DE69319596T2

DE69319596T2 - Molekulargewichtstrennung von biomolekülen durch kapillare elektrophorese unter verwendung einer polymerhaltigen lösung

Info

Publication number: DE69319596T2
Application number: DE69319596T
Authority: DE
Inventors: David M. Scotts Valley Ca 95066 Demorest; Frank L. Concord Ca 94521 Oaks; H.-Michael Redwood City Ca 94061 Wenz; William E. San Carlos Ca 94070 Werner; John E. San Jose Ca 95119 Wiktorowicz
Original assignee: Perkin Elmer Corp
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1992-05-01
Filing date: 1993-04-30
Publication date: 1999-03-04
Anticipated expiration: 2013-05-01
Also published as: JP3176373B2; DE69319596D1; WO1993022665A1; ATE168194T1; US5264101A; EP0638168A4; JPH07506432A; EP0638168A1; EP0638168B1

Description

Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Separation von Biomolekülen (wie Polypeptiden, Nucleinsäuren und Oligosacchariden), und insbesondere auf die Verwendung einer Lösung von geringer Viskosität mit einem hydrophilen Polymer, dessen prozentuale Ladung zwischen ca. 0,01 und 1,0% liegt, die sowohl als molekulare Siebmatrix als auch als nicht-kovalente Wandbeschichtung für die Kapillarelektrophorese wirksam ist.

Literatur

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Zhu, D-Z., et al., US-Patent Nr. 5,069,766 vom 3.12.1991.

Hintergrund des Erfindung

Die Verwendung der Elektrophorese ist für die Fraktionierung einer Vielzahl von Biomolekülen, einschließlich DNA-Spezies, Proteinen, Peptiden und derivatisierten Aminosäuren, weit verbreitet. Eine Elektrophoresetechnik, die eine schnelle Separation bei hoher Auflösung ermöglicht, ist die Kapillarelektrophorese (Cohen, 1987, 1988; Compton; Kaspar). Üblicherweise werden bei der Kapillarelektrophorese Kapillarröhrchen aus Quarz verwendet, deren Innendurchmesser zwischen ca. 10 und 200 um liegt und deren Länge zwischen ca. 5 und 100 cm und mehr betragen kann.
Beim üblichen Elektrophoreseverfahren wird ein Elektrophoreseröhrchen oder eine Platte mit einem flüssigen Elektrophoresemedium gefüllt, und das flüssige Medium ist kovalent vernetzt oder temperaturgehärtet, so daß ein nicht-fließfähiges, stabilisiertes Gelseparationsmedium entsteht. Ein Probenvolumen wird in ein Ende des Röhrchens gesaugt oder hineingegeben, und ein elektrisches Feld wird durch das Röhrchen angelegt, um die Probe durch das Medium zu ziehen. Die elektrophoretische Separation innerhalb der Matrix kann auf der Molekulargröße basieren, in den Fällen von denaturierten Proteinen und Nucleinsäurespezies (die ungefähr die gleiche Ladungsdichte haben), oder auf einer Kombination aus Größe und Ladung, im Fall von Peptiden und Proteinen.
Die Polymerkonzentration und/oder der Grad an Vernetzung des Separationsmediums kann variiert werden, so daß eine Separation von Spezies über einen breiten Bereich von Molekulargewichten und Ladungen ermöglicht wird. Zur Separation von Nucleinsäurefragmenten, die größer als ca. 1.000 Basen sind, ist beispielsweise ein bevorzugtes temperaturgehärtetes Material Agarose, wobei die Konzentration der Agarose von ca. 0,3%, zur Separation von Fragmenten im Größenbereich von 5.000 bis 60.000 Basen, bis zu ca. 2%, zur Separation im Bereich von 100 bis 3.000 Basenpaaren, variieren kann (Maniatis). Kleinere Fragmente, üblicherweise mit weniger als ca. 1.000 Basenpaaren, werden normalerweise in vernetztem Polyacrylamid separiert. Die Konzentration von Acrylamidpolymer kann von ca. 3,5%, zur Separation von Fragmenten im Bereich von 100-1.000 Basenpaaren, bis zu ca. 20%, zur Separation im Größenbereich von 10-100 Basenpaaren, reichen. Zur Separation von Proteinen sind vernetzte Polyacrylamide bei Konzentrationen zwischen ca. 3 und 20% im allgemeinen geeignet. Allgemein gilt: Je kleiner die zu fraktionierende Molekularspezies, desto höher die Konzentration von vernetztem Polymer.
Die in gehärteten Elektrophoresemedien der oben beschriebenen Art erreichbare Auflösung wurde im Fall von Spezies mit kleinem Molekulargewicht durch Schwierigkeiten bei der Bildung einer homogenen, gleichmäßigen Polymermatrix bei hoher Polymerkonzentration in einem Elektrophoreseröhrchen, und insbesondere in einem Kapillarröhrchen, begrenzt. Bei dem üblichen Verfahren zur Bildung einer hochkonzentrierten gehärteten Matrix in einem Röhrchen wird eine hochkonzentrierte Monomerlösung (Acrylamid und Bisacrylamid) in flüssiger Form in das Röhrchen eingeführt. Das flüssige Material wird dann, beispielsweise durch Einwirkung von Licht in Anwesenheit von Persulfat, polymerisiert.
Bei hohen Polymerkonzentrationen können Reaktionswärmegradienten, die sich im Röhrchen bilden, leicht ungleichmäßige Reaktionsgeschwindigkeiten und Hitzeverwirbelungen erzeugen, die zur Inhomogenität der Matrix führen können. Auch eingeschlossene Gasbläschen, die während der Vernetzungsreaktion erzeugt werden, führen zu Hohlräumen in der gesamten Matrix. Die Ungleichmäßigkeiten in der Matrix begrenzen den Grad an zu erreichender Auflösung, insbesondere bei eng verwandten Spezies mit geringem Molekulargewicht.
Alternativ wird im Fall von temperaturhärtenden Polymeren das Polymer in flüssiger Form in ein Elektrophoreseröhrchen eingeführt, woraufhin es durch Abkühlen zu einer festen Form erstarren kann. Dieser Ansatz ist jedoch im allgemeinen ungeeignet zur Fraktionierung von Spezies mit geringem Molekulargewicht, wie kleinen Peptiden und Oligonucleotiden, da die Polymere, wie Agar und Agarose, die bekanntermaßen die erforderlichen temperaturhärtenden Erstarrungseigenschaften besitzen, selbst bei hohen Polymerkonzentrationen nicht für die Fraktionierung von Spezies mit geringem Molekulargewicht wirksam sind.
Eine zweite Beschränkung im Zusammenhang mit vernetzten oder temperaturgehärteten Matrizes ist die Schwierigkeit, fraktionierte Molekularspezies in der Matrix nach der elektrophoretischen Separation wiederzugewinnen. Im Fall eines präparativen Elektrophoreseröhrchens muß die gehärtete Matrix vorsichtig von der Wand des Röhrchens separiert werden, bevor die Matrix entnommen werden kann, ein Vorgang, der bei Röhrchen mit kleinem Durchmesser praktisch unmöglich ist. Selbst nach dem Entfernen der Matrix und der Identifikation des Matrixbereiches, der die gewünschte Molekularspezies enthält, kann die Spezies von Interesse nur durch einen langwierigen Elutionsvorgang oder durch elektrophoretische Elution aus dem Matrixbereich wiedergewonnen werden.
Bei der Kapillarelektrophorese wurden Beschichtungsmaterialien üblicherweise kovalent an den Wänden von Mikrokapillarröhrchen befestigt (Cohen, et al., 1991; Karger, et al., 1989; Alstine, et al., 1987). Meistens werden polymerisierte Matrizes nach der kovalenten Befestigung der Beschichtungsmaterialien eingeführt (Cohen et al., 1991; Karger, et al., 1989). Wasserlösliche Polymere wurden vernetztem, polymerisierten Elektrophoresemedium zugegeben, um die Sprödigkeit zu verringern, d. h. um die Handhabung zu erleichtern, und um die Eigenschaften der Migrationsgeschwindigkeit zu verbessern (Ogawa, 1987; Ogawa, et al., 1990).
Grossmann (US-Patent Nr. 5,126,021 vom 30.6.1992) beschreibt die Verwendung eines ungeladenen, wasserlöslichen Polymers in einer Lösung von geringer Viskosität, dessen Porengröße für die kapillarelektrophoretische Separation von Biopolymeren nutzbar ist.
Wictorowicz (US-Patent Nr. 5,015,350) beschreibt die Verwendung von nicht-kovalenter Beschichtung zur Einstellung des elektroosmotischen Flusses für die Separation von Biomolekülen. Das Kapillarröhrchen wird zwischen einem anodischen und einem kathodischen Elektrolytbehälter angeschlossen, und ein elektrisches Feld wird zwischen den Behältern angelegt, um einen elektroosmotischen Fluß im Röhrchen zu erzeugen. Während des elektroosmotischen Flusses wird eine Verbindung, welche die Oberflächenladung des Röhrchens verändern kann, in und durch das Röhrchen gezogen, und die elektroosmotische Fließgeschwindigkeit im Röhrchen wird überwacht. Die Verbindung wird weiter in und durch das Röhrchen gezogen, bis eine gewünschte Geschwindigkeit des elektroosmotischen Flusses im Röhrchen, die durch die Überwachung bestimmt wird, erreicht ist.
Zhu, et al., (US-Patent Nr. 5,069,766) beschreibt die Unterdrückung von elektroosmotischem Fluß während der Kapillarelektrophorese durch den Einschluß eines visko sitätserhöhenden Additivs in einer oder beiden Elektrodenkammerlösungen.
Die Größenfraktionierung von Proteinen wurde mit flüssigem Polyacrylamid durchgeführt (Widhalm, et al., 1991; Takagi, et al., 1991; Bode, 1978). Proteinseparationen mit flüssigem Polyacrylamid bei der Kapillarelektrophorese sind jedoch mit Problemen verbunden, einschließlich (i) die Auswirkung des elektroosmotischen Flusses auf die Protein- oder Proteinkomplexmigration (Widhalm, et al., 1991); (ii) die Verwendung ausreichend hoher Polyacrylamidkonzentrationen, um eine Separation von Probenproteinen oder -proteinkomplexen in diskrete Banden zu erreichen (Takagi, et al., 1991), sowie (iii) die Schweifbildung von Proteinbanden (Bode, 1978).

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zur Separation von Biomolekülen in einer Probe vor. Ein Kapillarröhrchen mit zwei Enden wird vorbereitet. Das Kapillarröhrchen
(i) hat geladene chemische Grupen an seiner Innenwandfläche, und
(ii) ist mit einer Elektrolytlösung gefüllt, die 0,05 bis 30 Gew.-% einer nichtvernetzten, hydrophilen Polymer- oder Copolymerlösung enthält, die wenigstens eine Polymer- oder Copolymerspezies enthält, die (a) ein Molekulargewicht zwischen 20 und 5.000 kD und (b) eine prozentuale Ladung zwischen 0,01 und 1,0% hat. Die prozentuale Ladung wird durch den molaren Prozentanteil geladener Monomer-Teileinheiten zu den gesamten Polymer-Teileinheiten gemessen, wobei die Ladung der geladenen Monomer-Teileinheiten entgegengesetzt zur Wandladung bei dem ausgewählten pH-Wert der Elektrophorese ist. Die Enden des Röhrchens werden in einen anodischen und einen kathodischen Behälter getaucht, die jeweils eine Elektrolytlösung enthalten. Die Probe, welche die zu separierenden Biomoleküle enthält, wird in ein Ende des Röhrchens eingeführt. Dann wird zwischen den Behältern ein elektrisches Feld angelegt, dessen Polarität für die Fraktionierung der Biomoleküle in der Probe wirksam ist.
In der vorliegenden Erfindung nutzbare Polymere oder Copolymere umfassen folgende Gruppen: Polyacrylamide (wie Polyacrylamid, poly(N,N-dimethylacrylamid) und Polymethylacrylamid), Polyoxide (wie Polyethylenoxid und Polypropylenoxid), Polyether (wie Polyvinylmethylether), Vinylpolymere (wie Polyvinylpyrollydin, Polyvinylalkohol und Polyvinylacetat), Cellulosepolymere (wie Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxylpropylcellulose und Hydroxypropylmethylcellulose), acrylische Polymere (wie Polyhydroxyethylmethacrylat und Polyethylenglycolmonomethacrylat), natürliche Gummis und Polysaccharide (wie Xanthane, Dextrane, Agar, Guar und Stärken).
Die Polymer- oder Copolymerlösung kann ein Homopolymer, ein Copolymer oder eine Mischung aus beiden enthalten.
Die in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendeten Polymer- oder Copolymermoleküle enthalten wenigstens eine geladene Gruppe mit einer ausgewählten Ladung, die aus folgender Gruppe ausgewählt wurde: primä re Amine, sekundäre Amine, quartäre Amine, Carboxylsäuren, Sulfonsäuren, Phosphorsäuren, Schwefelsäuren und Phosphonsäuren. Die Polymer- oder Copolymermoleküle können wenigstens eine geladene Gruppe enthalten, die aus folgender Gruppe ausgewählt wurde: primäre Amine, sekundäre Amine und quartäre Amine, sowie wenigstens eine geladene Gruppe, die aus folgender Gruppe ausgewählt wurde: Carboxylsäuren, Sulfonsäuren, Phosphorsäuren, Schwefelsäuren und Phosphonsäuren.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung ist das Polymer ein Copolymer aus Acrylamid und Diallyldimethylammoniumchlorid (DADMAC), und das Copolymer hat ein Molekulargewicht zwischen ca. 200 und 600 kD. Außerdem enthalten die Polymermoleküle 0,02 bis 0,4% des quartären Amins N,N-dimethyl-pyrrolidin pro Teileinheit Acrylamid.
In einer anderen Ausführung der vorliegenden Erfindung ist das Polymer ein Copolymer aus Acrylamid und Tetramethylethylendiamin (TEMED), und das Copolymer hat ein Molekulargewicht zwischen ca. 100 und 500 kD. Außerdem enthalten die Polymermoleküle 0,05 bis 0,5% des tertiären Amins Tetramethylethylendiamin pro Teileinheit Acrylamid.
In einer anderen Ausführung ist die Konzentration an Polymermolekülen, die eine zur Wandladung entgegengesetzte Ladung enthalten, ausreichend, um die Wandoberfläche nicht-kovalent zu beschichten und den elektroosmotischen Fluß (EOF) wesentlich zu steuern und auf weniger als ca. 2 · 10-5 cm²/sec-V zu verringern.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann außerdem den Nachweis der Anwesenheit separierter Biomoleküle im Elektrophoresekapillarröhrchen durch Messen elektrochemischer, optischer (z. B. UV-Absorption oder Fluoreszenz) oder radioisotoper Eigenschaften der Biomoleküle im Röhrchen umfassen.
Das vorliegende Verfahren kann auf die Separation von Proteinen, Polypeptiden und Peptiden angewandt werden: Diese Biomoleküle können bei dem pH-Wert des Elektrophoresemediums eine positive oder negative Nettoladung haben. In einer Ausführung können die Biomoleküle vor der Separation durch die Verwendung von z. B. Natriumdodecylsulfat denaturiert werden. Das Denaturierungsmittel, z. B. Natriumdodecylsulfat, kann auch in der Elektrolytlösung vorhanden sein.
Außerdem kann das vorliegende Verfahren auf die Separation von Nucleinsäurefragmenten angewandt werden. Die Nucleinsäurefragmente können einzelsträngige oder doppelsträngige DNA oder RNA sein. Die differentielle Migration doppelsträngiger Nucleinsäuren kann durch die Zugabe eines interkalierenden Mittels zu den Fragmenten eingestellt werden, um vorzugsweise die Migrationsgeschwindigkeiten von Fragmenten mit geringerem Molekulargewicht durch die Polymerlösung zu erhöhen. Beispiele für solche interkalierenden Mittel sind Ethidiumbromid und Acridinorange. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann für die Durchführung einer Restriktionsaufschlußanalyse einer DNA-Probe verwendet werden, nachdem die Probe mit einer oder mehreren ausgewählten Restriktionsendonucleasen behandelt wurde.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auch für die Separation linearer, verzweigter, nativer sowie chemisch modifizierter Oligosaccharide verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung weist außerdem ein gefülltes Kapillarröhrchen zur Verwendung beim Verfahren der vorliegenden Erfindung auf. Das Kapillarröhrchen hat an seiner Innenwandoberfläche geladene chemische Gruppen und ist mit einer Elektrolytlösung gefüllt, die 0,05 bis 30 Gew.-% einer nicht-vernetzten, hydrophilen Polymer- oder Copolymerlösung enthält, die (a) ein Molekulargewicht zwischen 20 und 5.000 kD und (b) eine prozentuale Ladung zwischen 0,01 und 1,0% hat. Wie oben angegeben, wird die prozentuale Ladung durch die molare Prozentzahl geladener Monomer-Teileinheiten zu den gesamten Polymer-Teileinheiten gemessen, wobei die Ladung der geladenen Monomer-Teileinheiten entgegengesetzt zur Wandladung bei einem ausgewählten pH-Wert der Elektrophorese ist.
Die oben beschriebenen Polymere und geladenen Gruppen können für das Füllen des Kapillarröhrchens verwendet werden.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 ist eine vereinfachte schematische Ansicht eines Kapillarelektrophoresesystems, die bei der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet wird.
Fig. 2 ist eine schematische Ansicht eines Kapillarelektrophoresesystems, das für den Simultanbetrieb so wohl in einem Wechsel- als auch einem Gleichspannungsmodus ausgelegt ist.
Fig. 3 ist ein vergrößerter, fragmentarischer Teil eines Kapillarelektrophoreseröhrchens, der den elektroosmotischen Fluß (e) von rechts nach links darstellt.
Fig. 4 zeigt die Auswirkungen der Erhöhung der TEMED- Konzentration in Polymerisierungsreaktionen auf Viskosität und EOF von 2% (Gew./Vol.) Polyacrylamid.
Fig. 5 zeigt die Auswirkungen der Erhöhung der DADMAC- Konzentration in Polymerisierungsreaktionen auf Viskosität und EOF von 2% (Gew./Vol.) Polyacrylamid.
Fig. 6 zeigt die Separation in diskrete Peaks einer Proteinmischung mit mehreren Bestandteilen. Der für die Separation verwendete prozentuale Anteil an Copolymer DADMAC/[AAm] ist rechts von jedem Elektropherogramm angegeben.
Fig. 7 zeigt die Separation in diskrete Peaks der oben beschriebenen Proteinmischung. Der für die Separation verwendete prozentuale Anteil an Copolymer DADMAC/[AAm] ist rechts von jedem Elektropherogramm angegeben.
Fig. 8 zeigt eine vorgeschlagene Struktur für ein lineares Copolymer, das aus den Acrylamid- und DADMAC- Teileinheiten besteht.
Fig. 9 zeigt hypothetische Geschwindigkeitskurven für relativ kleine (gestrichelte Linien) und relativ große (Strichpunktlinien) Nucleinsäurefragmente in Beziehung zu einer angelegten Rechteckwellenspannung mit einer Impulsbreite und einer maximalen Spannung vmax.
Fig. 10 zeigt die Ergebnisse einer Kalibrierungskurve für Bestandteile einer Proteinmischung relativ zu dem am schnellsten migrierenden Bestandteil. Die graphische Darstellung zeigt den Logarithmus des Molekulargewichts gegen die relative Migration der Proteinbestandteile.
Fig. 11 zeigt die Ergebnisse von 3 Durchgängen, die aus 50 sequentiellen Durchgängen von Proteinseparationen herausgegriffen wurden, bei denen die erfindungsgemäße Polymerlösung verwendet wurde, wobei das Kapillarröhrchen zwischen den Durchgängen nur mit der Polymerlösung gespült wurde.
Fig. 12 zeigt die Separation doppelsträngiger DNA- Moleküle in einer erfindungsgemäßen kationischen Copolymerlösung bei 1, 2 und 3% (Gew./Vol.).
Fig. 13 zeigt eine graphische Darstellung des Logarithmus der spezifischen Viskosität gegen den Logarithmus von Molekulargewichtsstandards von Polyacrylamid.
Fig. 14 zeigt eine graphische Darstellung des Logarithmus der spezifischen Viskosität gegen die prozentuale Konzentration eines Polyacrylamids mit einem einzigen Molekulargewicht (376 kD).
Fig. 15 zeigt die graphische Darstellung von relativen Migrationszeiten von Proteinen in einer Proteinmischung relativ zu dem am schnellsten migrierenden Bestandteil gegen prozentuales Polyacrylamid über einen Bereich von prozentualen Polyacrylamidwerten (Ferguson-Regressionsanalyse).

Definition von Begriffen

Der Begriff Polymer wird in der vorliegenden Erfindung in seinem traditionellen Sinn eines großen Moleküls verwendet, das aus kleineren monomeren Teileinheiten besteht, die auf charakteristische Weise kovalent miteinander verbunden sind, d. h. ein aus identischen Teileinheiten zusammengesetztes Homopolymer. Der Begriff Copolymer wird für ein Polymer verwendet, das zwei oder mehr Arten monomerer Einheiten im selben Molekül enthält. Durch Copolymerisation können Copolymermaterialien mit unterschiedlichen Eigenschaften als jene von jedem einzelnen Homopolymer hergestellt werden. Ein Beispiel für ein Copolymer in der vorliegenden Erfindung ist eine Mischung aus Acrylamid und DADMAC zur Bildung eines linearen Polymers mit der in Fig. 8 gezeigten vorgeschlagenen Struktur. In der Beschreibung bezieht sich eine Polymerlösung auf eine Lösung, die ein Polymer, eine Polymermischung, ein Copolymer, eine Copolymermischung oder eine Mischung aus Polymeren und Copolymeren enthält.
Der Begriff hydrophil beschreibt ein Polymer/Copolymer, das in Wasser oder Wasserpuffersystemen löslich ist.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff Biomoleküle üblicherweise auf Proteine, Polypeptide, Peptide, Nucleinsäuren, einzel- und doppelsträngige DNA und/oder RNA. Andere Biomoleküle wie Oligosaccharide oder Glycoproteine können durch das erfindungsgemäße Verfahren ebenfalls analysiert werden.
Biomoleküle können linear, verzweigt, nativ oder chemisch modifiziert sein.
Proteine sind üblicherweise lange Ketten von Polymeren auf Aminosäurebasis (Polypeptide). Proteine können aus einer, zwei oder mehr Polypeptidketten bestehen und außerdem einige andere Arten von Substanzen in Verbindung mit der/den Polypeptidkette(n) enthalten, wie Eisen oder Kohlenhydrate. Die Größe der Proteine deckt einen sehr weiten Bereich von (einer willkürlichen Zahl) 5.000 bis zu mehreren Hunderttausend g/mol ab. Die Zahl 5.000 entspricht der Anwesenheit von ca. 40-45 Aminosäuren. Proteine, die kleiner als ca. 5.000 g/mol sind, werden üblicherweise als Polypeptide oder einfach Peptide bezeichnet (Bohinski).
Die prozentuale Ladung für Polymere und/oder Copolymere in einer Elektrolytlösung wird als die molare Prozentzahl von geladenen Monomer-Teileinheiten relativ zu den gesamten Polymer-Teileinheiten gemessen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beschreibt die Verwendung von wenigstens einem Polymer oder Copolymer in einer Elektrolytlösung zur Verwendung bei der Separation von Biomolekülen. Die erfindungsgemäße polymerhaltige Elektrolytlösung (Polymerlösung) wird üblicherweise in ein Kapillarröhrchen eingeführt, wobei das Kapillarröhrchen geladene chemische Gruppen an seiner Innenwandoberfläche aufweist: Beispiele für Kapillaren mit negativ geladenen Gruppen an der Innenwandoberfläche sind Glas- oder Quarzkapillaren. Das Kapillarröhrchen wird dann mit einer Polymerlösung gefüllt, die 0,05 bis 30 Gew.-% eines nicht-vernetzten, hydrophilen Polymers oder Copolymers enthält: Die Lösung kann eine oder mehr Polymer- oder Copolymerspezies enthalten. Üblicherweise hat die Polymer- oder Copolymerspezies (i) ein Molekulargewicht zwischen 20 und 5.000 kD und (ii) eine prozentuale Ladung zwischen 0,01 und 1,0%. Bei einem ausgewählten pH-Wert der Elektrophorese ist eine Ladung auf dem Polymer oder Copolymer entgegengesetzt zu den geladenen chemischen Gruppen auf der Innenwandoberfläche des Kapillarröhrchens.
Die Enden des Kapillarröhrchens werden in einen anodischen und einen kathodischen Behälter getaucht, die jeweils die oben beschriebene polymerhaltige Elektrolytlösung enthalten. Proben von Biomolekülen oder Biomolekülmischungen werden in ein Ende des Kapillarröhrchens eingeführt, und ein elektrisches Feld wird zwischen den Behältern angelegt. Während sich die geladenen Biomoleküle durch das elektrische Feld bewegen, werden sie aufgrund differentieller Migration durch die von der Polymerlösung dargestellte Siebmatrix auf der Basis von Größe und/oder Form fraktioniert.

1. Kapillarelektrophoresesystem

Fig. 1 ist eine vereinfachte schematische Ansicht eines Kapillarelektrophoresesystems 20 (Applied Biosystems, Foster City, CA), das zur Ausübung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist. Das System umfaßt ein Kapillarröhrchen 22 von einer Länge, die vorzugsweise zwischen ca. 10 und 200 cm liegt, üblicherweise weniger als ca. 100 cm, und mit einem Innendurchmesser, der vorzugsweise zwischen ca. 10 und 200 um beträgt, üblicherweise ca. 50 um. In der gezeigten Ausführung wird das Röhrchen in einer horizontalen Position gehalten, und die Endbereiche sind nach unten gebogen. Ein bevorzugtes Kapillarröhrchen ist ein Quarzröhrchen mit einem Innendurchmesser von 50 um, das bei Polymicro Technologies (Phoenix, AZ) erhältlich ist.
Allgemeiner kann das Kapillarröhrchen ein beliebiges Röhrchen oder Kanal sein, das eine Säule aus Polymerlösung aufnehmen kann, vorzugsweise bei einer Säuleninnen- oder Durchmesserdicke von 200 um oder weniger. Beispielsweise kann das Röhrchen die Form eines Kanals annehmen, der in einem Objektträger aus Glas oder dergleichen ausgebildet ist.
Die Innenfläche des Kapillarröhrchens hat üblicherweise geladene chemische Gruppen auf ihrer Innenwandfläche. In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung hat die Innenfläche des Röhrchens negativ geladene Gruppen, wobei der pH-Wert vorzugsweise zwischen 4 und 9 liegt. Die chemischen Oberflächengruppen können eine inhärente Eigenschaft des Kapillarenmaterials sein, wie dies bei einem Quarzröhrchen der Fall ist, das negativ geladene Silanolgruppen auf seiner Oberfläche aufweist. Alternativ oder zusätzlich können die Kapillarenwände mit bekannten Derivatisierungsreagenzien zur kovalenten Befestigung negativer chemischer Gruppen, wie Säuregruppen, an den Innenwänden der Kapillare behandelt werden, oder mit bekannten negativ geladenen Oberflächenbeschichtungsmitteln. Alternativ kann die Innenwandfläche kovalent so modifiziert werden, daß sie positiv geladene Gruppen aufweist, die kovalent an der Innenwandoberfläche befestigt sind. Verfahren zur Derivatisierung oder Beschichtung von Glas oder dergleichen sind in der Technik bekannt. Ein bevorzugtes Kapillarröhrchen ist ein Quarzröhrchen mit einem Innendurchmesser von 50 um, erhältlich bei Polymicro Technologies (Phoenix, AZ).
Die unten angegebenen Polaritäten können je nach den zu separierenden Biomolekülen vertauscht werden: der Behälter auf Detektorseite und der Behälter auf Probenseite - kathodisch zu anodisch oder anodisch zu kathodisch. Die Polaritäten des Durchgangs können relativ zur Ladung in jedem Behälter bei vielen Kapillarelektrophoresegeräten gewählt werden.
Ein kathodischer Behälter 26 im System enthält eine elektrolytische Polymerlösung 28; die Polymerlösung wird weiter unten beschrieben. Das Kathodenende des Röhrchens, mit 22a bezeichnet, wird während der Elektrophorese, wie gezeigt, in die Polymerlösung getaucht.
Ein Probenröhrchen 30 im System enthält die Biomelekülmischung, die in das Kathodenende des Röhrchens gefüllt werden soll. Vorzugsweise wird das Probenmaterial in verdünnter Elektrolytlösung oder in Wasser aufgelöst. Der Probenbehälter und der kathodische Behälter können sich auf einem Karussell oder dergleichen befinden, um sie in eine Position zu bringen, in der das untere Kathodenende des Röhrchens in das Behälterfluid getaucht werden kann. Obwohl hier nicht abgebildet, kann das Karussell zusätzliche Behälter aufweisen, die beispielsweise Lösungen zum Reinigen und Spülen des Röhrchens zwischen Elektrophoresedurchgängen oder unterschiedliche Polymerlösungen enthalten.
Das gegenüberliegende Anodenende des Röhrchens, das mit 22b bezeichnet ist, ist in einem anodischen Behälter 32 abgedichtet und in eine anodische polymerhaltige Elek trolytlösung 34 getaucht, die wie gezeigt im Behälter enthalten ist. Das zweite Röhrchen 38 im Behälter ist mit einem genau gesteuerten Vakuumsystem (nicht abgebildet) verbunden, um Fluid, z. B. Wasch- und Reinigungslösungen oder Elektrophoresepolymerlösung, durch das Röhrchen zu ziehen und das Biomolekülprobenmaterial im Behälter 30 in das Röhrchen zu füllen. Als Alternative zum Vakuumsystem kann ein Überdrucksystem verwendet werden, um Reinigungslösungen, Proben, usw. einzuführen.
Eine Hochspannungszufuhr 40 im System ist mit dem kathodischen und dem anodischen Behälter wie gezeigt verbunden, um ein ausgewähltes elektrisches Potential zwischen den beiden Behältern anzulegen. Die Leitungen der Stromzufuhr sind mit Platinelektroden 41, 42 im kathodischen bzw. dem anodischen Behälter verbunden. Die Stromzufuhr kann zum Anlegen einer Gleichspannung (=) zwischen den Elektroden ausgelegt sein, vorzugsweise bei einer Spannungseinstellung zwischen 5 und 50 kV. Alternativ oder zusätzlich kann die Stromquelle zum Anlegen einer Wechselspannung mit ausgewählter Frequenz zwischen den Behältern ausgelegt sein. Allgemein gilt: je kürzer das Kapillarröhrchen, um so höher die elektrische Feldstärke, die angelegt werden kann, und um so schneller die elektrophoretische Separation. Beim Betrieb im Wechselspannungsmodus gibt die Stromzufuhr vorzugsweise einen Rechteckwellenimpuls mit einer einstellbaren Frequenz von ca. 50 Hz bis zu einem kHz- Bereich und eine Effektivspannung von ca. 10-30 kV aus. Höhere Impulsfrequenzen, sogar im MHz-Bereich, können für einige Anwendungen geeignet sein.
Zur Vervollständigung der Beschreibung des in Fig. 1 gezeigten Systems ist ein Detektor 44 im System am Anodenende des Röhrchens angeordnet, um durch eine optische Erfassungszone 46 im Röhrchen migrierende Biomoleküle optisch (z. B. UV-Extinktion oder Fluoreszenz) zu überwachen. Der Detektor kann entweder für die Erfassung von UV- oder sichtbarer Absorption und/oder zur Fluoreszenzemissionserfassung oder Radioisotoperfassung ausgelegt sein. Die UV-Extinktion wird üblicherweise im Bereich von 200-280 nm durchgeführt, wofür beispielsweise ein eingebauter UV-Extinktionsdetektor im Kapillarelektrophoresesystem von Applied Biosystems Modell 270 verwendet wird, der eine Durchflußküvette mit einem Kapillarenhalter aufweist.
Die Fluoreszenzemissionserfassung wird vorzugsweise bei einer ausgewählten Erregerwellenlänge durchgeführt, die zwischen ca. 240 und 500 nm einstellbar ist, je nach der mit dem Biomolekül assoziierten fluoreszierenden Spezies, wie oben erläutert. Ein exemplarischer Fluoreszenzdetektor ist ein Detektor HP1046A, der bei Hewlett-Packard (Palo Alto, CA) erhältlich ist und wie oben für die Kapillarröhrchenerfassung modifiziert wurde. Der Detektor ist mit einem Integrator/Kurvenschreiber 45 verbunden, um elektrophoretische Peaks aufzuzeichnen.
Die Radioisotoperfassung kann durch Verwendung eines modifizierten HPLC-Isotopdetektors für ³H oder 14C (Radiomatic Instruments & Chemical Co., Inc., Meriden, CT) durchgeführt werden.
Im Betrieb wird das Kapillarröhrchen gründlich gewaschen, indem durch Anlegen eines Vakuums an den Behäl ter 32, wie in Beispiel 2 genauer dargelegt, geeignete Reinigungs- und Spüllösungen durch das Röhrchen gezogen werden. In der Praxis der vorliegenden Erfindung kann die polymerhaltige Elektrolytlösung selbst verwendet werden, um das System zwischen Probendurchgängen zu spülen. Wenn eine andere Reinigungslösung als die polymerhaltige Elektrolytlösung verwendet wird, wird das Röhrchen mit mehreren Volumina der elektrolytischen Polymerlösung gespült. Eine kleine Menge, üblicherweise 1-10 nl, Probenmaterial wird mittels Vakuum-einspritzung in das kathodische Röhrchenende gefüllt. Eine Spannung wird zwischen dem kathodischen und dem anodischen Behälter angelegt, bis alle Biomolekülpeaks die Erfassungszone durchlaufen haben.
Fig. 2 zeigt eine fragmentarische Ansicht eines Elektrophoresesystems 50, das zum Zweck des elektrophoretischen Durchgangs unter einem pulsierenden Feld betrieben werden kann. Das Kapillarröhrchen 52 im System hat eine kleine Unterbrechung 54 stromaufwärts neben der Erfassungszone, die mit 56 bezeichnet ist. Die Röhrchenabschnitte auf beiden Seiten der Unterbrechung sind durch eine poröse Glasmanschette 58 verbunden, welche die Elektrolytmigration in das und aus dem Röhrchen ermöglicht. Der verbundene Teil des Röhrchens ist in einem Behälter 60, der mit einer geeigneten polymerhaltigen Elektrolytlösung 62 gefüllt ist, abgedichtet. Eine geerdete Elektrode 64 im Behälter ist mit der Hochspannungsseite einer Wechselspannungszufuhr 66 verbunden, deren negative Seite mit einem geeigneten kathodischen Behälter in Verbindung steht. Die geerdete Elektrode 64 ist mit der Hochspannungsseite einer Gleichstromzufuhr 68 verbunden, deren negative Seite mit einem geeigneten anodischen Behälter in Verbindung steht.
Im Betrieb wird nach dem Einfüllen des Probenmaterials in das kathodische Ende des Röhrchens die Wechselspannungszufuhr auf eine gewünschte Spannung und einen gewünschten Frequenzwert und die Gleichstromzufuhr auf einen gewünschten Spannungswert eingestellt. Die Biomoleküle in der Probe werden unter dem Impulsfeld im Teil stromaufwärts der Unterbrechung 54 fraktioniert. Danach werden die Fragmente in einem Gleichspannungsfeld durch die Erfassungszone transportiert, wo die Fragmente ohne Impulsfrequenz-Störwirkungen optisch erfaßt werden können.
Obwohl hier nicht dargestellt, kann das Elektrophoresesystem auch leicht zum Sammeln separierter Biomoleküle für präparative Elektrophoreseanwendungen angepaßt werden. Das Probensammeln kann beispielsweise durchgeführt werden, indem eine Reihe kathodischer Behälter vorgesehen wird, in welche die Fragmente eluiert werden können.

II. Viskositätseigenschaften

Die Viskosität der Polymer- oder Copolymerlösung ist ein Faktor in der vorliegenden Erfindung, der die Geschwindigkeit bestimmt, mit der die Lösung mit den in konventionellen Elektrophoresegeräten üblichen Drücken durch eine Kapillare gezogen oder gedrückt werden kann. Die Geschwindigkeit des Lösungsflusses durch die Kapillare bestimmt, wieviel Zeit erforderlich ist, um die Lösungsmatrix zwischen sequentiellen Analysen auszuwechseln. Eine zu lange Auswechslungszeit macht die vorliegende Erfindung weniger praktisch oder zweckmäßig. Die Fließgeschwindigkeit, v, eines Fluids mit einer Viskosität, 11, die sich durch ein Kapillarröhrchen mit einer Länge, L, und einem Radius, r, und Druck, p, zwischen den Enden bewegt, wird durch die Poiseuille- Gleichung ausgedrückt:
v = πpr&sup4;/8Lη
Diese Gleichung kann umgestellt werden, um die Viskosität einer Lösung zu berechnen, die eine Zeit, t, benötigt, um das gesamte Volumen im Kapillarröhrchen auszuwechseln:
η = tpr²/8L²
Eine Kapillare, die beispielsweise 50 cm lang ist (L = 50) und einen Durchmesser von 50 um hat (r = 0,0025 cm), würde unter einem Druck von 20" Hg (p = 0,678 bar) eine Lösungsviskosität von weniger als 38 centipoise (11 = 0,38 poise) erfordern, damit ihr Volumen in weniger als 30 Minuten (t = 1.800 sec) ausgewechselt werden könnte, einer Zeit, die für eine konventionelle Kapillarelektrophorese als zu lang angesehen würde.
Die Viskosität der Polymer-/Copolymerlösung wird in der vorliegenden Erfindung durch das Molekulargewicht des Polymers und seine Konzentration in der Lösung bestimmt. Die spezifische Viskosität, ηsp, der Lösungen wird durch Messen der Zeit, t, für die Polymerlösung und der Zeit, t&sub0;, die Wasser benötigt, um durch ein Kapillarröhrchen mit einem konstanten, regulierten Druck und Temperatur zu fließen, berechnet. Das ABI Model 270 Capillary Electrophoresis System wird als Kapillarvis kosimeter in diesem Fall mit einem Druck von 20" Hg und einer Temperatur von 30ºC verwendet. Die spezifische Viskosität wird somit folgendermaßen berechnet:
ηsp = (t/t0) - 1
Durch Verwendung einer 2%igen Lösung aus linearen Polyacrylamiden mit Standardmolekulargewicht (Polyacrylamid, gebildet durch lineare Polymerisation von Acrylamidmolekülen, ist in einem breiten Bereich von Molekulargewichten erhältlich; Polysciences, Inc., Warrington, PA), wird eine gute lineare Korrelation zwischen dem Logarithmus der spezifischen Viskosität (gemessen wie oben beschrieben) und dem Logarithmus des Molekulargewichts erreicht, wie in Fig. 13 gezeigt. Die Steigung dieser Korrelation beträgt 1,042 und in Übereinstimmung mit konventionellen Techniken ist diese Viskosität ein direktes Maß der Größe des Polymers/Copolymers in Lösung. Somit sollte bei Verwendung unseres Beispiels einer Viskosität von weniger als 38 centipoise (spezifische Viskosität von 30) für eine 2%ige Polymerlösung ein Polyacrylamid mit einem Molekulargewicht unter ca. 790 kD verwendet werden, um zu lange Auswechslungszeiten zu vermeiden.
Wenn die Konzentration des Polymers oder Copolymers in der Lösung erhöht wird, steigt die Viskosität der Lösung entsprechend an. Diese Tatsache ist in Fig. 14 dargestellt, wo eine gute lineare Korrelation zwischen dem Logarithmus der spezifischen Viskosität und dem prozentualen Anteil (Gew./Vol.) linearen Polyacrylamids mit einem Molekulargewicht von 367 kD (Polysciences, Inc.) in Lösung besteht. Im Beispiel einer spezifischen Viskosität von weniger als 30 sollte also ein Poly acrylamid mit einem Molekulargewicht von 367 kD bei weniger als ca. 3,1% (Gew./Vol.) in Lösung vorhanden sein, um zu lange Auswechslungszeiten zu vermeiden.
Die Beziehung zwischen Viskosität und Konzentration des Polymers/Copolymers deutet darauf hin, daß ein Polymer/Copolymer mit geringerem Molekulargewicht verwendet werden kann, um die Viskosität gering zu halten, wenn eine hohe Konzentration erforderlich ist, um eine Auflösung von Biomolekülen in einer Mischung zu erreichen. Umgekehrt können bei geringeren prozentualen Konzentrationen von Polymer/Copolymer Polymere/Copolymere mit höhrem Molekulargewicht verwendet werden.
Das Molekulargewicht des Polymers oder Copolymers wird durch eine Anzahl unterschiedlicher Verfahren eingestellt. Erstens werden die Polymerisationsbedingungen verändert, um Veränderungen im Molekulargewicht des endgültigen Polymerprodukts zu bewirken. Das durchschnittliche Viskositäts-Molekulargewicht des Copolymers/Polymers wird erhöht durch (1) Erhöhen der Reaktionstemperatur, (2) Erhöhen des Anteils eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels in der Reaktionsmischung, wie Methanol, oder (3) Erhöhen der Initiatorkonzentrationen. Die obige Liste von Reaktionsbedingungen ist nicht umfassend, da andere Polymerisationsbedingungen oder -additive verwendet werden, um das Molekulargewicht zu steuern, abhängig von dem jeweils hergestellten Polymer/Copolymer.
Ein zweites Verfahren zur Einstellung des durchschnittlichen Molekulargewichts eines Polymers/Copolymers ist das Fraktionieren eines polydispersen Polymerprodukts in Fraktionen mit unterschiedlichem Molekulargewicht, gefolgt von Isolierung und Reinigung. Eine wäßrige Lösung aus Polymer/Copolymer wird fraktioniert durch (1) eine größenabhängige chromatographische Separation (so wie Gelpermeationschromatographie), (2) eine Dialyse unter Verwendung von Membranen mit spezifischen Molekulargewichtsgrenzen oder (3) fraktionierte Ausfällungen unter Verwendung eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, wie Methanol.
Die Konzentration der Polymer-/Copolymerlösung wird eingestellt durch (1) Zugabe unterschiedlicher Gewichte von festem Polymer zu einem spezifizierten Volumen von wäßrigem Puffer und Mischen bis zur vollständigen Auflösung des Feststoffs oder (2) Zugabe unterschiedlicher Gewichte oder Volumina einer konzentrierten wäßrigen Polymerlösung zu einem spezifizierten Volumen von wäßrigem Puffer und Mischen bis zur vollständigen Verteilung des Konzentrats.
Es ist klar, daß die Obergrenzen des Molekulargewichts von Polymer/Copolymer und/oder ihre Konzentration in Lösung primär durch die höchste Viskosität, die durch eine Kapillare gedrückt oder gezogen werden kann, bestimmt werden. Diese oberste Viskosität wird durch die Instrumentenparameter eingestellt, wie in den obigen Gleichungen ausgedrückt. Wenn also für die Kapillarelektrophorese beispielsweise eine kurze Kapillare (L = 20 cm) mit einem großen Radius (r = 0,01 cm) verwendet wird, könnte eine Lösung mit einer Viskosität von ca. 38.625 centipoise in 30 Minuten mit hohem Druck (P = 100 psi = 6,87 bar) durch die Kapillare gedrückt werden. Mit den Daten aus Fig. 13 (Logarithmus der spezifischen Viskosität gegen Polyacrylamidkonzentration) kann geschätzt werden, daß die oberste Konzentration für ein Polyacrylamid mit einem Molekulargewicht von 367 kD ca. 9% (Gew./Vol.) beträgt. Natürlich könnten durch Verwendung eines Polyacrylamids mit geringerem Molekulargewicht Lösungen mit höheren Konzentrationen durch eine Kapillare gedrückt werden, und es ist zu erwarten, daß Konzentrationen nahe 20% (Gew./Vol.) verwendbar wären.
Wie aus den oben dargelegten Beziehungen deutlich wird, kann ein Instrument mit einem höheren Druck einer bestimmten Polymerkonzentration relativ zu einem Instrument mit einem geringeren Druck eine höhere Fließgeschwindigkeit verleihen. Als weiteres Beispiel kann eine Kapillare mit größerem Durchmesser relativ zu einem Kapillarröhrchen mit kleinerem Durchmesser eine höhere Fließgeschwindigkeit verleihen. Die Faktoren, welche die Fließgeschwindigkeit beeinflussen, können auf der Basis der oben definierten Parameter, welche die Fließgeschwindigkeit beeinflussen, manipuliert werden.

III. Polymerlösungen und elektroosmotischer Fluß

Das Phänomen des elektroosmotischen Flusses in einer Polymerlösungsmatrix wird für eine Innenwand eines Kapillarröhrchens mit einer negativen Nettoladung unter Bezugnahme auf Fig. 3 beschrieben, die einen vergrößerten, fragmentarischen Teil eines Kapillarelektrophoreseröhrchens 70 zeigt.
Wie in Fig. 3 zu sehen ist, sind die negativ geladenen Gruppen auf der Röhrcheninnenwand, mit "-"-Symbolen bezeichnet, durch sowohl locker als auch fest gebundene positiv geladene Ionen, die in der Polymerelektrolytlö sung vorhanden sind und die im wesentlichen eine positiv geladene Hülle um die Fluidsäule im Röhrchen bilden, abgeschirmt. Die Dicke der Hülle positiver Ionen an der Wandoberfläche ist als elektrische Doppelschicht bekannt. Die elektrische Doppelschicht ist durch ein Zeta-Potential gekennzeichnet, das ein Maß des Potentials an der Kapillarenwand ist.
Unter dem Einfluß eines elektrischen Felds wird diese Säule aus Polymerlösung im Medium (das von einer Hülle positiver Ladungen umgeben ist) elektroosmotisch in die Bewegungsrichtung der positiven Hülle (d. h. zur Kathode) gezogen. Die Geschwindigkeit des elektroosmotischen Flusses im Röhrchen wird durch den Pfeil e in der Figur angegeben (der Pfeil e kann als Vektor mit einer Größe e und einer Richtung entlang der Achse des Röhrchens gedacht werden). Die Geschwindigkeit des elektroosmotischen Flusses e in einem Kapillarröhrchen kann durch folgende Gleichung beschrieben werden:
e = &epsi; E/4πη
wobei &epsi;, η, und E die dielektrische Konstante der Doppelschicht, ihre Viskosität, das Zeta-Potential bzw. die elektrische Feldstärke sind.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren haben die Polymere oder Copolymere in der Elektrolytlösung eine ausreichende prozentuale Ladung, um sich an die entgegengesetzt geladene Kapillarenwand zu binden. Diese Bindung verringert deutlich oder eliminiert den elektroosmotischen Fluß im Kapillarröhrchen durch Senkung der dielektrischen Konstante oder Erhöhung der Viskosität oder beides der elektrischen Doppelschicht. Die Stärke des elektroosmotischen Flusses muß hinreichend verringert werden, um diskrete Peaks oder Banden von separierten Biomolekülen zu ermöglichen, ohne wesentliche Schweifbildung oder Verbreiterung der Banden, d. h. verringerte Auflösung. Wie oben erwähnt, beruht die Separation von Biomolekülen durch das erfindungsgemäße Verfahren vorwiegend auf der durch die Polymere und/oder Copolymere in der Elektrolytlösung bewirkten Siebwirkung. Die Auswirkung der prozentualen Ladung in einer bestimmten Polymer-/Copolymerlösung auf den elektroosmotischen Fluß kann folgendermaßen bewertet werden.
Der elektroosmotische Fluß wird üblicherweise als die Mobilität (cm²/sec-V) einer elektrisch neutralen Substanz durch ein Kapillarröhrchen mit einer definierten Polymer-/Copolymerelektrolytlösung gemessen (Beispiel 2).

IV. Separation von Biomolekülen

Beim Separationsverfahren der vorliegenden Erfindung kann eine Anzahl von Polymeren und Copolymeren für die Zubereitung der polymerhaltigen Elektrolytlösung verwendet werden.
Üblicherweise haben die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polymere und Copolymere ein Molekulargewicht zwischen 20 und 5.000 kD. Folgende exemplarische Polymere und Copolymere sind im vorliegenden Verfahren zweckmäßig: Polyacrylamide wie Polyacrylamid, poly(N,N-dimethylacrylamid) und Polymethacrylamid; Polyoxide wie Polyethylenoxid und Polypropylenoxid; Polyether wie Polyvinylmethylether; Vinylpolymere wie Polyvinylpyrollydin, Polyvinylalkohol und Polyvinylacetat;
natürliche Gummis oder Polysaccharide wie Xanthane, Dextrane, Agar, Guar und Stärken; Cellulosepolymere wie Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxylpropylcellulose und Hydroxypropyl-methylcellulose; sowie Acrylpolymere wie Polyhydroxyethylmethacrylat und Polyethylenglycolmonomethacrylat. Mischungen aus Polymeren und Copolymeren können in der Praxis der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden.
Die prozentuale Ladung eines ausgewählten Polymers oder Copolymers kann auf verschiedene Arten erzielt werden (Beispiel 1). Wenn beim erfindungsgemäßen Verfahren Homopolymere verwendet werden, können sie so modifiziert werden, daß sie eine spezifizierte prozentuale Ladung enthalten. Nach oder während der Polymerisation kann ein Homopolymer so modifiziert werden, daß es eine gewünschte durchschnittliche prozentuale Ladung enthält, z. B. durch Hofmann-Abbau bei Polyacrylamid, so daß Vinylamine entstehen (Kulicke). Ein Beispiel für ein Homopolymer ist Polyacrylamid, das in einem breiten Bereich von Molekulargewichten erhältlich ist, linear polymerisiert in Anwesenheit von Ammoniumpersulfat, so daß ein Polyacrylamidmolekül gebildet wird.
Copolymere sind beim erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls zweckmäßig. Ein Vorteil von Copolymeren ist, daß eine der Teileinheiten spezifisch so gewählt werden kann, daß sie eine gewünschte Ladungsgruppe enthält. Diese Teileinheit kann dann Polymerisationsreaktionen mit einer anderen Teileinheit bei einer definierten Konzentration zugegeben werden, wodurch die Bildung eines Copolymers mit den gewünschten prozentualen Ladungseigenschaften ermöglicht wird. Beispielsweise können Copolymere von Acrylamid ([AAm]) und Tetramethyl ethylendiamin (TEMED), oder Acrylamid und Diallyldimethylammoniumchlorid (DADMAC) wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben gebildet werden. Die Copolymere können einen breiten Bereich prozentualer Ladungswerte sowie einen Bereich von Viskositätswerten abdecken.
Durch das Einsetzen anderer Arten von Acrylamiden in den Reaktionsschemata aus Beispiel 1 und 2 können andere Arten geladener Copolymere synthetisiert werden, wie Poly(methacrylamid), Poly(N-methylacrylamid) oder Poly- (N,N-dimethylacrylamid). Das Polymer kann beispielsweise ein Copolymer von N,N-dimethylacrylamid und Tetramethylethylendiamin (TEMED) sein, wobei das Copolymer ein Molekulargewicht zwischen ca. 200 und 800 kD hat und die Polymermoleküle 0,03 bis 0,6% des tertiären Amins Tetramethylethylendiamin pro Teileinheit N,N-dimethylacrylamid enthalten.
Außerdem sind Pfropf- oder Blockcopolymere in der Praxis der vorliegenden Erfindung ebenfalls zweckmäßig. Wäßrige geladene Pfropfpolymere können durch Polymerisation geladener Copolymere in Anwesenheit ungeladener Polymere gebildet werden. Ein Beispiel für eine solche Pfropfreaktion ist in Beispiel 1D für das Pfropfcopolymer von Acrylamid und DADMAC auf Dextran dargestellt.
Bei der Modifikation der Polymere und Copolymere der vorliegenden Erfindung zweckmäßige geladene Gruppen oder Teileinheiten umfassen folgende: primäre Amine wie Vinylamin, Glucosamin; sekundäre Amine wie Ethylenimin; tertiäre Amine wie Vinylpyridin und Tetramethylethylendiamin (TEMED); quartäre Amine wie Vinyl-N-methylpyridin, N,N-dimethyl-3,5-methylenpiperidin (DADMAC); Carboxylsäuren wie Acrylsäure, Methacrylsäure und Apfel säure; Sulfonsäuren wie Vinylsulfonsäure; Phosphorsäuren wie Vinylphosphorsäure; Schwefelsäuren wie Vinylschwefelsäure; sowie Phosphonsäuren wie Vinylphosphonsäure.
Indem DADMAC im Reaktionsschema aus Beispiel 2 durch andere Arten geladener Teileineheiten substituiert wird, können andere Arten geladener Copolymere synthetisiert werden, wie Polyacrylamid, das einen geringen Prozentsatz der aus den folgenden Verbindungen abgeleiteten geladenen Teileinheiten enthält: [3-(Methacryloylamino)propyl]trimethylammoniumchlorid oder der Teileinheit 2-Methacryloxyethyl(trimethylammonium)chlorid. Gleichermaßen kann das TEMED in Beispiel 1 durch eine genauso reaktionsfähige Verbindung ersetzt werden, die eine geladene Gruppe in das Polyacrylamid einführt, wie 2,2'-Azobis(2-methylpropionamidin)dichlorid.
Das Polymer kann beispielsweise ein Copolymer aus Acrylamid und [3-(Methacryloylamino)propyl]trimethylammoniumchlorid sein, wobei das Copolymer ein Molekulargewicht zwischen ca. 200 und 600 kD hat und die Polymermoleküle 0,01 bis 0,2% des quartären Amins N- [(pro- pyl)trimethylammoniumchlorid]methacrylamid pro Teileinheit Acrylamid enthalten.
Die oben aufgeführten Moleküle, die geladene Gruppen enthalten, können durch in der Technik bekannte Verfahren in Homopolymere eingebaut werden (siehe Beispiel 1). Für die vorliegende Erfindung zweckmäßige Polymere und Copolymere können auch ampholytische Polymere sein, die sowohl positive als auch negative Ladungsgruppen enthalten: Die unterschiedlich geladenen Einheiten können in dasselbe Polymer eingeführt werden, einschließ lich Mischungen aus positiven und negativen Ladungsgruppen. Die Polymer- oder Copolymermoleküle können beispielsweise wenigstens primäre Amin-, sekundäre Amin- und/oder quartäre Amingruppen enthalten und wenigstens Carboxylsäure-, Sulfonsäure-, Phosphorsäure-, Schwefelsäure- und/oder Phosphonsäuregruppen. Die Verwendung solcher ampholytischer Polymere kann für Separationen zweckmäßig sein, da sich beispielsweise die positive Ladung auf dem Polymer nicht-kovalent an die negative Kapillarenwand binden kann, und die leicht negative Ladung auf dem Polymer die Separation durch Ladungsabstoßung verbessern kann. In Lösung können sich die positiven und negativen Ladungen auf dem Polymer auch nicht-kovalent binden und die Siebeigenschaften der Matrix modifizieren.
In einigen Fällen können die oben aufgeführten Moleküle, die geladene Gruppen enthalten, auch direkt in Copolymere eingebaut werden, wie beispielsweise in Beispiel 1 für Acrylamid und DADMAC veranschaulicht ist.
Beispiel 2 beschreibt die Verwendung von Copolymeren aus Acrylamid ([AAm]) und TEMED oder DADMAC. Die Geschwindigkeit des elektroosmotischen Flusses wurde mit einer neutralen Markersubstanz gemessen. Das Verhältnis von TEMED oder DADMAC zu ([AAm]) wurde über die unten in Fig. 4 und 5 angegebenen Wertebereiche variiert. Sowohl bei TEMED als auch bei DADMAC wurde die Geschwindigkeit des elektroosmotischen Flusses (EOF) deutlich verringert (weniger als ca. 2 · 10&supmin;&sup5; cm²/sec-V) bei prozentualen Ladungswerten von 0,05%.
Fig. 4 zeigt die Auswirkungen der Erhöhung der TEMED- Konzentration bei Polymerisationsreaktionen auf Visko sität und EOF. Bei Verwendung einer konstanten Polyacrylamidkonzentration von 2 Gew.-% zur Messung des EOF sank der EOF mit ansteigendem prozentualen TEMED, und die in Fig. 4 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß der EOF unter 2 · 10&supmin;&sup5; cm²/sec-V bleibt, wenn die prozentualen Ladungswerte den Bereich von ca. 0,05% bis 0,5% abdecken. Die Viskosität der Polymerlösung sank mit steigendem prozentualen TEMED und blieb relativ konstant über ca. 0,2%. Diese Daten zeigen, daß ein Anstieg der prozentualen positiven Landung und kein Anstieg der Viskosität zu einer Abnahme des EOF führen.
Fig. 5 zeigt die Auswirkungen von 2 Gew.-% Polyacrylamid, das mit steigender DADMAC-Konzentration hergestellt wurde, bei Polymerisationsreaktionen auf Viskosität und EOF. Wie aus den in Fig. 5 dargestellten Ergebnissen ersichtlich ist, sinkt der EOF mit steigendem prozentualen DADMAC und bleibt unter 2 · 10&supmin;&sup5; cm²/sec-V für prozentuale Ladungswerte, die den Bereich von ca. 0,05% bis 0,26% abdecken. Die Viskosität der Polymerlösung steigt und sinkt mit steigendem prozentualen DAD- MAC, steigt aber linear im selben Bereich von 0,05 bis 0,26% an. DADMAC/[AAm]-Copolymere mit prozentualen Ladungswerten im Bereich von 0,05% bis 0,5% sind für die Separation vieler verschiedener Biomoleküle von unterschiedlicher Größe und/oder Form zweckmäßig. Diese Daten zeigen also auch, daß das Absinken des EOF durch einen Anstieg der prozentualen positiven Ladung und nicht durch die steigende Viskosität bewirkt wird.
Das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren ist für die Steuerung der prozentualen Ladung nützlich, die in Polymeren oder Copolymeren enthalten ist und die in der Praxis des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ver wendet werden soll, um einen verringerten EOF zu erhalten.
Für die Separation von Biomolekülen wird das Kapillarröhrchen üblicherweise mit einer Elektrolytlösung gefüllt, die 0,05 bis 30 Gew.-% einer nicht-vernetzten hydrophilen Polymer- oder Copolymerlösung enthält, die wenigstens eine Polymer- oder Copolymerspezies enthält, die (a) ein Molekulargewicht zwischen 20 und 5.000 kD und (b) eine prozentuale Ladung zwischen 0,01 und 0,1% hat, wie von der molaren Prozentzahl geladener Monomer- Teileinheiten zu gesamten Polymer-Teileinheiten gemessen. Eine Ladung auf dem Polymer oder Copolymer in Lösung ist entgegengesetzt zur Wandladung bei einem ausgewählten pH-Wert der Elektrophorese.
Die in Fig. 4 und 5 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß nicht die Viskosität für das Absinken des EOF verantwortlich ist, sondern die prozentuale Ladung des Polymer-/Copolymermoleküls.
Beispiel 3 beschreibt die Verwendung einer Anzahl von Polymerlösungen für die Separation von Biomolekülen. Die Separation einer Mischung aus Proteinen wurde verwendet, um die Molekularsiebfähigkeiten des vorliegenden Verfahrens zu veranschaulichen. Fig. 6 zeigt die Separation in diskrete Peaks einer Proteinmischung mit folgenden Bestandteilen: a-Lactalbumin (14 kD), Trypsinhemmer (20 kD), Eialbumin (45 kD), Rinderalbumin (66 kD) sowie β-Galactosidase (116 kD). In Fig. 6 entspricht die Reihenfolge der Peaks von links nach rechts den soeben aufgeführten Proteinen. Das für die Separation verwendete prozentuale DADMAC/[AAm] ist rechts von jedem Elektropherogramm angegeben. Wie in Fig. 6 zu sehen ist, sind prozentuale Ladungswerte im Bereich von 0,26, 0,1 bis 0,05% alle für die Separation von jedem Protein in der Proteinmischung wirksam. Der Vergleich der Separationsfähigkeit der Copolymerelektrolytlösung (Fig. 6) mit dem EOF derselben Copolymerlösung (Fig. 5) zeigt, daß jeder der Werte 0,26, 0,1 und 0,05% einen EOF-Mobilitätswert von weniger als 2 · 10&supmin;&sup5; cm²/sec-V hat.
Beim Wert 0,26% tritt in der ausgeprägten Basislinie ein Gefälle auf, das bei den längeren Laufzeiten Daten verwischen würde. Allgemein wird die Obergrenze der prozentualen Ladung als der Wert bestimmt, der keine ausgeprägten Basislinienstörungen (d. h. Gefälle, Steigung, Spikes, usw.) verursacht. Obwohl dies von der Art des Polymers abhängt, übersteigt dieser oberste Wert selten 1%.
Fig. 7 zeigt die Separation der oben beschriebenen Proteinmischung in diskrete Peaks. Der für die Separation verwendete prozentuale DADMAC/[AAm] ist rechts von jedem Elektropherogramm angegeben. Wie aus Fig. 7 zu sehen ist, sind prozentuale Ladungswerte von 0,02% und weniger für die Separation von jedem Protein in der Proteinmischung aufgrund ausgeprägter Bandenverbreiterung und Abnahme der Empfindlichkeit uneffektiv. Der Vergleich der Separationsfähigkeit der Copolymerelektrolytlösung (Fig. 7) mit dem EOF derselben Elektrolytlösung (Fig. 5) zeigt, daß jeder der Werte von 0,02% und weniger einen EOF-Mobilitätswert von über 2 · 10&supmin;&sup5; cm²/sec-V hat.
Zusätzlich zur Separation von Bestandteilen einer Mischung aus Biomolekülen ist das Verfahren der vorlie genden Erfindung auch zweckmäßig für die Bestimmung des Molekulargewichts eines ausgewählten Biomoleküls. Beispiel 3B beschreibt die Erzeugung einer Molekulargewichts-Kalibrierungskurve auf der Basis der relativen Migration bekannter Proteinstandards zu einem ausgewählten Molekulargewichtsstandard. Fig. 10 zeigt die Kalibrierungskurve vom Logarithmus des Molekulargewichts gegen die Migration der Proteinstandards relativ zu α-Lactalbumin (dem ausgewählten Bezugsstandard). Eine beliebige Anzahl von Verbindungen mit bekanntem Molekulargewicht und bekannter Ladung kann als Bezugsstandard verwendet werden, um die relative Migration festzustellen: beispielsweise geladene organische Moleküle, Farbstoffe, Nucleinsäuren, Proteine und andere geladene Biomoleküle. In der Praxis wird die Migration der Verbindung mit unbekanntem Molekulargewicht relativ zum ausgewählten Bezugsstandard, wie α-Lactalbumin, bestimmt, und das Molekulargewicht wird dann durch Vergleich mit einer Standardkurve bestimmt.
Beispiel 3C demonstriert die Reproduzierbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens. Eine 3%ige (Gew./Vol.) Copolymerlösung Acrylamid/TEMED wurde für die Separation einer Mischung aus Proteinstandards verwendet. Fünfzig Durchgänge wurden unter Verwendung derselben Mischung aus Proteinen nacheinander durchgeführt. Nach jedem Durchgang wurde die Kapillare mit der Copolymerlösung Acrylamid/TEMED gespült. Die Separationsergebnisse sind in Fig. 11 für die Durchgänge 1, 30 und 50 gezeigt. Wie aus Fig. 11 ersichtlich ist, ist die Separation der Bestandteile der Proteinmischung durch das erfindungsgemäße Verfahren sehr gut reproduzierbar.
In Beispiel 3D wurde die Auswirkung einer Änderung der prozentualen Konzentration von Polymer/Copolymer in der Lösung auf die relativen Migrationen von Biomolekülen untersucht. Wenn sich die prozentuale Konzentration des Polymers/Copolymers ändert, ändert sich auch die Differenz in der relativen Migration zwischen den Proteinstandards (Fig. 15). Das Gefälle der Linien in Fig. 15 für jeden Proteinstandard ist proportional zum Molekulargewicht, was anzeigt, daß die Polymer-/Copolymerlösung eine echte Siebmatrix darstellt. Außerdem ist dieses Verfahren eine andere Art, das Molekulargewicht eines bestimmten Biomoleküls zu bestimmen: Vergleich des Gefälles der Linie für ein unbekanntes Biomolekül mit der graphischen Darstellung der Gefälle der Linien der Molekulargewichtsstandards. Die relative Migration in Fig. 15 ist die Migrationsgeschwindigkeit eines bestimmten Proteins relativ zur Migration von α- Lactalbumin, d. h. die Migrationszeit von α-Lactalbumin geteilt durch die Migrationszeit von jedem Standardprotein.
Beispiel 4 demonstriert die Separation von DNA- Fragmenten in einer Mischung aus Restriktions-Aufschlußfragmenten. φX174 RF HaeIII Aufschlußfragmente wurden durch das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung von mit TEMED hergestelltem Polyacrylamid mit 0,24% Ladung separiert. Es gibt 11 φX174 RF HaeIII Aufschlußfragmente, deren Größe von 72 bis 1353 Basenpaare reicht. Fig. 12 zeigt die resultierenden Elektropherogramme für die drei Copolymerkonzentrationen 1, 2 und 3%. Die Daten in Fig. 12 veranschaulichen die Eigenschaft des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß ein Anstieg der prozentualen Konzentration des Polymers/Copolymers die Separationsfähigkeit der Technik beeinflußt.
Wie in Fig. 12 zu sehen ist, verbessert sich die Auflösung der Peaks, die den Fragmenten φX174 RF HaeIII mit 271 und 281 Basenpaaren entsprechen, wenn die Copolymerkonzentration steigt: bei 2% beginnen sie zu separieren und bei 3% werden die Peaks gut aufgelöst. Dieses Beispiel veranschaulicht, wie die Manipulation der prozentualen Konzentration des Polymers in Lösung die Auflösung beeinflußt.

V. Optimierung von Separationsbedingungen

Die Merkmale von für das vorliegende Verfahren zweckmäßigen Polymeren für die Einstellung des elektroosmotischen Flusses und das Molekularsieben in der Kapillarelektrophorese umfassen folgende:
1. eine Elektrolytlösung, die 0,05 bis 30 Gew.-% einer nicht-vernetzten, hydrophilen Polymer- oder Copolymerlösung enthält, die wenigstens eine Polymer- oder Copolymerspezies enthält;
2. wobei die Polymer- oder Copolymerspezies ein Molekulargewicht zwischen 20 und 5.000 kD hat; und
3. wobei die Polymer- oder Copolymerspezies eine prozentuale Ladung zwischen 0,01 und 1,0% hat, wie von der molaren Prozentzahl geladener Monomer- Teileinheiten zu den gesamten Polymer-Teileinheiten gemessen, wobei die Ladung der geladenen Monomer- Teileinheiten entgegengesetzt zur Wandladung bei einem ausgewählten pH-Wert der Elektrophorese ist.
Für jedes ausgewählte Polymer, Copolymer oder eine Mischung daraus kann der prozentuale Ladungswert opti miert werden, indem im wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben ein Bereich von prozentualen Ladungswerten ausgewählt wird, um den Wert zu finden, für den der elektroosmotische Fluß vorzugsweise auf weniger als 2 · 10&supmin;&sup5; gesenkt wird. Ein weiterer Test einer ausgewählten Polymer- oder Copolymerlösung ist die Separation einer Ziel-Biomolekülprobe. Das Gew.-% von Polymer/Copolymer in Lösung sollte so eingestellt werden, daß eine Separation der Bestandteile der ausgewählten Mischung von Biomolekülen erreicht wird (beispielsweise wie bei der oben beschriebenen Protein- oder DNA-Mischung gezeigt). Die Lösung sollte Bestandteile auf der Basis der Größe des Ziel-Biomoleküls auflösen.
Zusätzlich zur Verwendung von Polymeren oder Copolymeren mit spezifischen prozentualen Ladungen oder in Lösungen bei ausgewähltem Gew.-% können die Geschwindigkeiten der Fragmentmigration selektiv eingestellt werden durch:
1. Änderung der elektrischen Feldstärke. Migrationszeiten und bis zu einem gewissen Grad die Auflösung können durch Durchführung der Separation bei ca. 100 bis 400 V/cm eingestellt werden.
2. Änderung des pH-Werts der Lösung. Biomoleküle, insbesondere Proteine, können unterschiedliche Nettoladungen bei unterschiedlichen pH-Werten annehmen. Durch Einstellen des pH-Werts der Polymerlösung zwischen ca. 4 und 10 kann die relative Migrationsgeschwindigkeit verändert werden.
3. Temperaturänderung. Migrationszeiten und Auflösung können durch Durchführung der Separationen bei Tem peraturen von ca. 10 bis 60ºC geändert werden. Eine niedrigere Temperatur verbessert allgemein die Auflösung.
4. Änderung der Pufferartkonzentration oder Ionenstärke. Für jede bestimmte in der Polymer-/Copolymerlösung verwendete Pufferspezies gibt es einen optimalen Konzentrationsbereich für maximale Auflösung. Eine Bandenverbreiterung kann bei einer zu geringen Konzentration (geringen Ionenstärke) auftreten, oder eine Bandenverbreiterung kann bei einer zu hohen Ionenstärke auftreten. Insbesondere verbessern zwitterionische Puffer die Auflösung und verringern Variationen der Hintergrund-UV-Extinktion.
5. Zugabe von oberflächenaktiven Mitteln zum Puffer. Durch den Einbau der oberflächenaktiven Mittel Kohlenwasserstoff oder Fluorchlorkohlenwasserstoff mit neutralen, positiv oder negativ geladenen Kopfgruppen wird die Migration von Proteinen selektiv verändert. Insbesondere führt die Anwesenheit von Natriumdodecylsulfat (SDS) im Puffer zu Migrationen, die proportional zum Proteinmolekulargewicht sind.
6. Zugabe von Denaturierungsmitteln zum Puffer. Veränderte Migrationen von einzel- oder doppelsträngiger DNA und Verbesserung der Auflösung kann durch Zugabe von Denaturierungsmitteln wie Harnstoff oder Formamid zum Elektrolytpuffer bewirkt werden.
Faßt man die obige Aufzählung zusammen, bietet die vorliegende Erfindung eine Vielzahl von Parametern, die selektiv variiert werden können, um die Biomolekülfraktionierung zu verbessern. Die Migrationsgeschwindigkei ten der Biomoleküle können selektiv verändert werden, indem die Art des Polymers und seine Konzentration, der pH-Wert der Lösung, die Separationstemperatur und Feldstärke sowie Pufferzusammensetzung geändert werden. Für Nucleinsäuren können die Migrationsgeschwindigkeiten selektiv geändert werden, indem die Fragmente mit einem nicht-ionischen interkalierenden Mittel wie Ethidiumbromid oder Acridinorange komplexiert werden, und die Auflösung kann durch Zugabe von Denaturierungsmitteln wie Harnstoff und Formamid verbessert werden.

VI. Separation im pulsierenden Feld

Die oben beschriebenen elektrophoretischen Verfahren wurden unter einem Gleichspannungsfeld durchgeführt. In Übereinstimmung mit einem anderen Aspekt der Erfindung kann die Fraktionierung von Biomolekülen, insbesondere von Nucleinsäurefragmenten, verbessert werden, indem die elektrophoretische Separation unter einem pulsierenden Spannungsfeld durchgeführt wird, bei einer Frequenz, die wirksam ist, um die Separation innerhalb eines bestimmten Fragmentgrößenbereichs selektiv zu verbessern.
Theoretisch kann das Migrationsgeschwindigkeitsverhalten von Nucleinsäurefragmenten in einem pulsierenden Feld durch zwei mit der Größe zusammenhängende Wirkungen beeinflußt werden. Die erste Wirkung ist eine Resonanzwirkung, welche die Rotationsarten und die Frequenz des elektrischen Felds umfaßt. Tabelle 1 zeigt die Rotations- und Dehnungsresonanzfrequenzen, die für DNA- Doppelstrangfragmente mit 100, 1.000 und 10.000 Basenpaaren berechnet wurde. Die Rotationsresonanzfrequenzen in Hz wurden auf der Basis eines gestreckten Rotations ellipsoidmodells des Doppelstrangmoleküls berechnet (Mathew, et al.; Cantor, et al.) Tabelle 1
Eine starke Rotationsresonanzwirkung besagt, daß die Migrationsgeschwindigkeiten von Fragmenten in Resonanz mit dem elektrischen Feld vorzugsweise in bezug auf die Migrationsgeschwindigkeit in einem zeitinvarianten Feld verlangsamt werden. Dies ist so, weil von einem Molekül in Rotationsresonanz mit dem elektrischen Feld erwartet wird, daß es im Durchschnitt am ungünstigsten für die Migration in Richtung des Feldes ausgerichtet ist, wenn das elektrische Feld am größten ist. Von größeren Molekülen wird wegen ihrer langsameren Rotationszeiten erwartet, daß sie bei jedem Spannungsimpulszyklus weniger aus ihren feldorientierten Positionen abgelenkt werden; kleinere Moleküle mit ihren schnelleren Reaktionszeiten würden sich schneller wieder in Richtung des Feldes ausrichten. Wenn also Rotationsresonanzwirkungen vorherrschen, sollte es möglich sein, die Migration resonanter Spezies während der Elektrophorese relativ zur Migrationsgeschwindigkeit nicht resonanter Spezies zu verlangsamen.
Die zweite größenabhängige Wirkung, die in einem pulsierenden Feld zu erwarten ist, ist eine Trägheitswirkung aufgrund der Beschleunigung und Bremsung von Fragmenten in einem Fluid mit jedem Spannungsimpuls. Diese Wirkung wird in Fig. 9 veranschaulicht, die hypothetische Geschwindigkeitskurven für relativ kleine (gestrichelte Linien) und relativ große (Strichpunktlinien) Nucleinsäurefragmente in Beziehung zu einer angelegten Rechteckwellenspannung mit einer Impulsbreite und einer maximalen Spannung vmax zeigt. Die maximale Geschwindigkeit, welche die Fragmente erreichen sollten, ist die End- oder Stationärzustandsgeschwindigkeit der Fragmente in einem konstanten Spannungsfeld mit dem Potential vmax, d. h. 100% der Migrationsgeschwindigkeit in einem konstanten Feld.
Wie aus der Figur zu ersehen ist, wird von kleineren Fragmenten erwartet, daß sie nach dem Anlegen des Spannungsimpulses die Endgeschwindigkeit schneller erreichen als große, aber mit im wesentlichen derselben Geschwindigkeit wieder auf Nullspannung abbremsen, wenn der Spannungsimpuls endet. Da der von jedem Fragment während eines Spannungsimpulses zurückgelegte Weg genau das Integral der Geschwindigkeitskurve ist, wird erwartet, daß die Migrationsgeschwindigkeiten größerer Fragmente vorzugsweise in einem Wechselspannungsfeld abnehmen. Außerdem gilt: Je höher die Impulsfrequenz und je kürzer die Impulsdauer, desto kleiner ist die Fragmentgröße, die vorzugsweise in ihrer Migrationsgeschwindigkeit verzögert werden kann, da die Auswirkung von jeder Verzögerung in der Geschwindigkeitskurve bei kurzen Impulsen hervorgehoben wird.
In einigen Mischungen von Biomolekülen, insbesondere bei Nucleinsäurefragmenten, wo die Fraktionierung von Spezies in unterschiedlichen Größenbereichen erwünscht ist, können die oben besprochenen Variablen - einschließlich pH-Wert der Lösung, Polymerart und -konzentration, Feldfrequenz und Denaturierungsmittel - selektiv während des elektrophoretischen Durchgangs variiert werden, um die Fragmentauflösung zu verbessern. Beispielsweise kann, eine elektrophoretische Separation unter einem konstanten Feld oder mit zunächst niedriger Frequenz durchgeführt werden, um größere Fragmente aufzulösen, und dann auf eine höhere Frequenz ungeschaltet werden, um die Auflösung von kleineren Fragmenten zu verbessern. Als weiteres Beispiel kann der pH-Wert oder die Polymerkonzentration der Polymerlösung während eines Elektrophoresedurchgangs kontinuierlich variiert werden, wobei eine Standard-Zweikammermischvorrichtung verwendet wird, um einen kontinuierlichen Gradienten der Lösung herzustellen, die in das Kapillarröhrchen gezogen wird.

VII. Verwendbarkeit

Das erfindungsgemäße Fraktionierungsverfahren ist in einer beliebigen einer Vielfalt von oben erwähnten Anwendungen verwendbar, die eine Größenfraktionierung von Biomolekülen erfordern. Diese Anwendungen umfassen elektrophoretische Separationen von Proteinen, Polypeptiden, Peptiden sowie einzel- und doppelsträngigen Nucleinsäuren, einschließlich Restriktionsanalyse der DNA.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf die DNA- Sequenzierungsanalyse angewandt werden, wobei die DNA- Sequenzierungsreaktionen mit Fluoreszenzmarkern (Drossman) markierte Nucleinsäuren enthalten, und die Produkte dieser Reaktionen werden durch das erfindungsgemäße Verfahren nach ihrer Größe fraktioniert. Nucleinsäuremoleküle können unter entweder nicht-denaturierenden oder denaturierenden Bedingungen nach ihrer Größe fraktioniert werden. Typische Denaturierungsbedingungen umfassen die Zugabe von Harnstoff oder Formamid zu den Nucleinsäuren vor der Separation und/oder zu der Elektrolytlösung.
Außerdem kann das erfindungsgemäße Verfahren in einer einzelsträngigen Konformations-Polymorphismusanalyse der DNA verwendet werden (Makino). Polymerasekettenreaktionsverfahren (Mullis; Mullis, et al.; Perkin- Elmer Cetus Corp.) können auch auf eine Einzelstrangkonformations-Polymorphismusanalyse angewandt werden. Diese Analyse basiert auf dem Prinzip, daß einzelsträngige DNA-Moleküle Konformationen entwickeln, die sequenzspezifisch sind und durch Interaktion zwischen den Strängen stabilisiert werden: Üblicherweise wird eine solche Analyse unter nicht-denaturierenden Bedingungen durchgeführt, d. h. Bedingungen, die Konformationsmerkmale der einzelsträngigen Moleküle bewahren. Sogar eine einzige Basenveränderung zwischen einzelsträngigen Molekülen kann die Konformation ausreichend ändern, um eine relative Mobilitätsdifferenz zwischen den Molekülen zu erfassen. Die Bedingungen, unter denen die Größenfraktionierung von einzelsträngigen DNA-Molekülen druchgeführt wird, kann variiert werden, um die Mobilität der einzelsträngigen Moleküle zu beeinflussen. Beispielsweise können die folgenden Parameter variiert werden: prozentualer Polymeranteil, Art des Polymers, Glycerol (üblicherweise in einer Konzentration von ca. 5% bis 20% Gew./Vol. vorhanden) sowie Temperatur.
Das Fraktionierungsverfahren der vorliegenden Erfindung ist auch zweckmäßig für die Analyse von Produkten der Polymerasekettenraktionsverstärkung. Beispielsweise können Verstärkungsreaktionen mit einer Probenmatrize und ausgewählten Primern durchgeführt werden. Die Produkte werden nach ihrer Größe fraktioniert, um zu bestimmen, ob das Zielverstärkungsprodukt, das eine erwartete Größe hat, in der Reaktionsmischung vorhanden ist. Die Konzentration von Verstärkungsreaktionsprodukten kann ebenfalls bestimmt werden.
Das erfindungsgemäße Fraktionierungsverfahren kann auch für die Analyse von Nucleinsäure-Protein-Komplexen verwendet werden. Beispielsweise kann das Verfahren in einem Versuchsformat der Migrationsverschiebung verwendet werden, wo die Fähigkeit eines Probenproteins, ein Polynucleotid zu binden, das eine ausgewählte Nucleotidsequenz enthält, durch Vergleich der Mobilität des Polynucleotids in Anwesenheit und Abwesenheit des Probenproteins bewertet wird. Die Bindung des Polynucleotids am Probenprotein kann bestätigt werden, wenn sich die Mobilität des resultierenden Polynucleotid-Protein- Komplexes von jener des Polynucleotids alleine unterscheidet. Das Verfahren kann auch verwendet werden, um die Bindungsstöchiometrie zwischen dem Probenprotein und dem Polynucleotid zu bestimmen, indem das Verhältnis von Probenprotein zu Polynucleotid variiert wird. Günstigerweise enthält das Polynucleotid eine kennzeichnende Reportermarkierung, wie eine fluoreszierende Marke, durch die polynucleotidhaltige Peaks leicht identifiziert und quantifiziert werden können.
Die Anwendungen der Analyse von Restriktionsaufschlußprodukten umfassen folgende: Analyse von Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen zum genetischen Screening, Bestätigung der Vektorkonstruktion, Identifikation der spezifischen Nucleinsäurefragmente auf der Basis von Größe und/oder Hybridisierung an Nucleinsäureproben sowie Fraktionierung einzelsträngiger Fragmente zur chemischen oder enzymatischen Sequenzierung.
Folgende Anwendungen veranschaulichen, wie das Verfahren für die Restriktionsfragmentanalyse verwendet werden kann. Bei dem Restriktionsanalysebeispiel soll ein Restriktionsfragment, das eine Zielsequenz von Interesse enthält, aus einer Mischung genomischer Fragemente identifiziert werden. Nach dem Aufschließen der genomischen Mischung mit einem oder mehreren ausgewählten Restriktionsenzymen wird die Fragmentmischung unter Hybridisierungsbedingungen mit einer reportermarkierten Probe verbunden, die mit der Zielsequenz hybridisieren kann. Die Probe enthält vorzugsweise die komplementäre Zielsequenz und eine kovalent gebundene Probe, wie eine fluoreszierende Probe, die leicht von einem Fluoreszenzprobendetektor erfaßt werden kann. Die Probe kann mit den Fragmenten hybridisiert werden, beispielsweise durch Standard-Denaturierungs/Renaturierungs-Bedingungen mit einzelsträngigen Spezies, oder durch von RecA katalysierte Triplex-Bildung an die Fragmente in Duplex-Form gebunden werden.
Nach dem Binden der Probe an die Fragmente wird die Probe gemäß dem vorliegenden Verfahren fraktioniert. Der Detektor wird vorzugsweise in einem Doppelwellenlängenmodus betrieben, in dem UV-Absorption und Fluo reszenzemissionserfassung gleichzeitig durchgeführt werden.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden Proteine, Polypeptide und Peptide, entweder in einem denaturierten Zustand, nativen Zustand oder chemisch modifiziert, gemäß ihrer Größe oder ihrem Molekulargewicht durch Elektrophorese in einem Röhrchen, das eine Polymer- und/oder Copolymer-Elektrolytlösung enthält, separiert. Wenn diese Lösung für die Separation durch Kapillarelektrophorese eingesetzt wird, erhält man sehr schnelle und hochauflösende Separationen nach Molekulargewicht von mit SDS (Natriumdodecylsulfat) denaturierten Proteinen (s. Fig. 6 und 7). Durch Korrelation relativer Migrationszeiten mit Molekulargewichten von Standardproteinen kann das Molekulargewicht unbekannter Proteine geschätzt werden.
Zusätzlich zur Separation von Proteinen und Nucleinsäuren kann das erfindungsgemäße Verfahren auch auf die Größenfraktionierung von Nucleinsäure-Protein-Komplexen wie Ribonucleinproteinpartikeln, an ihre verwandten DNAs gebundenen DNA-Bindungsproteinen und an ihre verwandten RNA-Bindungsstellen gebundenen RNA-Bindungsproteinen (wie die TAT- und REV-Proteine von HIV-1) angewandt werden.
Hohe Masseempfindlichkeit und reproduzierbare Migrationszeiten werden durch die Verwendung von Polymeren oder Copolymeren erreicht, die eine prozentuale Ladung im Bereich von ca. 0,01 bis 1,0% haben, wobei die Ladung auf den Polymeren oder Copolymeren entgegengesetzt zur Ladung auf der Innenoberfläche des Kapillarröhrchens ist. Diese Kombination dient dazu, den elektroos motischen Fluß wesentlich auf unter ca. 2 · 10&supmin;&sup5;, cm²/sec-V zu verringern und die Adsorption von Proteinen während der Elektrophorese zu verhindern. Nicht alle Anwendungen erfordern die Verringerung des elektroosmotischen Flusses auf unter 2 · 10&supmin;&sup5; cm²/sec-V: Eine wesentliche Verringerung des elektroosmotischen Flusses erfolgt bei ca. 8 · 10&supmin;&sup5; cm²/sec-V. Die für die Separation verwendete Polymerlösung wird unter Verwendung gemäßigter Drücke, die in konventionellen Kapillarelektrophoresegeräten verwendet werden, in das Kapillarröhrchen eingeführt.
Nach der Separation einer biomolekülhaltigen Probe wird die Kapillare vor der Analyse der nächsten Probe mit frischer Polymerlösung gespült. Dieser Schritt verhindert bei der Bearbeitung sequentieller Proben die Möglichkeit der Kontamination oder von "Geisterpeaks" aus vorherigen Proben. Das Spülen des Systems mit frischer Polymerlösung wird durch die Begrenzung der Viskosität der Polymerlösung ermöglicht.
Das in der Separationslösung verwendete Polymer oder Copolymer hat ein Molekulargewicht im Bereich von 20 bis 5.000 kD. Das Molekulargewicht dieses Polymers liegt üblicherweise über einem Schwellenwert für Verhakung, wodurch die elektrophoretische Migration der ausgewählten Biomoleküle verlangsamt wird, die proportional zum Molekulargewicht der Biomoleküle ist (Grossman, US-Patent Nr. 5,126,021 vom 30.6.1992). Das Molekulargewicht des Polymers oder Copolymers in Lösung liegt unter einem Wert, der zu einer Lösung von hoher Viskosität führt, die nicht mit den in konventionellen Elektrophoresegeräten verwendeten Drücken in eine enge Ka pillare (Innendurchmesser weniger als 200 um) eingeführt werden kann.
Die Polymer- oder Copolymerelektrolytlösung kann auch ein organisches oder anorganisches Ion enthalten, das zur Steuerung des pH-Werts und für die optische Stabilität verwendet wird, einschließlich folgender: organische Säuren (wie Zitronensäure, Essigsäure, Ameisensäure) oder Zwitterionen (wie TES (N-tris[Hydroxymethyl]- 2-aminoethansulfonsäure) (Sigma), BICINE (N,N-bis[hydroxyethyl] glycin) (Sigma), ACES (2- [2-Amino-2-oxoethyl)-amino]ethansulfonsäure) (Sigma), Glycylglycin (Sigma); anorganische Säuren (wie Phosphorsäure); sowie organische Basen (wie "TRIS" (Sigma)).
Bei der Durchführung denaturierender Separationen kann der Polymer- oder Copolymerelektrolytlösung auch ein anionisches oberflächenaktives Mittel zugegeben werden. Das anionische oberflächenaktive Mittel ist üblicherweise ein Kohlenwasserstoff oder Fluorcarbonsulfat (wie Natriumdodecylsulfat (SDS)), Sulfonsäure (wie Natriumdecansulfonsäure) oder eine Carboxylsäure (wie Laurinsäure). Beispielsweise kann eine mit SDS denaturierte Proteinprobe, mit Wasser verdünnt, elektrokinetisch in die Kapillare eingespritzt werden. Die Separationen sind üblicherweise nach weniger als 15 Minuten abgeschlossen, wenn eine Separationslänge von ca. 30 cm und eine Feldstärke von 200 V/cm verwendet wird.
Beim Einsatz der UV-Erfassung auf der Säule bei Wellenlängen unter 240 nm üben die zwitterionischen Puffer wie ACES oder TES (Sigma) in einer Separationslösung, die Polyacrylamid und SDS bei einem pH-Wert zwischen 6 und 8 enthält, eine Stabilisierungswirkung auf die Hintergrund-UV-Extinktion aus. Diese Stabilisierung ermöglicht die wiederholbare und empfindliche UV- Erfassung bei 200 nm ohne übermäßiges Gefälle der Basislinie.
Die Verwendung einer Polymer- oder Copolymerlösung wie oben beschrieben für die Kapillarelektrophoreseseparation von Proteinen oder Nucleinsäuren nach Molekulargewicht ist ein Vorteil gegenüber konventionellen PAGE- Plattengelseparationen durch (1) eine kürzere Analysezeit, (2) eine vollständig automatisierte Separation und Erfassung, (3) eine quantitative Analyse, (4) eine zerstörungsfreie Analyse extrem kleiner Mengen von Proteinen oder Nucleinsäuren (Picogramm), sowie (5) eine benutzerfreundliche Matrix (d. h., eine vorgetestete Polymerlösung und keine herzustellenden festen Gele).
In einer Festgelmatrix sind Geisterpeaks schwer auszuschalten. Außerdem interagiert in festen Gelen irreversibel gebundenes Material in der Matrix leicht mit den Biomolekülen in nachfolgenden Separationen, wodurch die Auflösung verringert wird. Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß die Separationsmatrix, d. h. die Polymer-/Copolymerlösung, nach jedem Durchgang ausgewechselt werden kann. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß bei Unwirksamkeit einer elektrokinetischen Einspritzung beim Einführen der Probenmasse in die Kapillare eine hydrodynamische Einspritzung durch Unter- oder Überdruck verwendet werden kann, um eine Probenmasse in die Kapillare zu bewegen.
Die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten, eine niedrige Ladung enthaltenden Polymere und Copolymere wirken als Beschichtungen der geladenen Innenwandober fläche des Kapillarröhrchens und als Molekularsiebmatrizes für Biomoleküle.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, sollen sie jedoch keinesfalls eingrenzen.

Beispiel 1

Synthese von geladenen Polymeren oder Copolymeren

A. Copolymer aus Acrylamid und TEMED

Die Zugabe variierender Mengen von TEMED (N,N,N',N'- Tetramethylethylendiamin, (Aldrich Chemical Co.) zu der durch Ammoniumpersulfat (Aldrich Chemical Co.) initiierten Polymerisation von Acrylamid (Aldrich Chemical Co.) führt zur Produktion von Polyacrylamiden mit variierenden Molekulargewichten (s. Viskositätsdaten, Fig. 4) und prozentualen Ladungen (s. EOF-Daten, Fig. 4). Das folgende Beispiel veranschaulicht die Synthese von Polyacrylamid, in dem der molare prozentuale Anteil von TEMED zu Acrylamid 0,24% beträgt. Der molare prozentuale Anteil von TEMED kann erhöht oder verringert werden, indem die Konzentration von TEMED in der Lösung, die der Polymerisationsmischung in diesem Beispiel zugegeben wird, erhöht oder verringert wird.
Zu 500 ml entionisiertem Wasser in einem 2 l-Kolben werden 100 g Acrylamid gegeben. Diese Lösung wird 15 Minuten lang bei 50ºC bei kontanter aber leichter Bläschenbildung durch Helium gerührt. Es werden 400 ml Methanol (Burdick and Jackson, HPLC-Qualität) zugegeben und weitere 15 Minuten lang gerührt, wobei ein wassergekühlter Kondensator am Reaktionskolben befestigt ist. Es werden 10 ml 10% (Vol./Vol.) TEMED in Wasser zugege ben und 2 Minuten lang gerührt. Es werden 10 ml 10% (Gew./Vol.) Ammoniumpersulfat zugegeben, und die Polymerisation wird 2 Stunden lang unter Rühren fortgeführt.
Die klare, viskose Flüssigreaktionsmischung wird in einen 3 l-Polypropylenbecher gegossen. Unter konstantem manuellen Rühren werden langsam 500 ml Methanol zugegeben. Es wird gewartet, bis sich die resultierende Ausfällung als fester, weißer Klumpen aus Polyacrylamid am Boden des Bechers abgesetzt hat. Der Überstand wird dekantiert und verworfen. Dem Becher werden 500 ml Methanol zugegeben, die Klumpen werden manuell mit einem Glasstab zerdrückt, und Methanol wird um die Klumpen geschwenkt, um Restmaterial in den Überstand zu waschen, der wolkig erscheinen kann. Es wird gewartet, bis der feste Klumpen sich absetzt, der Überstand dekantiert und verworfen. Dieses Waschverfahren mit Methanol wird dreimal oder öfter wiederholt, bis der Überstand relativ klar erscheint.
Der feste Klumen wird in Stücke von ca. 1 cm · 2 cm oder kleiner gebrochen oder geschnitten, und diese Stücke werden in Polypropylenschalen gegeben. Die Schalen mit den separierten Stücken werden in einen Vakuumtrockenschrank (VWR 1430 oder Gleichwertiges) gestellt und 24 Stunden lang bei 50-60ºC bei ca. 30" Hg Vakuum (erzeugt durch eine Trivac D2A Vakuumpumpe oder Gleichwertiges, verbunden mit einem gekühlten Dampfabscheider) getrocknet. Die getrockneten Stücke aus Polyacrylamid werden in einer Mikromühle (Bel-Art, VWR Scientific) zu körnigem Pulver gemahlen und trocken in kleinen Fläschchen aufbewahrt, bis sie zur Herstellung einer Polymerlösung verwendet werden.

B. Copolymer aus Acrylamid und DADMAC

Die Zugabe variierender Mengen von DADMAC (Diallyldimethylammoniumchlorid, Aldrich Chemical Co.) zu der durch Ammoniumpersulfat initiierten Polymerisation von Acrylamid führt zur Produktion von Polyacrylamiden mit variierenden Molekulargewichten (s. Viskositätsdaten, Fig. 5) und prozentualen Ladungen (s. EOF-Daten, Fig. 5). Das folgende Beispiel zeigt, wie ein Polyacrylamid mit einem molaren prozentualen Anteil von 0,05 DADMAC zu Acrylamid hergestellt wird. Der molare prozentuale Anteil von DADMAC kann erhöht oder verringert werden, indem die Konzentration von DADMAC in der in diesem Beispiel verwendeten Lösung erhöht oder verringert wird.
Die Synthese und Wiedergewinnung von Polyacrylamid wird wie im obigen Beispiel A. durchgeführt, mit dem Unterschied, daß anstelle von TEMED 10 ml durch 1,14 (Gew./Vol.) DADMAC in Wasser ersetzt wird.

C. Umwandlung von Amidgruppen in Polyacrylamid zu Aminen

Die Umwandlung eines kleinen prozentualen Anteils von Amidgruppen in Polyacrylamid in die entsprechende geladene Amingruppe wird unter Verwendung der bekannten Hofmann-Degradation (Jen) durchgeführt. Eine Lösung aus 40 Teilen 5,25%igem Natriumhypochlorit und 2, 3 Teilen Natriumhydroxid wird über 20 Minuten 355 Teilen einer 20%igen Lösung aus Polyacrylamid in Wasser zugegeben. Das Polyacrylamid wird wie oben unter A. beschrieben, jedoch ohne Zugabe von TEMED hergestellt. Bei einer Temperatur von 30 bis 37ºC wird die Reaktion 30 Minuten lang aufrechterhalten. Die Reaktionslösung wird mit HCL auf einen pH-Wert von 6,9 neutralisiert. Das Polyacrylamid wird durch Ausfällung wie oben unter A. beschrieben wiedergewonnen. Die prozentuale Ladung auf dem Polyacrylamid wird durch Verlängerung oder Verkürzung der gesamten Reaktionszeit erhöht oder verringert.

D. Aufpfropfen von Copolymer aus Acrylamid und DADMAC auf Dextran

Acrylamidcopolymer wird mit einem ähnlichen Verfahren wie bei (McCormick) auf eine Dextran-Hauptkette aufgepfropft. Eine wäßrige Lösung aus 1,25 g Dextran, 8, 165 g Acrylamid und 0,66 g DADMAC wird unter Helium bei 25ºC 30 Minuten lang gerührt. 10 ml 0,05 N Salpetersäurelösung mit 0,0274 g Cer(IV)-ammoniumnitrat werden zugegeben, um die Polymerisation zu starten. Nach 3 Stunden wird das Pfropfcopolymer durch Ausfällung wie unter A. beschrieben wiedergewonnen. Die prozentuale Ladung wird gegenüber diesem Beispiel (d. h. 0,05%) erhöht oder verringert, indem die Menge an der Reaktionsmischung zugegebenem DADMAC erhöht oder verringert wird.

E. Polymer- oder Copolymerlösungen

Das Polymer oder Copolymer wird der gewünschten Pufferlösung (Gew./Vol.) zugegeben. Die Lösung wird dann durch leichte Rotation über ca. 2 Stunden gemischt, woraufhin die Lösung durch einen 0,45 um feinen Filter gefiltert wird. Die Lösung wird zum Entgasen bei 30ºC und 29" Hg 15 Minuten lang in einen Vakuumtrockenschrank gestellt. Die Lösung wird dann in die Behälter des Kapillarelektrophoresegeräts auf Detektorseite und auf Pufferseite eingeführt.

Beispiel 2

Die Auswirkung von geladenen Polymeren oder Copolymeren auf spezifische Viskosität und elektroosmotischen Fluß

Die Kapillarelektrophorese wurde auf einem ABI Model 270 Capillary Electrophoresis System durchgeführt. Das System umfaßt eine eingebaute Hochspannungs-Gleichstromzufuhr, in der Spannungseinstellungen bis zu 30 kV möglich sind. Das im System verwendete Kapillarröhrchen ist ein 50 cm langes Quarzkapillarröhrchen mit einem Innendurchmesser von 55 um und einem Außendurchmesser von 350 um von Polymicro Technologies (Phoenix, A2).
Der zur Anzeige der Geschwindigkeit des elektroosmotischen Flusses (Veo) verwendete Marker war die neutrale Verbindung, Mesityloxid, die eine UV-Extinktion bei 200 mm hat. Das elektrophoretische System wurde während des Durchgangs bei einer Spannungseinstellung von ca. +10 kV (ca. +200 V/cm) bei einer Temperatur von 30ºC betrieben. Die UV-Erfassung erfolgte mit einem eingebauten, für die Kapillarröhrchenerfassung ausgelegten 783 UV-Detektor. Das Detektor-Ausgangssignal wurde auf einem Spectrophysics Sp4400 Integrator/Kurvenschreiber integriert und graphisch dargestellt.
Eine frische Kapillaroberfläche wurde routinemäßig durch Spülen der Kapillare nacheinander mit 5-10 Kapillarenvolumina von 1,0 N NaOH, 3-5 Volumina 0,1 N NaOH und schließlich 3-5 Volumina Polymerlösung hergestellt. Die Lösungen wurden mittels Vakuum unter Verwendung eines eingebauten geregelten Vakuumsystems am anodischen Ende durch die Kapillare gezogen.
Allgemein werden nach dem Äquilibrieren mit der gewählten Polymer-/Copolymerelektrolytlösung 2-5 nl neutraler Marker (Mesityloxid) mittels eines am Detektorende angelegten Vakuums in die Kapillare gespritzt; der Marker wird verwendet, um den elektroosmotischen Fluß zu messen. Das Feld wird angelegt (+200 V/cm), und die Zeit (t, Sekunden), die der Marker für die Migration zum Detektor (30 cm) benötigt, wird aufgezeichnet.
Die Mobilität des elektroosmotischen Flusses (EOF) wird folgendermaßen berechnet:
Biomoleküle werden üblicherweise elektrokinetisch eingespritzt. Beispielsweise wird eine Probe der Biomoleküle mit ca. 0,01 mg/ml bei -5 kV über 10 Sekunden elektrokinetisch eingespritzt, woraufhin der Referenzmarker bei -5 kV über 2 Sekunden elektrokinetisch eingespritzt wird. Eine geeignete Spannung wird dann angelegt, um den Durchgang abzuschließen, üblicherweise von ca. -10 kV bis zu ca. -20 kV je nach der jeweiligen Separation.

A. Copolymer aus Acrylamid und TEMED

Mischungen aus Acrylamid und Tetramethylethylendiamin (TEMED) wurden wie in Beispiel 1 beschrieben bei dem in Fig. 4 unten gezeigten prozentualen Anteil von TEMED zu Acrylamidmonomer ([AAm]) gebildet. Die Copolymerlösung wurde in einem Puffer gebildet, der aus 50 mM ACES, pH-Wert 7,0, und 0,2% SDS bestand. Dieser Puffer oder andere geeignete Elektrolytlösungen können für die Bildung der Copolymerelektrolytlösung verwendet werden. Die Konzentration von Polyacrylamid betrug 2 Gew.-%. Die Viskosität der Copolymerelektrolytlösung wurde mit einem Kapillarviskosimeter wie oben beschrieben bestimmt. Die Copolymerelektrolytlösung wurde wie oben beschrieben mittels Vakuum durch das Kapillarrörchen gezogen. 2 bis 5 nl neutraler Marker (Mesityloxid) wurden mittels eines an das kathodische Ende angelegten Vakuums in die Kapillare eingespritzt. Eine Spannung von 200 V/cm wurde angelegt. Der elektroosmotische Fluß (EOF) wurde als die Mobilität des Markers, berechnet in cm²/sec-V, bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt. Wie aus Fig. 4 zu ersehen ist, wird bei Werten von TEMED/[AAm] im Bereich von ca. 0,05% bis 0,5% die EOF-Mobilität auf weniger als 2 · 10&supmin;&sup5; cm²/sec-V verringert: Ein EOF- Mobilitätswert von ca. 2 · 10&supmin;&sup5; cm²/sec-V zeigt einen sehr niedrigen Pegel von elektroosmotischem Fluß an.

B. Copolymer aus Acrylamid und DADMAC

Mischungen aus Acrylamid und Diallyldimethylammoniumchlorid (DADMAC) wurden bei dem in Fig. 5 unten gezeigten prozentualen Anteil von DADMAC zu Acrylamidmonomer ([AAm]) wie in Beispiel 1 beschrieben zur Reaktion gebracht. Die Copolymerlösung wurde in einem Puffer gebildet, der aus 50 mM ACES, pH-Wert 7,0, und 0,2% SDS bestand. Dieser Puffer oder andere geeignete Elektrolytlösungen können für die Bildung der Copolymerelektrolytlösung verwendet werden. Die Konzentration von Acrylamidcopolymer betrug 2%. Die Viskosität der Copo lymerelektrolytlösung wurde mit einem Kapillarviskosimeter wie oben beschrieben bestimmt. Die Copolymerelektrolytlösung wurde mittels Vakuum wie oben beschrieben durch das Kapillarröhrchen gezogen. 2 bis 5 nl neutraler Marker (Mesityloxid) wurden mittels eines an das kathodische Ende angelegten Vakuums in die Kapillare eingespritzt. Eine Spannung von +200 V/cm wurde angelegt. Der elektroosmotische Fluß (EOF) wurde als die Mobilität des neutralen Markers, berechnet in cm²/sec-V, bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt. Wie aus Fig. 5 ersichtlich ist, wird die EOF-Mobilität bei Werten von DADMAC/ [AAm] im Bereich von ca. 0,05% bis 0,26% auf weniger als 2 · 10&supmin;&sup5; cm²/sec-V verringert: Ein EOF- Mobilitätswert von ca. 2 · 10&supmin;&sup5; cm²/sec-V zeigt einen sehr niedrigen Pegel von elektroosmotischem Fluß an.

Beispiel 3

Separation von Probenpolypeptiden

A. Proteinseparation

Eine Mischung der folgenden Proteine wurde bei Sigma (St. Louis, MO) bezogen: α-Lactalbumin (14 kD), Sojatrypsinhemmer (20 kD), Eialbumin (45 kD), Rinderalbumin (66 kD) und β-Galactosidase (116 kD). Die Proteine in der Mischung waren mit SDS durch Standardverfahren (Ausubel, et al.) denaturiert. Kurz, das Protein wurde bei 1,0 mg/ml in 1% SDS/l% Mercaptoethanol in kochendem Wasser 15 Minuten lang erhitzt. Die Proteine wurden vor der Analyse mit Wasser auf 0,02 mg/ml verdünnt.
Mischungen aus Acrylamid und Diallyldimethylammoniumchlorid (DADMAC) wurden wie in Beispiel 1 beschrieben bei den in Fig. 6 und 7 gezeigten prozentualen Anteilen von DADMAC zu Acrylamidmonomer ([AAm]) hergestellt. Die Copolymerlösung wurde in einem Puffer hergestellt, der aus 50 mM ACES, pH-Wert 7,0, (Sigma) bestand, das 0,2% Natriumdodecylsulfat (SDS) enthielt. Die Konzentration des linearen Copolymers Polyacrylamid/DADMAC in Lösung betrug 2% (Gew./Vol.). Die Copolymerelektrolytlösung wurde mittels Vakuum wie oben beschrieben durch das Kapillarröhrchen gezogen, und das kathodische Ende der Kapillare wurde in die Probenmischung getaucht. Ca. 1-2 ng Protein wurden mittels einer Feldstärke von -100 V/cm über 10 Sekunden in die Kapillare eingespritzt. Während sich das Kapillarenende im Pufferbehälter befand, wurde eine Feldstärke von -200 V/cm angelegt. Die Separation wurde bei 30ºC durchgeführt und Proteine bei 200 nm erfaßt. Das Kapillarröhrchen hatte einen Innendurchmesser von 55 um und eine effektive Separationslänge von 28 cm.
Elektropherogramme, welche die Ergebnisse der Kapillarelektrophorese für die Separation der Bestandteile der Proteinmischung zeigen, durchgeführt mit DADMAC/[AAm], sind in Fig. 6 und 7 gezeigt.

B. Größenkalibrierung

Die oben beschriebene Proteinmischung wurde im wesentlichen wie oben beschrieben unter Verwendung von 0,24% TEMED/[AAm] bei einer Konzentration des linearen Copolymers Polyacrylamid/TEMED in Lösung von 3% (Gew./Vol.) separiert. Der Logarithmus des Molekulargewichts wurde gegen die Migration der Proteinstandards relativ zu a-Lactalbumin (die Migrationszeit von oc-Lactalbumin geteilt durch die Migrationszeit des jeweiligen Proteinpeaks) für jedes Protein in der Mischung graphisch dargestellt. Die resultierende Kalibrierungskurve ist in Fig. 10 gezeigt.

C. Reproduzierbarkeit

Die Reproduzierbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde durch wiederholte Probeneinspritzungen unter den obigen Bedingungen demonstriert, wobei die Kapillare 10 Minuten lang bei 20" Hg nach jedem Probendurchgang mit der Copolymerlösung gespült wurde. Alle Probenproteine wurden von Sigma bezogen. Die Konzentration des linearen Copolymers Polyacrylamid/TEMED in Lösung betrug 3% (Gew./Vol.). Die Konzentration von TEMED/[AAm] betrug 0,24%. 50 sequentielle Probendurchgänge wurden durchgeführt. Die Separationsergebnisse für die Durchgänge 1, 30 und 50 sind in Fig. 11 gezeigt.

D. Ferguson-Regressionsanalyse

Die relativen Migrationen von jedem der Proteine in der oben beschriebenen Proteinmischung wurden relativ zur Migration von X-Lactalbumin bei einer Anzahl prozentualer Copolymerkonzentrationen bestimmt. Das in dieser Analyse verwendete Copolymer war TEMED/[AAm] bei 0,24% über den Konzentrationsbereich des linearen Copolymers Acrylamid/TEMED in Lösung, wie in Fig. 15 gezeigt. Die Kapillarelektrophoresebedingungen waren wie oben beschrieben.

Beispiel 4

Separation von Proben-Nucleinsäuren

φX174 RF, aufgeschlossen mit HaeIII, wurde von Bethesda Research Laboratories ((BRL) Gaithersburg, MD) bezogen. Die HaeIII-Restriktionsaufschließung von φX174 RF ergab 11 doppelsträngige DNA-Fragmente im Größenbereich von 72 bis 1353 Basenpaaren. Die Probe wurde auf 0,06 mg/ml verdünnt. Acrylamid und TEMED wurden wie in Beispiel 1 beschrieben bei einem molaren prozentualen Anteil TEMED von 0,24 hergestellt. Die Copolymerlösung wurde in einem Puffer gebildet, der aus 125 mM TES (Sigma), pH- Wert 7,0, bestand. Die Konzentrationen des für die Nucleinsäureseparation verwendeten linearen Copolymers Polyacrylamid/TEMED sind in Fig. 12 gezeigt (1, 2 und 3%). Die Copolymerelektrolytlösung wurde wie oben beschrieben mittels Vakuum durch das Kapillarröhrchen gezogen, und das kathodische Ende der Kapillare wurde in die Probenmischung getaucht. Ca. 1-2 ng der DNA- Restriktionsaufschlußmischung wurden mittels einer Feldstärke von -100 V/cm 10 Sekunden lang in die Kapillare gespritzt. Während sich das Kapillarenende im Pufferbehälter befand, wurde eine Feldstärke von -200 V/cm angelegt. Die Separation wurde bei 30ºC durchgeführt und die DNA-Fragmente durch Extinktion bei 260 nm erfaßt. Das Kapillarröhrchen hatte einen Innendurchmesser von 55 um und eine effektive Separationslänge von 28 cm.
Ein Elektropherogramm, das die Ergebnisse der Kapillarelektrophorese für die Separation der Bestandteile der DNA-Fragmentmischung zeigt, durchgeführt mit TE- MED/[AAm], ist in Fig. 12 gezeigt.
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf bestimmte Verfahren und Ausführungen beschrieben wurde, können verschiedene Modifikationen und Änderungen durchgeführt werden, ohne den Geltungsbereich der Erfindung zu verlassen.

Claims

1. Ein Verfahren zum Separieren von Biomolekülen in einer Probe, aufweisend

Vorbereiten eines Kapillarröhrchens mit zwei Enden, wobei das Kapillarröhrchen (i) auf seiner Innenwandfläche geladene Gruppen aufweist, und (ii) mit einer Elektrolytlösung gefüllt ist, die 0,05 bis 30 Gew.-% einer nicht-vernetzten, hydrophilen Polymer- oder Copolymerlösung enthält, die wenigstens eine Polymer- oder Copolymerspezies enthält, die (a) ein Molekulargewicht zwischen 20 und 5.000 kilodalton und (b) eine prozentuale Ladung zwischen 0,01 und 1,0% hat, gemessen durch die molare Prozentzahl geladener Monomerteileinheiten zu den gesamten Polymerteileinheiten, wobei die Ladung der geladenen Monomerteileinheiten entgegengesetzt zur Wandladung bei einem ausgewählten Elektrophorese-pH-Wert ist,

Eintauchen der Enden des Röhrchens in anodische und kathodische Behälter, die eine Elektrolytlösung enthalten,

Einführen einer Probe, welche die zu separierenden Biomoleküle enthält, in ein Ende des Röhrchens, sowie

Anlegen eines elektrischen Felds mit einer Polarität, durch die diese Biomoleküle in der Probe fraktioniert werden können, zwischen den Behältern.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Polymere oder Copolymere aus folgender Gruppe ausgewählt werden: Polyacrylamide, Polyoxide, Polyether, Vinylpolymere, Cellulosepolymere, Acrylpolymere sowie natürliche Gummis und Polysaccharide, wobei die Polymere oder Copolymere so modifiziert wurden, daß sie eine bestimmte prozentuale Ladung enthalten.

3. Das Verfahren nach Anspruch 2, worin die Polymere oder Copolymere Polyacrylamide sind, die aus folgender Gruppe ausgewählt werden: Polyacrylamid, Poly(methacrylamid), Poly(N-methylacrylamid) sowie Poly(N,N-dimethylacrylamid).

4. Das Verfahren nach Anspruch 2, worin die Polymere oder Copolymere Polyoxide sind, die aus folgender Gruppe ausgewählt werden: Polyethylenoxid und Polypropylenoxid.

5. Das Verfahren nach Anspruch 2, worin die Polymere oder Copolymere Polyether sind und der Polyether ein Polyvinylmethylether ist.

6. Das Verfahren nach Anspruch 2, worin die Polymere oder Copolymere Vinylpolymere sind, die aus folgender Gruppe ausgewählt werden: Polyvinylpyrollydin, Polyvinylalkohol sowie Polyvinylacetat.

7. Das Verfahren nach Anspruch 2, worin die Polymere oder Copolymere natürliche Gummis oder Polysaccharide sind, die aus folgender Gruppe ausgewählt werden: Xanthene, Dextrane, Agar, Guar und Stärken.

8. Das Verfahren nach Anspruch 2, worin die Polymere oder Copolymere Cellulosepolymere sind, die aus folgender Gruppe ausgewählt werden: Methylcellulo se, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose sowie Hydroxypropyl-methylcellulose.

9. Das Verfahren nach Anspruch 2, worin die Polymere oder Copolymere Acrylpolymere sind, die aus folgender Gruppe ausgewählt werden: Polyhydroxyethylmethacrylat und Polyethylenglycolmonomethacrylat.

10. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die Polymer- oder Copolymerlösung ein Homopolymer enthält.

11. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die Polymer- oder Copolymermoleküle wenigstens eine geladene Gruppe enthalten, die aus folgender Gruppe ausgewählt wird: primäre Amine, sekundäre Amine, quartäre Amine, Carbonsäuren, Sulfonsäuren, Phosphorsäuren, Schwefelsäuren sowie Phosphonsäuren.

12. Das Verfahren nach Anspruch 11, worin die Polmyer- oder Copolymermoleküle eine positiv geladene Gruppe enthalten, die aus einer Verbindung abgeleitet wurde, die aus folgender Gruppe ausgewählt wird: Diallyldimethylammoniumsalz, Tetramethylethylendiamid, [3-(Methacryloamino)propyl]-trimethylammoniumsalz, 2,2'-Azobis(2-methylpropionamidin)salz sowie 2-Methylacryloxyethyl(trimethylammonium)salz.

13. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin das Polymer ein Copolymer aus Acrylamid und Diallyldimethylammoniumchlorid (DADMAC) ist und dieses Copolymer ein Molekulargewicht zwischen ca. 200 und 600 kilodalton hat und die Polymermoleküle 0,02 bis 0,4% des quartären Amins N,N-dimethyl-pyrrolidin pro Teileinheit Acrylamid enthalten.

14. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin das Polymer ein Copolymer aus Acrylamid und Tetramethylethylendiamin (TEMED) ist und dieses Copolymer ein Molekulargewicht zwischen ca. 100 und 500 kilodalton hat und die Polymermoleküle 0,05 bis 0,5% des tertiären Amins Tetramethylethylendiamin pro Teileinheit Acrylamid enthalten.

15. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin das Polymer ein Copolymer aus N,N-dimethylacrylamid und Tetramethylethylendiamin (TEMED) ist und dieses Copolymer ein Molekulargewicht zwischen ca. 200 und 800 kilodalton hat und die Polymermoleküle 0,03 bis 0,6% des tertiären Amins Tetramethylethylendiamin pro Teileinheit N,N-dimethylacrylamid enthalten.

16. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin das Polymer ein Copolymer aus Acrylamid und [3-(Methacryloylamino)-propyl]trimethylammoniumchlorid ist und dieses Copolymer ein Molekulargewicht zwischen ca. 200 und 600 kilodalton hat und die Polymermoleküle 0,01 bis 0,2% des quartären Amins N-[(Propyl)trimethylammoniumchlorid]-methyacrylamid pro Teileinheit Acrylamid enthalten.

17. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die Konzentration von Polymermolekülen, die eine der Wandladung entgegengesetzte Ladung aufweisen, ausreichend ist, um die Wandfläche nichtkovalent zu beschichten und den elektroosmotischen Fluß wesentlich zu steuern und auf weniger als ca. 2 · 10&supmin;&sup5; cm²/sec-V zu verringern.

18. Das Verfahren nach Anspruch 1, das außerdem die Bestimmung der Anwesenheit separierter Biomoleküle in dem Elektrophoresekapillarröhrchen umfaßt, indem elektrochemische, optische oder radioisotope Eigenschaften der Biomoleküle im Röhrchen gemessen werden.

19. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die Biomoleküle aus folgender Gruppe ausgewählt werden: Proteine, Polypeptide und Peptide.

20. Das Verfahren nach Anspruch 19, worin die Biomoleküle mit Natriumdodecylsulfat denaturiert wurden und Natriumdodecylsulfat in der Elektrolytlösung vorhanden ist.

21. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die Biomoleküle Nucleinsäurefragmente sind.

22. Das Verfahren nach Anspruch 21, worin die Nucleinsäurefragmente mit Harnstoff oder Formamid denaturiert sind und Harnstoff oder Formamid in der Elektrolytlösung vorhanden ist.

23. Das Verfahren nach Anspruch 21, worin die Fragmente doppelsträngige Nucleinsäuren sind und die differentielle Migration durch Zugabe eines Einlagerungsmittels zu den Fragmenten eingestellt wird, um vorzugsweise die Migrationsgeschwindigkeiten von Fragmenten mit geringerem Molekulargewicht durch die Polymerlösung zu erhöhen.

24. Das Verfahren nach Anspruch 21, zur Verwendung bei der Durchführung einer Restriktionsaufschlußanalyse einer DNA-Probe, das außerdem das Aufschließen der Probe mit einer oder mehreren ausgewählten Restriktionsendonucleasen aufweist.

25. Das Verfahren nach Anspruch 21, worin die Nucleinsäurefragmente die Produkte von DNA-Sequenzierungsreaktionen sind und worin die DNA-Sequenzierungsreaktionen mit Fluoreszenzmarken markierte Nucleinsäuren enthalten.

26. Das Verfahren nach Anspruch 21, worin die Biomoleküle einzelsträngige DNA sind und die relative Migration der Biomoleküle von Konformationspolymorphismen zwischen den Biomolekülen abhängig ist.

27. Das Verfahren nach Anspruch 21, worin die Biomoleküle DNA-Moleküle sind, welche die Verstärkungsprodukte von Polymerasekettenreaktionen sind.

28. Das Verfahren nach Anspruch 21, worin die Biomoleküle Nucleinsäure-Protein-Komplexe sind.

29. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die Biomoleküle aus folgender Gruppe ausgewählt werden: lineare, verzweigte, native sowie chemisch modifizierte Oligosaccharide.

30. Ein gefülltes Kapillarröhrchen zur Verwendung in der Kapillarelektrophorese, aufweisend ein Kapillarröhrchen mit geladenen Gruppen auf seiner Innenwandfläche, gefüllt mit einer Elektrolytlösung, die 0,05 bis 30 Gew.-% einer nicht-vernetzten, hydrophilen Polymer- oder Copolymerlösung enthält, die wenigstens eine Polymer- oder Copolymerspezies ent hält, die (a) ein Molekulargewicht zwischen 20 und 5. 000 kilodalton und (b) eine prozentuale Ladung zwischen 0,01 und 1,0% hat, gemessen durch die molare Prozentzahl geladener Monomerteileinheiten zu den gesamten Polymerteileinheiten, wobei die Ladung der geladenen Monomerteileinheiten entgegengesetzt zur Wandladung bei einem ausgewählten Elektrophorese-pH-Wert ist.

31. Das Röhrchen nach Anspruch 30, worin die Polymere oder Copolymere aus folgender Gruppe ausgewählt werden: Polyacrylamide, Polyoxide, Polyether, Vinylpolymere, Cellulosepolymere, Acrylpolymere sowie natürliche Gummis und Polysaccharide, wobei die Polymere oder Copolymere so modifiziert wurden, daß sie eine bestimmte prozentuale Ladung enthalten.

32. Das Röhrchen nach Anspruch 30, worin die Polymer- oder Copolymermoleküle eine geladene Gruppe enthalten, die aus folgender Gruppe ausgewählt wird: primäre Amine, sekundäre Amine, quartäre Amine, Carbonsäuren, Sulfonsäuren, Phosphorsäuren, Schwefelsäuren und Phosphonsäuren.