DE3337668C2

DE3337668C2 - Verfahren zur Elektroelution elektrisch geladener Makromoleküle

Info

Publication number: DE3337668C2
Application number: DE3337668A
Authority: DE
Inventors: Andreas Dr. 7800 Freiburg Clad; Nils Dr. 3352 Einbeck Hese; Manfred 3350 Kreiensen Weisweiler
Original assignee: Schleicher and Schuell GmbH
Current assignee: General Electric Deutschland Holding GmbH
Priority date: 1983-10-17
Filing date: 1983-10-17
Publication date: 1985-12-05
Also published as: DE3337668A1; FR2553294A1; GB2148325A; GB8415860D0; JPS6098348A; IL72108A0

Abstract

Das Verfahren zur praktisch verlustfreien Elektroelution von elektrisch geladenen Makromolekülen, insbesondere biologischen Ursprungs, ist dadurch gekennzeichnet, daß die eluierten Makromoleküle in einer aus zwei hintereinandergeschalteten Polymermembranen gebildeten Fallen gefangen werden, von denen die erste Membran die im elektrischen Feld wandernden Makromoleküle hindurchtreten läßt, die nachfolgende zweite Membran aber der weiteren Wanderung der Makromoleküle undurchlässig entgegensteht, während die kleineren Ionen und Moleküle durchgelassen werden. Nach Abschalten des elektrischen Feldes sind beide Membranen der Falle für jeglichen Stofftransport praktisch undurchlässig. Die Makromoleküle können dann bequem in hochkonzentrierter Form aus der Falle mit dem in der Falle enthaltenen flüssigen Medium abpipettiert werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Elektroelution von elektrisch geladenen Makromolekülen der im Oberbegriff des Anspruchs 1 genannten Art.

Unter Elektroelution wird dabei im Rahmen der Erfindung nicht nur die Elution von Makromolekülen aus Gelen, insbesondere Elektrophoresegelen, also die klassische Elektroelution verstanden, sondern auch das EIuieren aus verdünnten Lösungen zum Zwecke des Konzentrierens oder das Überführen von Makromolekülen aus Lösungen zum Zwecke der Entsalzung oder Umpufferung (Dialyse). Aus Gründen der klareren Darstellung wird für alle diese Aspekte der Oberbegriff »Elektroelution« zur Beschreibung der Erfindung definiert und benutzt

Elektrisch geladene Makromoleküle im Sinne der Erfindung sind Makromoleküle mit einem Molekulargewicht von größer als 1000 und sind speziell biologische Makromoleküle wie insbesondere DNA, RNA oder Proteine.

Ein Verfahren der im Oberbegriff des Patentanspruchs 1 genannten Art ist aus der Zeitschrift Analyti-

to cal Biochemistry 124, 299 bis 302 (1982) bekannt Als Falle für die eluierten Makromoleküle dient dabei ein Nylonsäckchen, in dem ein Adsorbtionsgel, insbesondere Malachitgrüngel, enthalten ist, in dem die aus dem Elektrophoresegel eluierten Makromoleküle zwischen adsorbiert werden. Nach vollständiger Elektroelution wird das Zwischenadsorptionsgel seinerseits auf einer Säule eluiert, insbesondere mit einmolarer Natriumperchloratlösung. Die durch diese Zwischenadsorption entstehenden Verluste an Makromolekülen liegen bei min-

destens 25%, so daß also mit anderen Worten nach diesem Verfahren, das das beste derzeit zur Verfugung stehende Verfahren ist, Ausbeuten von höchstens 75% erzielbar sind. Außerdem ist das Verfahren ungewöhnlich zeitraubend und kostenaufwendig. Kostenaufwen- dig insbesondere im Hinblick auf die hohen Materialkosten vor allem des Zwischenadsorptionsgeis und zeitaufwendig durch die zweite Elution der Makromoleküle. So wird für die Aufarbeitung einer Elektrophoresegelfraktion nach dem bekannten Verfahren eine Zeit von mindestens 40 min benötigt

Angesichts dieses Standes der Technik liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu schaffen, nach dem elektrisch geladene Makromoleküle beliebigen Ursprungs rascher, verlustfreier und mit geringeren

Betriebskosten elektroeluierbar sind.

Die Erfindung löst diese Aufgabe durch ein Verfahren der eingangs genannten Art das die im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 genannten Merkmale aufweist Mit anderen Worten, der Kerngedanke der Erfindung beruht also darauf, die unter Einwirkung des äußeren elektrischen Feldes eluierten und überführten Makromoleküle nicht in einer Adsorptionsfalle einzufangen, sondern in einer zwischen zwei Polymermembranen gebildeten Falle, die mit destilliertem Wasser oder mit Pufferlösung gefüllt ist aufzufangen. Dies gelingt dadurch, daß die eluierten Makromoleküle zunächst auf eine innere Fallenmembran geführt werden, die in Gegenwart des elektrischen Feldes auch für Makromoleküle duchlässig ist, und dann auf eine äußere Fallen- membran, ebenfalls eine Polymermembran, geführt werden, die auch im elektrischen Feld für die Makromoleküle unduchlässig ist Nach Abschalten des elektrischen Feldes ist auch die innere Fallenmembran praktisch für jeden Stofftransport undurchlässig, ist also ins- besondere auch wasserdicht so daß die in der Falle konzentrierten Makromoleküle zusammen mit dem in der Falle eingeschlossenen flüssigen Medium in einfacher Weise, beispielsweise durch Abpipettieren, aus der Falle entnommen werden können. Dieser Vorgang der Elektroelution elektrisch geladener Makromoleküle kann mit einer Ausbeute von mindestens 90% durchgeführt werden. Für die Elution einer Elektrophoresegelfraktion werden nicht mehr als 5 min benötigt. Außerdem entfallen die Kosten für das nach dem Stand der

Technik benötigte Zwischenadsorptionsgel.

Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung kann dadurch ein Problem entstehen, daß sich die in die Falle überführten Makromoleküle auf der äußeren Fallen-

membran ansammeln. Sie können dadurch nicht kurzfristig quantitativ mit dem in der Falle eingeschlossenen flüssigen Medium entnommen werden. Dieser Ansammlung, Haftung und/oder Adsorption der elektrisch geladenen Makromoleküle auf der äußeren, auch im elektrischen Feld undurchlässigen Fallenmeuibran kann dadurch begegnet werden, daß man nach Abschluß der eigentlichen Elektroelution und Überführung aller Makromoleküle in die Falle das äußere elektrische PeId kurz umpolt, wobei sämtliche an der äußeren Fallenmembran gesammelten elektrisch geladenen Makromoleküle von der Membran abgelöst werden und zurück in das Fallenmedium wandern. Das umgepolte Feld wird vorzugsweise für 10 bis 15 s angelegt Dem gleichen Zweck dient auch die Verwendung von Membranen, die gezielt jeweils negativ oder positiv geladene Teilchen nicht adsorbieren. Zu diesem Zweck wird also vor dem negativen Pol des äußeren elektrischen Feldes eine äußere Fallenmembran verwendet, die keine positiven Teilchen adsorbiert und umgekehrt, wird vor dem positiven Pol des äußeren elektrischen Feldes eine äußere Fallenmembran verwendet, die keine negativen Teilchen adsorbiert

Beide vorstehend beschriebenen Maßnahmen können selbstverständlich kombiniert verwendet werden.

Der Elutionsraum ist zumindest auf einer Seite von einer Falle begrenzt Auf der gegenüberliegenden Seite ist zwar vorzugweise auch eine Falle vorgesehen, jedoch braucht prinzipiell auch nur eine Abschlußmembran vorgesehen sein. Selbst ohne Abschlußmemtxan sind das Verfahren gemäß der Erfindung selbstverständlich noch funktionsfähig, insofern nämlich, als die im elektrischen Feld eluierten Makromoleküle bei richtiger Polung des Feldes in die eine vorhandene Falle wandern. Bei einem solcherart offenen Elutionsraum oder Elutionskanal steht die Falle jedoch stets unmittelbar mit dem relativ hoch konzentrierten Puffer oder Elektrolyten der horizontalen Elektrophoresekammer in Verbindung, in der die Vorrichtung in an sich bekannter Weise betrieben wird. Bei Abtrennung des Elutionsraumes durch zumindest eine für den Stofftransport in Abwesenheit eines elektrischen Feldes praktisch undurchlässige Abschlußmembran kann im Elutionsraum und in den Fallen ein flüssiges Medium verwendet werden, also beispielsweise eine Pufferlösung, die wesentlich verdünnter als die in der Elektrophoresekammer verwendete Pufferlösung ist. Besonders vorteilhaft können die Falle oder die Fallen und der Elutionsraum sogar mit destilliertem Wasser gefüllt werden.

Das Volumen der Falle ist vorzugsweise um den Faktor 10 bis 100 kleiner als das Volumen des Elutionsraumes. Dadurch wird in der Falle gleichzeitig ein spürbarer Konzentrationseffekt für die Makromoleküle erzielt

Membranen mit den vorstehend spezifizierten Eigenschaften sind in großer Vielfalt im Handel ohne weiteres erhältlich. Vorzugsweise werden mit Wasser benetzbare oder in Wasser quellbare Membranen eingesetzt, insbesondere Membranen auf der Basis von Cellulose, Celluloseester, Polyamiden, Polyimiden und Polysulfonen. Dabei werden insbesondere Membranen auf der Basis von Cellulose und Celluloseestern, speziell Celluloseacetat, bevorzugt.

Für die innere Fallenmembran wird dabei eine Membran mit einer Porengröße im Bereich von 0,055 bis 0,2 μιη ausgewählt, während für die äußere Membranen solche verwendet werden, die keine Moleküle mit einem Molekulargewicht von größer als 1000 durchlassen, und zwar auch nicht in Gegenwart eines relativ starken äußeren elektrischen Feldes. Der Benutzer wird im einzelnen nicht an die vorstehend hinweisend gegbenen Bemessungsgrenzen gebunden sein, sondern im einzelnen die Auslegung und Kombination der Membranen nach der speziell zu lösenden Elutionsaufgabe festlegen.

Weiterhin können die Membranen gestützt oder ungestützt, verstärkt oder unverstärkt sowie symmetrisch oder asymmetrisch aufgebaut sein. Stets wird über die Auswahl der Anwendungszweck entscheiden. Solche ίο Membranauswahl liegt im Bereich der täglichen Arbeit des Fachmanns. Bei Einsatz asymmetrischer Membranen ist jedoch darauf zu achten, daß die dichte oder »aktive« Oberfläche solcher asymmetrischer Polymermembranen vorzugsweise zum Innenraum der Falle gekehrt ist

Das Verfahren gemäß der Erfindung werden vor allem zur Elektroelution aus Elektrophoresegelen, zum Konzentrieren und Entsalzen von biologischen Makromolekülen wie beispielsweise DNA, RNA und Proteinen eingesetzt Ein weiteres wichtiges Anwendungsgebiet ist darüber hinaus das Aufkonzentrieren positiv geladener Makromoleküle, insbesondere positiv geladener Proteine, bei entsprechend eingestelltem pH-Wert als Selbst- und Endzweck oder in Kombination mit einer gleichzeitigen Reinigung und Konzentrierung negativ geladener Makromoleküle, also insbesondere eine Trennung positiv und negativ geladener biologischer Makromoleküle.

Das Verfahren und das Prinzip der Erfindungg sind anhand von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit der Zeichnung näher erläutert Es zeigt F i g. 1 in schematischer Darstellung ein erstes Ausführungsbeispiel; und
Fig.2 in ebenfalls schematischer Darstellung ein zweites Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

In der Fig. 1 sind schematisch ein Elutionsraum 1, eine am negativen Pol des äußeren elektrischen Feldes liegende Falle 2, eine am positiven Pol des äußeren elektrischen Feldes liegende Falle 3 und der Elektrolyt oder Puffer 4 der Elektrophoresekammer dargestellt, in der das Verfahren durchgeführt wird.

In der aus F i g. 1 ersichtlichen Weise sind beide Fallen 2, 3 von qualitativ gleichen Membranen, nämlich jeweils einer inneren Membran M 2 und einer äußeren Membran M1 begrenzt Das Medium, in dem die Elektroelution durchgeführt wird, weist einen Spiegel 5 auf, der dicht unterhalb der Oberkanten der Membranen steht, um einen möglichst großflächigen Stromdurchgang zu gewährleisten.

Nach Einschalten des elektrischen Feldes wandern die in der F i g. 1 mit einem großen Kreis symbolisierten negativ geladenen Makromoleküle aus dem Elutionsraum 1 durch die innere Fallenmembran M 2 hindurch auf die äußere Fallenmembran M1, durch die sie auch in Gegenwart eines elektrischen Feldes nicht hindurchtreten können, während die Pufferionen aus dem Medium im Elutionsraum 1 ohne weiteres auch durch die Membran 1 hindurch und in den Puffer 4 der Elektrophoresekammer eintreten. Die negativ geladenen Makromoleküle werden auf der äußeren Fallenmembran M1 gesammelt. Nach Überführung aller im Elutionsraum 1 vorhandenen negativ geladenen Makromoleküle durch die Membran M 2 hindurch in die Falle 3 wird der elektrische Strom für 10 bis 15 s umgepolt, so daß also in der Darstellung der F i g. 1 der positive Pol auf der linken Seite und der negative Pol auf der rechten Seite liegen. Dies führt zu einer Ablösung der auf der äußeren Mem-

bran M1 gesammelten negativ geladenen Makromoleküle und zu ihrer Überführung in den Innenraum der Falle 3. Aus dieser Falle können die Makromoleküle dann beispielsweise durch Abpipettieren des in der Falle 3 enthaltenen flüssigen Mediums quantitativ gewon- nen werden. Bei abgeschaltetem elektrischen Feld sind beide Membranen Mi, M2 praktisch für jeden Stofftransport undurchlässig, vor allem wasserdicht, verhindern also insbesondere ein Nachströmen von Wasser sowohl aus dem Elutionsraum 1 als auch aus der Elektrophoresekammer in die beispielsweise durch Abpipettieren allmählich leerer werden Falle 3.

In der F i g. 2 ist in der gleichen schematischen Darstellung wie in F i g. 1 eine modifizierte Membrananordnung dargestellt Bei der in F i g. 2 gezeigten Prinzip sind is die beiden äußeren Fallenmembranen MX und M3 nicht wie bei dem in F i g. 1 gezeigten Ausführungsbeispiel identisch. Vielmehr ist bei dem in F i g. 2 gezeigten Ausführungsbeispiel die Membran M1 so ausgerüstet, daß sie keine positiven Teilchen adsorbiert, während die dem positiven Pol des äußeren elektrischen Transportfeldes zugekehrte äußere Fallenmembran M 3 so ausgerüstet ist daß sie zumindest praktisch keine negativ geladenen Teilchen adsorbiert Bereits durch einen nur außerordentlich kurzen Spannungsstoß mit vertauschten Polen können sämtliche von der Oberfläche der äußeren Membran Λ/3 zurückgehaltenen elektrisch geladenen Makromoleküle in das flüssige Medium in der Falle 3 überführt werden. Im übrigen arbeitet die in F i g. 2 schematisch dargestellte Vorrichtung in gleicher Weise wie vorstehend im Zusammenhang mit der Fig. 1 erläutert

Von besonderem Vorteil ist daß die inneren Membranen M 2 wasserdicht sein müssen und damit so ausgewählt werden können, daß sie auch in Gegenwart eines elektrischen Feldes für Bakterien undurchlässig sind. Auf diese Weise wird in den Fallen 2,3 ein Makromolekülkonzentrat erhalten, das auch absolut bakterienfrei ist Eine solche bakterienfreie Elution ist bei den Verfahren nach dem Stand der Technik nicht möglich und führt zu häufig spürbaren Verlusten an Makromolekülen insbesondere biologischer Herkunft durch Bakterienfraß.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Elektroelution von elektrisch geladenen Makromolekülen durch Oberfuhren der zu eluierenden Makromoleküle unter Einwirkung eines äußeren elektrischen Feldes aus einem Elutionsraum in eine Falle, dadurch gekennzeichnet, daß die im elektrischen Feld wandernden Makromoleküle zunächst durch eine innere Fallenmembran (M 2) geführt werden, die im elektrischen Feld für die Makromolekaie durchlassig, in Abwesenheit eines äußeren elektrischen Feldes aber für jeden Stofftransport praktisch undurchlässig; insbesondere wasserdicht ist, und dann auf eine äußere Fallenmembran (MX; MZ) geführt werden, dre im elektrischen Feld zwar durchlassig für kleine Ionen und Moleküle ist, aber auch im elektrischen Feld keine Makromolekaie durchlaßt, und daß die Makromoleküle dann mit dem flüssigen Medium aus der Falle zwischen den beiden Fallenmembranen (M 1, M 2; M 2; M 3) entnommen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das elektrische Feld nach Oberführung aller Makromoleküle aus dem Elutionsraum in die Falle oder in die in Feidrichtung zu beiden Seiten des Elutionsraumes angeordneten Fallen (M 1, M 2; M 2, MS) kurzzeitig umgepolt wird, um die auf den für die Makromoleküle undurchlässigen Membranen (MV, M3) gesammelten Makromoleküle wieder von der Membran abzulösen und in das in der Falle vorgelegte Medium zu überführen.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als innere Membran (M 2) eine Membran eingesetzt wird, die auch in Gegenwart eines elektrischen Feldes für Bakterien undurchlässig ist

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei Einsat? von asymmetrischen Membranen, diese so angeordnet werden, daß die dichten oder aktiven Oberflächen dieser Membranen dem Innenraum der Falle (2, 3) zugekehrt sind.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als äußere Membranen solche einsetzt, die am negativen Pol des äußeren elektrischen Feldes liegende äußere Membran (MX) keine positiven Makromoleküle adsorbiert und absorbiert und die am positiven Pol des äußeren elektrischen Feldes liegende äußere Membran (M 3) keine negativen Makromoleküle adsorbiert und absorbiert