DE69205879T2

DE69205879T2 - Gel enthaltende Mikrokapillarsäule.

Info

Publication number: DE69205879T2
Application number: DE69205879T
Authority: DE
Inventors: Chia-Hui Shieh
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1991-04-19
Filing date: 1992-04-02
Publication date: 1996-04-04
Anticipated expiration: 2012-04-03
Also published as: DE69205879D1; US5098539A; EP0510824B1; EP0510824A1; JPH05149921A; JPH081428B2

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Hochleistungs- Kapillarelektrophoreseinstrumente und -verfahren, und insbesondere Gel enthaltende Mikrokapillarsäulen für die Hochleistungs-Kapillarelektrophorese.

Hintergrund der Erfindung

Die Elektrophorese ist eine der am meisten verwendeten Trenntechniken in den Naturwissenschaften mit biologischem Bezug. Molekülarten wie beispielsweise Peptide, Proteine und Oligonucleotide werden getrennt, indem man diese Molekülarten unter der Wirkung eines elektrischen Feldes in einer Pufferlösung wandern läbt. Diese Pufferlösung wird normalerweise in Verbindung mit einer niedrigen bis mittleren Konzentration eines geeigneten Gelbildners, wie beispielsweise Agarose oder Polyacrylamid, verwendet, um das Auftreten einer Vermischung der zu trennenden Molekülarten weitestmöglich zu verringern. Es bestehen zwei hauptsächliche Trennmechanismen: a) Trennungen aufgrund von Unterschieden in der effektiven Ladung der Analyten; und b) Trennungen auf der Grundlage der Molekulargröße.
Der erste dieser Mechanismen ist allgemein auf Stoffe mit niedrigem oder mäßigem Molekulargewicht, wie beispielsweise oligonucleotide, beschränkt. Dies deshalb, weil die effektiven Ladungen von hochmolekularen Stoffen ziemlich ähnlich werden, wodurch es schwierig oder unmöglich wird, sie zu trennen.
Trennvorgänge auf der Grundlage der Molekulargröße werden im allgemeinen als Molekular "siebung" bezeichnet. Die Molekularsiebung beruht auf Gelmatrixsubstanzen mit kontrollierten Porengrößen als Trennmedium. Bei derartigen Trennsystemen resultiert die Trennung, falls die effektive Ladung der Analyten gleich groß ist, auf Unterschieden im Vermögen der unterschiedlich großen Molekülarten, die Gelmatrix zu durchdringen. Kleinere Moleküle bewegen sich relativ schneller als größere durch ein Gel mit einer gegebenen Porengröße.
Oligonucleotide und mittel- bis hochmolekulare Polypeptide und Proteine werden im allgemeinen mittels Molekularsieb- Elektrophorese getrennt, wenngleich im Fall von Proteinen Ladung und Größe unabhängig voneinander zur Trennung verwendet werden können. Im Fall von proteinartigen Stoffen ist es jedoch im allgemeinen erforderlich, die zu trennenden Stoffe so zu modifizieren, daß sie sämtlich die gleichen effektiven Ladungen besitzen. Dies wird im allgemeinen dadurch erreicht, daß man ein SDS-PAGE (=sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)-Derivatbildungsverfahren anwendet, wie beispielsweise in Gel Electrophoresis of Proteins: a Practical Approach (2nd edition), B. D. Hames & D. Rickwood, Eds., IRL Press, axford University Press, 1990, beschrieben. Vergleiche auch New Directions in Electrophoretic Methods, J. W. Jorgenson Ampersand M. Phillips, Eds., Published by American Chemical Society, Washington, D. C., 1987.
Gelegentlich ist die Trennung proteinartiger Stoffe unter Bedingungen erwünscht, die ein möglichst geringes Risiko der Denaturierung des Proteins mit sich bringen. In derartigen Fällen vermeidet man Systemzusätze, wie beispielsweise Harnstoff und SDS, die eine Denaturierung des Proteins hervorrufen können. Infolgedessen beruhen die hierbei erhaltenen Trennungen auf Unterschieden sowohl der Molekulargröße wie der Ladung der Bestandteile der Stoffe.
Die meisten elektrophoretischen Trennvorgänge werden derzeit in Träger-Slabs oder offenen Betten durchgeführt. Diese Trennarten sind sehr schwer zu automatisieren oder zu quantifizieren. Außerordentlich hochauflösende Trennungen von Stoffen mit unterschiedlichen effektiven Ladungen wurden mittels Offenrohr- Freizonenelektrophorese und Isotachophorese in engen Kapllarröhren durchgeführt. Außerdem kann der Massenstrom (d. h. die Strömung des Elektrophoresepuffers und der zu analysierenden Probe durch die Kapillarröhre) durch Elektroosmose angetrieben werden, um sehr scharfe Elektropherogramm-Spitzen bzw. -Linien zu erhalten. Diese hochwirksame Offenrohr-Elektrophorese wurde jedoch nicht allgemein auf die Trennung von mittel- bis hochmolekularen Oligonucleotiden angewandt, da diese Stoffe sehr ähnliche effektive Ladungen besitzen, wie oben angegeben. Außerdem ergibt die Offenrohr-Elektrophorese keine Größenselektivität für proteinartige Stoffe. Die Erzielung hochauflösender Trennvorgänge, beispielsweise von Oligonucleotiden, steht in unmittelbarer Beziehung zu den in dem betreffenden Elektrophoresesystem verwendeten Gel enthaltenden Mikrokapillaren. Daher, und wegen der Bedeutung der Hochleistungs-Kapillarelektrophorese als ein Trennverfahren in den biologischen Wissenschaften, wurde den bei dieser Technik verwendeten Gelmaterialien beträchtliche Aufmerksamkeit zugewandt.
Typischerweise in der Hochleistungs-Kapillarelektrophorese verwendete Polymer-Gelmaterialien sind üblicherweise jedes beliebige quer vernetzte Polymer mit einer Porenstruktur, die durch Änderung der Anteile von Monomer und Vernetzungsmittel sowie der Reaktionsbedingungen einstellbar ist. Bevorzugte Polymer-Gelmaterialien basieren auf Acrylamid und N'-Methylenbisacrylamid, wobei das N'-Methylenbisacrylamid als ein Vernetzungsmittel dient. Andere Vernetzungsmittel sind unter anderen N,N'-(1,2-Dihydroxyäthylen)-bisacrylamid, N,N'- Diallyltartardiamid, N,N'-Cystamin-bisacrylamid und N- Acryloyltris(hydroxymethyl)aminomethan. Die Gelpolymerisation wird üblicherweise durch Ammoniumpersulfat und N,N,N',N'- Tetramethyläthylendiamin (TEMED) eingeleitet.
Die Porengröße von Polyacrylamid-Gelen hängt von der Gesamtmonomerkonzentration (% T) und der Konzentration an Quervernetzer (% C) ab. Die Porengröße läßt sich progressiv erhöhen, indem man % T bei einem gegebenen festen % C verringert; jedoch sind sehr verdünnte Gele mechanisch unstabil, und Porengrößen von mehr als 80 nm lassen sich nicht erzielen. Alternativ kann man % C fortschreitend erhöhen bei festem % T, in Fällen, wo angenommen wird, daß die Zunahme der Porengröße durch die Bildung einer perlenartigen Struktur statt eines 3-D- Gitters bedingt ist. Bei dieser Vorgehensweise lassen sich stabile Gele hoher Porengröße (etwa 200 bis 250 nm) bei 30 % C N'-Methylenbisacrylamid erzielen; jedoch werden bei höheren Konzentrationen die Gele hydrophob und neigen dazu, zu kollabieren.
Zwar wurden im Stand der Technik Kapillargele selbst ziemlich genau definiert und analysiert, jedoch ist die Herstellung der derartige Gele enthaltenden Kapillarröhren nicht gut definiert. Beispielsweise wird bei herkömmlichen Gel enthaltenden Mikrokapillarsäulen das Kapillargel in der Säule mittels einer kovalenten Befestigung des Gels an der Säule gehalten. Vergleiche beispielsweise S. Hjerte', "High-Performance Electrophoresis Elimination of Electroosmosis and Solute Absorption." J. Chrom., 347:191-198 (1985); U. S. Patentschrift 4 865 707 (Karger et al) und U. S. Patentschrift 4 997 537 (Karger et al). Die in den vorstehenden Veröffentlichungen beschriebenen Gel enthaltenden Mikrokapillarsäulen leiden an wenigstens einem der folgenden Probleme: Die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Partien von Mikrosäulen ist nicht vorherbestimmbar; die Stabilität der Säulen selbst versagt nach etwa 50 bis 150 Kapillar-Versuchsläufen; und die zur Herstellung derartiger Säulen erforderliche Reaktionszeit kann bis zu etwa 24 Stunden betragen.
Zwar ist die Kapillarelektrophoresetechnologie allgemein auf den Einsatz im Forschungsbereich ausgerichtet, jedoch wurde neuerdings darauf hingewiesen, daß diese Analysetechnik das Potential zur Anwendung als ein klinisches Untersuchungsverfahren besitzt. Vergleiche "Capillary Electrophoresis: Tool for Clinical Diagnosis?", Clin. Lab Letter 12, 4: 1-2 (1991). Zwar ist die Gewährleistung beispielsweise von Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Säulenpartien und Stabilität der Säule auch bei Anwendungen auf dem Forschungsgebiet bedeutsam, jedoch verschärfen sich diese Probleme in einem klinischen Umfeld, wo für analytische Patientenergebnisse Konsistenz gegenüber den jeweils angewandten analytischen Verfahren gefordert werden muß. Verbesserte mit Gel gefüllte Kapillarsäulen für die Elektrophorese, welche eine erhöhte Stabilität, größere Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Partien, verbesserte Auflösung und kürzere Reaktionszeiten besitzen, wären daher von großem Wert auf diesen Gebieten, welche ein derartiges Analyseverfahren anwenden.

Zusammenfassung der Erfindung

Den vorstehenden Bedürfnissen wird durch die vorliegende Erfindung genügt, welche eine verbesserte, ein Gel enthaltende Kapillarsäule für die Hochleistungs-Elektrophorese schafft, welche eine Mikrokapillare mit einem Innenhohlraum und eine Wandung mit einer Innenoberfläche sowie ein den Innenhohlraum der Mikrokapillare ausfüllendes Polymer-Gel aufweist, wobei das Gel mit der Wandung durch ein bifunktionelles Agens, an welches es gebunden ist, verbunden ist und wobei das bifunktionelle Agens seinerseits ionisch an die Innenoberfläche der Wandung gebunden ist. Ein geeignetes bifunktionelles Agens ist daher ein solches, das eine erste, zur Ionenbindung mit der Innenoberfläche der Wandung befähigte Funktionalität und eine zweite, zur Bindung mit einem Polymer-Gel befähigte Funktionalität besitzt. Vorzugsweise umfaßt die ein Gel enthaltende Mikrokapillare gemäß der vorliegenden Erfindung eine Mikrokapillare, ein bifunktionelles Agens, das wenigstens ein positiv geladenes Amin und wenigstens eine aktive funktionelle Gruppe aufweist, sowie ein Polymer-Gelmaterial. Das bifunktionelle Agens gewährleistet eine ausgezeichnete Haftung des Polymer-Gels an der Innenwandung der Mikrokapillare. Für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Ausdruck "bifunktionell" mit Bezug auf das Agens ein Agens, das wenigstens zwei Funktionen zu erfüllen vermag, und ist nicht eine Begrenzung hinsichtlich der in dem Agens enthaltenen Gruppen oder Teilgruppen.
Das bifunktionelle Agens umfaßt wenigstens eine positiv geladene Aminoverbindung oder ein geladenes Aminopolymer und wenigstens eine aktive funktionelle Gruppe. Die positiv geladene Aminoverbindung wird an der aktivierten Innenwandung der Mikrokapillare adsorbiert. Die aktive funktionelle Gruppe ist als eine Gruppe definiert, welche ein Kohlenstoffatom mit wenigstens einer Doppelbindung aufweist. Die aktive funktionelle Gruppe vermag beispielsweise mit Acrylamidmonomeren zu copolymerisieren. Sie bindet daher das Gelmaterial an das adsorbierte bifunktionelle Reagens.
Polyacrylamid-Gele, welche durch das beschriebene bifunktionelle Agens als Überzug auf die Innenkapillarwandung aufgebracht werden, benötigen eine beträchtlich geringere Reaktionszeit als Gele, die covalent an der Kapillarwandung befestigt werden. Dies rührt daher, daß eine Adsorption statt covalenter Bindung Anwendung findet. Da das Agens adsorbiert wird, wird es im Effekt ein "Teil" der Innenwandung der Kapillare, derart daß, wenn das Agens mit dem Gel copolymerisiert, das Gel sicher an der Kapillare befestigt ist.
Gel enthaltende Miltrokapillarsäulen gemäß der Erfindung können wie folgt hergestellt werden: Zunächst wird die Innenoberfläche der Kapillare aktiviert. Sodann wird das bifunktionelle Agens in die aktivierte Kapillare eingeführt, wodurch die positiv geladene Aminogruppe an der aktivierten Innenwandung adsorbiert wird und die aktive funktionelle Gruppe im Innenteil der Säule freiliegt. Sodann wird als nächstes die Mikrokapillare mit einer Lösung gefüllt, welche wenigstens ein Monomer mit oder ohne wenigstens ein Quervernetzungsmittel aufweist; andere Stoffe, wie beispielsweise ein Katalysator, können in die Lösung einbezogen werden. Diese Lösung wird sodann innerhalb der Mikrokapillare polymerisieren gelassen, derart daß die polymerisierende Lösung mit der aktiven funktionellen Gruppe des bifunktionellen Agens copolymerisiert. Abschließend ist eine Polymermatrix gebildet, die die Mikrokapillare vollständig ausfüllt. In üblicher Weise kann als abschließender Schritt wenigstens ein Ende der ein Gel enthaltenden Mikrokapillare sauber und gerade abgeschnitten werden. Die ein Gel enthaltende Mikrokapillare ist sodann gebrauchsfertig für den Einsatz oder zur Aufbewahrung bis zur späteren Verwendung.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Die folgenden Zeichnungsfiguren dienen zum Zweck der Erläuterung in Verbindung mit der detaillierten Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele der Erfindung:
Fig. 1 ist eine vergrößerte perspektivische Ansicht des Endes einer ein Gel enthaltenden Mikrokapillare gemäß der Erfindung;
Fig. 2 ist ein Elektropherogramm der Trennung eines Poly d(A) 25-30 mers und eines Poly d(A) 40-60 mers, unter Verwendung einer ein 7M-Harnstoff-Polyacrylamid-Gel enthaltenden Mikrokapillare gemäß der vorliegenden Beschreibung;
Fig. 3 ist ein Elektropherogramm der Trennung der gleichen Oligomere wie in Fig. 2, unter Verwendung einer ein Polyacrylamid-Gel enthaltenden Mikrokapillare gemäß der vorliegenden Beschreibung;
Fig. 4 ist ein Elektropherogramm der Trennung eines Poly d(T) 20 mers und eines Poly d(T) 40 mers, unter Verwendung einer ein 7M-Harnstoff-Polyacrylamid-Gel enthaltenden Mikrokapillare gemäß der vorliegenden Beschreibung; und
Fig. 5 ist eine graphische Darstellung der Stabilität einer ein 7M-Harnstoff-Polyacrylamid-Gel enthaltenden Mikrokapillare gemäß der vorliegenden Beschreibung, in Darstellung der "Wanderungszeit" in Abhängigkeit von "der Zahl von Probeninjektionen".

Detaillierte Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

Wie in Fig. 1 veranschaulicht, weist die Gel enthaltende Mikrokapillarsäule gemäß der vorliegenden Erfindung eine Mikrokapillare 10 mit einer aktivierten Schicht 12 auf; der Bereich 12a ist der innerste aktivierte Bereich der Mikrokapillare 10. An der aktivierten Schicht 12 ist ein bifunktionales Agens 14 physikalisch adsorbiert, welches eine positiv geladene Aminoverbindung oder ein Aminopolymer 14a und eine aktive funktionale Gruppe 14b aufweist; die aktive funktionale Gruppe 14b ist mit einem Polymer-Gel 20 innerhalb der Bohrung der Mikrokapillare 10 copolymerisiert.
Das bifunktionale Agens 14 hat die folgende chemische Struktur:
worin von R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; drei unabhängig voneinander aus der folgenden Gruppe gewählt werden können
worin n eine ganze Zahl zwischen 0 und 10,
m eine ganze Zahl zwischen 0 und 5,
R aus der aus den folgenden Komponenten bestehenden Gruppe gewählt ist
mit der Maßgabe, daß von R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; wenigstens ein Substituent eine aktive funktionale Gruppe aufweisen muß, welche einen aus der folgenden Gruppe gewählten Teil umfaßt:
wobei y eine ganze Zahl zwischen 1 und 5000, vorzugsweise zwischen 1 und 2000, besonders bevorzugt 1 ist, und
X aus der aus Fluor, Chlor, Brom, Jod und Astatin bestehenden Gruppe gewählt ist.
Gemäß einer am meisten bevorzugten Ausführungsform des bifunktionalen Agens sind R&sub1;, R&sub2; und R, jeweils -(CH&sub2;)n CH&sub3;, wobei n gleich 0 ist (d. h. -CH&sub3;), R&sub4; ist (CH&sub2;)&sub2;=CH&sub2;, X ist Jod ("I") und y ist 1. Demgemäß kann eine am meisten bevorzugte Ausführungsform des bifunktionalen Agens wie folgt wiedergegeben werden:
Die zur Herstellung der Mikrokapillare 10 verwendeten speziellen Werkstoffe und Materialien sind dem Fachmann bekannt und werden in typischer Weise gewählt, mit der Maßgabe, daß die bei der Elektrophorese verwendeten besonderen Nachweissysteme mit derartigem Material angemessen funktionieren können. Derartige Materialien sind beispielsweise unter anderem Glas, Aluminiumoxid (Tonerde), Berylliumoxid und geschmolzenes Silica. Vorzugsweise ist die Mikrokapillare aus geschmolzenem Silica hergestellt. Vorzugsweise beträgt der Innendurchmesser der Mikrokapillare zwischen etwa 10 und etwa 2000 Mikrometer, mehr bevorzugt zwischen etwa 10 und etwa 200 Mikrometer, und am meisten bevorzugt etwa 100 Mikrometer.
Der Innenteil oder Innenbereich 12a der Mikrokapillare 10 wird vor dem Einbringen des bifunktionalen Agens in diese vorbehandelt. Diese Vorbehandlung "aktiviert" den Innenteil 12a, wobei dieser mit einer negativen Ladung versehen wird. Die Vorbehandlung erfolgte vorzugsweise durch Füllen der Mikrokapillare 10 mit 1N HCl über 10 Minuten, nachfolgend mit 1N NaOH über 10 Minuten, sodann gefolgt von einer Waschung mit entionisiertem Wasser über 10 Minuten. Dieses Standardverfahren bewirkt eine wirksame Aktivierung der Mikrokapillare für Adsorptionszwecke.
Das Agens wird in die Kapillare als eine bifunktionale Agenslösung eingebracht. Am meisten bevorzugt ist die bifunktionale Agenslösung eine wäßrige Lösung. Jedoch können polare Lösungsmittel wie beispielsweise Dioxan, Dimethylformamid, Aceton, Methanol oder Äthanol verwendet werden. Vorzugsweise enthält die Lösung zwischen etwa 1 % und etwa 80 % (Volumenprozent) an dem bifunktionalen Agens, mehr bevorzugt zwischen etwa 10 % und etwa 50 %, und am meisten bevorzugt etwa 30 %. Der pH-Wert der bifunktionalen Agenslösung beträgt vorzugsweise zwischen etwa 4 und etwa 12, mehr bevorzugt zwischen etwa 5 und etwa 9, und am meisten bevorzugt etwa 8. Falls jedoch irgendeiner der Substituenten R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; oder R&sub4; H ist/sind, so beträgt der pH- Wert der bifunktionalen Agenslösung dann weniger als etwa 7,0, derart daß eine Protonisierung des Amins stattfinden kann.
Die bifunktionale Agenslösung wird sodann in die aktivierte Mikrokapillare eingebracht und zwischen etwa 1 Minute und etwa 60 Minuten durch sie hindurchgespült, mehr bevorzugt zwischen etwa 15 Minuten und 45 Minuten, und am meisten bevorzugt etwa 30 Minuten. Nach dieser Zeitperiode ist das bifunktionale Agens an der Mikrokapillare adsorbiert. Vorzugsweise findet die Adsorption bei etwa Zimmertemperatur statt, wenngleich Temperaturen von 20 bis 35 ºC akzeptabel sind. Nachdem das bifunktionale Agens mit der Mikrokapillaren-Innenwandung reagiert hat, ist der Innenbereich der Mikrokapillare bereit für die Einbringung eines Polymer-Gelmaterials in die Mikrokapillare.
Für die Kapillarelektrophorese anwendbare Polymer-Gelmaterialien sind bekannt. Das verwendete Polymer-Gelmaterial 20 kann ein beliebiges Polymer sein, das eine Porenstruktur besitzt, die variiert werden kann -- das Gel kann vernetzt oder unvernetzt sein. Vorzugsweise ist das Polymer-Gel ein vernetztes Polymer, dessen Porenstruktur variiert, je nach den zur Bildung des Gels zugefügten Mengen an Monomer und Vernetzungsmittel, sowie in Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen. Wie zuvor angegeben, werden die Änderungen in der Totalkonzentration des Monomers und des Vernetzungsmittels allgemein als % T bzw. % C ausgedrückt. Für das System aus dem Monomer Acrylamid und dem Vernetzungsmittel N,N'-Methylenbisacrylamid, das am meisten bevorzugt für die Zwecke der Erfindung verwendet wird, werden % T und % C wie folgt abgeleitet:
% T = Gramm Acrylamid + Gramm Bisacrylamid/100 Milliliter Lösungsmittel
% C = Gramm Bisacrylamid x 100/Gramm Bisacrylamid + Gramm Acrylamid
Siehe Hjerten, Chromatographic Review 5, 9:122-219 (1967). Die Konzentrationen des Monomers und eines beliebigen Vernetzungsmittels werden je nach der gewünschten Porosität der Polymermatrix bestimmt. Wie oben erwähnt, wird die Reaktion vorzugsweise mit Ammoniumpersulfat initiiert. Jedoch kann die Konzentration des Initiators (und gegebenenfalls Polymerisationskatalysators) in dem Reaktionsgemisch experimentell bestimmt werden. Dies kann in der Weise erfolgen, daß man Testlösungen herstellt, welche das gewünschte % T und % C enthalten, während man jedoch die verwendete Menge an Initiator (und Polymerisationskatalysator) variiert. Vorzugsweise beträgt % T von etwa 1 bis etwa 30, mehr bevorzugt von etwa 3 bis etwa 15, und am meisten bevorzugt etwa 12. % C beträgt vorzugsweise von etwa 0 bis etwa 15, mehr bevorzugt von etwa 1 bis etwa 6, und am meisten bevorzugt etwa 2.
Nachdem % T und % C bestimmt wurden, wird ein frischer Ansatz des Polymerisationsgemischs hergestellt und in die Mikrokapillarröhre injiziert, typischerweise mittels einer Injektionsspritze. Die Bildung von Blasen sollte vermieden werden, da dies zu einer unbrauchbaren mit Gel gefüllten Mikrokapillarsäule führen kann. Nachdem die Mikrokapillarröhre mit dem Polymerisationsgemisch gefüllt wurde, werden die Enden der Mikrokapillare mit Stopfen oder Verschlußkappe verschlossen, und dieser Stopfen- bzw. Kappenverschluß der Mikrokapillare wird aufrechterhalten, während die Polymerisationsreaktion abläuft.
Die Polymerisationsreaktion wird am vorteilhaftesten bei etwa Zimmertemperatur und über wenigstens 2 Stunden durchgeführt, mehr bevorzugt über Nacht. Jedoch können die Polymerisationstemperaturen und -dauern je nach dem verwendeten Gelmaterial variieren.
Als abschließender Schritt nach Beendigung der Polymerisationsreaktion werden die Verschlußstopfen oder -kappen von den Enden der Mikrokapillare entfernt, und wenigstens ein Ende der Mikrokapillare wird sauber und rechtwinklig abgeschnitten. Der Zweck dieses Abschneidevorgangs besteht darin, daß am Ende der Mikrokapillare eine glatte Oberfläche aus Gelmaterial verbleibt - an diesem Ende kann die zu analysierende Probe eingeführt werden. Die mit Gel gefüllte Mikrokapillarsäule kann sodann in eine geeignete Elektrophoreseapparatur eingesetzt werden. Die Säule kann in der Apparatur geprüft werden, indem man ein sehr niedriges elektrisches Feld (etwa 100 bis 150 V/cm) während etwa 1 Stunde an die Kapillare anlegt. Eine nicht richtig vorbereitete Säule wird eine "rauschbehaftete" Grundlinie oder einen Null-Strom-Zustand hervorrufen.
Die hochauflösende Kapillarelektrophorese unter Verwendung der vorbereiteten Gel-gefüllten Mikrokapillarsäulen umfaßt die Verfahrensschritte: elektrophoretische Einbringung einer Teilmenge einer Probe, welche Bestandteile enthält, die in der Säule gemäß der Erfindung getrennt werden sollen; Anlegen eines elektrischen Feldes zwischen etwa 50 und etwa 600 V/cm; Hindurchfließenlassen eines Stroms von vorzugsweise weniger als etwa 2 bis etwa 50 Mikroamper durch die Mikrokapillare; sowie den instrumentellen Nachweis und die Messung der getrennten Analyten, wenn sie an einem on-line-Detektor vorbeiwandern. Typischerweise werden die Messungen als Elektropherogramm-Spitzen oder -Scheitel wiedergegeben, wobei jede nachgewiesene Probenkomponente einen definierten Peak besitzt, der auf der Strömungsgeschwindigkeit der betreffenden Komponente an dem Detektor vorbei, sowie auf dem Anteil der betreffenden Komponente in der Probe beruht.
Die verbesserten mit Gel gefüllten Mikrokapillarsäulen, welche ein bifunktionales Agens enthalten, das ein positiv geladenes Amin und eine aktive funktionelle Gruppe aufweist, zeigen eine ausgezeichnete Stabilität und haben ein Auflösungsvermögen (d. h. das Vermögen zur Trennung der Probenbestandteile), das gleich dem oder besser als das früherer Säulen ist. Außerdem zeigen derartige Säulen eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit von Meßvorgang zu Meßvorgang bzw. von Charge zu Charge. Die vorliegenden Säulen erfordern nur etwa 30 Minuten zur Vorbereitung der Mikrokapillare mit adsorbiertem bifunktionalem Agens, im Vergleich zu etwa 24 Stunden, wie dies mit covalent arbeitenden Stoffen, welche das Gel an die Mikrokapillare binden, erforderlich war.
Die folgenden Beispiele dienen lediglich zum Zweck der Veranschaulichung und sollen keine einschränkende Bedeutung für die vorhergehende Beschreibung und die nachfolgenden Ansprüche darstellen und auch nicht in diesem Sinne ausgelegt werden.

Beispiele

Die Kapillarelektrophorese der in den folgenden Beispielen beschriebenen Proben wurde auf einem Beckman Instruments, Inc. PACE Hochleistungs-Kapillarelektrophoresesystem (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA. Model Nr. #2000) durchgeführt. Die Datenanalyse erfolgte mittels System Gold Software (Beckman Instruments, Inc.). Das PACE Hochleistungs- Kapillarelektrophoresesystem enthält eingebaute Schmalbandfilter bei 214 nm, 254 nm, 280 nm und 415 nm, für on-line-Nachweis. Das Nachweisfenster war in etwa 6,5 cm Abstand vom Säulenausgang angeordnet.
Die Proben wurden auf das Eingangs-Tray des erwähnten Kapillarelektrophoresesystems aufgesetzt. Die Proben wurden automatisch in die mit Gel gefüllte Mikrokapillarröhre injiziert, und zwar nach dem elektrokinetischen Verfahren über 1,5 Sekunden bei 75 kV.
Der Elektrophoresepuffer war 7 M Harnstoff in 10 mM Trishydroxymethylaminomethan - 250 mm Borat, pH 8,3.

Beispiel I

Herstellung des bifunktionellen Agens

106 g Natriumcarbonat (J. T. Baker, Phillisberg, NJ, Cat. #3604), 37,5 ml Alkylamin (Aldrich Chemical, Milwaukee, Wis., Cat. #24107-5) und 200 ml Methanol (B&J, McGaw Park, Il., Cat. #230) wurden in einem 1-l-Rundkolben gerührt. 124,5 ml Jodmethan (Aldrich, Cat. #1-778-0) in 50 ml Äthanol wurden mittels eines Tropftrichters langsam in den Kolben zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht (18 Stunden) umgerührt. Das Methanol wurde auf einem Rotavap (Rotationsverdampfer) abgedampft. Sodann wurden 15 ml Jodmethan in den Kolben zugegeben, und nachfolgend 10 Minuten lang geschüttelt. 200 ml Wasser und 20 ml Tetrahydrofuran (B&J, Cat. #340) wurden zu der Lösung zugegeben und 20 Minuten umgerührt. Das Natriumcarbonat wurde sodann gefiltert, und die wäßrige Schicht wurde gesammelt und durch ein 0,2 Mikrometer-Membranfilter gefiltert.
Die erhaltene Lösung enthielt ein quaternäres Alkylaminbifunktionelles Agens.

Beispiel II

Herstellung von Gel-Säulen

Eine 65 cm lange, einen Innendurchmesser von 100 Mikrometer aufweisende Mikrokapillarsäule (Polymicro, Phoenix, Az., #TSP100375) wurde vorbehandelt, indem man ins Innere der Mikrokapillare 1N Salzsäure 10 Minuten lang einleitete, sodann 10 Minuten lang 1N Natriumhydroxid, sodann 10 Minuten lang mit entionisiertem Wasser spülte. Nach der Vorbehandlung wurde die Gel-Säule mit dem bifunktionellen Agens aus Beispiel I überzozogen, indem man die Lösung 30 Minuten lang in die Kapillare einbrachte.
Zur Herstellung des 7M Harnstoffgels wurden 1,2 g ultrareines Acrylamid (ICN, Irvine, CA. Cat. #814320) in 10 ml 7M Harnstoff, Tris-hydroxymethylaminomethanborat-Puffer ("tris-borat"-Puffer) gelöst (7M Harnstoff, 100 mM Tris, 250 mM Borat, pH 8,3). Die Acrylamidlösung wurde sodann durch ein 0,2 Mikrometer- Nylonfilter gefiltert. 2 ml Acrylamidlösung, 2 Mikroliter 10- %iges Ammoniumpersulfat (BRL, Gaithersburg, MD Cat. #5523) in entionisiertem Wasser, und 2 Mikroliter N,N,N',N'- Tetramethylendiamin (BRL, Cat. #5524 UB) wurden gemischt und unter Verwendung von Heliumgas unter einem Druck von 68,9 kPa (10 psi) in die mit Überzug versehene Mikrokapillarsäule gegossen; nach 3 1/2 Minuten wurde der Druck auf 34,5 kPa (5 psi) abgesenkt mit nachfolgender allmählicher weiterer Druckabsenkung, derart, daß nach 5 Minuten der Druck 0 psi betrug. Die Mikrokapillare wurde an ihren Enden verschlossen und zur Polymerisierung 18 Stunden lang bei Raumtemperatur gehalten. Die mit Gel gefüllten Mikrokapillarröhren wurden sodann bis zur Verwendung bei 4 bis 8 ºC aufbewahrt.
Für eine Gel-Säule, die keinen 7M Harnstoff enthält, wurde nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren vorgegangen, mit dem Unterschied, daß das Acrylamid in Tris-borat-Puffer (100 mM Tris, 100 mM Borat, pH 8,3) gelöst wurde.

Beispiel III

Trennung von Poly d(A) Oligomeren in 7M Harnstoff-Gelsäule

Poly d(A) 25-30 mere und 40-60 mere (Pharmacia, Teil #27-7986-01 bzw. #27-7988-01) wurden in dem erwähnten PACE - Hochleistungs-Kapillarelektrophoresesystem unter Verwendung der mit dem 7M Harnstoff-Gel gefüllten Mikrokapillarsäule aus Beispiel II getrennt. Die Mikrokapillare besaß eine Gesamtlänge von 47 cm, eine effektive Länge von 40 cm und einen Innendurchmesser von 100 um. Die Probeninjektion erfolgte mit 75 kV über 1,5 Sekunden mit 1,50 OD Einheiten/ml Probe. Der Analyselauf bzw. -gang wurde mit 11,1 kV bei 30 ºC durchgeführt.
Die analytischen Ergebnisse sind in Fig. 2 veranschaulicht, in welcher das Absorptionsvermögen (x 10&supmin;³) auf der horizontalen Achse gegen die Wanderungszeit auf der vertikalen Achse aufgetragen ist, und das Poly d(A) 25-30 mer zeitlich vor dem Poly d(A) 40-60 mer erscheint.

Beispiel IV

Trennung von Poly d(A) Oligomeren - Nicht-Harnstoff- Gelsäule

Die gleichen Oligomeren wie in Beispiel III wurden gemäß der Verfahrensweise nach Beispiel III getrennt, unter Verwendung einer mit dem Nicht-Harnstoff-Gel gefüllten Mikrokapillarsäule aus Beispiel II. Die analytischen Ergebnisse sind in Fig. 3 wiedergegeben, in der Weise wie in Beispiel III beschrieben.

Beispiel V

Trennung von Poly d(T) Oligomeren - 7M Harnstoff-Gelsäule

Ein Gemisch von Poly d(T) 20 mer und - 40 mer (Pharmacia, Teil #28-8610-01) wurde nach der Vorgehensweise von Beispiel III getrennt, unter Verwendung der mit 7M Harnstoff-Gel gefüllten Mikrokapillarsäule nach Beispiel II. Die analytischen Ergebnisse sind in Fig. 4 veranschaulicht, gemäß der Beschreibung in Beispiel III, wobei das Poly d(T) 20 mer zeitlich vor dem Poly d(T) 40 mer erscheint.

Beispiel VI

Stabilitätsuntersuchung - 7M Harnstoff-Gelsäule

Es wurden die Migrationszeiten für Poly d(A) 25, 29, 41, 47 und 50 mere jeweils über eine Anzahl von Injektionen der Oligomere bestimmt, unter Verwendung der mit 7M Harnstoff-Gel gefüllten Mikrokapillarsäule von Beispiel II. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 veranschaulicht. Die Ergebnisse zeigen, daß die mit Gel gefüllte Mikrokapillarsäule über wenigstens ca. 100 Injektionen hin stabil ist. In Fig. 5 wurden die folgenden Symbole verwendet: Poly d(A) 25-º; Poly d(A) 29- ; Poly d(A) 41 - x; Poly d(A) 47 - ; und Poly d(A) 50 - /.
Das bifunktionale Agens der vorliegenden Erfindung gewährleistet die Adsorption des Amin-Teils des Reagens an der Mikrokapillare innerhalb etwa 30 Minuten nach Einbringung des Agens in diese. Die aktive funktionelle Gruppe vermag dann mit dem in die Mikrokapillare eingebrachten in Polymerisation befindlichen Gelmaterial zu copolymerisieren. Die vorstehenden Beispiele zeigen, daß eine das bifunktionelle Agens enthaltende mit Gel gefüllte Mikrokapillarsäule ein ausgezeichnetes Auflösungsververmögen besitzt und über wenigstens 100 Probeninjektionen stabil ist. Das bifunktionelle Agens erfordert nur etwa 30 Minuten zur Adsorption an der Kapillareninnenwandung, im Gegensatz zu etwa 24 Stunden, wie dies für die covalente Befestigung nach dem Stande der Technik erforderlich ist. Somit bietet das bifunktionelle Agens der vorliegenden Erfindung verschiedene zusätzliche Vorteile gegenüber bekannten Gelgefüllten Mikrokapillarsäulen.

Claims

1. Ein Gel enthaltende Mikrokapillarsäule umfassend

a) eine Mikrokapiilare (10) mit einem Innenhohlraurn und einer Wandung mit einer Innenoberfläche (12,12a); sowie

b) ein den Innenhohlraum der Mikrokapillare ausfüllendes Polymergel (20), wobei das genannte Gel durch ein bifunktionales Agens (14,14a,14b), an welches es gebunden ist, mit der Wandung verbunden ist,

dadurch gekennzeichnet, daß das bifunktionale Agens ionisch an die Innenoberfläche der Wandung gebunden ist.

2. Mikrokapillare nach Anspruch 1, bei welcher das bifunktionale Agens wenigstens ein positiv geladenes Amin und wenigstens eine zur Bindung mit einem polymeren Gel befähigte aktive funktionelle Gruppe aufweist.

3. Mikrokapillare nach Anspruch 2, bei welcher die aktive funktionelle Gruppe wenigstens ein durch eine Doppelbindung mit einem zweiten Atom verbundenes Kohlenstoffatom aufweist.

4. Mikrokapillare nach Anspruch 2, bei welcher die aktive funktionelle Gruppe wenigstens ein durch eine Dreifach- Bindung mit einem zweiten Atom verbundenes Kohlenstoffatom aufweist.

5. Mikrokapillare nach Anspruch 1, bei welcher das bifunktionelle Agens durch die folgende Struktur wiedergegeben ist:

worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; jeweils unabhängig voneinander aus der nachstehenden Gruppe gewählt sind:

worin n eine ganze Zahl zwischen 0 und 10 ist,

m eine ganze Zahl zwischen 0 und 5 ist,

R aus der aus

bestehenden Gruppe gewählt ist und

R&sub4; eine aktive funktionelle Gruppe ist;

y eine ganze Zahl zwischen 1 und 5000 ist; und

X aus der aus Fluor, Chlor, Brom, Jod und Astatin bestehenden Gruppe gewählt ist.

6. Mikrokapillare nach Anspruch 5, bei welcher R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; jeweils -(CH&sub2;)n CH&sub3; sind.

7. Mikrokapillare nach Anspruch 6, bei welcher n den Wert 0 besitzt.

8. Mikrokapillare nach Anspruch 5, bei welcher die aktive funktionelle Gruppe einen Teil aufweist, der aus der aus

bestehenden Gruppe gewählt ist.

9. Mikrokapillare nach Anspruch 5, bei welcher die aktive funktionelle Gruppe einen -C=C- Teil aufweist.

10. Mikrokapillare nach Anspruch 5, bei welcher y eine ganze Zahl zwischen 1 und 2000 ist.

11. Mikrokapillare nach Anspruch 5, bei welcher y den Wert 1 besitzt.

12. Mikrokapillare nach Anspruch 5, bei welcher X Jod ist.

13. Mikrokapillare nach Anspruch 1, bei welcher das bifunktionelle Agens durch die folgende Struktur wiedergegeben wird:

14. Mikrokapillare nach Anspruch 1, bei welcher das Polymergel des weiteren ein Copolymer aus Acrylamid und wenigstens einem Vernetzungsmittel umfaßt.

15. Mikrokapillare nach Anspruch 1, bei welcher die Mikrokapillare aus der aus Glas, Aluminiumoxid (Tonerde), Berylliumoxid und geschmolzenem Silica bestehenden Gruppe gewählt ist.

16. Mikrokapillare nach Anspruch 1, bei welcher die Mikrokapillare aus geschmolzenem Silica besteht.

17. Ein Gel enthaltende Mikrokapillarsäule umfassend

a) eine Mikrokapillare (10) mit einem Innenhohlraum und einer Wandung mit einer Innenoberfläche (12,12a); und

b) ein den Innenhohlraum der Mikrokapillare ausfüllendes Polymergel (20), wobei das Gel kovalent an ein bifunktionelles Agens (14,14a,14b) gebunden ist, das mit der Wandung verbunden ist,

dadurch gekennzeichnet, daß das bifunktionelle Agens durch die folgende Struktur wiedergegeben ist:

worin das positiv geladene Amin ionisch an die Innenoberfläche der Wandung gebunden ist.

18. Mikrokapillare nach Anspruch 17, bei welcher das Polymergel des weiteren ein Copolymer von Acrylamid und wenigstens einem Vernetzungsmittel umfaßt.

19. Mikrokapillare nach Anspruch 17, worin das Gel ein Copolymer aus Acrylamidmonomer und N,N'-Methylenbisacrylamid-Vernetzungsmittel ist.

20. Mikrokapillare nach Anspruch 17, bei welcher die Mikrokapillare geschmolzenes Silica ist.

21. Verfahren zur Durchführung von Kapillarelektrophorese, umfassend

a) Injektion einer Teilmenge einer zu trennende Bestandteile enthaltenden Probe auf eine ein Gel enthaltende Mikrokapillarsäule gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20,

b) Anlegen eines elektrischen Feldes von wenigstens etwa 50 V/cm an die mit Probe injizierte Mikrokapillarsäule; und

c) sequentieller instrumenteller Nachweis der Bestandteile.