DE69106562T2

DE69106562T2 - Oberfläche mit verringerter Proteinwechselwirkung.

Info

Publication number: DE69106562T2
Application number: DE69106562T
Authority: DE
Inventors: Sally A Swedberg
Original assignee: Hewlett Packard Co
Current assignee: HP Inc
Priority date: 1990-04-11
Filing date: 1991-04-08
Publication date: 1995-05-11
Anticipated expiration: 2011-04-09
Also published as: DE69106562D1; EP0452055B1; US5114768A; EP0452055A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf feste Oberflächen, die Proteinlösungsprodukten ausgesetzt sind, und insbesondere auf Kapillare, die bei elektrophoretischen Trennungen durch Kapillarzonenelektrophorese verwendet werden. Dies ist eine Continuation-In-Part der anhängigen U.S.-Anmeldung S.N. 234,456, eingereicht am 19. August 1988 und der anhängigen Anmeldung PCT PA PC US 88 01877, eingereicht am 2. Juni 1988, die beide von dieser Anmelderin stammen.

Hintergrund der Erfindung

Die Elektrophorese ist eine gut bekannte Technik zur Trennung geladener Spezies durch Ausnutzung ihrer Unterschiede betreffs der Geschwindigkeit der Ausbreitung unter dem Einfluß eines elektrischen Feldes. Der Prototyp aller moderner elektrophoretischer Verfahren ist die freie, oder bewegliche Grenz-, Elektrophorese. Die Beweglichkeit u in Quadratzentimetern pro Volt-Sekunde eines Moleküls in einem elektrischen Feld ist durch das Verhältnis der Geschwindigkeit der Ausbreitung v, in Zentimetern pro Sekunde, zu der elektrischen Feldstärke E, in Volt pro Zentimeter, gegeben: u=v/E. Für kleine Ionen, wie z.B. Chlorid, liegt u zwischen 4 und 9 x 10&supmin;&sup4; cm²v&supmin;¹s&supmin;¹ (25ºC); für Proteine, liegt sie bei etwa 0,1 bis 1,0 x 10-X cm²v&supmin;¹s&supmin;¹. Ein Protein breitet sich folglich in einem elektrischen Feld viel langsamer aus als kleine Ionen, da diese einfach ein viel kleineres Verhältnis von Ladung zu Masse haben.
Die freie Elektrophorese wurde weitgehend durch verschiedene Formen von Zonenelektrophorese ersetzt, bei der die wasserhaltige Proteinlösung in einer Festkörpermatrix festgesetzt ist, die eine mechanische Starre liefert und Konvektions- und Vibrations-Störungen reduziert. Ein Matrixmaterial, das porös ist, ermöglicht ferner ein Durchsieben. Diese Form von Zonenelektrophorese kann ein Proteingemisch sowohl auf der Grundlage der elektrischen Ladung als auch der molekularen Größe trennen, wodurch eine hohe Auflösung geschaffen wird.
Die Kapillarzonenelektrophorese ("CZE"; CZE = Capillary Zone Electrophoresis) in Kapillaren kleinen Durchmessers wurde zuerst von Jorgenson und Lukacs gezeigt und wurde nutzbringend als ein effizientes Verfahren für die Trennung von bestimmten kleinen Lösungsprodukten geprüft. J. Chromatog, 218 (1981), Seite 209; Anal. Chem., 53 (1981) Seite 1298. Vorteilhafte Faktoren für die CZE umfassen die kleinen Probengrößen, eine geringe oder keine Probenvorbehandlung, eine hohe Auflösung, die Automatisierung und die Möglichkeit zur Quantifizierung und Rückgewinnung von biologisch aktiven Proben. Z.B. beschreibt das U.S.-Patent 4,675,300, Erfinder Zare und andere, erteilt am 23. Juni 1987, Theorien und Ausrüstung für elektrokinetische Trennungsverfahren, die einen mit einem Laser angeregten Fluoreszenzdetektor verwenden. Das System, das von Zare u.a. beschrieben wird, umfaßt eine Quarzglaskapillare mit einem inneren Durchmesser von 75 um.
Unglücklicherweise tritt einer der einzelnen größten Nachteile der Kapillarzonenelektrophorese dann auf, wenn Versuche unternommen werden, Makromoleküle, wie z.B. Proteine, zu trennen. Trennungen von Makromolekülen durch die CZE führt zu ungünstigen Wechselwirkungen der Biopolymere mit der Silikakapillarwand.
Jorgenson und Lukacs bemerkten, daß die Trennung von Musterproteinen, wie z.B. Cytochrom, Lysozym und Ribonuklein A, in ungezogenen Quarzglaskapillaren mit einem Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7 von einem starken Nacheffekt begleitet wurde, und schlugen vor, dies könnte durch Coulomb-Wechselwirkungen der positiv geladenen Proteine und der negativ geladenen Kapillarwand verursacht werden. Jorgenson u.a, Science, 222 (1983) Seiten 266 - 272. Die Autoren berichten von der Untersuchung von Teflon-Kapillaren, fanden jedoch heraus, daß diese ebenfalls gegenüber Proteinen eine signifikante Adsorptivität zeigen. Sie versuchten, die Oberfläche des Quarzglases mit Gruppen, wie z.B. Trimethyl, Silan, Oktadecylsilan, Aminopropylsilan und vernetzter Methylzellulose, zu deaktivieren, was offensichtlich nicht erfolgreich war. Darauf wandten sie sich den bindenden Glykol-enthaltenden Gruppen auf der Oberfläche zu.
Lauer und McManigill, Analytical Chemistry, 58 (1986) Seite 166, berichteten, daß die Coulomb-Abstoßung zwischen Proteinen und der Kapillarwand der Silikakapillare die Adsorptions-Tendenzen der Proteine mit der Kapillarwand überwinden kann. Sie zeigten Trennungen von Musterproteinen (in einem molekularen Gewichtsbereich von 13.000 bis 77.000) durch Verändern des pH-Werts der Lösung relativ zum isoelektrischen Punkt (pI) der Proteine, um deren Nettoladung zu ändern. Die Nachteile dieses Lösungsansatzes bestehen jedoch darin, daß Silika beginnt, sich über einem pH-Wert von 7 aufzulösen, was die Säulenlebensdauer verkürzt und das Verhalten verschlechtert, wobei nur Proteine mit pI's kleiner als dem pH-Wert des Puffers analysiert werden können, was den Bereich der brauchbaren Analyse drastisch reduziert, und wobei aufgrund der Komplexität der Proteinzusammensetzung und -struktur ferner noch Nicht-Coulomb-Wechselwirkungen auftreten können, selbst mit Proteinen, die eine negative Nettoladung tragen.
Ein weiterer Lösungsansatz für das Problem von Biopolymer-, oder Protein-, Wechselwirkungen bestand darin, die Ionenstärke zu erhöhen. Es wurde gezeigt, daß dieses Konzept im Prinzip arbeitet, jedoch eine Erwärmung ebenfalls erhöht wird, wenn die Ionenstärke erhöht wird. Diese Erwärmung tendiert dazu, die Effizienz der Trennung zu verschlechtern.
Noch ein weiterer Lösungsansatz für das Problem der unerwünschten Proteinwechselwirkungen mit der Kapillarwand bestand darin, die Elektrophorese-Röhre mit einer monomolekularen Schicht eines nicht vernetzten Polymers zu beschichten. Dementsprechend beschreibt das U.S.-Patent 4,680,201, Erfinder Hjerten, erteilt am 14. Juli 1987, ein Verfahren zum Vorbereiten einer dünnwandigen Kapillarröhre mit kleinem Durchmesser für elektrophoretische Trennungen durch die Verwendung einer Bifunktionsverbindung, in der eine Gruppe speziell mit der Glaswand reagiert und die andere mit einem Monomer, das an einem Polymerisationsprozeß teilnimmt. Dieses Frei-Radikal-Verfahren hat eine Polymer-Beschichtung zur Folge, wie z.B. eine Polyacrylamid-Beschichtung, und wird zur Verwendung bei der Beschichtung anderer Polymere, wie z.B. Poly(vinylalkohol) und Poly(vinylpyrrolidon), vorgeschlagen. Jedoch tendieren dieses Verfahren und die Kapillarröhrenbehandlung dazu, den elektroosinotischen Fluß zu zerstören, während die Effizienz noch ziemlich niedrig ist. Diese ziemlich niedrige Effizienz läßt vermuten, daß die unerwünschten Protein-Wand-Wechselwirkungen noch auftreten.
Das U.S.-Patent 4,690,749, erteilt am 1. September 1987, Van Alstine und andere, offenbart die Aktivierung einer Glasoberfläche mit Aminosilan, um die reaktiven Oberflächengruppen von Silanolen zu Aminen zu ändern. Van Alstine und andere lehren die Verwendung von neutralen Polymeren, wie z.B. Polyäthylenglykol oder Dextranpolymer, um mit der elektrophoretischen oberfläche konvalent gebunden zu sein Die Daten, die von Van Alstine u.a. geliefert werden, zeigen, daß deren Behandlung den elektroosmotischen Fluß reduziert, was mit ihrer Ansicht in Einklang steht, daß der elektroosmotische Fluß nicht wünschenswert ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Kapillarröhren mit hoher Effizienz zu schaffen, die für elektrophoretische Trennungen von Lösungsprodukten, die Makromoleküle einschließen, brauchbar sind, wobei Wechselwirkungen zwischen den Lösungen und der Bohrungswandung beträchtlich reduziert sind.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Kapillarröhren zu schaffen, die eine Steuerung des elektroosmotischen Flusses ermöglichen, wie z.B. eine Steuerung des Flußbetrags und/oder der Flußrichtung.
Weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden für Fachleute bei der Durchsicht der Beschreibung und der beigefügten Ansprüche offensichtlicher, ebenso beim Realisieren der vorliegenden Erfindung.
Bei einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Herstellungsgegenstand geliefert, der Proteinlösungsprodukte ausgesetzt wird, wenn er verwendet wird. Besonders bevorzugte Gegenstände der Erfindung werden als Kapillarröhren gebildet und sind bei der Kapillarzonenelektrophorese nützlich, um Proteinlösungsprodukte zu trennen. Die Erfindungsgegenstände haben eine feste Oberfläche, die durch ein Polymer bestimmt ist oder ein solches trägt. Eine Zwischenschicht ist kovalent mit dem Polymer gebunden. Die Zwischen-Schicht ist wirksam, um Wechselwirkungen zwischen der Oberfläche und den Proteinlösungsprodukten zu reduzieren. Die Zwischenschicht umfaßt entweder eine hydratisierbare amphoterische Phase oder eine Mehrzahl von Halogenatomen, die durch mindestens ein Heteroatom gebunden sind.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele

Die vorliegende Erfindung liefert eine feste Oberfläche, die aus einem weiten Bereich von Materialien (über die Verwendung von ausschließlich Silika hinaus) gebildet ist, wobei diese Oberfläche modifiziert ist, um reduzierte Wechselwirkungen mit Proteinlösungsprodukten zu haben. Z.B. werden Implantationsstoffe, um Körperteile zu heilen oder zu ersetzen, Proteinlösungsprodukten und Physi-Sorb-Proteinen, ausgenommen modifizierte, ausgesetzt. Eine besonders bevorzugte Anwendung besteht in Kapillarröhren geringen Durchmessers, wie z.B. Röhren, die bei der Kapillarzonenelektrophorese brauchbar sind. Diese Röhren haben üblicherweise einen inneren Durchmesser, der kleiner als 500 um, noch typischerweise von etwa 20 um bis etwa 200 um, ist. Andere Anwendungen umfassen medizinische Verwendungen, wie z.B. Herz-Lungen-Maschinen, bei denen Oberflächen Proteinlösungsprodukten ausgesetzt sind. Der Bequemlichkeit halber handelt es sich nachfolgend um eine Kapillarröhre kleinen Durchmessers (weniger als etwa 500 um), wobei die Bohrungswandung gemäß der Erfindung modifiziert wurde.
Die Modifikation befindet sich bei der Verwendung als eine Zwischenschicht zwischen der innenseitigen Wand der Kapillare und den Proteinlösungsprodukten, wodurch sich eine Phase reduzierter Wechselwirkung entlang der Bohrungswandung, oder der innenseitigen Wand, erstreckt. Die Phase reduzierter Wechselwirkung ist wirksam, um Wechselwirkungen zwischen Proteinlösungsprodukten und der Bohrung zu reduzieren, vorzugsweise während ein vernünftig hoher elektroosmotischer Fluß ermöglicht wird und eine exzellente Effizienz die Folge ist. Diese Zwischenschicht ist vorzugsweise etwa 4 bis etwa 6 Molekularschichten dick, so daß der elektroosmotische Fluß bei der Verwendung für die Kapillarzonenelektrophorese vernünftig hoch ist. Jedoch sind weniger Molekularschichten (solange es zumindest eine ist) oder größere Molekularschichten möglich und können für bestimmte Anwendungen erwünscht sein. Wenn die Oberfläche Massemolekularschichten trägt, tendiert der elektroosmotische Fluß dazu, wesentlich abzunehmen, was normalerweise in einem System mit einem einzelnen Detektor mit Spezies, die sich zu zwei Elektroden hin ausbreiten, nicht erwünscht ist.
Gemäß meiner Anmeldung Serien-Nr. 234,456, eingereicht am 19. August 1988, hydriert man, wenn die Kapillarbohrung oder Innenwandoberfläche, die modifiziert werden soll, auf Silika basiert, diese zuerst und läßt sie dann mit einem Organo- oder Chloro-Silan mit zwei Funktionsendgruppen reagieren. Ich habe entdeckt, daß ein großer Bereich von Materialien, zusätzlich zu Silika, modifiziert werden kann, um reduzierte Wechselwirkungen mit Proteinlösungsprodukten aufzuweisen. Diese zusätzlichen Materialien sind im allgemeinen Polymere, die die Kapillarröhre selbst bilden können oder innerhalb einer Silika-Kapillarwand auf diese beschichtet oder mit dieser verbunden sein können. D.h., wenn die Polymere nicht selbst die Kapillarröhre bilden oder festlegen, werden sie von der inneren Wand der Röhre getragen, und die Zwischenschicht wird ferner auf das Polymer beschichtet.
Durch Erweitern des Bereichs von brauchbaren Kapillarmaterialien über Silika hinaus gewinnt man den Vorteil, bei größeren Bereichen als dem pH-Bereich von etwa 2 - 7, auf den man durch die Verwendung des Silika beschränkt ist, arbeiten zu können. D.h., durch die Polymermodifikationen, die nachfolgend detaillierter beschrieben werden, kann man in pH-Bereichen von etwa 2 - 10 arbeiten, und in vielen Fällen sogar bei viel höheren pH-Bereichen, wie z.B. in der Größenordnung von etwa 11 - 12.
Bei der Wahl eines geeigneten Polymers zur Verwendung bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung betrachtet man die folgenden Kriterien und sucht nach: einer hohen Widerstandsfähigkeit gegenüber elektrischen Feldern, einem Material, das nicht-porös ist und während der Trennungen bestimmte Manipulationen ermöglicht, einem Material, das elektrisch nicht-leitfähig ist, das in dem hochsalzigen, wasserhaltigen Medium, in dem die Trennungen durchgeführt werden, relativ stabil ist, wobei das Material vorzugsweise einen relativ großen Transmissionsbereich bei UV- und sichtbaren Wellenlängen für On-Column-Erfassungen (obwohl auch Post-Column- Erfassung möglich ist), liefert.
Unter den polymeren Materialien, die diese Kriterien erfüllen, sind Nylon, Styrole oder Vinylsilikone, Acryle, Polyuretane, Polycarbonate, Polyester, Silikon-Alkoxy-Elastomere und Fluorkohlenstoffe. Obwohl Silika eine sehr hochenergetische Oberfläche ist und die polymeren Materialien eine relativ niederenergetischere Oberfläche liefern können, müssen die polymeren Oberflächen noch modifiziert werden, um Protein-Wechselwirkungen entlang der Oberfläche zu reduzieren, Diese polymeren Oberflächen werden gemäß der Erfindung zu Zwischenstoffoberflächen modifiziert. Die Zwischenstoffoberflächen werden dann vorzugsweise weiter behandelt, um die Zwischenschicht, die nach einer der Mehrzahl von unterschiedlichen Möglichkeiten modifiziert ist, hinzuzufügen. Die Mehrzahl der unterschiedlichen Möglichkeiten stellt unterschiedliche Ausführungsbeispiele der Erfindung dar.
Die verwendeten Polymere müssen Mehrpunkt-Befestigungen mit den Anteilen liefern, die die bevorzugten Ausführungsbeispiele bei der weiteren Modifikation der Zwischenstoffoberflächen bilden werden. Zwei derartige Ausführungsbeispiele bestehen darin, daß eine hydratisierbare amphoterische Phase gebildet wird, oder daß konvalent gebundene Halogenanteile befestigt werden. Sowohl die amphoterische Phase als auch die Halogen-enthaltende Phase werden von den Zwischenstoffoberflächen abgeleitet. Die Zwischenstoffoberflächen sind polymere Oberflächen, die modifiziert wurden, um reaktive Stickstoff-Nukleophile, Sauerstoff-Nukleophile oder Kohlenstoff-Elektrophile einzuschließen. Veranschaulichende Modifikationen für eine Vielzahl von geeigneten anfänglichen polymeren Oberflächen werden nun beschrieben.
Die polymeren Oberflächen werden modifiziert, oder präpariert, um die Zwischenschichten durch Aktivierung bestimmter Funktionsgruppen aufzunehmen. Diese Funktionsgruppen sind typischerweise Sauerstoff- oder Stickstoff-Nukleophile und können auch ein Kohlenstoff-Elektrophil sein.
Die Mehrpunkt-Befestigungen der Polymere können durch verschiedene Funktionsgruppen erreicht werden. Veranschaulichende Funktionsgruppen umfassen Hydroxyl (als ein Sauerstoff-Nukleophil), Karboxyl (als ein Kohlenstoff-Elektrophil) und Amino (als ein Stickstoff-Nukleophil). Spezifische Beispiel von Polymeren mit diesen veranschaulichenden Funktionsgruppen sind Hydroxyl-Alkyl-Methacrylate (Hydroxy-Methyl-Methacrylat und Hydroxy-Äthyl-Methacrylat) und Hydroxy-Silikon-Gummis. Beispiele von Karboxyl-enthaltenden Polymeren sind Nylons und Ester, wie z.B. Methylmetacrylat. Beispiele von Polymeren mit Funktions-Amino-Gruppen sind Nylons und Styrole.
Wo es z.B. erwünscht ist, Styrol zu verwenden, werden die Mehrpunkt-Befestigungen, durch die die Zwischenschicht gebunden wird, normalerweise Amino-Gruppen sein. Eine brauchbare Technik zum Vorbereiten der Funktions-Amino-Gruppen besteht darin, die Styroloberfläche mit 47% Salpetersäure in Schwefelsäure für 20 Minuten bei 0ºC mit einer Flußgeschwindigkeit von 1 - 2 Säulen-Volumen pro Minute zu durchtränken. Die Kapillare wird mit Wasser bei 1 - 2 Säulen-Volumen pro Minute für 1/2 - 1 Stunde ausgespült. Eine Reduktion kann dann z.B. mit 6% Na&sub2;S&sub2;O&sub4; in 2.0M Natriumhydroxid bei 1 - 2 Säulen-Volumen erreicht werden.
Wählt man Nylon als polymerisches Material, kann eine Amin- Karboxyl-Gruppe als die Funktionalität verwendet werden, durch die die Zwischenschicht befestigt wird. Die Nylonoberfläche kann vorbereitet werden, indem 4N-Salzsäure mit einer Geschwindigkeit von 1 - 2 Säulen-Volumen pro Minute für 30 Minuten bis 1 Stunde bei 35ºC durch die Kapillare gegossen werden. Die überschüssige Salzsäure wird mit voll entsalztem Wasser mit 1 - 2 Säulen-Volumen pro Minute für 1/2 - 1 Stunde aus der Röhre gespült. Dies liefert eine hydrolytische Spaltung. Für eine nicht-hydrolytische Spaltung kann die Nylonoberfläche aktiviert werden, indem die Kapillare mit 1 - 2 Säulen-Volumen pro Minute für 10 - 15 Stunden bei 70ºC mit N, N-Dimethylaminopropylamin durchtränkt wird. Das überschüssige freie Mittel wird mit Äthanol und dann mit Wasser ausgespült.
Ist es erwünscht, Ester zu verwenden, wie z.B. Methyl-Methacrylat, kann ein aktiviertes Karboxyl erhalten werden, indem die Kapillare mit einer Geschwindigkeit von 1 - 2 Säulen-Volumen pro Minute mit 95 % Hydrazin bei 70ºC für 8 - 10 Stunden durchtränkt wird. Der Überschuß wird mit 1 - 2 Säulen- Volumen pro Minute für 30 Minuten bis 1 Stunde, zuerst mit Äthanol und dann mit Wasser ausgespült.
Ein Hydroxy-Alkyl-Methacrylat kann direkt durch ein Sauerstoff-Nukleophil gekoppelt werden.
Hydroxyl-enthaltende Oberflächen können auf eine große Anzahl von Art und Weisen aktiviert werden. Im allgemeinen sind alle derartigen Aktivierungen von Funktionsgruppen von Polymeroberflächen den Fachleuten bekannt. Nach der Aktivierung ist die Zwischenschicht gebildet.
Wenn die Kapillare vorbereitet und zur Reaktion mit den Spezies, die die gewünschten Zwischenschichten bilden werden, bereit sind, kann man mit jedem Ausführungsbeispiel der Erfindung fortfahren. Z.B. können Lösungen gewünschter hydratisierbarer amphoterischer Verbindungen bei einem pH-Wert von 7.0 als 0.2 mM Konzentrationen in 0.1M Phosphatpuffer vorbereitet werden. Die Enden der Säulen werden dann verschlossen, und es wird ermöglicht, daß sich die Säulen für ein Minimum von etwa 2 Stunden bei 4ºC setzen, um ein Reaktionsprodukt des Proteins, Peptids oder synthetischen Ampholyts mit dem aktivierten Sauerstoff- oder Stickstoff-Nukleophil der Säule zu bilden. Die überschüssigen amphoterischen Verbindungen, die nicht reagierten, können dann mit Flußgeschwindigkeiten von 1 - 2 mL/Minute für näherungsweise 2 - 3 Stunden mit dem geeigneten Anfangspuffer weggewaschen werden.
Alternativ kann man, wenn das Halogen-enthaltende Ausführungsbeispiel gewünscht ist, die vorbereitenden Kapillaren z.B. mit einer 0.2 M-Lösung eines Azyl-Chlorids (z.B. Pentafluorbenzoyl-Chlorid) durch Pumpen durch die Säule reagieren lassen, gefolgt vom Waschen mit Phenylmethan, Methanol und danach Wasser.
Nun werden zwei besonders bevorzugte Ausführungsbeispiele der Zwischenschicht beschrieben. Ein Ausführungsbeispiel wird manchmal mit Kapillarröhren des "ersten Ausführungsbeispiels" bezeichnet und liegt dann vor, wenn die Zwischenschicht eine hydratisierbare amphoterische Phase einschließt. Ein weiteres, oder "zweites Ausführungsbeispiel" liegt vor, wenn die Zwischenschicht einen endständigen Anteil einschließt, der durch zumindest ein Heteroatom konvalent gebunden ist.
Die Kapillarröhren des ersten Ausführungsbeispiels besitzen eine Zwischenschicht, die eine hydratisierbare amphoterische Phase einschließt, die durch Reagieren (d.h. kovalentes Binden oder Koppeln) eines Proteins, Peptids oder eines Ampholyths mit den Sauerstoff- oder Stickstoff-Nukleophilen der Zwischenstoffoberflächen, wie oben beschrieben ist, vorbereitet wird. Die Amino-Gruppen (des Stickstoff-Nukleophils) und die Karboxyl- oder Hydroxy-Gruppen (des Sauerstoff-Nukleophils) werden aktiviert, um das Koppeln zu beeinflussen. Z.B. können die Amino-Gruppen mit Glutaraldehyd oder Karbonyl-Diimidazol, und die Karboxyl- oder Hydroxyl-Gruppen mit Karbonyl-Diimidazol aktiviert werden. Alternativ können die Proteine, Peptide oder Ampholyte selbst aktiviert werden, um das Koppeln zu beeinflussen. Die Aktivierung der koppelnden Proteine, Peptide oder Ampholyte ist nach dem Stand der Technik gut bekannt.
Geeignete Proteine, Peptide und Ampholyte zum Einschluß in die konvalent gebundene Zwischenschicht weisen ein Molekulargewicht zwischen etwa 200 Daltons bis etwa 58.000 Daltons auf. D.h. Moleküle der Größe von Dipeptiden bis Makromoleküle können verwendet werden. Ampholyte sind besonders bevorzugt, da diese synthetischen Moleküle für besonders schmale pI-Bereiche kommerziell erhältlich sind. Wie bekannt ist, können Ampholythe durch Copolymerisation von Aminen und Aminosäuren mit Epichlorhydrin synthetisiert werden. Durch eine geeignete Auswahl der Amine und Aminosäuren kann ein großer Anteil der Pufferkapazität in ein schmales pH-Intervall (2 - 3 pH-Einheiten) konzentriert werden. Ampholyte sind von Quellen, wie z.B. den Pharmacia Fine Chemicals (unter dem Handelsnamen "Pharmalyte") und von den Bio-Rad Laboratories (unter dem Handelsnamen "Bio-Lyte") kommerziell erhältlich.
Die amphoterische Phase, ob Protein, Peptid oder Ampholyt, schließt ionisierbare, kationische und ionisierbare anionische Spezies ein. Die kationischen Spezies umfassen Amino, Guanidium, Imidiazolium und Gemische derselben. Amino-Spezies für die kationischen Spezies können aus Lysin-Seitenketten erhalten werden, Guanidium kann aus Arginin-Seitenketten erhalten werden und Imidiazolium aus Histinid. Die anionischen Spezies der amphoterischen Phase weisen Karboxyl-Gruppen von Asparginsäure- und Glutaminsäure-Seitenketten auf. Die synthetischen Ampholyte weisen ionisierbare kationische Spezies von Amino-Gruppen auf, wobei die meisten derselben terziär sind, jedoch einige sekundär oder primär sind. Die anionischen Spezies wird durch Karboxyl-Gruppen zweier Arten geliefert: α-Amino-Karboxyl-Gruppen und Karboxyl-Gruppen von polymerisiertem Glycylglycin.
Die Proteine, Peptide und Ampholyte, die zum Bilden der amphoterischen Phase geeignet sind, sind alle unter Gebrauchsbedingungen stark hydriert. Dies ist wichtig für die Umsteuerbarkeit der Wechselwirkungen (wenn auch reduziert) zwischen der beschichteten Oberfläche und den Protein-Lösungsprodukten. Diese hydratisierbare amphoterische Phase ermöglicht sowohl die Steuerung des elektroosmotischen Flußbetrags als auch der Flußrichtung. Eine Steuerung des elektroosmotischen Flußbetrags bedeutet, daß die Effizienz für spezielle Trennungen optimiert werden kann. Eine Steuerung der Flußrichtung bedeutet, daß die Eluierungsreihenfolge modifiziert werden kann, und tatsächlich umgekehrt werden kann. Umkehrbarkeit des elektroosmotischen Flusses bedeutet, daß ein Protein, das normalerweise sehr langsam abgebaut wird, früher eluiert werden kann.
Beschichtungen mit dem Ausführungsbeispiel der hydratisierbaren amphoterischen Phase der Erfindung hatten Proteintrennungen mit einer Effizienz im Bereich von 300.000 bis etwa 1 Million theoretischer Platten zur Folge. Diese hocheffizienten Trennungen wurden mit sehr geringen Wechselwirkungen vom Protein zur Wand (k') erreicht, gewöhnlich geringer als 0.02. Es wird angenommen, daß die elektroosmotischen Flußgeschwindigkeiten bei diesen sehr geringen k'-Werten für eine maximale Effizienz optimal sind.
Ein zweites Ausführungsbeispiel einer reduzierten Wechselwirkungsphase umfaßt einen endständigen Anteil, der konvalent durch zumindest ein Heteroatom gebunden ist. Der endständige Anteil befindet sich entfernt von der Oberfläche und ist durch eine Zwischenverbindung, die das (die) Heteroatom(e) einschließt, konvalent an die Oberfläche gebunden. Der endständige Anteil umfaßt eine Mehrzahl von Halogenatomen, die Substituenten in einer Acryl-Gruppe, einer Alkylaryl-Gruppe oder einer Alkyl-Gruppe sein können. Vorzugsweise ist der endständige Anteil ein Aryl-Pentahal.
Veranschaulichende endständige Anteile mit Halogenatomen, die in eine Alkyl-Gruppe substituiert sind, sind CX&sub3;-(CX&sub2;)n - wobei n zwischen 0 und etwa 5 liegt, und X aus Wasserstoff und Halogen ausgewählt wird, wobei zumindest zwei X Halogen sind.
Veranschaulichende endständige Anteile mit Halogenatomen, die in einem Alkyl-Aryl substituiert sind, sind
wobei n zwischen 1 und etwa 5 liegt, und X aus Wasserstoff und Halogen ausgewählt wird, wobei zumindest zwei Halogen sind.
Veranschaulichende endständige Anteile, die in eine Aryl-Gruppe substituiert sind, sind
wobei X aus Wasserstoff und Halogen ausgewählt wird, wobei zumindest zwei Halogen sind.
Diese endständigen Anteile sind durch zumindest ein Heteroatom einer Zwischenverbindung konvalent an die Oberfläche gebunden. Das Heteroatom ist Stickstoff, vorzugsweise aus einer Amino-Gruppe, Sauerstoff, vorzugsweise aus einer Karbonyl-Gruppe und kann ferner Schwefel einschließen. Wie nachfolgend ausführlicher beschrieben wird, können mehrere Heteroatome vorliegen, wobei mehrere bevorzugt sind. Die Heteroatome erhöhen den hydrophilen Charakter der reduzierten Wechselwirkungsphase und reduzieren, zusammen mit den Halogenatomen der endständigen Anteile, die Proteinwechselwirkungen mit der Kapillarröhre, z.B. die, die von den vander-Waals'-Kräften verursacht werden, die Wasserstoffbindung und Punktladungen.
Besonders bevorzugte Verbindungen, die die Heteroatome einschließen und sich zwischen der Oberfläche und den Endanteilen befinden, sind Amide, Ester, sekundäre Amine, Karbamate, Karbonate und Dithiole, die aktivierte Karbonyle einschließen.
Eine modifizierte Zwischenstoffoberfläche mit Stickstoff- Nukleophil, Sauerstoff-Nukleophil oder Kohlenstoff-Elektrophil reagiert dann mit der Verbindung, die Halogen-Substituenten aufweist. Diese Halogenverbindung schließt eine elektrophile Spezies ein, wenn die Oberfläche Stickstoff- oder Sauerstoff-Nukleophile aufweist, und schließt eine nukleophile Spezies ein, wenn die Oberfläche Kohlenstoff-Elektrophile aufweist. Beispielhafte Reaktanten für die oben beschriebene Situation sind Pentafluorbenzoyl-Chlorid, Pentafluorbenzaldehyd und Pentafluor-Benzolsäure. Ein exemplarischer Reagent für die nachfolgenden Situation ist ein 2, 3, 4, 5, 6 Pentafluoralkylamin mit der Struktur
wobei n zwischen 1 und etwa 5 liegt. Wenn n=1, kann das 2, 3, 4, 5, 6 Pentafluorbenzylamin durch Reduzierung der Nitrile vorbereitet werden. Jedoch können diese elektrophilen oder nukleophilen Halogenverbindungen aus einer großen Vielfalt von verschiedenen Verbindungen ausgewählt werden. Einige weitere Beispiele sind:
2, 3, 4, 5, 6-Pentafluorbenzhydrol, Pentafluorbenzonitril, 2, 3, 4, 5, 6-Pentafluorbenzyl-Alkohol, 2, 3, 4, 5, 6-Pentafluor-Zimtsäure, 2, 3, 4, 5, 6-Pentafluorphenoxy-Essigsäure, 2, 3, 4, 5, 6-Pentafluorphenyl-Essigsäure, DL-1-(Pentafluorphenyl)-Ethanol, Pentafluorphenylhydrazin, 2, 2, 3, 3, 3-Pentafluor-1-Propanol, Pentafluorpropionisches Anhydrid, Pentafluorpyridinisches, 2, 3, 4, 5, 6-Pentafluorstyren, Pentafluorthiophenol, und α-Brom-2, 3, 4, 5, 6-Pentafluortoluen.
Statt dem Reagieren des Oberflächen-modifizierten Zwischenstoffs mit dem Stickstoff- oder dem Sauerstoff-Nukleophil oder dem Wasserstoff-Elektrophil unmittelbar mit der gewünschten Halogen-Verbindung in Vorbereitung der Oberflächen des zweiten Ausführungsbeispiels, kann ein Zwischenbandschritt durchgeführt werden, um einen Beabstandungsarm, oder ein Band, zu befestigen. Dieses Band ist folglich Teil der Zwischenverbindung. Ein Vorteil eines derartigen Bandschrittes besteht darin, daß zusätzliche Heteroatome in die reduzierte Wechselwirkungsphase eingebracht werden können.
Geeignete Beabstandungsarme für die Reaktion mit dem Stickstoff-Nukleophil sind Elektrophile, wie z.B. aktiviertes Karbonyl (z.B. Säurehalid, Anhydrid oder Karbodiimid-aktiviertes Karbonyl oder aktiviertes Ester (wie z.B. N-Hydroxy-Succinimid-Ester), eigentliches reaktives Karbonyl (z.B. Aldehyd), Haloalkyl-Kohlenstoffelektrophil (z .B. α-Halo-Essigsäure oder Haloepoxypropane) und mit Bisoxiranen. Exemplarische aktivierte Karboxyl-Karbonyle sind Succinyl-Chlorid, Succin-Anhydrid, 1, 6-Hexan-Säure und Karbodiimid, wie z.B. EDAC (1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Karbodiimid) oder Dicyclohexyl-Karbodimiid, und Disuccinimidyl-Tartarat und Dithiobis (Succinimidyl-Propionat). Beispielhafte Aldehyde sind Glutaraldehyd und Succin-Semialdehyd. Beispielhafte Haloalkyl-Kohlenstoffelektrophile sind α-Brom-Essigsäure und Epichlorohydrin. Beispielhafte Bisoxirane sind Ethylen- Glycol-Diglycidyl-Äther und 1,4-Butanediol-Biglycidyl-Äther.
Ein besonderer Vorteil eines Dithiol-Bandes (dargestellt durch das exemplarische Reagent Dithiobis (Succinimidyl- Propionat) besteht darin, daß eine reduzierte Wechselwirkungsphase mit solchen Dithiol-Heteroatomen die Regeneration der Oberfläche durch Reduktion und Reformation unter milden Bedingungen ermöglicht.
Wenn die Oberfläche mit einem Sauerstoff-Nukleophil (wie oben beschrieben) modifiziert wurde, kann ein Zwischenbandschritt mit Beabstandungsarmen durchgeführt werden, die als Kohlenstoffelektrophile wirken, wie z.B. aktivierte Karboxyl-Karbonyle, α-Halo-Alkyl oder Epoxid-Kohlenstoffelektrophile. Beispielhafte aktivierte Karboxyl-Karbonyle sind Succinyl-Chlorid, Succin-Anhydrid, 1,6-Hexan-Säure und Karbodimiid (wie z.B. EDAC oder Dicyclohexyl-Karbodimiid), N-Hydroxysuccinimid-aktivierte Karbonyle (z.B. Di-Succinimidyl-Tartrat und Dithiobis (Succinimidyl-Propionat)). Das letztere liefert ein Dithiol-Band, das eine regenerierbare Oberfläche, wie oben beschrieben, ermöglicht. Beispielhafte Halo-Alkyle sind α-Halo-Karbonyl (z.B. α-Brom-Essigsäure) und Halo-Epoxy-Propane (z.B. Epibromhydrin und Epichlorhydrin). Beispielhafte Epoxide sind Bisoxiran, wie z.B. Ethylen-Glycol-Diglycidyl-Äther und 1,4-Butanediol-Diglycidyl-Äther.
Wenn die Oberfläche mit einem Kohlenstoff-Elektrophyl modifiziert wurde, kann ein Zwischenbandschritt verwendet werden, bei dem Beabstander, die als Nukleophile wirken, ausgewählt werden. Exemplarische Nukleophile Reagenten sind Diamine, Karbonsäuren-Amine und Dithiole.
Obwohl die vorliegende Erfindung bezugnehmend auf spezifische Beispiele beschrieben wurde, sollte es offensichtlich sein, daß verschiedene Modifikationen und Veränderungen ohne weiteres durch Fachleute durchgeführt werden können. Demgemäß sollte die vorhergehende Offenbarung nur veranschaulichend interpretiert werden und nicht in einem begrenzenden Sinn interpretiert werden. Die vorliegende Erfindung ist nur durch den Anwendungsbereich der folgenden Ansprüche begrenzt.

Claims

1. Ein Herstellungsgegenstand, der beim Gebrauch Protein- Lösungsprodukten ausgesetzt wird, der folgende Merkmale aufweist:

eine feste Oberfläche, die durch ein Polymer definiert ist oder ein solches trägt, eine Zwischenschicht, die konvalent an das Polymer gebunden ist und wirksam ist, um Wechselwirkungen zwischen der Oberfläche und den Protein-Lösungsprodukten zu reduzieren, wobei die Zwischenschicht eine hydratisierbare amphoterische Phase oder eine Mehrzahl von Halogenatomen, die in der Zwischenschicht durch zumindest ein Heteroatom gebunden sind, einschließt.

2. Der Gegenstand gemäß Anspruch 1, der als eine Kapillarröhre gebildet ist, wobei die feste Oberfläche sich an der inneren Wand der Röhre befindet.

3. Der Gegenstand gemäß Anspruch 2, bei dem die amphoterische Phase ein Reaktionsprodukt eines Proteins, eines Peptids oder eines Ampholyts und eines Sauerstoff- oder Stickstoff-Nukleophils ist.

4. Der Gegenstand gemäß Anspruch 3, bei dem die amphoterische Phase einen bestimmbaren isoelektrischen Punkt aufweist und selektiv eine elektroosmotische Flußsteuerung ermöglicht.

5. Der Gegenstand gemäß Anspruch 4, bie dem die elektroosmotische Flußsteuerung durch den pH-Wert der Lösung gewählt ist.

6. Der Gegenstand gemäß Anspruch 5, bei dem die amphoterische Phase eine Steuerung des elektroosmotischen Flußbetrages ermöglicht.

7. Der Gegenstand gemäß Anspruch 5, bei dem die amphoterische Phase eine Steuerung der elektroosmotischen Flußrichtung ermöglicht.

8. Der Gegenstand gemäß Anspruch 2, bei dem die amphoterische Phase ionisierbare kationische und ionisierbare anionische Spezies einschließt, wobei die kationischen Spezies aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Amino, Guanidium, Imidazolium und Gemischen derselben besteht, und wobei die anionischen Spezies Karboxyl-Gruppen sind.

9. Der Gegenstand gemäß Anspruch 8, bei dem die amphoterische Phase eine Pufferkapazität in einem pH-Intervall von etwa 2 oder 3 pH-Einheiten hat.

10. Der Gegenstand gemäß Anspruch 2, bei dem zumindest ein Heteroatom aus entweder einem oder einer Mehrzahl von Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel besteht.

11. Der Gegenstand gemäß Anspruch 2, bei dem die Mehrzahl von Halogenatomen Substituenten in einer Aryl-Gruppe, einer Alkylaryl-Gruppe oder einer Alkyl-Gruppe sind.

12. Der Gegenstand gemäß Anspruch 2, bei dem der endständige Anteil ein Aryl-Pentahal ist.

13. Der Gegenstand gemäß Anspruch 2, bei dem sich die Halogenanteile fern von der inneren Wand befinden und folgende Struktur einschließen

wobei X aus Wasserstoff und Halogen ausgewählt wird, wobei zumindest zwei der X Halogen sind.

14. Der Gegenstand gemäß Anspruch 13, bei dem das Heteroatom Teil einer Zwischenverbindung ist, wobei die Zwischenverbindung zumindest ein Amid, ein Ester, ein sekundäres Amin, ein Karbonat oder ein Karbamat einschließt.

15. Der Artikel gemäß Anspruch 1, bei dem das Polymer aus der Gruppe, die aus Nylon , Styren, Phenyl-Silikon, Acryl, Polyurethan, Polykarbonat, Polyester, Silikon- Alkoxy-Elastomer und Fluorkarbon besteht, ausgewählt ist.

16. Der Gegenstand gemäß Anspruch 15, der als eine Kapillarröhre gebildet ist, wobei sich die Oberfläche an der inneren Wand derselben befindet.