DE69508852T2

DE69508852T2 - Beschichtete kapillarsäulen und elektroforetische trennungsmethoden zu deren gebrauch

Info

Publication number: DE69508852T2
Application number: DE69508852T
Authority: DE
Inventors: Chia-Hui Shieh
Original assignee: Beckman Coulter Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1994-01-25
Filing date: 1995-01-24
Publication date: 1999-08-19
Anticipated expiration: 2015-01-25
Also published as: DE69508852D1; JP3607923B2; WO1995020157A1; JPH08508577A; US5447617A; EP0690984B1; EP0690984A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Kapillarsäulen mit Innenoberflächenbeschichtungen und auf elektrophoretische Trennverfahren und deren Anwendung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Kapillarsäulen, die eine neutrale vernetzte hydrophile Beschichtung auf ihren Innenwandoberflächen aufweisen. Die neutrale vernetzte hydrophile Beschichtung verringert eine Wechselwirkung des Analyten mit der Innenoberfläche der Kapillarsäule und schützt gleichzeitig die Innenoberfläche der Kapillarsäule während der elektrophoretischen Trennung von sauren und basischen Verbindungen.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Elektrophoretische Trenntechniken wurden über Jahre hinweg verwendet, um Moleküle entsprechend den Unterschieden der effektiven Ladung und/oder entsprechend den Unterschieden der Molekulargröße der Moleküle zu trennen. Bis in letzterer Zeit wurden elektrophoretische Trennungen in Gelplatten oder offenen Gelbetten durchgeführt, die typischerweise aus einem Polyacrylamid-Gelmaterial hergestellt waren. In letzterer Zeit haben Kapillarelektrophoresetechniken in Verbindung mit photometrischen Detektionsverfahren die Automation und schnelle quantitative Analyse von Molekülen ermöglicht. Eine hohe Auflösung aufweisende Trennung von Molekülen mit unterschiedlichen effektiven Ladungen wurden durch die Anwendung elektrophoretischer Prinzipien auf mit Puffer gefüllte oder mit Gel gefüllte enge Kapillarrohre erzielt.
Typischerweise werden bei der Kapillarelektrophorese verwendete Kapillarsäulen aus Längenabschnitten von Silika-Rohren hergestellt, die Durchmesser in der Größenordnung von 25 um bis 200 um und Längen von ungefähr 10 bis 200 cm aufweisen. Die Puffer- und Gel-Trennmedien werden direkt in das Innere der Säulen gepumpt, und Elektrophoresetechniken werden zur Trennung vielfältiger Arten von Molekülen verwendet, unter Einschluß von Peptiden, Proteinen und Oligonukleotiden, Nukleinsäuren und anderen geladenen Molekulararten. Das Gebiet der elektrophoretischen Trenntechnik wird kontinuierlich bezüglich der Arten und Größen der Moleküle erweitert, die unter Verwendung von Kapillarelektrophoreseverfahren getrennt und erfaßt werden können.
Die mit der Kapillarelektrophorese verbundenen Vorteile sind vielfältig. Eine quantitative Information kann mit sehr kleinen Probengrößen erzielt werden, und die Menge des verbrauchten Gels oder Puffers ist minimal. Weiterhin wird die für die Trennungen erforderliche Zeit stark verringert, und die Technik eignet sich als solche für die Automation und die elektronische Datenspeicherung und Datenmanipulation. Von Bedeutung ist hierbei, daß die Kapillarelektrophorese mit bestimmten Erscheinungen verbunden ist, die sich bei der traditionellen Platten-Gelelektrophorese nicht ergeben. Eine dieser Erscheinungen ist die nunmehr bekannte elektroosmotische Strömungserscheinung, die durch eine Massenströmung von Pufferlösungen in Richtung auf eine der Elektroden gekenzeichnet ist.
Die elektroosmotische Strömung wird durch die Ionisation von Silanolfunktionalitäten auf der Oberfläche der Silika-Kapillarröhre erzeugt. Die Ionisation führt zu einer Schicht von Protonen in der elektrophoretischen Pufferlösung an der Oberfläche des Silika-Rohres. Bei Vorhandensein eines elektrischen Feldes ähnelt die Protonenschicht einer positiv geladenen Flüssigkeitssäule, die in Richtung auf die Kathode wandert, wodurch eine allgemeine Massenbewegung des Puffermediums hervorgerufen wird. In vorteilhafter Weise kann die elektroosmotische Strömung bei vielen Anwendungen dazu verwendet werden, elektrophoretische Trennungen zu verbessern. Wenn beispielsweise die elektrophoretische Wanderung oder Migration der Moleküle, die getrennt werden, in der entgegengesetzten Richtung zu der elektroosmotischen Strömung erfolgt, so besteht das Endergebnis in einer Vergrößerung der Säulenbetriebsleistung und verbesserten Trennungen.
Für viele elektrophoretische Anwendungen ist die elektroosmotische Strömung unerwünscht, und es wird bevorzugt, die Massenströmung zu beseitigen oder erheblich zu verringern. Allgemein bewegen sich, wenn die elektroosmotische Strömung auf ein Minimum verringert ist, elektrophoretische Probenbestandteile lediglich durch die elektrophoretische Wanderung, wodurch die Analyse-Reproduzierbarkeit und Massenrückgewinnung der Probenkomponenten verbessert wird.
Ein Verfahren zur weitgehenden Verringerung oder Steuerung der elektroosmotischen Strömung besteht in der Verwendung von Kapillarsäulen, die aus Silika-Kapillarsäulen hergestellt sind, die auf der Innenseite mit einem Polymermaterial beschichtet sind. Die Polymerbeschichtung führt zu einer Beseitigung oder weitgehenden Verringerung des Ausmaßes der Ionisation der Silänol-Gruppen an der Oberfläche, wodurch zumindest eine erhebliche Verringerung der Massenströmung in der Elektrophoresesäule hervorgerufen wird. Um unerwünschte hydrophobische- hydrophobische Wechselwirkungen zwischen Probenbestandteilen und der Beschichtung zu vermeiden, sind die Polymerbeschichtungen tradionell hydrophil. Ein Problem, das sich bei den hydrophilen Polymerbeschichtungen ergibt, besteht in deren geringer physikalischer Integrität, ihrer Neigung zur Trennung von der Oberfläche der Kapillare und der resultierenden kurzen Lebensdauer. Entsprechend wurden hydrophile Polymere mit der Oberfläche der Silika-enthaltenden Kapillaren durch ein Vernetzungsmittel gekoppelt, das eine Si-O-Si-Bindung an der Wandgrenzfläche bildet. Siehe beispielsweise US-Patent 5 221 447. Eine kovalente Bindung hydrophiler Polymere an der Oberfläche des Kapillarrohres trägt zur Verringerung der Neigung der Beschichtung zu einer Trennung bei, doch bleibt die physi kalische Integrität der Beschichtungen ein Problem.
Zusätzlich fördern hydrophile Beschichtungen selbst bei kovalenter Bindung an der Oberfläche der Silika-Kapillaren durch eine Si-O-Si-Bindung eine wässrige Wechselwirkung mit Si-O-Si- Funktionalitäten. Dies kann zu der unerwünschten Hydrolyse der Si-O-Si-Bindung und zu einer sich daraus ergebenden verkürzten Nutzlebensdauer führen.
Wie dies weiter oben erwähnt wurde, besteht ein weiteres Problem bei Kapillarelektrophoresetechniken in der Neigung von Probenbestandteilen, an der Wand der Kapillarsäule und insbesondere an Silikarohren anzuhaften. Dies ist insbesondere im Fall von kleinen geladenen Molekülen der Fall, die sehr leicht von den reaktiven Silika-Funktionalitäten angezogen werden. Wenn kleine Peptide und Amide in elektrophoretischen Trennmedien vorhanden sind, treten sie sowohl elektrostatisch als auch hydrophob mit der Kapillarwand in Wechselwirkung. Das Ergebnis besteht in einer Verringerung des Trennwirkungsgrades und einer unerwünschten Banderweiterung, was fehlerhafte Trenndaten ergibt.
Ähnlich wie hinsichtlich der elektroosmotischen Strömung war die Schaffung von Elektrophorese-Kapillaren, die in der Lage sind, das Ausmaß der Wechselwirkung zwischen Probenbestandteilen und der Wand zu einem Minimum zu machen, nicht vollständig erfolgreich. Bisherige Versuche schließen die Verwendung einer dynamischen Doppelschicht-Beschichtung ein. Diese Zweischicht- Beschichtungen sind nicht stabil und erfordern Zusätze in den strömenden Puffern, die während des Elektrophoresverfahrens verwendet werden. Hydrophobe Beschichtungen sind zum Schutz der Si-O-Si-Oberflächen von Silika-Säulen wirkungsvoll, rufen jedoch unerwünschte Hydrophob-Hydrophob-Wechselwirkungen zwischen der Kapillarwand und den Analyten hervor. Wie dies weiter oben erwähnt wurde, sind hydrophile Beschichtungen beim Schutz der Si-O-Si-Oberfläche nicht wirkungsvoll.
Entsprechend ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, neuartige beschichtete Kapillarsäulen zu schaffen, die für Elektro phorese-Trennungen brauchbar sind und die die elektroosmotische Strömung zu einem Minimum machen.
Es ist weiterhin ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Kapillarsäulen zu schaffen, die Wechselwirkungen zwischen Probenbestandteilen und der Kapillar-Innenwand verringern oder beseitigen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Kapillaren zu schaffen, die physikalisch stabile Beschichtungen aufweisen.
Es is zusätzlich ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Kapillaren zu schaffen, die für die elektrophoretische Trennung einer Vielzahl von geladenen Molekülen brauchbar sind.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung erreicht die obengenannten Ziele durch Schaffung von Kapillarsäulen mit Innenoberflächen- Beschichtungen, die zu der Beseitigung oder weitgehenden Verringerung des Ausmaßes der Wechselwirkung zwischen Probenbestandteilen und der Innenoberfläche der Kapillarsäule beitragen. Die beschichteten Kapillarsäulen der vorliegenden Erfindung tragen zusätzlich zur weitgehenden Verringerung des Ausmaßes der elektroosmotischen Strömung während elektrophoretischer Trennungen bei, wodurch die Massenströmung beseitigt wird und die Probenbewegung auf die elektrophoretische Wanderung beschränkt wird. In vorteilhafter Weise führt die Verwendung der Kapillarsäulen der vorliegenden Erfindung zu verbesserten Trennungen für eine Anzahl von sauren und basischen Verbindungen, unter Einschluß von Aminen, Aminosäuren, Peptiden und Proteinen. Weiterhin haben die hier beschriebenen Polymerbeschichtungen eine beträchtliche physikalische Integrität, und sie sind äußerst stabil, wodurch die Nutzlebensdauer der Säulen gegenüber bekannten Säulen erheblich verbessert wird.
Insbesondere schließen die Kapillarsäulen der vorliegenden Erfindung einen Längenabschnitt eines Rohres mit einer Innen oberfläche ein. Die Innenoberfläche weist eine Verbund-Polymerbeschichtung auf, die eine hydrophobe polymerische Funktionalität, die kovalent an die Innenoberfläche des Kapillarrohres gebunden ist, und ein hydrophiles Polymer ein, das mit der hydrophoben polymerischen Funktionalität kopolymerisiert ist. Vorzugsweise ist das Kapillarrohrmaterial, das zur Zubereitung der Säule verwendet wird, aus Silika hergestellt, und die hydrophobe polymerische Funktionalität ist kovalent an der Innenoberfläche durch eine Si-O-Si-Bindung gebunden, die dadurch gebildet wird, daß die Si-OH-Funktionaltäten der Kapillaroberfläche mit einem geeigneten Reaktanten zur Reaktion gebracht werden. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die hydrophobe polymerische Funktionalität Polybutadien, und das hydrophile Polymer ist Polyacrylamid.
Die beschichteten Kapillarsäulen der vorliegenden Erfindung können dadurch zubereitet werden, daß ein Längenabschnitt eines Silika-Rohrmaterials mit einer Innenoberfläche und Si-OH-Funktionalitäten auf der Innenoberfläche bereitgestellt wird und eine reaktive Si-OH-Verbindung zur Reaktion mit den Si-OH- Funktionalitäten gebracht wird. Geeignete Si-OH-Reaktionsverbindungen schließen Silan- und Siloxan-Verbindungen ein, die zumindest eine neutrale hydrophobe Funktionalität aufweisen, wobei die hydrophobe Fuktionalität polymerisch ist und in der Lage ist, weiter mit polymerisierbaren Monomeren zu reagieren. Wenn dann bewirkt wird, daß ein hydrophiler Monomer homopolymerisiert und mit der hydrophobischen Funktionalität reagiert, so führt dies zu einer Verbund-Polymerbeschichtung von hydrophilen und hydrophoben Polymeren. Bei bevorzugten Verfahren ist die Reaktionsverbindung ein polymeres Polybutadienyl- Triethoxy-Silan, und das hydrophile Monomer ist Acrylamid.
Weiterhin werden hier Verfahren zur Zubereitung und Verfahren zur Verwendung der beschichteten Kapillarsäulen der vorliegenden Erfindung offenbart. Insbesondere schließt gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Zubereitung einer beschichteten Kapillarsäule die Schritte der Bereitstellung eines Längenabschnittes eines Silika-Rohres mit einer Innen oberfläche und Si-OH-Funktionalitäten auf der Innenoberfläche und das zur Reaktion bringen einer Si-OH-Reaktionsverbindung mit den Si-OH-Funktionalitäten ein, wobei die Si-OH-Reaktionsverbindung eine hydrophobe polymerische Funktionalität aufweist. Wenn dann eine Polymerisation des hydrophilen Monomers in Kontakt mit der hydrophoben Polymer-Funktionaltät hervorgerufen wird, so führt dies zu einem Verbund-Polymer-Netzwerk von hydrophilen und hydrophoben Polymeren. Das Verbund-Polymer- Netzwerk hat eine hohe physikalische Integrität und eine verlängerte Nutzlebensdauer.
Diese und weitere Vorteile, die sich aus der vorliegenden Erfindung ergeben, werden für den Fachmann bei einem Verständnis der Erfindung ersichtlich, wie sie in der ausführlichen Beschreibung der Erfindung in Kombination mit den folgenden Zeichnungen beschrieben wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine Querschnittsansicht einer Kapillarelektrophorese-Säule der vorliegenden Erfindung, die eine Verbundbeschichtung aus einem hydrophoben Polymer und einem hydrophilen Polymer auf der Innenoberfläche einer Silika- Kapillarsäule zeigt,
Fig. 2 ist eine Teil-Querschnittsansicht einer Kapillarelektrophorese-Säule, die eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt,
Fig. 3 ein Elektropherogramm ist, das sich aus der elektrophoretischen Trennung der HaeIII-Digestion von φX174 DNA ergibt,
Fig. 4 ist ein Elektropherogramm, das sich aus der elektrophoretischen Trennung von Proteinen in einer wässrigen Lösung gemäß der vorliegenden Erfindung ergibt,
Fig. 5 zeigt die Reproduzierbarkeit der Elektropherogramme, die unter Verwendung einer beispielhaften Säule der vorliegenden Erfindung gewonnen werden,
Fig. 6 ist ein Elektropherogramm, das aus der elektrophoretischen Analyse von Proteinen in Kükeneiweiß gewonnen wurde.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung ergibt beschichtete Kapillarsäulen, die besonders in elektrophoretischen Trennsystemen brauchbar sind, wie z. B. den Kapillarelektrophorese-Systemen der P/ACE- Serie, die von der Firma Beckman Instruments, Inc., Fullerton, Kalifornien hergestellt und vertrieben werden. Insbesondere sind die beschichteten Kapillarsäulen der vorliegenden Erfindung als Trennmedien in Anwendungen brauchbar, in denen eine Vielzahl von Molekularspezies auf der Grundlage ihrer elektrophoretischen Mobilität getrennt wird. Diese Molekularspezies schließen basische und sauere Makromoleküle, wie z. B. Proteine und Polynukleotide sowie kleinere Verbindungen, wie z. B. basische Medikamente und Nukleinsäuren ein.
Die hier beschriebenen beschichteten Kapillarsäulen tragen zur Beseitigung oder weitgehenden Verringerung der elektroosmotischen Strömung während elektrophoretischer Trennungen bei. Als ein Merkmal der vorliegenden Erfindung sind die Beschichtungsmaterialien, die zur Bildung der beschichteten Säulen verwendet werden, Verbindungen, die durch kovalente Bindungen miteinander und mit der Wand der Kapillarsäule verbunden sind, wodurch ein verbindendes polymerisches Netzwerk gebildet wird. Dies führt zu Beschichtungen, die eine verbesserte physikalische Integrität aufweisen, was andererseits Säulen mit längeren Nutzlebensdauern und einer verbesserten Zuverlässigkeit und Präzision bei elektrophoretischen Trennverfahren ergibt. Die verbesserte physikalische Integrität und die chemischen Eigenschaften der Beschichtungen tragen weiterhin zu einer verlängerten Fähigkeit bei, die Wechselwirkung der verschiedenen Analyten mit der Wand der Kapillarsäule zu verhindern.
Die beschichteten Kapillarsäulen der vorliegenden Erfindung beinhalten hydrophile polymerische Eigenschaften in der Beschichtung und beseitigen damit weitgehend hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Probenkomponenten und der Kapillarwand. Zusätzlich beinhalten die Kapillarsäulen der vorliegenden Erfindung hydrophobe Funktionalitäten, die kovalent an die Oberfläche der Kapillarsäule gebunden sind. Diese hydrophoben Eigenschaften verringern die Wechselwirkung der wässrigen Elektrophorese-Pufferumgebung mit der Innenwand der Kapillare, wodurch eine Hydrolyse der kovalent gebundenen Beschichtung von der Wand des Kapiallarrohres zu einem Minimum gemacht wird.
Insbesondere und unter Bezugnahme auf eine beispielhafte Längs-Teilquerschnittsansicht einer Säule nach Fig. 1 werden die beschichteten Kapillarsäulen 10 der vorliegenden Erfindung aus einem Längenabschnitt eines Kapillarrohres 12 mit einer Innenoberfläche 14 hergestellt. Die Innenoberfläche 14 weist eine Verbund-Polymerbeschichtung auf, die eine hydrophobe polymere Funktionalität 16, die kovalent an die Innenoberfläche 14 des Kapillarrohres 12 gebunden ist, und ein hydrophiles Polymer ein, das an die hydrophobe polymere Funktionalität 16 gebunden ist.
Das Kapillarrohr 12, das zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet ist, kann aus organischen Polymermaterialien, wie z. B. Polyacrylaten, Polyvinylen, Polymetacrylaten oder anorganischen Materialien hergestellt werden, die Silika und Quarz einschließen. Vorzugsweise weist das ausgewählte organische oder anorganische Material chemische Komponenten auf, die unter leichten pH- und Temperatur-Bedingungen mit Verbindungen reagieren, die hydrophobe Funktionalitäten aufweisen, so daß die hydrophobe polymere Funktionalität 16 kovalent an die Oberfläche des Kapillarrohres gebunden ist. Wie dies in Fig. 1 gezeigt ist, ist die hydrophobe polymere Funktionalität 16 zusätzlich in der Lage, mit einer hydrophilen Verbindung 18 zu reagieren, die entweder ein Polymer ist oder polymerisierbar ist, wodurch sich eine Beschichtung aus einem vernetzten Netzwerk eines hydrophoben Polymers und eines hydrophilen Polymers ergibt.
Das bevorzugte Material zur Herstellung von Kapillarsäulen, die bei der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, ist Silika. Silika-Kapillarsäulen wurden über Jahrzehnte hinweg in Chromatographie-Verfahren verwendet und finden in letzterer Zeit eine Anwendung bei elektrophoretischen Verfahren. Entsprechend ist die Herstellung und Handhabung dieser Säulen dem Fachmann bekannt und wird hier nicht weiter ausführlich erläutert. Wie dies ausführlich im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung erläutert wird, weist Silika in vorteilhafter Weise Si-OH- Funktionalitäten auf, die sehr leicht mit Verbindungen, wie z. B. Siloxanen und in ähnlicher Weise reaktiven Silanen reagieren. Weil Siloxane und Silane mit einer Vielzahl von unterschiedlichen chemischen Substituenten in weitem Umfang im Handel erhältlich sind, ist ihre Verwendung in Kombination mit Silika-Säulen bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung besonders vorteilhaft.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind geeignete Verbindungen, die hydrophobe Funktionalitäten aufweisen und zu einer kovalenten Hindung an die Oberfläche des Kapillarrohres in der Lage sind, Silan- oder Siloxan-Verbindungen mit polymeren Kohlenwasserstoff-Komponenten. Derartige Kohlenwasserstoff enthaltende Verbindungen sind vorzugsweise zusätzlich in der Lage, mit ausgewählten hydrophilen Monomeren oder hydrophilen. Polymeren zu reagieren. Diese zusätzliche Fähigkeit ermöglicht die Verbindung eines gebundenen Zwischenverbindungsnetzes oder Verbundnetzwerkes aus hydrophoben Polymeren und hydrophilen Polymeren auf der Kapillar-Innenoberfläche. Entsprechend sind die bevorzugten hydrophoben Polymer-Kohlenwasserstoff-Komponenten reaktive Kohlenwasserstoffe, wie z. B. Polybutadien. Für den Fachmann ist es zu erkennen, daß diese Kohlenwasserstoffe reaktive Vinyl-Komponenten zur Reaktion mit den hydrophilen Vinyl-Monomeren aufweisen. Weiterhin können hydrophile Vinylmonomere bei Vorliegen derartiger Vinyl enthaltender Kohlen wasserstoffe polymerisiert werden und reagieren mit den Vinyl enthaltenden Kohlenwasserstoffen, um ein Netzwerk aus hydrophilen Polymeren zu bilden, die kovalent mit hydrophoben Polymer-Funktionalitäten vernetzt sind, die ihrerseits kovalent an die Wand des Kapillarrohres gebunden sind.
Somit sind bei bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Verbindungen mit hydrophilen Funktionalitäten Vinyl enthaltende hydrophile Monomere, und die hydrophobe Funktionalitäten aufweisenden Verbindungen sind Silane oder Siloxane, die modifiziert wurden, um Polybutadien-Komponenten zu tragen, die in der Lage sind, mit den hydrophilen Vinyl-Monomeren zu reagieren. Der Fachmann wird erkennen, daß nach der Polymerisation das Ergebnis in einem homopolymerisierten und copolymerisierten Netzwerk von hydrophoben Polymer-Funktionalitäten und hydrophilen Polymer-Funktionalitäten besteht. Die resultierende beschichtete Elektrophorese-Kapillarsäule weist ein beträchtlich verringertes Ausmaß an Si-OH-Funktionalitäten auf der Innenoberfläche des Kapillarrohres auf. Damit wird eine elektroosmotische Strömung oder Massenströmung in der Säule unter dem Einfluß eines elektrischen Feldes im wesentlichen beseitigt. Weiterhin verringert die hydrophobe Polymer-Funktionalität, die an die Oberfläche der Säule gebunden ist, wässrige elektrophoretische Puffer-Wechselwirkungen mit der kovalenten Bindung, die zur kovalenten Vernetzung der Beschichtung gebildet ist. Diese verringerte Wechselwirkung beseitigt eine Hydrolyse der kovalenten Bindung, die typischerweise eine Si-O-Si-Bindung ist, und trägt zu einer vergrößerten Nutzlebensdauer der Säule bei. Schließlich schirmt der hydrophile polymerische Teil der Beschichtung die Elektrophorese-Analyten von den hydrophoben Teilen der Beschichtung ab, wodurch unerwünschte Hydrophob- Hydrophob-Wechselwirkungen zwischen Probenanalyten-Bestandteilen und der Beschichtung oder Kapillarwand beseitigt werden.
Für den Fachmann ist es zu erkennen, daß eine Vielzahl von Verbindungen mit hydrophoben Kohlenwasserstoff-Funktionalitäten und eine Vielzahl von hydrophilen monomerischen Verbindungen für die Ausführung der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Insbe sondere sind Polybutadien-Funktionalitäten, die auf reaktiven Polysiloxanen oder Polysilanen mit einem weiten Bereich von Molekulargewichten geschaffen werden, brauchbar. Diese Molekulargewichte reichen von 200 bis über 2.000.000. Der begrenzende Faktor bei dem Molekulargewicht ist die Länge der Polybutadien-Kette, die eine räumliche Behinderung hervorrufen und die Bindung des Silans oder Siloxans an der Oberfläche der Kapillarsäule stören kann. Weil diese Verbindungen reaktive Vinyl-Funktionalitäten haben, sind sie in der Lage, mit hydrophilen Vinylmonomeren zu kopolimerisieren, unter Einschluß von Hydroxyethylmetacrylat, Vinylpyrolidon, Acrylamiden und anderen, um ein Beschichtungsnetzwerk zu bilden, das eine hydrophobe Kohlenwasserstoff-Polymerschicht und ein zweites Netzwerk von hydrophilen Polymerschichten einschließt. In ähnlicher Weise können Ester, die zu Umesterungsreaktionen auf der Oberfläche von Acrylat-Kapillarrohren in der Lage sind und Vinyl-Kohlenwasserstoff-Funktionalitäten haben, mit hydrophilen Monomeren kopolymerisieren, um ähnliche Netzwerke zu bilden.
Unter erneuter Bezugnahme auf Fig. 1 ist bei bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung das Kapillarrohr 12 aus Silika hergestellt, und es kann in Abhängigkeit von der speziellen analytischen Anwendung in seiner Länge und seinem Durchmesser veränderlich sein. Typischerweise hat die Säule eine Länge von zwischen ungefähr 10 cm bis 200 cm und einen Innendurchmesser von 25 bis 200 um. In vorteilhafter Weise hat die Oberfläche des Silika-Kapillarrohres SiOH- Komponenten, die mit einer Anzahl von organischen und anorganischen chemischen Funktionalitäten reaktionsfähig sind und und Reaktionsstellen zur kovalenten Bindung von Verbindungen mit wünschenswerten chemischen Eigenschaften an die Wandinnenoberfläche 14 des Kapillarrohres ergeben. Weiterhin sind gemäß bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung die hydrophoben chemischen Funktionalitäten 16 Polybutadien- Funktionalitäten, die an der Innenwandoberfläche 14 über Si-O- Si-Bindungen angebracht sind, die durch die Reaktion eines Siloxans mit SiOH-Funktionalitäten erzeugt sind. Bei dieser bevorzugten Ausführungsform ist das hydrophile Polymer 18 Polyacrylamid, das bei seiner Bildung durch polymerisieren eines Acrylamid-Monomers bei vorliegen von geeigneten Injizierungsmitteln außerdem mit Rest- und freien Vinylgruppen des Polybutadiens kopolimerisiert und zu der Bildung der vernetzten oder Verbund-Polymer-Beschichtung beiträgt.
Die längsverlaufende Teil-Querschnittsansicht nach Fig. 2, die eine Wand einer Kapillarsäule zeigt, zeigt graphisch die bevorzugte beschichtete Säule. Im einzelnen ist die Beschichtung der bevorzugten Kapillarsäule 30 der vorliegenden Erfindung ein vernetztes Polymer-Netzwerk, das kovalent über eine Si-O-Si-Bindung 32 an die Innenwandoberfläche 38 des Kapillarrohres 34 gebunden ist. Polybutadien bildet eine hydrophobe Beschichtungsschicht 36 benachbart zur Innenwandoberfläche 38 der Kapillare, und Polyacrylamid bildet eine hydrophile äußere Schicht 40, die für eine Wechselwirkung mit Probenbestandteilen und den wässrigen Puffersystemen verfügbar ist, die bei elektrophoretischen Trennungen verwendet werden. Weiterhin wirkt das Polyacrylamid als eine Brücke zwischen Längen des Polyacrylamids, wodurch ein vernetztes Netzwerk von Polymeren gebildet wird. Der Fachmann wird erkennen, daß die hydrophoben Charakteristiken der vorstehend beschriebenen Beschichtung die Wechselwirkung des wässrigen Puffers mit der Kapillarwandoberfläche zu einem Minimum machen. Insbesondere schließen die hydrophob-hydrophilen Abstoßungen eine Wechselwirkung zwischen wässrigen Medien und der Beschichtungsgrenzfläche an der Kapillarwandoberfläche aus, wodurch eine Hydrolyse der SiOH- Bindung beseitigt wird. Somit bleibt das polymere Beschichtungsnetzwerk kovalent an der Kapillar-Innenwandoberfläche gebunden und trägt zu einer beträchtlichen Vergrößerung der Nutzlebensdauer der Kapillarsäule bei.
Ein weiteres Merkmal der bevorzugten beschichteten Kapillarsäule der vorliegenden Erfindung besteht in der hydrophilen Charakteristik der Beschichtung. Wie dies in Fig. 1 und Fig. 2 gezeigt ist, steht der hydrophile Teil der Beschichtung für eine Wechselwirkung mit dem Puffersystem zur Verfügung, das während elektrophoretischer Trennungen verwendet wird.
Zusätzlich wirkt der hydrophile Polymerteil als eine Pufferzone zwischen dem hydrophoben Teil der Beschichtung und den Puffermedien. Dieser hydrophile polymerische Puffer verhindert hydrophobe-hydrophobe Wechselwirkungen zwischen der Beschichtung und elektrophoretischen Probenkomponenten und macht entsprechend eine Probenabsorption auf der Oberfläche der Kapillarsäule zu einem Minimum.
Gemäß der vorliegenden Erfindung schließen Verfahren zur Zubereitung der beschichteten Kapillarsäulen die allgemeinen Schritte der Bereitstellung eines Längenabschnittes eines Silika-Rohres mit einer Innenoberfläche mit Si-OH- Funktionalitäten auf der Innenoberfläche und das nachfolgende Hervorrufen einer Reaktion einer Siloxan-Verbindung mit den Si-OH-Funktionalitäten ein. Die Siloxan-Verbindung ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß sie eine neutrale polymerisierbare Funktionalität aufweist, die Reaktionsplätze zur Vernetzung oder Kopolimerisation mit Monomeren ergibt, die mit der polymerisierbaren Funktionalität reaktionsfähig sind. Wenn das hydrophile Monomer für die Kopolimerisation mit der Polymerisierbaren Funktionalität verfügbar gemacht wird, besteht das Ergebnis in einer vernetzten Beschichtung von hydrophilen und hydrophoben Polymeren.
Bevor das Siloxan mit den SiOH-Funktionalitäten zur Reaktion gebracht wird, ist es zu bevorzugen, zunächst die Innenoberfläche der Kapillare durch aufeinanderfolgendes Waschen der Oberfläche mit einer anorganischen Säure, einer anorganischen Base und schließlich mit einem flüchtigen niederen organischen Alkohol vorzubereiten. Das Hervorrufen der Reaktion des Silans mit den SiOH-Funktionalitäten umfaßt typischerweise das einfache Inkontaktbringen der Innenoberfläche der Kapillare mit einer geeigneten Silanverbindung, wie z. B. Polybutadienyl- Trietoxy-Silan. Die Verwendung eines inerten unter Druck stehenden Gases, wie z. B. Helium, bei einem Druck von ungefähr 6,9 · 10&sup4; Pa (10psi) verbessert die Wirksamkeit und verringert die Länge an Zeit, die erforderlich ist, um das Silan mit der Innenwand der Kapillarsäule in Kontakt zu bringen. Wie dies in der Technik bekannt ist, reagiert die Silan-Funktionalität sehr gut mit den SiOH-Komponenten, um Si-O-Si-Bindungen zu bilden. Sobald die Silanverbindung an der Innenwand des Kapillarrohres sicher festgelegt ist, wird eine hydrophile monomerische Verbindung in Kontakt mit der kovalent gebundenen Silanverbindung gebracht. Wie dies bereits erwähnt wurde, ist die hydrophile monomere Verbindung durch ihre hydrophile Eigenschaft und ihre Fähigkeit gekennzeichnet, mit einer hydrophoben Funktionalität auf der kovalent gebundenen Silan-Verbindung zu reagieren. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist das hydrophile Monomer Acrylamid, das ohne weiteres mit den Vinyl-Funktionalitäten von Polybutadien homopolymerisiert und kopolimerisiert. Der Fachmann ist ohne weiteres in der Lage, übliche Polymerisationschemie-Techniken anzuwenden, die in der Technik zur Polymerisierung von Acrylamid unter Bedingungen bekannt sind, bei denen das Acrylamid mit den Vinyl-Funktionalitäten reagiert, die auf dem Polybutadien verfügbar sind.
Bei den besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird das während des Polymerisationsschrittes gebildete Polyacrylamid weiter vernetzt, um die physikalische Integrität des Beschichtungsmaterials zu verstärken. Übliche Vernetzungsverfahrensweisen können verwendet werden, unter Einschluß der Verwendung von Divinyl-Monomeren, wie z. B. N,N'- Methylen-bis-Acrylamid, während des Polymerisierungsschrittes. Ein alternatives Vernetzungsverfahren umfaßt die Verwendung von Formaldehyd bei dem nach der Polymerisation erfolgenden Vernetzungsschritt. Die beiden Aldehyd-Protonen von Formaldehyd stehen zur Reaktion mit den Acrylamid-Protonen zur. Verfügung, und wenn die zur Reaktion gebrachten Acrylamid-Protonen auf verschiedenen Polyacrylamid-Strängen liegen, werden sie vernetzt. Der Fachmann sollte mit der Anwendung von Techniken zur Vernetzung von Acrylamid vertraut sein. Zusätzlich werden Beispiele von Bedingungen für die Vernetzung weiter unten in Form von Arbeitsbeispielen angegeben.
Nach der Homopolymerisation des hydrophilen Monomeren und der Koreaktion des hydrophilen Monomeren mit der hydrophoben Poly mer-Funktionalität wird überschüssiges Polyacrylamid aus dem Inneren der Kapillarsäule unter Verwendung einer Wasserwaschung unter Druck entfernt. Die beschichtete Säule ist dann zur Verwendung in einer Vielzahl von elektrophoretischen Trennungen geeignet.
Die beschichteten Kapillarsäulen der vorliegenden Erfindung werden sehr leicht gebildet und sind zur Verwendung in einem beliebigen Kapillarelektrophoresesystem anpaßbar. Weiterhin erfordert ihre Verwendung keine speziellen Handhabungsverfahren, und typische Elektrophoresetechniken gelten für ihre Anwendung. Entsprechend können die Säulen gemäß der Erfindung nach der Anordnung in üblichen Kapillarelektrophorese-Geräten bei Verfahren zur Analyse von Probenzusammensetzungen auf Probenbestandteile durch Kapillarelektrophorese verwendet werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung schließen diese Verfahren typischerweise die Schritte des Eintauchens eines Endes der beschichteten Kapillarsäule in einen anodischen Voratsbehälter und das Eintauchen eines zweiten Endes der beschichteten Säule in einen kathodischen Voratsbehälter ein. Dann führt die Einführung einer Probenzusammensetzung in das Innere der beschichteten Säule an einem Ende und das Anlegen eines elektrischen Feldes längs der Voratsbehälter zu einer unterschiedlichen Wanderung der Probenbestandteile innerhalb der Kapillarsäule. Wenn ein geeigneter Detektor, beispielsweise ein Detektor für den sichtbaren UV-Bereich oder ein Fluoreszenzdetektor in geeigneter Weise an zumindest einem Ende der beschichteten Säule angeordnet wird, werden die getrennten Probenbestandteile erfaßt und es wird ein Elektroferrogramm erzeugt.
Nachdem die Erfindung nunmehr allgemein beschrieben wurde, wird sie unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele noch leichter verständlich, die zu Erläuterungszwecken angegeben werden und nicht dazu bestimmt sind, die vorliegende Erfindung zu beschränken, sofern dies nicht angegeben ist.

BEISPIEL 1

Das folgende erläutert beispielhafte erste Schritte zur Zubereitung einer beschichteten Kapillarsäule der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in Elektrophorese-Verfahren. Diese ersten Schritte umfassen die Vorbereitung der Innenoberfläche einer Kapillarsäule und die kovalente Bindung modifizierter hydrophober Polybutadien-Funktionalitäten an die vorbereitete Innenoberfläche.
Eine aus geschmolzenem Silika bestehende Kapillarsäule mit einer Länge von 65 cm und einem Durchmesser von 50 um (erhältlich von Polymicron, Phoenix, AZ, USA) wurde für die anfängliche Reaktion durch Spülen der Innenoberflächenwände mit einer Lösung von 1N HCl für 15 Minuten vorbereitet. Der Spülvorgang wurde durch Pumpen der HCl-Lösung durch das Kapillarrohr erzielt. Als nächstes wurde die HCl-Lösung von dem Kapillarrohr entfernt, und die Innenoberfläche wurde in der gleichen Weise mit 1N NaOH über 15 Minuten gespült. Schließlich wurde nach der Entfernung der NaOH-Lösung das Innere der Kapillare mit Methanol über 15 Minuten hinweg gespült.
Nach der Entfernung der restlichen Methanollösung aus dem Kapillarrohr wurde das vorbereitete Rohr mit einer 50%-tigen Toluol-Lösung eines mit Triethoxysilyl modifizierten Polybutadiens (50% Polybutadienyl-Triethoxysilan in Toluol, das von der Firma HulsAmerica, Inc., Piscataway, New Jersey gekauft wurde), gespült. Das Polybutadienyl-Triethoxysilan ist eine Polymerverbindung mit mehrfachen reaktiven Triethoxy-Silan- Funktionalitäten, die an polymeres Polybutadien gebunden sind. Wie dies in der Technik bekannt ist, weist die Polybutadien- Funktionalität hängende Vinylgruppen auf, die unter Vinylpolymerisationsbedingungen reaktiv sind. Die Polybutadienyl- Triethoxy-Silan-Lösung hatte eine Viskosität von 25-50 Zentistoke, was eine Anzeige ihres Molekulargewichtes ist.
Der Spülschritt wurde über 30 Minuten ausgeführt, worauf die beiden offenen Endes des Kapillarrohres mit Silikonstopfen verschlossen wurden und das verschlossene Rohr wurde für 24 Stunden stehengelassen.

BEISPIEL 2

Das folgende Beispiel erläutert die abschließenden Schritte bei der Zubereitung der beschichteten Kapillarsäule der vorliegenden Erfindung. Allgemein beinhaltet die Zubereitung dieser beschichteten Kapillarsäule die Verwendung der Säule mit an deren Innenwand gebundenem Polybutadien, wie dies in Beispiel 1 beschrieben wurde, und die Synthetisierung linearen Polyacrylamids bei Vorhandensein des gebundenen Polybutadiens. Das Ergebnis besteht in einer Schicht eines hydrophilen linearen Polyacrylamids, das die gebundene hydrophobe Polybutadien- Beschichtung umgibt.
Die Kapillarsäule mit gebundenem Polybutadien, die im Beispiel 1 beschrieben wurde, wurde zubereitet. Dann wurde nach der 24- stündigen Alterungsperiode die Polybutadien-gebundene Kapillarsäule über 30 Minuten mit Toluol gespült. Nach 30 Minuten wurde das restliche Toluol entfernt, und die Kapillarsäule wurde über Minuten mit Methanol gespült. Als nächstes wurde eine 5%-ige wässrige Lösung von Acrylamid, das von ICN Biomedical Inc., Irvine, CA, USA erhältlich ist, zubereitet. Die Lösung wurde über 30 Minuten unter einem Vakuum von 100 mbar entgast, um den Gehalt an gelöstem Sauerstoff zu verringern. Gleichzeitig mit der Entgasung der 5 gewichtsprozentigen Acrylamid-Lösung wurde ein getrenntes 100 Ml-Volumen an Wasser durch blasenförmiges Hindurchleiten von Helium durch das Wasser desoxidiert, um den Sauerstoffgehalt unter 10% des ursprünglichen Sauerstoffgehaltes zu verringern. Drei Minuten vor der Entfernung der 5 gewichtsprozentigen wässrigen Acrylamid-Lösung aus dem Vakuum wurde das desoxidierte Wasser zur Zubereitung einer Lösung von 10 Gewichtsprozenten N,N,N',N'-Tetramethylendiamin (TEMED), das von der Firma ICN Biochemicals, Irvine, CA, USA beschafft wurde, und einer Lösung von 10 Gewichtsprozenten Ammoniumpersulfat (APS) verwendet, das von ICN Biochemicals beschafft wurde.
Dann wurden unmittelbar 10 uL der 10 gewichtsprozentigen TEMED- Lösung und 10 uL der 10 gewichtsprozentigen APS-Lösung zu 2 M1 der entgasten Acrylamid-Lössung hinzugefügt, um eine Polymerisationsmischung zu bilden. Diese Polymerisationsmischung wurde in das Polybutadien-gebundene Kapillarrohr unter Verwendung eines Heliumdruckes von 6,9 · 10&sup4; Pa (10 psi) gedrückt. Nach einer dreiminütigen Reaktionsperiode wurde der Heliumdruck von 6,9 · 10&sup4; Pa (10 psi) aufgehoben, und zwei Minuten später wurden die beiden Enden der Kapillarsäule mit Kappen versehen, und das Rohr wurde über 24 Stunden hinweg stehengelassen. Als nächstes wurden die Endkappen entfernt und restliches Polyacrylamid, das nicht zur Reaktion mit dem Polybutadien gelangte, und restliches Acrylamid wurden aus dem Inneren der Kapillarsäule unter Verwendung von Wasser bei einem Druck von 6,9 · 10&sup5; Pa (100 psi) herausgedrückt. Das Ergebnis bestand in einer dünnen Schicht aus linearem Polyacrylamid, das mit Vinyl-Restgruppen auf dem gebundenen Polybutadien koreagiert hatte. Die beschichtete Kapillarsäule, die entsprechend dem vorstehenden Verfahren zubereitet wurde, war zur Verwendung in Kapillarelektrophorese- Trennungen bereit.

BEISPIEL 3

Das folgende Beispiel erläutert ein Verfahren zur Zubereitung einer alternativen beschichteten Kapillarsäule der vorliegenden Erfindung. Die nachfolgend beschriebene beschichtete Kapillarsäule unterscheidet sich von der im Beispiel 2 beschriebenen beschichteten Säule dadurch, daß der hydrophile Teil der Beschichtung ein vernetztes Polyacrylamid ist. Das vernetzte Polyacrylamind ergibt die Beschichtung mit vergrößerter physikalischer Integrität und eine resultierende längere und stärker brauchbare Lebensdauer.
Zur Zubereitung dieser alternativen Beschichtung wurde die Polybutadien-gebundene Kapillarsäule, die im Beispiel 1 beschrieben wurde, zubereitet. Nach der 24-stündigen Alterungszeit wurde das Polybutadien-gebundene Kapillarrohr für 30 Minuten mit Toluol gespült. Nach 30 Minuten wurde das restliche Toluol entfernt, und das Kapillarrohr wurde für 15 Minuten mit Methanol gespült. Dann wurde eine 5 gewichtsprozentrige wässrige Acrylamid-Lösung zubereitet und entgast, wie dies im Beispiel 2 beschrieben wurde. Ausreichend N,N'-Methylen-bis-Acrylamid wurde zu der entgasten 5 gewichtsprozentigen Acrylamid-Lösung hinzugefügt, um aus der Lösung ein 1 gewichtsprozentiges N,N'- Methylen-bis-Acrylamid zu machen. Dann wurde eine 10 gewichtsprozentige wässrige TEMED- und 10 gewichtsprozentige wässrige APS-Lösung zubereitet, wie dies im Beispiel 2 beschrieben ist. Eine Polymerisationslösung wurde durch Hinzufügen von 10 uL der TEMED-Lösung und 10 uL der APS-Lösung zu 2 mL der Acrylamid- und N,N'-Methylen-bis-Acrylamid-Lösung zubereitet. Diese Polymerisationslösung wurde mit einer Kapillarsäule in Kontakt gebracht, die so zubereitet wurde, wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist, indem die Lösung unter 6,9 · 10&sup4; Pa (10 psi) Helium für zwei Minuten hindurchgedrückt wurde, gefolgt von einer Verringerung des Heliumdruckes auf 0 Pa (0 psi). Man ließ vier Minuten verstreichen, und die Polymerisationslösung wurde ein zweites Mal unter den gleichen Bedingungen und über die gleiche Zeitdauer hindurchgedrückt. Dieses Verfahren wurde noch zusätzlich viermal wiederholt, und die Kapillare wurde mit doppelt destilliertem und ionisiertem Wasser nachfolgend zu dem folgenden Zyklus gespült. Die resultierende Kapillarsäule enthielt eine Beschichtung, die eine Schicht aus Polybutadien, die kovalent an die Innenoberfläche der Kapillare über eine Si-O-Si-Bindung gebunden ist, und ein Netzwerk von vernetztem Polyacrylamid einschloß, das zusätzlich mit den Vinyl-Restgruppen des Polybutadiens reagierte. Die resultierende Beschichtung war sicher an der Innenwand des Kapillarrohres angebracht und zusätzlich mit einer verbesserten physikalischen Integrität durch das vernetzte Netzwerk versehen.

BEISPIEL 4

Das folgende Beispiel erläutert ein Verfahren zur Zubereitung einer zweiten alternativen beschichteten Kapillarsäule der vorliegenden Erfindung. Die nachfolgend beschriebene beschichtete Säule unterscheidet sich von der beschichteten Säule wie sie in Beispiel 2 beschrieben ist, dadurch, daß der hydrophile Teil der Beschichtung ein vernetztes Polyacrylamid ist. Die beschichtete Säule unterscheidet sich von der im Beispiel 3 beschriebenen Säule dadurch, daß das vernetzte Polyacrylamid unter Verwendung anderer Vernetzungsmittel und Verfahren gebildet wurde. Das vernetzte Polyacrylamid ergibt für die Beschichtung eine vergrößerte physikalische Integrität und eine sich daraus ergebende längere und brauchbarere Lebensdauer.
Um diese alternative Beschichtung zuzubereiten, wurde die in Beispiel 1 beschriebene Polybutadien-gebundene Kapillarsäule zubereitet. Nach der 24-stündigen Alterungsperiode wurde das Polybutadien-gebundene Kapillarrohr über 30 Minuten mit Toluol gespült. Nach 30 Minuten wurde das restliche Toluol entfernt, und das Kapillarrohr wurde über 15 Minuten mit Methanol gespült. Danach wurde eine 5 gewichtsprozentige wässrige Acrylamidlösung zubereitet und entgast, wie dies im Beispiel 2 beschrieben wurde. Die Lösungen von TEMED und APS und die Polymerisationslösung wurden so zubereitet, wie dies im Beispiel 2 beschrieben wurde. Nach der Zubereitung dieser Lösung wurde die Polymerisationslösung in eine Kapillarsäule, die in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise zubereitet wurde, unter den gleichen Bedingungen gedrückt, wie dies im Beispiel 2 beschrieben wurde. Nachdem das Acrylamid polymerisiert war, um ein lineares Polymer zu bilden und nachdem das restliche Polyacrylamid, das nicht mit dem Polybutadien reagierte, und überschüssiges Acrylamid aus der Säule entfernt wurde, wurde die beschichtete Säule mit einer 37%-tigen Formaldehylösung mit 2% 1N NaOH gefüllt. Die Formaldehyd-Lösung wurde in der Säule über 24 Stunden stehengelassen, worauf die Kapillarsäule mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen wurde. Die resultierende beschichtete Säule war für elektrophoretische Trennungen einer Anzahl von unterschiedlichen Arten von Verbindungen geeignet.

BEISPIEL 5

Das folgende Beispiel veranschaulicht beispielhafte Anwendungen für die beschichteten Kapillarsäulen der vorliegenden Erfindung. Die beschichteten Säulen der vorliegenden Erfindung sind, wie nachstehend beschrieben, insbesondere bei der Trennung von kleinen geladenen Teilchen wie beispielsweise von Nukleinsäuren brauchbar.
Eine beschichtete 30/37 cm- (37 cm gesamt und 30 cm zum UV-Fenster) Kapillare, die wie vorstehend in Beispiel 2 beschrieben zubereitet wurde, wurde in einem P/ACE-Kapillarelektrophoresegerät (hergestellt von Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA) angeordnet. Die Säule wurde mit einem Puffer befüllt, der 3% Acrylamid in 50 mM Tris-HCl und 2 mM EDTA einschloß. Eine Probe einer HaeIII digerierten φX174 DNA-Lösung (200 ug/ml DNA), die einen inneren Orange-G-Standard enthielt, wurde unter Verwendung einer 10 s dauernden 3,4 · 10³ Pa (0,5 psi) Druckinjektion in ein Ende der Säule injiziert und 200 V/cm oder 7,4 kV wurden bei einer Temperatur von 20ºC über die Elektrophorese-Vorratsbehälter angelegt. Die getrennten basischen DNA-Fragmente wurden mit einem UV-Detektor bei 254 nm nachgewiesen. Fig. 3 stellt ein Elektropherogramm dar, das nach weniger als 20 Minuten Wanderung erhalten wurde. Jedes der DNA-Fragmente wurde von den anderen DNA-Fragmenten durch eine Grundlinien- Trennung getrennt, wobei die Wanderungsreihenfolge die folgende war: erster Peak oder Gipfel: innerer Orange-G-Standard; zweiter Peak: DNA-Fragment mit 72 Basenpaaren; dritter Peak: 188 Basenpaare; 194 Basenpaare; fünfter Peak: 234 Basenpaare; sechster Peak: 271 Basenpaare; siebter Peak: 281 Basenpaare; achter Peak: 310 Basenpaare; neunter Peak: 603 Basenpaare, zehnter Peak: 872 Basenpaare; elfter Peak: 1078 Basenpaare; zwölfter Peak: 1353 Basenpaare.

BEISPIEL 6

Das folgende Beispiel veranschaulicht eine beispielhafte Anwendung für die beschichteten Kapillarsäulen der vorliegenden Erfindung. Die beschichteten Säulen der vorliegenden Erfindung sind, wie nachstehend beschrieben und in Fig. 4 dargestellt, insbesondere bei der Trennung von Proteinen brauchbar. Eine wässrige Lösung wurde zubereitet, die jeweils 1 mg/ml eines inneren Standards (Histamin), Lysozym, Cytochrom C und Ribonuklease A enthielt, und eine beschichtete, 20/27 cm Kapillarsäule, die gemäß den vorstehend in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, wurde in einem P/ACE- Kapillarelektrophoresegerät (hergestellt von Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA) angeordnet. Die Säule wurde mit einem 20 mM MES- (Puffer erworben von Sigma Chemical, St.Louis, M0) und 20 mM Citrat-Puffer, eingestellt auf einen pH von 6,0, befüllt. Eine Probe der wässrigen Proteinlösung wurde unter Verwendung einer 2 s andauernden 3,4 · 10³ Pa (0,5 psi) Druckinjektion in ein Ende der Säule injiziert und 500 V/cm wurden bei einer Temperatur von 25ºC über die Elektrophorese- Vorratsbehälter angelegt. Die aufgetrennten Proteine wurden mit einem UV-Detektor bei 214 nm nachgewiesen. Fig. 4 zeigt das Elektropherogramm, das nach weniger als 12 Minuten Wanderung erhalten wurde. Jedes der Proteine wurde von den anderen Proteinen durch eine Grundlinien-Trennung getrennt, wobei die Wanderungsreihenfolge auf dem Elektropherogramm von links nach rechts der innere Standard (Histidin), Lysozym, Cytochrom C und Ribonuklease A war.

BEISPIEL 6

Um die Mehrbenutzungs- und Langzeitbenutzungs-Stabilität und -Reproduzierbarkeit von Assays unter Verwendung der beschichteten Säule der vorliegenden Erfindung zu demonstrieren, wurde der in Beispiel 5 durchgeführte Protein-Assay 210 mal wiederholt. Für jeden der wiederholten Assays wurde die elektrophoretische Wanderungszeit für jedes Protein festgestellt. Die Ergebnisse dieses Reproduzierbarkeitstest sind in Fig. 5 veranschaulicht. Die Reproduzierbarkeit der Wanderungszeit des inneren Standards (Histamin) ist in Bahn 1 dargestellt (Wanderungszeit 1,99 Minuten). Die Reproduzierbarkeit der Lysozym-Wanderungszeit ist in Bahn 2 dargestellt (Wanderungszeit 4,6 Minuten). Die Reproduzierbarkeit der Cytochrom C-Wanderungszeit ist in Bahn 3 dargestellt (Wanderungszeit 5,77 Minuten). Zuletzt ist die Reproduzierbarkeit der Ribonuklease-Wanderungszeit in Bahn 4 dargestellt (Wanderungszeit 9,73 Minuten).
Die relativen Standardabweichungen für den wiederholten Histamin-Assay, Lysozym-Assay, Cytochrom-C-Assay und Ribonuklease-Assay ist jeweils 0,74%, 1,08%, 1,12% und 1,63%. Diese Daten demonstrieren deutlich die außergewöhnliche physikalische Stabilität und die Langzeitbenutzungs-Eigenschaften einer beispielhaften Säule der vorliegenden Erfindung.

BEISPIEL 7

Das folgende Beispiel veranschaulicht eine weitere Anwendung einer beispielhaften Säule der vorliegenden Erfindung. Insbesondere wurde eine Säule verwendet, die gemäß dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, um die Proteine im Hühnereiweiß aufzutrennen. Die Assay-Bedingungen und die Probenkonzentration waren dieselben, wie sie in Beispiel 5 beschrieben sind. Die Ergebnisse des Assays sind in Fig. 6 dargestellt. Der Peak bei Wanderungszeit 5,46 wurde als Lysozym, der Peak bei 5,89 als Conalbumin und der Peak bei 7,18 als Ovalbumin identifiziert.
Während die Erfindung in Verbindung mit deren speziellen Ausführungsformen beschrieben wurde, ist klar, daß sie weitere Modifikationen zuläßt und daß beabsichtigt ist, daß diese Anmeldung irgendwelche Veränderungen, Verwendungen oder Anpassungen der Erfindung abdeckt, die im allgemeinen den Grundsätzen der Erfindung folgen und die derartige Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung einschließen, wie sie unter die bekannte oder übliche Praxis in der Technik fallen, auf die sich die Erfindung bezieht, und wie sie auf die wesentlichen Merkmale, die hierin vorstehend dargelegt sind, angewendet werden können und wie im Umfang der beigefügten Ansprüche folgt.

Claims

1. Kapillarsäule (20,30) für elektrophoretische Trennungen von Probenbestandteilen, wobei die Kapillarsäule folgendes umfaßt:

einen Längenabschnitt eines Rohres (12; 34) mit einer Innenoberfläche (14; 38), wobei die Innenoberfläche eine polymerische Verbundbeschichtung aufweist, wobei die polymerische Verbundbeschichtung eine hydrophobe polymerische Funktionalität (16; 36), die kovalent an die Innenoberfläche gebunden ist, und ein hydrophiles Polymer (18; 40) umfaßt, das mit der hydrophoben polymerischen Funktionalität kopolimerisiert ist.

2. Kapillarsäule nach Anspruch 1, bei der das Rohr (34) aus Silika hergestellt ist und die hydrophobe polymerische Funktionalität kovalent an die Innenoberfläche durch eine Si-O-Si- Bindung (32) gebunden ist.

3. Kapillarsäule nach Anspruch 1, bei der die hydrophobe polymerische Funktionalität Polybutadien ist.

4. Kapillarsäule nach Anspruch 1, bei der das hydrophile Polymer Polyacrylamid ist.

5. Kapillarsäule nach Anspruch 4, bei der das Polyacrylamid vernetzt ist.

6. Kapillarsäule nach Anspruch 1, bei der die polymerische Verbundbeschichtung eine Polybutadien-Funktionalität, die kovalent an die Innenoberfläche gebunden ist, und Polyacrylamid ist, das mit der Polybutadien-Funktionalität kopolimerisiert ist.

7. Kapillarsäule nach Anspruch 6, bei der das Kapillarrohr aus Silika gebildet ist und die Polybutadien-Funktionalität kovalent über eine Si-O-Si-Bindung an die Innenoberfläche gebunden ist.

8. Kapillarsäule nach Anspruch 7, bei der die Polybutadien- Funktionalität kovalent an die Innenoberfläche durch Reagieren von Polybutadienyl-Triethoxy-Silan mit Si-OH des Silika gebunden ist.

9. Kapillarsäule nach Anspruch 6, bei der das Polyacrylamid vernetzt ist.

10. Verfahren zur Zubereitung einer Kapillarsäule, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

Schaffung eines Längenabschnittes aus Silikarohr, das eine Innenoberfläche und Si-OH-Funktionalitäten auf der Innenoberfläche aufweist,

Bewirken einer Reaktion einer Si-OH-Reaktionsverbindung mit den Si-OH-Funktionalitäten, wobei die Si-OH-Reaktionsverbindung eine hydrophobe polymerische Funktionalität aufweist, und

Bewirken einer Polymerisation des hydrophilen Monomers in Kontakt mit der hydrophoben polymerischen Funktionalität, wodurch ein polymeres Verbundnetzwerk von hydrophilen und hydrophoben Polymeren geschaffen wird:

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die Si-OH-Reaktionsverbindung Polybutadienenyl-Triethoxy-Silan ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das hydrophile Monomer Acrylamid ist.

13. Verfahren nach Anspruch 10, das weiterhin den Schritt der Vernetzung des hydrophilen Polymeren einschließt.

14. Verfahren nach Anspruch 12, das weiterhin den Schritt der Polymerisierung des Acrylamids bei Vorliegen von N,N'-Methylen- bis-Acrylamid einschließt, wodurch vernetztes Polyacrylamid gebildet wird.

15. Verfahren nach Anspruch 12, das weiterhin den Schritt des Inkontaktbringes des polymerisierten Acrylamids mit Formaldehyd einschließt, wodurch vernetztes Polyacrylamid gebildet wird.

16. Verfahren zum Analysieren einer Probenzusammensetzung auf Probenbestandteile durch Kapillarelektrophorese, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

Bereitstellung einer Kapillarelektrophoresesäule, die einen Längenabschnitt eines Rohres mit einem ersten Ende, einem zweiten Ende und einer Innenoberfläche aufweist, wobei die Innenoberfläche eine polymerische Verbundbeschichtung aufweist und die polymerische Verbundbeschichtung eine hydrophobe polymerische Funktionalität, die kovalent an die Innenoberfläche gebunden ist, und ein hydrophiles Polymer umfaßt, das mit der hydrophoben polymerischen Funktionalität kopolimerisiert ist,

Eintauchen des ersten Endes in einen anodischen Voratsbehälter und Eintauchen des zweiten Endes in einem kathodischen Voratsbehälter,

Einleiten der Probenzusammensetzung in den Längenabschnitt des Kapillarrohres an dem ersten Ende oder an dem zweiten Ende, und

Anlegen eines elektrischen Feldes längs der Voratsbehälter, wobei das elektrische Feld in der Lage ist, eine Wanderung der Probenbestandteile unter unterschiedlichen Raten bezüglich jedes Probenbestandteils innerhalb der Kapillarsäule zu bewirken.

17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Probenbestandteile aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus basischen und sauren Verbindungen besteht.

18. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem das Rohr aus Silika hergestellt ist und die hydrophobe polymerische Funktionalität kovalent durch eine Si-O-Si-Bindung an die Innenoberfläche gebunden ist.

19. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die hydrophobe polymerische Funktionalität Polybutadien ist.

20. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem das hydrophile Polymer Polyacrylamid ist.