DE69113617T2

DE69113617T2 - Unterdrückung der elektroendosmose bei der kapillarelektrophorese.

Info

Publication number: DE69113617T2
Application number: DE69113617T
Authority: DE
Inventors: Roberto Rodriguez; C Wehr; Ming-De Zhu
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 1990-12-20
Filing date: 1991-12-12
Publication date: 1996-05-15
Anticipated expiration: 2011-12-13
Also published as: WO1992011078A1; EP0516810B1; US5069766A; JP2716260B2; JPH05504299A; CA2074472A1; EP0516810A4; EP0516810A1; DE69113617D1

Description

Diese Erfindung liegt im Bereich der gelfreien Kapillarelektrophorese und bezieht sich insbesondere auf das spontane Auftreten van Elektroendosmose und ihre Interferenz mit elektrophoretischer Separation.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Kapillarelektrophorese ist eine Technik, die bei der Analyse biologischer Mischungen von beträchtlichem Interesse ist, insbesondere von Mischungen aus kleinen Peptiden, Proteinen und nukleiden Säuren, da sie an extrem kleinen Proben durchgeführt werden kann und die Verwendung von Hochspannungen ermöglicht, die mit hoher Geschwindigkeit Separationen erzeugen. Kapillare bieten auch den Vorteil, daß die eine spektroskopische Online-Erfassung ermöglichen, ein einfaches und höchst wirksames Erfassungsmittel, bei dem die gelösten Stoffe nicht verdünnt werden und Ungenauigkeiten aufgrund von Spitzenverbreiterung oder Mischen beim Austreten der gelösten Stoffe aus der Kapillare vermieden werden. Die Kapillarelektrophorese allgemein umfaßt verschiedene Arten elektrophoretisoher Separation; am bekanntesten sind die Freizonenelektrophorese und das isoelektrische Fokussieren. Die Freizonenelektrophorese wird mit einer Pufferlösung als Separationsmedium durchgeführt. Die Separation und Erfassung der gelösten Stoffe wird in einem einzigen Schritt durchgeführt, während sich die gelösten Stoffe kontinuierlich mit Geschwindigkeiten fortbewegen, die mit ihrem Ladungs-Masse- Verhältnis variieren. Der elektrische Strom dient dadurch sowohl zur Separation der gelösten Stoffe in Zonen als auch dazu, die Zonen nacheinander über einen Erfassungspunkt zu ziehen. Das isoelektrische Fokussieren wird mit einem Medium durchgeführt, das eine Mischung aus Ampholyten mit einem pH-Gefälle enthält, das sich über die Länge der Kapillare erstreckt. In einer Fokussierphase veranlaßt der elektrische Strom jeden gelösten Stoff, sich fortzubewegen, bis er die Stelle erreicht, an der der pH-Wert dem isoelektrischen Punkt des gelösten Stoffes entspricht. Die Fokussierphase ist abgeschlossen, wenn alle gelösten Stoffe in ihren jeweiligen Positionen entlang der Kapillare stabilisiert sind, anschließend erfolgt eine Mobilisierungsphase, in der das gesamte Muster der gelösten Stoffe durch eine beliebige von verschiedenen Techniken in Richtung eines Erfassungspunktes oder hinter diesem mobilisiert wird.
Ein Phänomen, das bei der Kapillarelektrophorese häufig auftritt, insbesondere wenn die Kapillare aus einem Siliziumdioxyd enthaltenden Material besteht, ist die Elektroendosmose, die auch als elektroosmotischer Fluß bezeichnet wird. Die Elektroendosmose entsteht durch ein elektrokinetisches Potential, das zwischen der Wand des festen Elements und dem Flüssigkeitsseparationsmedium an der Wand entsteht. Die Strömung, die durch dieses Potential hervorgerufen wird, ist eine Massenströmung, die auftritt, wenn dem Separationsmedium ein zur festen Oberfläche tangentiales elektrisches Feld auferlegt wird.
Die Massenströmung aufgrund der Elektroendosmose hat eine potentiell große Auswirkung auf die Kapillare. Eine solche Massenströmung beeinträchtigt die Separation, da sie gewöhnlich eine Mobilisierung aller gelösten Stoffe, ungeachtet ihrer elektrophoretischen Mobilität, hervorruft, indem sie das Separationsmedium selbst mobilisiert, wodurch sie mit den Differentialen in der Mobilisierung interferiert, die der Reaktion der einzelnen gelösten Stoffe zuzuschreiben sind. In Extremfällen führt dies zu einer Spitzenverbreiterung und einem Verlust der Auflösung. Außerdem variiert die elektroendosmotische Kraft von einem Durchgang zum nächsten, wenn Proteine an der Oberfläche der Kapillare unspezifisch absorbiert und desorbiert werden. Dies beeinträchtigt die Reproduzierbarkeit der Separation.
Die Elektroendosmose in Kapillaren wird allgemein durch eine Beschichtung der inneren Kapillarenwandung unterdrückt. Die Beschichtung besteht allgemein aus neutralen Gruppen, die kovalent an die Oberfläche der Kapillare gebunden sind, wodurch alle exponierten geladenen Gruppen eliminiert werden und das Flüssigkeitsmedium an der Wand von allen übrigen geladenen Gruppen, die sich in der Nähe der Oberfläche befinden, abgeschirmt wird. In einigen Fällen verfallen diese Beschichtungen jedoch bei längerer Benutzung oder wenn sie aggressiven gelösten Stoffen oder Separationsmedien ausgesetzt werden. Dies begrenzt die Nutzlebensdauer der Kapillare, und wenn Kapillare mit teilweise verfallenen Beschichtungen bei der isoelektrischen Fokussierung verwendet werden, begrenzt der Verfall die Länge der Fokussierzeit für jeden einzelnen Durchgang.

ZUSSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es wurde nun herausgefunden, daß die Elektroendosmose in einem Kapillarelektrophoreseprozess unterdrückt werden kann, indem entweder dem Anolyten oder dem Katholyten oder beiden ein die Viskosität erhöhender gelöster Stoff oder ein Gel zugefügt werden. Dies kann beispielsweise durch Auflösen eines Polymers oder Bildung eines Gels in einer oder beiden Elektrodenlösungen erreicht werden. Wenn ein Polymer verwendet wird, wird dieses von einer Beschaffenheit und in einer Menge sein, die ausreicht, um die Viskosität in einem Maß zu erhöhen, daß die Massenströmung von der Elektrodenkammer in das Innere der Kapillare oder umgekehrt verringert wird. Wenn ein Gel verwendet wird, wird es gleichermaßen in ausreichender Konzentration und Dichte sein, um eine Massenströmung von der Elektrodenkammer in das Innere der Kapillare oder umgekehrt zu verhindern.
Die Elektroendosmose wird ohne Verwendung einer speziell behandelten Kapillare und ohne daß zusätzliche Bestandteile in die Kapillare eingebracht werden müssen, die mit der Separation interferieren oder die Mobilisierung der gelösten Stoffe behindern könnten, unterdrückt. Die Erfindung hat außerdem dem Vorteil, daß längere Fokussierzeiten beim isoelektrischen Fokussieren ermöglicht werden und ein Verlust der Reproduzierbarkeit aufgrund des Verfalls der Kapillarbeschichtungen ausgeschlossen wird. Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ersichtlich.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Fig. 1, 2 und 3 sind Darstellungen von Detektoraufzeichnungen aus Experimenten mit der Freizonenelektrophorese unter Verwendung eines Beispiels der Techniken zur Unterdrückung der Elektroendosmose aus der vorliegenden Erfindung mit einer unbeschichteten Siliziumdioxidkapillare. Die drei Experimente waren identisch bis auf die Tatsache, daß in Fig. 1 kein die Elektroendosmose unterdrückendes Mittel verwendet wurde, in Fig. 2 ein die Elektroendosmose unterdrückendes Mittel verwendet wurde und in Fig. 3 eine Kombination aus einem linearen viskosen Polymer und einem Gel verwendet wurde.
Fig. 4, 5 und 6 sind Darstellungen von Detektoraufzeichnungen aus Experimenten mit dem isoelektrischen Fokussieren in beschichteten und unbeschichteten Kapillaren. Die beschichtete Kapillare in Fig. 4 stellt ein Verfahren der bisherigen Technik zur Unterdrückung der Elektroendosmose dar, die unbeschichtete Kapillare in Fig. 5 wurde ohne ein die Elektroendosmose unterdrückendes Mittel verwendet, und die unbeschichtete Kapillare in Fig. 6 wurde mit einem viskosen Polymer als die Elektroendosmose unterdrückendes Mittel verwendet. Alle anderen Bedingungen waren während der drei Experimente identisch.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG UND BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGEN

Während die Erfindung mit die Viskosität erhöhenden Additiven in beiden Elektrodenkammern, d.h. Anolyt und Katholyt, gleichzeitig durchgeführt werden kann, werden auch mit einem Additiv in nur einer der beiden Kammern wirksame Ergebnisse erzielt. Die Wahl der Kammer in Beziehung zur Richtung, in der die elektroendosmotische Massenströmung normalerweise auftreten würde, ist nicht entscheidend; das Additiv kann daher entweder in das Einlaßende oder das Auslaßende der Elektrodenkammer (in Richtung des elektroendosmotischen Flusses gesehen) eingebracht werden. Bei bevorzugten Ausführungen wird das Additiv jedoch am Einlaßende in die Elektrodenkammer eingebracht. Mit Kapillaren aus Siliziumdioxyd enthaltenden Material beispielsweise tritt der elektroendosmotische Fluß normalerweise in Richtung der Kathode auf. Bei der bevorzugten Verfahrensweise der Erfindung für Siliziumdioxyd enthaltende Kapillare wird das Additiv daher in den Anolyten eingebracht.
Wenn ein Polymer verwendet wird, kann es ein beliebiges Polymer sein, das in der Elektrolytlösung, in die es eingebracht werden soll, löslich ist, was die Viskosität erhöht. Bevorzugte Polymere sind durch eine Viskosität von mindestens ca. 0,05 Pas (50 Centipoise) als wäßrige Lösung mit 2 Gew.-% bei 25ºC gekennzeichnet, vorzugsweise mindestens ca. 0,075 Pas (75 Centipoise) unter diesen Bedingungen, und am allerbesten mindestens ca. 0,1 Pas (100 Centipoise) unter diesen Bedingungen. Entsprechend kann die Viskosität der tatsächlichen Elektrolytlösung mit dem darin aufgelösten Polymer zur Verwendung in der Anolyten- und Katholytenkammer stark variieren, so lange sie die Massenströmung in die oder aus der Kapillare in ausreichendem Maße unterdrückt) so daß die Interferenz mit der elektrophoretischen Separation entweder erheblich verringert oder im wesentlichen ausgeschaltet wird. Die Viskosität wird allgemein höher als bei den Stoffen sein, die in die Kapillare selbst eingeführt werden könnten. In den meisten Fällen werden die besten Ergebnisse mit Lösungen erzielt, die eine Viskosität von mindestens ca. 0,05 Pas (50 Centipoise) haben, vorzugsweise mindestens 0,1 Pas (100 Centipoise), besser noch mindestens 1 Pas (1.000 Centipoise), und am allerbesten mindestens ca. 2,5 Pas (2.500 Centipoise). Die Konzentration des Polymers kann variieren und wird so ausgewählt, daß eine Lösung mit der gewünschten Viskosität erreicht wird. In den meisten Fällen liegt die Konzentration zwischen ca. 0,3% und ca. 10% auf Gewichtsbasis, vorzugsweise zwischen ca. 1% und ca. 5%.
Beispiele für Polymere, die für den Gebrauch bei dieser Erfindung geeignet sind, sind Zellulosederivate, Polyalkylenglykole, auf Sacharid basierende und substituierte auf Sacharid basierende Polymere, Polysilane, Polyakrylamid, Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon. Beispiele für Zellulosederivate sind Natriumcarboxymethylzellulose, Natriumcarboxymethyl-2-hydroxyethylzellulose, 2-hydroxyethylzellulose, 2-hydroxy-propylzellulose, Methylzellulose, Hydroxypropylmethylzellulose, Hydroxyethylmethylzellulose, Hydroxybutylmethylzellulose und Hydroxyethylethylzellulose. Beispiele für Polyalkylenglykole sind Polyethylen- und Polypropylenglykole. Beispiele für auf Sacharid basierende und substituierte auf Sacharid basierende Polymere, sowohl linear als auch verzweigt, die bei der Erfindung nützlich sind, sind Dextran, Hyaluronsäure (ein Polymer aus Acetylglukosamin und Glucuronsäure als alternative Einheiten), Robinienbohnengummi (eine Gummilösung aus einer Polysacharidpflanze, die im wesentlichen Galaktomannan ist), Polytran (ein bei Pillsbury Co., Minneapolis, Minnesota erhältliches Skleroglucan), Pustulan (ein bei Calbiochem Corp., San Diego, Kalifornien erhältliches Polysacharid), Amylose, Amylopektin, lösliche Stärke und Hydroxylpropylstärke.
Gele, die für den Gebrauch bei dieser Erfindung geeignet sind, sind alle Stoffe, die in der Elektrolytlösung, in die sie eingebracht werden sollen, ein Gel bilden und in dieser Form die Massenströmung in die oder aus der Kapillare behindern oder wesentlich verringern. Die Gele können bezüglich ihrer Porosität, Porengröße, Dichte, Konzentration und chemischen Struktur, sowohl bei natürlich auftretenden als auch bei synthetischen Substanzen, variieren, da keiner dieser Parameter für die Erfindung entscheidend ist. Üblicherweise als elektrophoretische Separationsmedien verwendete Gele sowie normalerweise für andere Zwecke verwendete Gele können hier verwendet werden. Bei wäßrigen Systemen wird das Gel natürlich ein hydrophiles Gel sein. Die bekanntesten sind Polyakrylamidgele und Stärkegele. Spezielle Beispiele sind Gele aus der Sephadex-Serie und Agarosegele. Auch Gelkombinationen, auch aus verschiedenen Geltypen, können verwendet werden. Einige der geeignetsten Gele für diese Verwendung sind Polyakrylamidgele in Konzentrationen von mindestens ca. 3 Gew.-%, vorzugsweise zwischen ca. 5 und ca. 10 Gew.-%, und Agarosegele in Konzentrationen von ca. 0,17 bis ca. 8 Gew.-%, vorzugsweise zwischen ca. 0,5 und ca. 3 Gew.-%.
Das Gel wird vorzugsweise in situ in der Elektrodenkammer selbst gebildet. Wie für die physische Verbindung zwischen der Elektrodenkammer und der Kapillare besteht eine breite Auswahl von Konfigurationen für Kapillarelektrophoresesysteme mit verschiedenen Verbindungsarten. Bei der optimalen Anordnung befindet sich das Gel in direktem Kontakt mit der Öffnung der Kapillare oder sehr nahe daran, was eventuelle Lücken oder freies Volumen zwischen Gel und Kapillare, in dem eine Massenströmung auftreten kann, minimiert.
Der Begriff "Einbringen" und ähnliche Begriffe werden hierin verwendet, um die Art zu bezeichnen, in der das Additiv mit der Elektrolytlösung kombiniert wird. Für lösliche Polymere bezieht sich der Begriff auf das "Auflösen" eines Polymers in der Elektrolytlösung, während sich der Begriff für Gels auf die "Kombination" des gelbildenden Kolloids mit der flüssigen Lösung in der bekannten Weise der Gelbildung bezieht. Die tatsächliche Art des Einbringens ist jedoch nicht entscheidend und umfaßt außerdem Emulsionen, Suspensionen und andere Arten von Mischungen. Die einzige Anforderung ist, daß das resultierende Elektrolytmedium, sei es eine Lösung, ein Gel oder anderes, sich bezüglich seines Widerstands gegen eine Massenströmung ausreichend von der Flüssigkeit in der Kapillare unterscheidet, und daß das Elektrolytmedium jeder Massenströmung Widerstand bietet, die normalerweise in der Kapillare entsteht, ohne den Durchgang des elektrischen Stroms zu behindern.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß die Elektrolytlösung, die das eingebrachte Additiv enthält, sei es aufgelöstes Polymer oder Gel, schnell und einfach vom Benutzer in die Elektrodenkammer eingebracht, ausgetauscht oder entnommen werden kann. Dies bietet dem Benutzer Flexibilität, da es ihm ermöglicht, optional eine bestimmte Art und Menge von aufgelöstem Polymer oder Gel auszuwählen, die für ein bestimmtes System oder eine bestimmte Separation geeignet sind, und diese auf Wunsch zu verändern.
Die vorliegende Erfindung kann auf Kapillare aus beliebigem Material angewandt werden, die für den Aufbau eines elektrokinetischen Potentials empfänglich sind. Solche Materialien haben polarisierte Gruppen an der Oberfläche, insbesondere Gruppen, die für die Ionisierung bei Kontakt mit einer Elektrolytlösung empfänglich sind. Der Grad der Ionisierung sowie die Polarität der Ladung, und dadurch die Richtung des elektroendosmotischen Flusses (d.h. in Richtung der Anode oder Kathode), variiert mit dem Material. Die üblichsten Materialien für die Kapillarelektrophorese sind Siliziumdioxyd enthaltende Materialien, bei denen die Richtung der Elektroendosmose wie oben angegeben in Richtung der Kathode ist. Die bekanntesten Siliziumdioxyd enthaltenden Materialien sind Glas, Quarz und geschmolzenes Siliziumdioxyd.
Die Länge und der Innendurchmesser der Kapillare sind nicht entscheidend, und die Erfindung bezieht sich auf einen breiten Bereich von beiden. Ein höherer Grad an Elußwiderstand in der Elektrodenkammer ist jedoch allgemein für weitere Kapillare erforderlich. Mit diesem Wissen ist die geeignete Auswahl in jedem bestimmten System leicht durch Routine- Experimentation zu bestimmen, wenn sie für den ausgebildeten Benutzer nicht sogar offensichtlich ist. Die Kapillare reichen allgemein von ca. 10 bis ca. 200 um Innendurchmesser, vorzugsweise ca. 20 bis ca. 100 um. Kapillare mit Durchmessern am unteren Ende dieser Bereiche sind allgemein empfänglicher für Elektroendosmose, erfordern jedoch geringere Konzentrationen an Gel oder aufgelöstem Polymer. Kapillare mit Durchmessern am oberen Ende dieser Bereiche erfordern höhere Konzentrationen an Gel oder aufgelöstem Polymer für gleichwertige Ergebnisse.
Während die Erfindung als einziges Mittel zur Unterdrückung von Elektroendosmose verwendet werden kann, kann sie auch als zusätzliches Mittel dienen. Sie kann also mit beschichteten Kapillaren verwendet werden, deren Beschichtung die Proteinadsorption verringert und auch dazu dient, die Elektroendosmose zu unterdrücken. In solchen Fällen unterdrückt das Einbringen des Additivs in eine oder beide Elektrolytkammern die Tendenz zur Elektroendosmose weiter und erhält die Unterdrückung aufrecht, wenn die Beschichtung altert, sich zersetzt oder auflöst, wodurch die Nutzlebensdauer der Kapillare verlängert wird. Die Erfindung ist jedoch bei umbeschichteten Kapillaren, bei denen die Silanolgruppen dem flüssigen Separationsmedium in der Kapillare ausgesetzt werden, besonders nützlich.
Diese Erfindung kann auf alle Arten der Kapillarelektrophorese angewandt werden, einschließlich Freizonenelektrophorese und isoelektrischem Fokussieren. Bei der Freizonenelektrophorese wandern gelöste Stoffe mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten unter dem Einfluß des elektrischen Feldes durch die Kapillare und wandern weiter, solange das Feld auferlegt wird. Die erzielte Separation basiert also auf dem Differential der Migrationsgeschwindigkeit. Das Separationsmedium in der Kapillare kann eine einfache Lösung oder eine durch ein Siebmittel oder andere Additive ergänzte Lösung sein, die gewählt wurden, um die Separation und Auflösung der Zonen zu verbessern, während sie sich separieren und sich über die Länge der Kapillare fortbewegen. Die Lösungen in der Anoden- und der Kathodenkammer sind im allgemeinen identisch und haben denselben pH-Wert.
Die Freizonenelektrophorese kann auch mit Größenausschluß oder Sieben kombiniert werden, um die Separation zu verbessern. Diese Anwendung der Erfindung umfaßt daher Separationen, die ein Siebmittel, z.B. ein geeignetes Polymer, in der Kapillare umfassen. Dies ist besonders nützlich bei der Separation von Mischungen, die identische oder nahezu identische Ladungs-Masse-Verhältnisse haben, z.B. nukleide Säuren.
Bei der isoelektrischen Fokussierung wird durch Verwendung einer sauren Lösung im Anolyten und einer basischen Lösung im Katholyten ein pH-Gefälle in der Kapillare eingerichtet.
Außerdem wird eine Mischung aus Ampholyten in das Separationsmedium in der Kapillare aufgenommen, um das pH-Gefälle aufzubauen. Jeder gelöste Stoff wandert unter dem Einfluß des elektrischen Felds in eine Position in der Kapillare, an der der pH-Wert mit dem isoelektrischen Punkt des gelösten Stoffes identisch ist. Die Separation, d.h. die isoelektrische Fokussierung, wird also auf der Basis der isoelektrischen Punkte anstelle des Differentials der Mobilisierungsgeschwindigkeiten erzielt. Sobald die Fokussierung abgeschlossen ist, wird das pH-Gefälle durch Veränderung einer der Lösungen oder Zugabe eines Stoffes verschoben oder verlagert, und die Zonen der gelösten Stoffe werden mit einheitlichen Geschwindigkeiten entweder in Richtung des Anolyten oder des Katholyten zum Zwecke der Erfassung mobilisiert. Die vorliegende Erfindung ist sowohl in der Fokussier- als auch der Mobilisierungsphase nützlich, ist jedoch am wichtigsten und einflußreichsten während der Fokussierphase.
Die folgenden Beispiele dienen zur Illustration.

BEISPIEL 1

Dieses Beispiel demonstriert die Unterdrückung des elektroendosmotischen Flusses bei der Freizonenelektrophorese in Übereinstimmung mit der Erfindung durch Verwendung eines Anolyten, der ein viskoses lineares Polymer enthält, sowie durch Verwendung eines Anolyten, der eine Kombination aus einem Gel und einem viskosen linearen Polymer enthält. Zum Vergleich ist auch eine einfache Anolytlösung enthalten.
Bei jedem Durchgang dieses Beispiels wurden zwei Vitamine in einer unbeschichteten Kapillare separiert, indem unter alkalischen pH-Bedingungen positive bis negative Polarität verwendet wurde. Niacinamid ist ein ungeladenes Vitamin, das nur unter dem Einfluß der Elektroendosmose in der Kapillare wandert. Thiamin ist ein kationisches Vitamin, dessen Migration durch die kombinierte Wirkung von Elektroendosmose und seiner inhärenten elektrophoretischen Mobilität (die unter diesen Bedingungen die gleiche Richtung hat wie die Elektroendosmose) verursacht wird. Alle Separationen erfolgten unter folgenden Bedingungen:
Kapillare: Innendurchmesser 35 cm x 50 um, unbeschichtet
Separationsmedium: 10 mM Natriumborat, pH-Wert 8,5
Katholyt: 10 mM Natriumborat, pH-Wert 8,5
Ladungsbedingungen: elektrokinetische Ladung bei konstanter Spannung von 12 kV 4 Sekunden lang
Durchgangsbedingungen: konstante Spannung von 10 kV
Erfassung: Extinktion bei 200 nm, Gesamtskala 0,1 Extinktionseinheiten
Probe: Thiamin (1,25 mg/ml) + Niacinamid (0,25 mg/ml) in 10 mM Natriumborat, pH-Wert 8,5
Fig. 1 zeigt die Separation von Thiamin und Niacinamid in der unbeschichteten Kapillare mit 10 mM Natriumborat (pH- Wert 8,5> als Anolyt, d.h. kein die Elektroendosmose unterdrückendes Mittel war vorhanden - zu Vergleichszwecken außerhalb des Geltungsbereichs der vorliegenden Erfindung. Bei Verwendung von Niacinamid als Indikator für die Elektroendosmose wird die elektroendosmotische Mobilität (uEEO) als 9,66 x 10&sup4;cm²sec&supmin;¹v&supmin;¹ berechnet. Die Asymmetrie der Thiaminspitze in dieser Figur sowie in Fig. 2 und 3 beruht vermutlich auf der Interaktion des Vitamins mit der Kapillarwand.
Fig. 2 zeigt die Separation der beiden Vitamine in der unbeschichteten Kapillare mit einem Anolyten, der 10 mM Natriumborat (pH-Wert 8,5) + 1,8% Hydroxypropylmethylzellulose (deren Viskosität in 2%iger Lösung 4 Pas (4.000 Centipoise) beträgt) enthält. Fig. 2 zeigt also, daß unter diesen Bedingungen uEEO auf 3,33 x 10&supmin;&sup4;cm²sec&supmin;¹v&supmin;¹ gesenkt wird.
Fig. 3 zeigt die Separation der beiden Vitamine in der unbeschichteten Kapillare mit einem Anolyten, der 10 mM Natriumborat (pH-Wert 8,5) + 1% ladungsfreie Agarose + 5% Polyvinylalkohol (50.000 Mr) enthält. Fig. 3 zeigt also, daß unter diesen Bedingungen das Niacinamid nicht innerhalb von 40 Minuten eluiert, was anzeigt, daß uEEO auf weniger als 0,9 x 10&supmin;&sup4;cm²sec&supmin;¹v&supmin;¹ gesenkt wird.
Zusammenfassend zeigen diese Vergleiche, daß die Zugabe eines linearen viskosen Polymers zum Anolyten die Elektroendosmose um mindestens 65% verringerte und daß die Zugabe eines linearen viskosen Polymers und eines Gels zum Anolyten die Elektroendosmose um mindestens 90% verringerte.

BEISPIEL 2

Dieses Beispiel demonstriert, daß die Zugabe eines viskosen linearen Polymers zum Anolyten die Stärke des elektroendosmotischen Flusses bei der isoelektrischen Fokussierung ausreichend unterdrückt, um die Bildung schmaler fokussierter Zonen zu ermöglichen. Die verwendete Probe war eine Mischung aus vier Hämoglobin-Varianten, den Hämoglobinen A, F, S und C. Während der Mobilisierungsphase wandern diese Varianten in dieser Reihenfolge. Die Experimente demonstrieren, daß die Auflösung dieser vier Hämoglobin-Varianten durch die Verwendung eines die Elektroendosmose unterdrückenden Mittels in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung erheblich verbessert wird und mit der Auflösung vergleichbar ist, die bei Verwendung einer für denselben Zweck beschichteten Kapillare erzielt wird.
Die Separationen wurden unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Kapillare: Innendurchmesser 14 cm x 25 um, beschichtet oder unbeschichtet wie angegeben
Katholyt: 20 mM Natriumhydroxid
Mobilisierungsmittel: 20 inM Natriumhydroxid + 80 mM Natriumchlorid
Probe: Hämoglobin A, F, S und C (4 mg/ml Gesamtprotein) in 2%igem Biolyte 3-10
Fokussierbedingungen: 7 kV 6 Minuten lang
Mobilisierungsbedingungen: 8 kV
Erfassung: Extinktion bei 280 nm, Gesamtskala 0,128 Extinktionseinheiten
Für Fig. 4 wurde eine beschichtete Kapillare mit einem Anolyten verwendet, der nur 40 mM Phosphorsäure enthielt (kein die Elektroendosmose unterdrückendes Mittel) - ein Vergleichstest außerhalb des Geltungsbereichs der vorliegenden Erfindung.
Für Fig. 5 wurde eine unbeschichtete Kapillare verwendet, der Anolyt enthielt wiederum nur 40 mM Phosphorsäure (kein die Elektroendosmose unterdrückendes Mittel) - ein Vergleichstest außerhalb des Geltungsbereichs der vorliegenden Erfindung.
Für Fig. 6 wurde eine unbeschichtete Kapillare verwendet, diesmal enthielt der Anolyt 2% Hydroxypropylmethylzellulose mit 4 Pas (4.000 Centipoise) als die Elektroendosmose unterdrückendes Mittel, zusätzlich zu den 40 mM Phosphorsäure.
Zusammenfassend zeigen diese Vergleiche, daß die unbeschichtete Kapillare mit dem im Anolyten aufgelösten Polymer für die Unterdrückung des elektroendosmotischen Flusses am wenigsten der beschichteten Kapillare entsprach.

Claims

1. Ein Verfahren zur Unterdrückung der Elektroendosmose während der elektrophoretischen Separation einer Flüssigkeitsprobenmischung in Bestandteile in einer Kapillaren aus einem Material, welches für den Aufbau eines elektrokinetischen Potentials empfänglich ist, wobei die Kapillare in einem elektrischen Stromkreis zwischen zwei Elektrolytlösungen angeordnet ist, die jeweils einen Katholyten und einen Anolyten enthalten, wobei das Verfahren das Einbringen eines Additivs mit umfaßt, welcher aus der Gruppe ausgewählt ist, welche einen wasserlöslichen Polymer, ein hydrophiles Gel und eine Kombination beider in der einen oder in beiden Elektrolytlösungen in einer ausreichenden Menge umfaßt, um einer Massenströmung durch das Ende der Kapillaröffnung in diesem zu widerstehen.

2. Ein Verfahren in Übereinstimmung mit Anspruch 1, in welchem die Kapillare aus einem Siliziumdioxyd enthaltenden Material gebildet ist, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Glas, Quarz und geschmolzenem Siliziumdioxyd gebildet ist, ohne daß Elektroendosmose unterdrückende neutrale organische Gruppen an deren innerer Oberfläche gebunden sind.

3. Ein Verfahren in Übereinstimmung mit Anspruch 1 oder Anspruch 2, in welchem die eingebrachte Menge des Additivs ausreichend ist, um die Viskosität der Elektrolytlösung auf wenigstens ungefähr 0,05 Pas (50 Centipoise) zu erhöhen, in welcher der Additiv enthalten ist.

4. Ein Verfahren in Übereinstimmung mit irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, in welchem die eingebrachte Menge des Additivs ausreichend ist, um die Viskosität der Elektrolytlösung auf wenigstens ungefähr 2,5 Pas (2500 Centipoise) zu erhöhen, in welchem der Additiv eingebracht ist.

5. Ein Verfahren in Übereinstimmung mit Anspruch 1 oder Anspruch 2, in welchem der Additiv ein Polyakrylamidgel mit einer Konzentration von ungefähr 5 bis ungefähr 10 Gew.-% ist.

6. Ein Verfahren in Übereinstimmung mit Anspruch 1 oder Anspruch 2, in welchem der Additiv ein Agarosegel mit einer Konzentration von ungefähr 0,5 bis ungefähr 3 Gew.-% ist.

7. Ein Verfahren in Übereinstimmung mit irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Additiv ein wasserlösliches Polymer ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die Zellulosederivate, Polyalkylenglykole, auf Sacharid basierende und substituierte auf Sacharid basierende Polymere, Polysilane, Polyakrylamide, Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon umfaßt.

8. Ein Verfahren in Übereinstimmung mit Anspruch 1 oder Anspruch 2, in welchem der Additiv eine Kombination eines wasserlöslichen Polymers mit einer Konzentration von ungefähr 1 bis ungefähr 5 Gew.-% und einem hydrophilen Gel in einer Konzentration von ungefähr 3 bis ungefähr 10 Gew.-% ist.

9. Ein Verfahren in Übereinstimmung mit irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, in welchem der Additiv ein wasserlösliches Polymer in einer ausreichenden Konzentration ist, um die Viskosität der Elektrolytlösung, in welche der Additiv eingebracht ist, auf wenigstens 2,5 Pas (2500 Centipoise) zu erhöhen.

10. Ein Verfahren in Übereinstimmung mit irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, in welchem die Kapillare aus einem Siliziumdioxyd enthaltenden Material gebildet ist und der Additiv in die Elektrolytlösung inkorporiert ist, die den Anolyten enthält.