DE3926687A1 - Durchlaufgelelektrophorese-apparatur - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Apparatur zur Durchführung von Gelenktrophoresen im Durchlaufverfahren.

Die währen der Elektrophorese aus einem homogenen Makromolekül-Gemisch sepa­ rierten Fraktionen sollen durch die Durchlauf-Vorrichtung aus dem Gel heraus­ eluiert werden und somit eine Isolierung ermöglichen, ohne das Gel zu zerstören.

Stand der Technik

Die Gelelektrophorese ist in allen ihren Varianten eines der wichtigsten biochemischen Analysenverfahrens. Damit kann in der Protein- und Nukleinsäureanalytik eine Auftrennung mit einer Auflösung erreicht werden, die mit anderen Methoden (wie z. B. Flüssigkeitschromatographie) nicht leicht erzielt werden kann. Mit der Gelelektrophorese werden geladene Makromoleküle (Proteine, DNA-Fragmente, Huminsäuren usw.) durch Anlegen eines elektrischen Feldes an einem Polymergel nach Größe und Ladung aufge­ trennt. Die am meisten angewendeten Varianten der Elektrophorese sind die Flachbett-Gelelektrophorese und die Röhrchen-Gelelektrophorese, wobei die separierten Fraktionen im Trennmedium (Gel) verbleiben. Eine quantitative Auswertung der Trennung ist bei diesen Verfahren nur bedingt möglich. Im Gegensatz dazu ermöglicht die Durchlauf-Gelelektrophorese die Elution der Fraktionen aus dem Trennmedium, so daß die qualitative Untersuchung und die quantitative Gewinnung der Fraktionen durch den on-line Anschluß von entsprechenden Geräten (Spektrometern, Fraktionsammlern) ermöglicht wird. Ein zu diesem Zweck in der Literatur beschriebenes Gerät (B. D. Hames und D. Rickwood (Hrs.): Gel electrophoresis of proteins, a partical approach, IRL Press, Oxford 1986, S. 136 pp) hat den Nachteil, daß es sehr aufwendig im Aufbau ist und trotz seiner Dimensionierung eine schlechte Trennleistung und -auflösung erbringt. Geräte dieses Typs werden heute von mehreren Herstellern im bundesdeutschen Handel angeboten bzw. vertrieben (HPEC^TM Model 230A und 270A von Applied Biosystems/6108 Weiterstadt, HPE^TM 100 System von BioRad/München, IP-3A Isotachophoretic Analyzer von Shimadzu/ Duisburg, Capillary Electrophoresis System I von Dionex / 6270 Idstein). Ihnen ist der Nachteil gemeinsam, daß sie Auftrennungen meistens nur im analyti­ schen Maßstab, und ohne die Möglichkeit Fraktionen aufzufangen, erlauben (Ausnahme: HPEC Model 230A von Applied Biosystems) und daß aufgrund ihres komplizierten Aufbaus und der aufwendigen Bedienung das Preis/ Leistungsverhältnis für den anvisierten Kundenkreis (Forschungs- und Universitätsinstitute), extrem ungünstig ausfällt. Somit bleibt diesen Geräten eine breite Anwendung im biochemisch-medizinischen Laboralltag erschwert.

Aufgabe

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine schnell aufzubauende, leicht bedienbare, universell einsetzbare und leicht in den bestehenden Gerätepark eines standardmäßig ausgerüsteten biochemisch-medizinischen Labors zu integrierende Durchlaufelektrophorese-Apparatur zu konstuieren, die elektrophoretische Auftrennungen im analytischen und semipräparativen Maßstab mit frei wählbaren Trennmedien und das Auffangen der separierten Fraktionen ermöglicht.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß wir zur Durchführung der Elektrophorese einen Apparat bestehend aus Elektrophorese-Rohr, oberer Elektrodenkammer und unterer Elektrodenkammer konstruiert haben, wobei die untere Elektrodenkammer vom Elutionspuffer, der gleichzeitig auch als Elektrolyt dient, ständig durchspült wird. Jede Fraktion, die während der Elektrophorese die untere Elektrodenkammer erreicht, wird durch den Elutionspuffer mitgenommen und zur weiteren Analyse und Aufnahme den angeschlossenen Detektoren und dem Fraktionsammler zugeführt. Die Dichtigkeit der Apparatur wird durch die Verwendung von Dichtungen mit Überwurfmuttern gewährleistet. Um die Bildung von größeren Gasblasen an der Elektrode und der Spülkammer der unteren Elektrodenkammer, die eine Unter­ brechung des elektrischen Stromflusses und somit auch der Elektrophorese zur Folge hätten, zu vermeiden, umspült ein Teil des Elutionsmittels die Elektrode der unteren Elektrodenkammer und wird über einen Bypass dem Elutionsmittel-Reservoir zugeführt. Dieser Teil des Elektrodenpuffers kommt nicht mit den zu eluierenden Fraktionen in Berührung. Die sich an der Elek­ trode bildenden Gasblasen werden von diesem Flüssigkeitsstrom mitgerissen.

Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen darin, daß die Apparatur leicht aufzubauen und zu bedienen und an jeden vorhandenden Detektor und Fraktionssammler anzuschließen ist. Die zum Betrieb benötigten Netzgerät und Umwälzpumpen gehören auch zur standardmäßigen Ausrüstung eines jeden Labors und können auch problemlos angeschlossen werden. Der Aufbau des Trenn-Rohres ermöglicht die Verwendung von beliebigen Trennmedien, so daß der Apparat sich zur Trennung von allen in der biochemisch-medizinischen Forschung anfallenden Gemischen eignet. Ein zusätzlicher Vorteil dieses Apparates ist, daß er für Trennungen sowohl im analytischen wie auch im halbpräparativen Bereich geeignet ist. Das bei der Flachbettgel-Elektro­ phorese häufig auftretende Problem der Quantifizierung der erhaltenen Frak­ tionen, die nur umständlich und ungenau erfolgt, wird durch die Elution mit anschließender photometrischer oder anderer (z. B. Radioaktivitätsmonitor o. ä.) Detektion elegant gelöst. Außerdem wird durch die Einführung eines Flüssigkeits-Bypass die Bildung von störenden Gasblasen an der Elektrode der unteren Elektrodenkammer verhindert.

Aufbau des Gerätes

(s. Konstruktionszeichnungen Blatt 1, 2 und 3): Das Gerät besteht aus der oberen Elektrodenkammer (1), dem Trenn-Rohr (2), der unteren Elektrodenkammer (3) und dem Füllsockel (4).

Die obere Elektrodenkammer ist mit einem Stromanschluß (1a) mit Schutz­ manschette (1b), einer Platindrahtelektrode (1c), zwei Schlauchanschlüssen (1d) und einem Haltestab (1h) versehen. Über die Schlauchanschlüsse (1d) wird die Elektrodenkammer mit einem Elektrolyt-Reservoir verbunden. Mittels einer Pumpe kann die Elektrolytlösung ständig umgewälzt werden, so daß Änderungen der Leitfähigkeit, die durch die Zersetzung der Elektrolytlösung entstehen, vermieden werden. Mit Hilfe des Haltestabes (1h) kann der Apparat an einem Laborstativ befestigt werden.

Das Trenn-Rohr (2) besteht aus dem Elektrophorese-Rohr (2a), dem Kühl­ mantel (2b) mit Oliven für den Kühlmittelanschluß (2e) und den beiden Überwurf-Schraubverbindungen (2c, 2d, 2f, 2g). An seinen beiden Enden ist der Kühlraum durch die Pfropfen wasserdicht verschlossen. Das Trenn-Rohr wird in die dafür vorgesehene Öffnung (1e) am Boden der oberen Elektrodenkammer (1) gesteckt. Zum Festhalten wird die obere Überwurf- Mutter (2c) auf die Haltemanschette (1g) geschraubt, Ring-Anschlag (2d) verhindert das Herausrutschen des Rohres und der O-Ring (1f) dichtet die Verbindung ab. Die Verbindung mit der unteren Elektrodenkammer wird in ähnlicher Weise durch Einstecken des Trenn-Rohres in die Öffnung (3k) und durch Anschrauben der Überwurf-Mutter (2f) auf die Manschette (3j) herge­ stellt. Festigkeit und Dichtigkeit werden hier durch den Ring-Anschlag (2g) und den O-Ring (3f) gewährleistet.

In der unteren Elektrodenkammer (3) befinden sich der Stromanschluß (3a) mit Schutzmanschette (3b) und Platin-Scheibenelektrode (3c) und das Elutionssystem bestehend aus den Einlauf- (3d) und Auslaufoliven (3e), dem Durchflußrohr (3g) mit der Elutionskammer (31) und dem Bypass-Anschluß (3h). Der Elutionspuffer wird über die Einlaufolive (3d) in das System ein­ gepumpt. Ein Teil des Puffers fließt durch die Elutionskammer (31), nimmt die dort ankommenden Fraktionen mit und verläßt die Kammer über die Olive (3e) in Richtung Detektoren usw. Ein anderer, geringerer Teil wird ständig bei einer geringerer Durchflußrate als der Hauptraum über den Bypass-Anschluß (3h) an der Elektrode (3c) vorbei in das Elektrodenpuffer-Reservoir zurück­ gepumpt. Er umspült dabei die Platin-Elektrode, so daß der elektrische Kon­ takt hergestellt wird. Gleichzeitig werden die an der Elektrode entstehenden Gasblasen, die sonst den elektrischen Kontakt stören oder unterbrechen würden, durch die Strömung fortgerissen.

Zum Einfüllen des Trenn-Mediums wird das Trenn-Rohr in die entsprechende Öffnung (4a) des Füllsockels (4) eingesteckt und mittels der schon erwähnten Vorrichtung (Überwurf-Mutter 2f, Manschette 4b) festgehalten. Eine Boden­ platte aus Silikongummi (4c) dichtet das Rohr von unten ab. In das Elek­ trophorese-Rohr (2a) kann nun die Monomer-Lösung eingefüllt werden, die nach dem Auspolymerisieren das Trenn-Medium ergibt.

Auf Blatt 4 der Konstruktionszeichnungen ist eine mögliche Zusammenschaltung des Durchlaufelektrophoresegerätes mit anderen analytischen Geräten zur Durchführung einer Elektrophorese aufgezeichnet.

Mögliches Anschlußschema der Durchlaufelektrophorese-Apparatur an bestehende Laborapparate

• 1. Durchlaufgelelektrophorese-Apparatur
• 2. Pumpen
• 3. Elektrodenpuffer-Reservoirs
• 4. Netzgerät
• 5. UV-Detektor
• 6. Schreiber
• 7. Radioaktivitätsdetektor o. anderer Detektor
• 8. Fraktionsammler

Claims (5)

1. Durchlaufgelelektrophorese-Apparatur, dadurch gekennzeichnet, daß die Apparatur aus einer oberen Elektrodenkammer (1), einem Trenn-Rohr (2), einer unteren Elektrodenkammer (3) und einem Füllsockel (4) zusammengesetzt ist.

2. Durchlaufgelelektrophorese-Apparatur nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die obere Elektrodenkammer (1) aus Stromanschluß (1a), Schutzmanschette (1b), Platindrahtelektrode (1c), Schlauchanschlüssen (1d), Haltemanschette (1g) mit O-Ring (1f) und Haltestab (1h) besteht.

3. Durchlaufgelelektrophorese-Apparatur nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Trenn-Rohr (2) aus Elektrophorese-Rohr (2a), Kühlmantel (2b) mit Oliven (2e) und Überwurf-Schraubverbindungen (2c, 2d, 2f, 2g) besteht.

4. Durchlaufgelelektrophorese-Apparatur nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die untere Elektrodenkammer (3) aus Stromanschluß (3a) mit Schutzmanschnette (3b) und Platin-Scheibenelektrode (3c), Haltemanschette (3j) mit O-Ring (3f) und dem Elutionssystem, bestehend aus Einlauf- und Auslaufoliven (3d, 3e), Durchflußrohr (3g), Elutionskammer (3i) und Bypass-Anschluß (3h) besteht.

5. Durchlaufelektrophorese-Apparatur nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Füllsockel (4) aus Haltemanschette (4b) und Bodenplatte (4c) besteht.