試料を電気泳動
分離する電気泳動手段と、該電気泳動ゲルの出口側から
搬送流体を供給すると共に前記電気泳動ゲルの出口側の
泳動電極から発生する気体を逃がす通路となる搬送流体
供給手段と、該電気泳動ゲルの出口側から電気泳動分離
された試料を連続して搬送流体中に流出させ搬送する搬
送手段と、該搬送流体に発光液を混合する混合手段と、
発光液が混合された後の搬送流体が所定距離だけ搬送さ
れた位置で該搬送流体中の試料から発光する蛍光を受光
する受光手段とを有することを特徴とする。

【００１８】また、本発明のゲル電気泳動パターン読み
取り装置は、ゲル電気泳動パターン読み取り装置におい
て、前記電気泳動ゲルの出口側の近傍に設ける泳動電極
を、電気泳動ゲルの出口の端面より高い位置に設け、前
記搬送流体供給手段は、電気泳動ゲルの出口の端面より
高い位置から搬送流体を供給する搬送流体供給管である
ことを特徴とする。

【００１９】また、更に、本発明のゲル電気泳動パター
ン読み取り装置においては、前記搬送流体が、電気泳動
ゲルにおける一方電極側の緩衝液と同様な組成を有する
液体であり、また、前記発光液は、過シュウ酸エステル
発光反応液であることを特徴とする。

【００２０】また、本発明のゲル電気泳動パターン読み
取り装置は、電気泳動を行うためのゲルと、ゲルを充填
した第１細管と、試料の入口となるゲルの端部に接触す
る緩衝液を溜める第１緩衝液槽と、第１緩衝液槽の緩衝
液に接触する第１電極と、試料の出口となるゲルの端部
に接触する緩衝液を溜める第２緩衝液槽と、試料の出口
となるゲルの端部より高い位置で第２緩衝液槽の緩衝液
に接触する第２電極と、第１電極および第２電極の間に
泳動電圧を印加する電源と、第２緩衝液槽の上部側から
緩衝液を供給する緩衝液供給管と、第２緩衝液槽から緩
衝液が供給されて泳動分離した試料を流す第２細管と、
化学発光液を供給する第３細管と、第２細管からの液体
と第３細管からの液体を混合する混合器と、混合器から
の混合液を流して化学発光液の反応遅延時間を与える第
４細管と、第４細管の終端部に設けられ混合液から蛍光
を検出する蛍光検出器と、蛍光検出器で検出された蛍光
の電気信号を処理するデータ処理装置とを備えることを
特徴とする。

【００２１】また、本発明のゲル電気泳動パターン読み
取り装置において、蛍光検出器は、試料を流す緩衝液と
化学発光液との混合液を蛇行させて流す細管を備え、光
電変換素子の前に該細管により蛇行させた混合液を流す
ことを特徴とする。

【００２２】

【作用】本発明のゲル電気泳動パターン読み取り装置に
おいては、試料供給手段が、螢光物質により標識した試
料を電気泳動ゲルの入口側から供給すると、電気泳動手
段が、該電気泳動ゲルの入口側と出口側の近傍に設けた
泳動電極に泳動電圧を印加して試料を電気泳動分離す
る。搬送流体供給手段は、該電気泳動ゲルの出口側から
搬送流体を供給すると共に、前記電気泳動ゲルの出口側
の泳動電極から発生する気体を逃がす通路となる。搬送
手段は、該電気泳動ゲルの出口側から電気泳動分離され
た試料を連続して搬送流体中に流出させ搬送する。混合
手段がここで該搬送流体に発光液を混合するので、その
後、電気泳動分離された試料を搬送している搬送流体中
において、発光液から発光した中間活性体が、試料に標
識された蛍光物質を励起させる。その結果、試料の蛍光
物質から蛍光が発する。受光手段は、搬送流体の流路に
おいて試料に標識された蛍光物質が励起して蛍光を発す
るまでの時間を経過した位置となっている（当該搬送流
体が所定距離だけ搬送された）位置で、該搬送流体中の
試料から発光する蛍光を受光する。

【００２３】このように、本発明のゲル電気泳動パター
ン読み取り装置においては、電気泳動した試料の螢光物
質を励起するための光として、レーザ光源の光を用い
ず、例えば、化学反応発光を行う発光液から発生した中
間活性体を用いる。中間活性体のエネルギーは、螢光物
質に移送され、試料の螢光物質に対して十分な励起作用
を及ぼす。この結果、試料の螢光物質は十分に励起され
て蛍光を発光するので、通常の光検出器により、十分な
検出感度で電気泳動蛍光パターンを検出することができ
る。

【００２４】本発明のゲル電気泳動パターン読み取り装
置においては、電気泳動ゲルの出口側に設ける泳動電極
が、電気泳動ゲルの出口の端面より高い位置に設けられ
て、前記搬送流体供給手段が、電気泳動ゲルの出口の端
面より高い位置から搬送流体を供給し、該泳動電極から
発生する気体を前記搬送流体の供給路を介して除去す
る。これは、電気泳動手段が電気泳動ゲルに泳動電圧を
印加して試料を電気泳動分離する際、電気分解による気
体が発生するので、この気体が電気泳動ゲルの出口側の
たまると電気泳動を阻害する要因となるため、搬送流体
供給手段の通路からこの気体を除去する。また、この気
体は、搬送手段が電気泳動ゲルの出口側から電気泳動分
離された試料を連続して搬送流体中に流出させて搬送す
る際にも、その搬送流体の流れを乱し、搬送流体中にお
いて試料を電気泳動分離された状態で移送することを乱
す要因ともなるので、搬送流体供給手段の通路から搬送
流体の移送の前にこの気体を除去する。

【００２５】ここでの搬送流体は、電気泳動ゲルにおけ
る一方電極側の緩衝液と同様な組成を有する液体とす
る。このため、搬送流体を電気泳動ゲルの一方電極側の
緩衝液としてそのまま利用することができ、電気泳動ゲ
ルの出口側から緩衝液の中に吐き出される電気泳動分離
された試料を搬送流体中に導入されたものとして、その
まま搬送する。

【００２６】また、本発明のゲル電気泳動パターン読み
取り装置では、前記発光液は、過シュウ酸エステル発光
反応液を用いる。この過シュウ酸エステル発光反応液
は、中間活性体を生成して、そのエネルギーを蛍光物質
に与えて発光する機構を有するため、中間活性体の生成
反応を調整することにより、発光量の調整を容易に行う
ことができ、その反応時間を調整して、試料の蛍光物質
に与える励起のための光量を調整できる。

【００２７】また、本発明のゲル電気泳動パターン読み
取り装置において、蛍光検出器は、試料を流す緩衝液と
化学発光液との混合液を蛇行させて流す細管を備えてお
り、該細管により混合液を蛇行させて光電変換素子の前
を流すことにより、光電変換素子の前を通過する時間を
長くして、混合液から発する蛍光を検出する。これによ
り、蛍光の検出感度が高められる。

【００２８】このように、本発明のゲル電気泳動パター
ン読み取り装置においては、螢光物質により標識した試
料を電気泳動ゲルへ供給するプロセス，電気泳動ゲルで
試料を電気泳動するプロセス，電気泳動した試料の螢光
物質を励起するプロセス，および試料の螢光物質から蛍
光を受光するプロセスの各々のプロセスを、ここで搬送
流体の中に試料を流す搬送流体の一連の流れで行うこと
ができ、これにより、試料のゲル電気泳動パターン読み
取りを連続して行うことができる。

【００２９】

【実施例】以下、本発明の実施例を図面を用いて具体的
に説明する。図１は、本発明の一実施例にかかる電気泳
動パターン読み取り装置の全体の装置構成を説明するブ
ロック図である。図１において、１０は試料供給部、１
１は電気泳動ゲル、１２は細管、１３は上部緩衝液槽、
１４は下部緩衝液槽、１５ａは第１電極、１５ｂは第２
電極、１６は電源、１７は搬送流体供給部、１８は液溜
槽、１９は搬送流体供給管、２０は搬送流体出口、２１
は第１搬送細管、２２は混合器、２３は発光液供給管、
２４は発光液槽、２５は第２搬送細管、２６は遅延部、
２７は蛍光検出部、２８はデータ処理装置である。

【００３０】図１を参照して、装置構成から説明する
と、電気泳動装置の電気泳動部は、試料を注入して泳動
分離を行うための電気泳動ゲル１１を中心にして装置が
構成される。電気泳動ゲル１１は細管１２に充填されて
保持される。細管１２の上部側には上部緩衝液槽１３が
接続され、下部側には下部緩衝液槽１４が接続される。
上部緩衝液槽１３および下部緩衝液槽１４には緩衝液が
溜められ、電気泳動ゲル１１に緩衝液を介して泳動電圧
が印加される。このため、上部緩衝液槽１３の緩衝液に
は第１電極１５ａが設けられ、上部緩衝液槽１４には第
２電極１５ｂが設けられて、この第１電極１５ａおよび
第２電極１５ｂの間に泳動電圧を印加する電源１６が電
気的に接続される。

【００３１】上部緩衝液槽１３の側が、電気泳動ゲル１
１で泳動分離する試料の入口側となる。このため、上部
緩衝液槽１３に試料供給部１０が結合され、泳動分離す
る試料の供給を受けて、電気泳動ゲル１１に対して上部
緩衝液槽１３の緩衝液を介して泳動分離する試料が注入
される。下部緩衝液槽１４の側が、電気泳動ゲル１１に
より泳動分離された試料の出口側となる。このため、下
部緩衝液槽１４の下部側には、泳動分離された試料を搬
送流体によって導出する搬送流体出口２０が設けられ
る。

【００３２】ところで、電気泳動ゲル１１により泳動分
離された試料は、下部緩衝液槽１４の搬送流体出口２０
から搬送流体と共に導出されるが、このため、下部緩衝
液槽１４には搬送流体が、搬送流体供給管１９から供給
される。また、搬送流体供給管１９は、一定の流速およ
び流量での搬送流体の供給を維持するため、搬送流体を
溜めている液溜槽１８に接続されており、液溜槽１８に
は搬送流体の所定量が搬送流体供給部１７から供給され
溜められる。

【００３３】ここでの下部緩衝液槽１４に供給される搬
送流体は、電気泳動ゲル１１に対する緩衝液としても機
能する組成を有するものが必要となるため、好ましく
は、上部緩衝液槽１３で用いられる緩衝液と同じ組成の
液体が用いられ、または、この緩衝液と同様な組成を有
する液体が用いられても良い。下部緩衝液槽１４の緩衝
液は、搬送流体として機能することが必要あるため、上
部緩衝液槽１３の緩衝液と同じものとはせず、流動性を
高めた組成としても良い。

【００３４】また、電気泳動装置の泳動パターン検出部
は、図１のブロック図の下部に示されるように、下部緩
衝液槽１４の搬送流体出口２０から導出された搬送流体
の流路を中心に構成される。下部緩衝液槽１４の搬送流
体出口２０は、第１搬送細管２１に接続され、第１搬送
細管２１は混合器２２の一方の入口に接続される。混合
器２２の他方の入口は、発光液槽２４から発光液が供給
される発光液供給細管２３に接続されており、混合器２
２において、一方の入口から供給されている泳動分離さ
れた試料を含む搬送流体と、他方の入口から供給されて
いる発光液が混合される。混合器２２の出口は第２搬送
細管２５に接続されている。第２搬送細管２５は、混合
器からの混合液を流して発光液の化学発光の反応遅延時
間を与える遅延部２６を有しており、遅延部２６を経て
蛍光検出部２７に至る。蛍光検出部２７は蛍光を検出す
るための光電子増倍管を備えており、蛍光検出部２７で
検出された蛍光を電気信号に変換する。変換された電気
信号は、データ処理装置２８に供給されて信号処理され
る。

【００３５】発光液槽２４の発光液としては、ケミルミ
ネッセンスなどの化学的発光液、ほたるの発光などで知
られていバイオルミネッセンスの発光液などが利用され
る。ケミルミネッセンスのなかでは、特に、中間活性体
を生成し、そのエネルギーを蛍光物質に与えて蛍光を発
生する過シュウ酸エステル化学反応などが好適に利用に
できる。この過シュウ酸エステル化学反応による発光液
は、従来からＤＮＡの解析のために試料に標識している
蛍光物質を用いて、その蛍光物質を励起させるための効
率のよい発光を得ることができ、蛍光物質の発光領域に
おいて有効な波長の励起光を得ることができる。

【００３６】次に、このように構成される電気泳動装置
の一連の動作について説明する。まず、化学発光を担う
酵素、または発光基質などの蛍光物質で標識した試料
を、試料供給部１０から上部緩衝液槽１３に注入して、
細管１２に充填されている電気泳動ゲル１１に導入す
る。ここでの試料に標識する蛍光物質としては、従来か
らＤＮＡの電気泳動パターン解析などで多く用いられて
いる標識物質と同様な蛍光物質を用いる。すなわち、こ
こでは、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴ
Ｃ）、イソチオシアン酸ローダミン（ＥＩＴＣ）、イソ
チオシアン酸テトラメチルローダミン（ＴＭＲＩＴ
Ｃ），および置換イソチオシアン酸ローダミン（ＸＲＩ
ＴＣ）の４種を用いる。

【００３７】試料を電気泳動ゲル１１に導入した後、第
１電極１５ａおよび第２電極１５ｂの間に、電源１６か
らの泳動電圧を印加する。泳動電圧として１０ｋＶの電
圧を電気泳動ゲル１１の両端に印加すると、試料は泳動
し始める。このとき、電気泳動の副作用として、第１電
極１５ａおよび第２電極１５ｂの各電極板には電気分解
による気体が発生するが、上部緩衝液槽１３の電極板の
側で発生する気体は、そのまま上部側から放出される。
また、下部緩衝液槽１４の電極板の側で発生する気体
が、下部緩衝液槽１４の中で電気泳動ゲル１１の終端部
に溜ると、電気泳動を阻害する要因となるので、第２電
極１５ａの電極板は、電気泳動ゲル１１の終端部のゲル
端面よりも高い位置に配置し、更に、この第２電極１５
ａの電極板から発生する気体は、下部緩衝液槽１４の上
部側から搬送流体供給管１９を介して（搬送流体の緩衝
液の流れとは逆方向に流れて）外部に放出されるような
配置とする。

【００３８】電気泳動により泳動分離された状態の試料
は、搬送流体供給管１９から供給される搬送流体の緩衝
液の流れに沿って、下部緩衝液槽１４の下部側の搬送流
体出口２０から搬送流体と共に導出され、第１搬送細管
２１を流れて、混合器２２に到達する。混合器２２に
は、化学発光のための基質を含む発光液が発光液供給細
管２３から供給されており、混合器２２において、泳動
分離された状態の試料を含む搬送流体の緩衝液の中に、
発光液の化学発光のための基質が混合される。混合器２
２で発光液を混合された混合液体は、搬送流体の緩衝液
の流れに沿って、混合器２２から第２搬送細管２５を流
れて、更に、遅延部２６を流れて、化学発光の反応遅延
時間の経過した流れを形成した後に、蛍光検出部２７を
通過して捨てられる。

【００３９】発光液供給細管２３から供給される化学発
光のための基質を含む発光液は、発光基質として、アリ
ルオキザレートと過酸化水素水溶媒としてアセトントリ
ル、またはアセトアルカリ触媒としてのイミダゾールな
どとの混合液が用いられる。アリルオキザレートとして
は、ビス（２，４，６−トリクロロフェニル）オキザレ
ート（ＴＣＰＯ）と、ビス［４−ニトロ−２−（３，
６，４−トリオキサデシロキシカルボニル）フェニル］
オキザレート（ＴＤＰＯ）およびビス−（２，４−ジニ
トロフェニル）オキザレート（ＤＮＰＯ）が使用でき
る。

【００４０】蛍光検出部２７は、目的の波長を選択的に
透過するため光学ファイルタと光電変換素子から構成さ
れており、従来の技術による蛍光検出器と同様に、検出
部における細管を通過する搬送流体（試料および発光液
を含む緩衝液）からの蛍光を検出して電気信号に変換す
る。電気信号に変換された蛍光のパターンは、そのまま
泳動分離された試料の電気泳動パターンを示しており、
この電気泳動パターンをデータ処理装置２８に入力して
データ処理を行う。すなわち、データ処理装置２８で
は、検出された蛍光の強度に応じてそのピーク位置を求
めて、分子量別に分離した試料の配列を求める。

【００４１】この場合、蛍光検出部２７における蛍光の
検出は、発光液を混合され泳動分離された試料を含む緩
衝液の混合液体が、搬送流体としての流れに沿って、検
出部における細管を通過する間に、この混合液体から発
光している蛍光を光電変換素子が検出する。このため、
ここでは更に蛍光の集光効率を向上させるために、種々
の構成が可能である。

【００４２】図２は、集光効率を向上させた蛍光検出部
の構成例を説明する図である。例えば、図２に示すよう
に、蛍光検出部２７において、光電変換素子の検出部の
前を混合液体が通過する細管を蛇行させることにより、
光電変換素子の光電子増倍管に対する検出部の細管の発
光領域の面積を増加させて、感度よく蛍光の検出を行う
ような構成とすることができる。蛇行以外の方法とし
て、また、螺旋上に巻くことも可能である。この蛍光検
出部２７における蛍光検出では、レーザ光源からのレー
ザ光による励起方法の蛍光検出と比較して、励起光によ
る散乱がないため比較的容易に高感度を得ることができ
る。

【００４３】また、蛍光物質の標識材料は、レーザで励
起する蛍光式の装置が種々開発されているため、入手に
問題となることはない。また、試料となるＤＮＡが微量
である場合であっても、蛍光標識したプライマやダイデ
オキシ・ヌクレオチドを用いて、遺伝子増幅の方法（ポ
リメラーザ・チェイン・リアクション法など）を用いる
ことにより、比較的簡単に必要量を得ることが可能であ
る。

【００４４】次に、ＤＮＡに直接的に蛍光物質を共有結
合させる以外の方法として、ＤＮＡの２本鎖に挾まり込
む（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅ）色素を用いる例を説明す
る。蛍光物質としては、エチジウム・ホモダイマー（Ｅ
ｔｈｄｉｕｍＨｏｍｏｄｉｍｅｒ），ジアゾール・オ
レンジ・ホモダイマー（ＴｈｉａｚｏｌｅＯｒａｎｇ
ｅＨｏｍｏｄｉｍｅｒ），オギサゾール・イエロー・
ホモダイマー（ＯｘａｚｏｌｅＹｅｌｌｏｗＨｏｍ
ｏｄｉｍｅｒ）などの色素を用いる（例えば、Ｎａｔｕ
ｒｅ，Ｖｏｌ．３５９，２９Ｏｃｔ．，ｐｐ．８５９
〜８６１，１９９２を参照）。これらの色素は、試料と
なるＤＮＡ断片と混合するだけで、２本鎖の隙間の部分
に挾まり込み脱落しにくい特徴を有している。従って、
特に、標識するための化学的処理は不要であり、実験を
非常に能率的に行うことができる。

【００４５】図３は電気泳動パターンを得る場合の標準
となるマーカおよびサンプルＤＮＡを泳動した結果から
得られる蛍光強度の時間推移をそれぞれに示す図であ
る。マーカには、λ−ＤＮＡをＨｉｎｄ IIIにて消化
したものを用いた場合を示しており、色素は、エチジウ
ム・ホモダイマーを使用している。この結果、マーカの
泳動結果として、図３（ａ）に示すような蛍光強度の時
間推移が得られる。

【００４６】また、サンプルＤＮＡには、Ｍ１３ｍｐ１
８ＤＮＡを制限酵素Ｂｓｐ１２８６Ｉで分解したものを
用いた場合を示しており、色素は、ジアゾール・オレン
ジ・ホモダイマーを使用している。この結果、サンプル
の泳動結果は、図３（ｂ）に示すような蛍光強度の時間
推移が得られる。このような方法によると、蛍光物質を
標識することが簡単に行えることから、２本鎖ＤＮＡを
用いた実験に手軽に用いることが可能である。

【００４７】以上に説明した本実施例では、ゲルの終端
から試料が出てくるまでの間、蛍光検出ができないの
で、始めは印加電圧を上げて高速電気泳動を行ってい
る。キャピラリ方式による電気泳動装置では、ゲルの断
面積が小さいため電圧を上げても流れる電流量は数ｍＡ
と少ない。また、本実施例による電気泳動装置において
は、泳動電圧を印加する電圧源はその泳動電圧を可変で
きる構成とし、印加電圧を泳動中に除々に上げる制御を
行うことにより、大型のＤＮＡ断片部分でも比較的に高
速に分離することを可能としている。これは、特に、バ
ンド間隔がＤＮＡで一定となるように制御する場合など
に便利な構成となっている。

【００４８】

【発明の効果】以上に述べたように、本発明の電気泳動
パターン読み取り装置によれば、レーザ光源を使用しな
いで試料に標識された蛍光物質を発光させるため、励起
光による散乱光がなく、高い信号雑音比で信号を検出す
ることができる。また、これにより、高価なレーザ光源
が不要であるため、装置を安価に実現できるという効果
を奏する。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の一実施例にかかる電気泳動パ
ターン読み取り装置の全体の装置構成を説明するブロッ
ク図、

【図２】図２は、集光効率を向上させた蛍光検出部の構
成例を説明する図、

【図３】図３は、電気泳動パターンを得る場合の標準と
なるマーカおよびサンプルＤＮＡを泳動した結果から得
られる蛍光強度の時間推移をそれぞれに示す図、

【図４】図４は、蛍光検出法によるゲル電気泳動分離パ
ターン検出方法を説明するためのゲル電気泳動装置の概
略のブロック図、

【図５】図５は、蛍光検出法によるゲル電気泳動分離パ
ターン検出方法を説明するためのゲル電気泳動装置の蛍
光検出部の一部の詳細を示す図である。

【符号の説明】

１０…試料供給部１１…電気泳動ゲル１２…細管１３…上部緩衝液槽１４…下部緩衝液槽１５ａ…第１電極１５ｂ…第２電極１６…電源１７…搬送流体供給部１８…液溜槽１９…搬送流体供給管２０…搬送流体出口２１…第１搬送細管２２…混合器２３…発光液供給管２４…発光液槽２５…第２搬送細管２６…遅延部２７…蛍光検出部２８…データ処理装置３１…ゲル３２…細管３３…上部緩衝液槽３４…下部緩衝液槽３５ａ…第１の電極３５ｂ…第２の電極３５ｂ３６…光源３７…検出器３８…データ処理部３９…電源

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者山本顕次神奈川県横浜市中区尾上町６丁目81番地日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社内 (56)参考文献特開昭63−222264（ＪＰ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】螢光物質により標識した試料を電気泳動
ゲルの入口側から供給する試料供給手段と、該電気泳動
ゲルの入口側と出口側の近傍に設けた泳動電極に泳動電
圧を印加して試料を電気泳動分離する電気泳動手段と、
該電気泳動ゲルの出口側から搬送流体を供給すると共に
前記電気泳動ゲルの出口側の泳動電極から発生する気体
を逃がす通路となる搬送流体供給手段と、該電気泳動ゲ
ルの出口側から電気泳動分離された試料を連続して搬送
流体中に流出させ搬送する搬送手段と、該搬送流体に発
光液を混合する混合手段と、発光液が混合された後の搬
送流体が所定距離だけ搬送された位置で該搬送流体中の
試料から発光する蛍光を受光する受光手段とを有するこ
とを特徴とするゲル電気泳動パターン読み取り装置。
【請求項２】請求項１に記載のゲル電気泳動パターン
読み取り装置において、前記電気泳動ゲルの出口側の近
傍に設ける泳動電極を、電気泳動ゲルの出口の端面より
高い位置に設け、前記搬送流体供給手段は、電気泳動ゲ
ルの出口の端面より高い位置から搬送流体を供給する搬
送流体供給管であることを特徴とするゲル電気泳動パタ
ーン読み取り装置。
【請求項３】請求項１に記載のゲル電気泳動パターン
読み取り装置において、前記搬送流体は、電気泳動ゲル
における一方電極側の緩衝液と同様な組成を有する液体
であることを特徴とするゲル電気泳動パターン読み取り
装置。
【請求項４】請求項１に記載のゲル電気泳動パターン
読み取り装置において、前記発光液は、過シュウ酸エス
テル発光反応液であることを特徴とするゲル電気泳動パ
ターン読み取り装置。
【請求項５】電気泳動を行うためのゲルと、ゲルを充
填した第１細管と、試料の入口となるゲルの端部に接触
する緩衝液を溜める第１緩衝液槽と、第１緩衝液槽の緩
衝液に接触する第１電極と、試料の出口となるゲルの端
部に接触する緩衝液を溜める第２緩衝液槽と、試料の出
口となるゲルの端部より高い位置で第２緩衝液槽の緩衝
液に接触する第２電極と、第１電極および第２電極の間
に泳動電圧を印加する電源と、第２緩衝液槽の上部側か
ら緩衝液を供給する緩衝液供給管と、第２緩衝液槽から
緩衝液が供給されて泳動分離した試料を流す第２細管
と、化学発光液を供給する第３細管と、第２細管からの
液体と第３細管からの液体を混合する混合器と、混合器
からの混合液を流して化学発光液の反応遅延時間を与え
る第４細管と、第４細管の終端部に設けられ混合液から
蛍光を検出する蛍光検出器と、蛍光検出器で検出された
蛍光の電気信号を処理するデータ処理装置とを備えるこ
とを特徴とするゲル電気泳動パターン読み取り装置。
【請求項６】請求項５に記載のゲル電気泳動パターン
読み取り装置において、蛍光検出器は、試料を流す緩衝
液と化学発光液との混合液を蛇行させて流す細管を有
し、光電変換素子の前に該細管により蛇行させた混合液
を流すことを特徴とするゲル電気泳動パターン読み取り
装置。