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Verfahren zur Elektroelution elektrisch geladener
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Makromoleküle Beschreibung Die Erfindung betrifft ein Verfahren der
im Oberbegriff des Anspruchs 1 genannten Art nach dem deutschen Patent DBP 33 37
668.
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Das deutsche Patent 33 37 668 beschreibt ein Verfahren der im Oberbegriff
des Anspruchs 1 genannten Art, bei dem bei Einsatz von asymmetrischen Membranen
diese so angeordnet werden, daß die glatten dichten aktiven Oberflächen dieser asymmetrischen
Membranen jeweils dem Innenraum der Falle zugekehrt sind. Für die beiden außenliegenden
Membranen des Elutionsgerätes, also für die Membranen
in den Positionen
M1 und M4 der hier beigefügten Zeichnung, bedeutet dies, daß die aktiven Oberflächen
dieser beiden außenliegenden asymmetrischen Membranen einander zugekehrt sind.
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Mit diesem Verfahren wird eine qualitativ einwandfreie Elution elektrisch
geladener Makromoleküle, speziell von RNA und DNA, aus dem vorgelegten Elektrophoresegel
und eine einwandfreie Aufkonzentrierung dieser elektrisch geladenen Makromoleküle
in der Falle erreicht. Bei länger dauernden Elutionsvorgängen, speziell bei dem
Versuch, die Elution in einem Arbeitsgang quantitativ durchzuführen, stellt sich
als unangenehmer Nebeneffekt jedoch ein relativ starkes Ansteigen des Pufferspiegels
sowohl in der Elutionskammer zwischen den beiden außenliegenden Fallen als auch
in diesen beiden Fallenkammern selbst ein.
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Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, das Verfahren der
eingangs genannten Art dahingehend zu verbessern, daß die Elution auch über einen
längeren Zeitraum, insbesondere bis zum quantitativen Endpunkt, durchgeführt werden
kann, ohne daß störende Pufferspiegelveränderungen eintreten.
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Zur Lösung dieser Aufgabe schafft die Erfindung ein Verfahren, das
durch die im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 genannten Merkmale erfindungswesentlich
gekennzeichnet ist.
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Nach einer Ausgestaltung der Erfindung können Veränderungen des Pufferspiegels
insbesondere dann vollständig ausgeschaltet werden, wenn die asymmetrischen Membranen
in den Außenpositionen in der Weise gleichsinnig angeordnet werden, daß ihre glatten
dichten aktiven Oberflächen gleichsinnig zum Pluspol des zur Elution angelegten
äußeren elektrischen Feldes weisen, wenn also die rauhe Oberfläche, also die
Oberfläche
der Stützstruktur oder Schwammstruktur der asymmetrischen Membran in der Position
M4 dem Inneren des Elutionsgerätes, genauer gesagt dem Inneren der Fallenkammer,
zugekehrt iSt. Überraschend bei dieser Membrananordnung ist dabei, daß die Wirkung
der Unterdrückung der Pufferspiegelveränderung durch eine solche Membrananordnung
erhalten werden kann, ohne daß sich dabei die Transporteigenschaften der Membran
in Position M4 für Wasser und kleine negativ geladene Pufferionen und andere kleine
Ionen sowie das Rückhaltevermögen für die negativ geladenen Makromoleküle, also
insbesondere für RNA- und DNA-Moleküle, nicht ändern. Der Einsatz solcher oder ähnlicher
asymmetrischer Membranen zur Durchführung der Umkehrosmose lehrt nämlich, daß bei
Verwendung der Membran in der Weise, daß deren rauhe Oberfläche dem Zulauf und deren
aktive Oberfläche dem Permeatraum zugekehrt ist, die Membran in aller Regel durch
Strukturzusammenbruch unbrauchbar wird, zumindest jedoch zu einer signifikanten
Verminderung der Rückhalteleistung führt. Daß gerade eine solche Verminderung der
Rückhalteleistung bei Verwendung der asymmetrischen Membran in Position M4 bei der
Elektroelution elektrisch geladener Makromoleküle im Rahmen des vorliegenden Verfahrens
nicht auftritt, ist zumindest ebenso überraschend wie die Tatsache, daß durch die
gleichsinnige Ausrichtung der aktiven Membranoberflächen die Pufferspiegelveränderung
unterbunden werden kann.
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Der durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erzielbare
wesentliche technische Fortschritt liegt darin, daß die Elektroelution aus einer
Elutionskammer heraus in eine Fallenkammer hinein theoretisch beliebig lange ohne
jeden Nachteil durchgeführt werden kann. Dies ermöglicht praktisch 100 %-ige Elutionsausbeuten
in einem einzigen Arbeitsgang. Dabei ist es jedoch zur sinnvollen praktischen
Ausnutzung
dieses Verfahrensvorteils wünschenswert und für eine Reihe mikrobiologischer Anwendungen
sicher auch erforderlich, den quantitativen Endpunkt der Elution verlustlos und
problemlos bestimmen zu können.
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Nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung werden zur Lösung
dieser Aufgabe die zu eluierenden Makromoleküle vorzugsweise radioaktiv markiert
und wird dann die Trennung einfach so lange durchgeführt, bis in der Elutionskammer
praktisch keine radioaktive Strahlung mehr gemessen werden kann, bis also praktisch
keine radioaktiv markierten Makromoleküle mehr in der Elutionskammer vorliegen.
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Zur Durchführung dieses Verfahrens gemäß der Ausgestaltung der Erfindung
wird dabei vorzugsweise so vorgegangen, daß nach kurzzeitigem Abschalten des elektrischen
Feldes der Inhalt der Elutionskammer in einen Szintillationszähler überführt und
dort auf verbliebene Makromoleküle vermessen wird. Wenn keine Restaktivität mehr
nachweisbar ist, die Anzahl der im Elutionskammerfluid verbliebenen radioaktiv markierten
Makromoleküle also so klein ist, daß ihre Aktivität unterhalb der Nachweisgrenze
des verwendeten Szintillationszählers liegt, wird dies als quantitativer Endpunkt
der Elution angesehen. Ist bei der Quantitätsprüfung der Endpunkt der Elution noch
nicht erreicht, so wird das ausgemessene Elutionskammerfluid aus dem Szintillationszähler
wieder in die Elutionskammer zurückgeführt. Anschließend wird das elektrische Feld
erneut eingeschaltet und die Elution so lange fortgesetzt, bis der Endpunkt der
Elution erreicht ist. Dabei wird diese Arbeitsweise nur dadurch ermöglicht, daß
sämtliche Membranen des Elutionsgerätes, also die Membranen in den Positionen M1,
M2, M3 und M4 in dem nachstehend beschriebenen Ausführungsbeispiel eines Elutionsgerätes,
sowohl für Wassermoleküle als auch für
Puffermoleküle und damit
erst recht für die bereits in den Fallen befindlichen Makromoleküle, absolut undurchlässig
werden bzw. sind.
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Bei entsprechender experimenteller bzw. verfahrenstechnischer Ausgestaltung
kann der zeitliche Radioaktivitätsverlauf in der Elutionskammer selbstverständlich
auch direkt in der Elutionskammer gemessen werden.
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Die Erfindung ist im folgenden anhand eines Ausführungsbeispiels in
Verbindung mit der Zeichnung näher erläutert.
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Dabei zeigt die einzige Figur, nämlich die Fig. 1 im schematischen
Axialschnitt ein Ausführungsbeispiel für ein Elutionsgerät zur Durchführung des
Verfahrens gemäß der Erfindung.
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In der Fig. 1 ist schematisch und im Axialschnitt ein Ausführungsbeispiel
für ein Elutionsgerät 1 zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung dargestellt.
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Das hier gezeigte Gerät weist zwei äußere Membranen in den Positionen
M1 und M4 auf, sowie zwei innere Membranen in den Positionen M2 und M3. Zwischen
den Membranen M2 und M3 ist eine Elutionskammer ausgebildet, zwischen den Membranen
und M1 und M2 bzw. M3 und M4 je eine Fallenkammer. Das Elutionsgerät 1 wird zur
Durchführung der Elution in eine gebräuchliche Elektrophoresekammer eingesetzt,
deren Feld durch die in der Fig. 1 dargestellten Polungsangaben 2,3 angedeutet ist.
Die Elektrophoresekammer und das Elutionsgerät 1 sind so hoch mit Pufferlösung 4
gefüllt, daß deren Spiegel 5 die Oberkanten der Membranen
in den
Positionen M1 bis M4 gerade nicht überspült.
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Die aktiven Oberflächen 6,7 der Membranen in den Positionen M1 und
M4 sind gleichsinnig, und zwar dem Pluspol des äußeren elektrischen Feldes zugekehrt,
ausgerichtet.
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Die Membranen in den Positionen M2 und M3 sind in dem hier gezeigten
Ausführungsbeispiel symmetrisch. Bei Verwendung asymmetrischer Membranen sind diese
vorzugsweise gleichsinnig mit den Membranen in den Positionen M1 und M4 ausgerichtet,
also ebenfalls mit ihren aktiven Oberflächen zum Pluspol des äußeren elektrischen
Feldes weisend.
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Zur Durchführung der Elution wird das zu eluierende Elektrophoresegel
in die Pufferlösung in die zwischen den Membranen in den Positionen M2 und M3 ausgebildete
Elutionskammer eingebracht. Anschließend wird das elektrische Feld der Elektrophoresekammer,
in die das Elutionsgerät 1 eingesetzt ist, eingeschaltet. Dabei wandern die elektrisch
negativ geladenen Teilchen, insbesondere also die zu eluierenden elektrisch negativ
geladenen Makromoleküle, durch die Membran M3 hindurch in die Falle 8. Während die
großen und in der Fig. 1 auch groß dargestellten negativ geladenen Makromoleküle
vor der Membran M4 zurückgehalten werden, treten die kleineren negativ geladenen
Ionen und Moleküle, insbesondere also die Pufferionen, durch die Membran 4 hindurch
in das Elektrophoresegerät hinein aus dem Elektroelutionsgerät 1 hinaus.
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Entsprechend wandern positiv geladene Teilchen in Richtung auf den
Minuspol des äußeren angelegten elektrischen Feldes zu durch die Membran 2 hindurch
in die Fallenkammer 9.
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Je nach Wahl der in Position M1 angeordneten Membran werden
dann
entweder die größeren positiv geladenen Ionen oder Moleküle in der Falle 9 zurückgehalten
oder treten die geladenen Teilchen in Anwesenheit des elektrischen Feldes insgesamt
durch die Membran 1 hindurch ebenfalls in die Elektrophoresekammer hinein aus.
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In Abwesenheit eines äußeren elektrischen Feldes, also beim Abschalten
der an die Elektrophoresekammer angelegten Spannung, sind sämtliche Membranen M1
bis M4 für jeden Stofftransport undurchlässig, insbesondere wasserdicht.
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Dies ermöglicht, daß bei Verwendung radioaktiv markierter Makromoleküle
zur Bestimmung des Endpunkts der Elution bei abgeschaltetem äußeren elektrischen
Feld der gesamte Inhalt der Elutionskammer 10 entnommen, in einem Szintillationszähler
vermessen und erforderlichenfalls wieder in die Elutionskammer 10 zurückgeführt
werden kann, ohne daß dadurch nach dem Wiedereinschalten des elektrischen Feldes
die weitere Fortführung des Elutionsverfahrens in irgendeiner Weise beeinträchtigt
wird. Eine exakte Bestimmung des quantitativen Endpunktes der Elution ist dadurch
möglich.
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