DE69304000T2

DE69304000T2 - Kapillarsäule enthaltend eine dynamisch vernetzte Zusammensetzung und Verfahren zum Gebrauch

Info

Publication number: DE69304000T2
Application number: DE69304000T
Authority: DE
Inventors: Andras Guttman
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1992-01-31
Filing date: 1993-01-25
Publication date: 1997-01-23
Anticipated expiration: 2013-01-26
Also published as: WO1993015395A1; US5213669A; JPH06506779A; EP0578814A1; DE69304000D1; EP0578814B1; US5370777A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist auf die Analyse von Proben allgemein und insbesondere auf die Analyse von proteinhaltigen Materialien unter Verwendung von Kapillar-Elektrophorese- Techniken gerichtet. Bei einer speziellen Ausführungsform ist die Erfindung auf eine Kapillarsäule gerichtet, die eine dynamisch vernetzte Zusammensetzung aufweist, die zur Analyse von oberflächenaktiven : proteinhaltigen Materialkomplexen durch Kapillar-Elektrophorese brauchbar ist.

Ausgangspunkt der Erfindung

Die Kapillar-Gel-Elektrophorese ist eine der am weitgehendsten verwendeten Trenntechniken in Biologie-bezogenen Wissenschaften. Molekulare Spezies, wie z.B. Proteine, Peptine, Nukleidsäuren und Oligonukleotide werden dadurch getrennt, daß die Spezies dazu gebracht werden, in einer Pufferlösung unter dem Einfluß eines elektrischen Feldes zu wandern. Die Pufferlösung wird normalerweise in Verbindung mit einer niedrigen bis mäßigen Konzentration eines geeigneten Geliermittels, wie z.B. Agarose oder Polyacrylamid verwendet, um das Auftreten einer Mischung der zu trennenden Spezies zu einem Minimum zu machen. Es liegen zwei primäre Trennmechanismen vor: a) Trennungen, die auf Unterschieden in der effektiven Ladung der Spezies beruhen, und b) Trennungen, die auf der Molekulargröße beruhen.
Der erste dieser Mechanismen ist allgemein auf Materialien mit niedrigem oder mäßigem Molekulargewicht beschränkt, wie z.B. auf kleine Oligonukleotide (mit einer Länge von ungefähr 1 bis 50 Nukleotiden). Dies ergibt sich daraus, daß typischerweise ein unbedeutender Unterschied zwischen den effektiven Ladungen von Materialien mit hohem Molekulargewicht vorliegt, was die Aufgabe der Trennung schwierig oder unmöglich macht.
Trennungen auf der Grundlage der Molekulargröße werden allgemein als molekulares 'Sieben' bezeichnet. Ein molekulares Sieben verwendet Gelmatritzen mit gesteuerten Porengrößen als Trennmedium. Die Trennung ergibt sich aus den relativen Fähigkeiten der eine unterschiedliche Größe aufweisenden molekularen Spezies, durch die Gelmatrix hindurchzudringen; kleinere Moleküle bewegen sich schneller als größere Moleküle durch ein Gel mit einer vorgegebenen Porengröße.
Ein mittleres bis hohes Molekulargewicht aufweisende Olionukleotide (mit einer Länge von mehr als ungefähr 50 Nukleotiden) Polypeptide und Proteine werden üblicherweise durch eine Molekular-Sieb-Elektrophorese getrennt. Proteine sind heteropolyelektrolytisch (d.h. eine angenähert äquivalente Anzahl von negativ geladenen und positiv geladenen Hälften, wobei das Gesamtmolekül eine resultierende neutrale Ladung aufweist). Als solche werden Proteine zu geladenen Molekülen, während sie eine geladene Kapillarsäule durchlaufen. Entsprechend müssen zur Trennung von proteinhaltigen Materialien auf der Grundlage der Größe der Moleküle diese Materialien das gleiche effektive Ladungs-/Massenverhältnis aufweisen, während sie die Kapillarsäule durchlaufen.
Die Erzielung des gleichen effektiven Ladungs-/Massenverhältnisses wird üblicherweise dadurch erreicht, daß die proteinhaltigen Materialien mit einem oberflächenaktiven Mittel behandelt werden, wie z.B. Natriumdodecylsulfat ('SDS'), und daß ein Polyacrylamid-Gelmaterial als Siebmedium verwendet wird. Ein derartiges Verfahren wird als das Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ('SDS-PAGE') bezeichnet. Siehe beispielsweise die Veröffentlichung 'Gel Electrophoresis of Proteins: A Practiced Approach' (Second Ed). B. D. Harnes & D. Rickwood, Eds. IRL Press, Oxford University Press, 1990. Siehe weiterhin die Veröffentlichung 'New Directions in Electrophoretic Methods', T. W. Jorgenson & M. Phillips, Eds., veröffentlicht von der American Chemical Society, Washington D.C. 1987.
Ein oberflächenaktives Mittel wie z.B. SDS umfaßt ein hydrophobes (Wasser hassendes) 'Ende' und einen hydrophilen (Wasser liebenden) 'Kopf'. Daher steht ein oberflächenaktives Mittel mit einer Proteinspezies über hydrophobe Wechselwirkungen zwischen dem hydrophoben 'Ende' des oberflächenaktiven Mittels und den Proteinspezies in Wechselwirkung. Bei einer Ionisation wird der hydrophile 'Kopf' der Moleküle des oberflächenaktiven Mittels, die die Proteinspezies umgeben, negativ geladen, positiv geladen oder sie bleiben neutral; bei einer Ionisation wird SDS negativ geladen. Entsprechend weist ein SDS:Protein- Komplex eine gleichförmige Ladungsverteilung auf, und ein derartiger Komplex kann dann auf der Grundlage der Größe bezogen auf die Porengrößen-Verteilung durch die gesamte Gelmatrix hindurch getrennt werden.
Im Handel erhältliche Kapillar-Elektrophorese-Geräte, wie z.B. das P/ACE -Hochleistungs-Kapillar-Elektrophoresesysem (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA, USA) verwenden ein Detektionssystem auf der Grundlage der Ultraviolett('UV-') Lichtabsorption. Obwohl die UV-Detektion von SDS- Protein-Komplexen in Polyacrylamid-gefüllten Kapillaren möglich ist, ist eine derartige Detektion auf eine spezielle Wellenlängendetektion von ungefähr 250 nm und mehr beschränkt. Dies ergibt sich aus der hohen UV-Absorption, die sich sowohl bei vernetzten als auch unverentzten Polyacrylamid-Gelen ergibt.
Derartige Detektionsbeschränkungen sind ein deutlicher Nachteil insbesondere hinsichtlich der Analyse von Proteinen. Dies ergibt sich daraus, daß Proteine UV-Licht sehr stark bei 214 nm aufgrund der Peptid-Bindungen innerhalb der Protein absorbieren. Daher sollte eine UV-Detektion von Proteinen bei ungefähr 214 nm durchgeführt werden. Aufgrund der Beschränkungen hinsichtlich einer Detektion bei 250 nm und mehr, die sich aus der Verwendung von Polyacrylamidgelen ergibt, ist jedoch die Empfindlichkeit und Selektivität der UV-Detektion von proteinhaltigen Materialien unter Verwendung von Gelsystemen auf der Grundlage von Polyacrylamid begrenzt.
Entsprechend würde die UV-Detektion von oberflächenaktiven: proteinhaltigen Materialien stark verbessert, wenn die Detektion an der Säule bei niedrigeren UV-Wellenlängen durchgeführt würde. Dies erfordert im Hinblick auf die vorstehenden Ausführungen Molekularsiebmaterialien, die die Nachteile von Polyacrylamid-Gelen nicht aufweisen.

Zusammenfassung der Erfindung

Hier werden Kapillarsäulen offenbart, die dynamisch vernetzte zusammensetzungen enthalten und die auf die Analyse von oberflächenaktiven:proteinhaltigen Materialkomplexen durch Kapillar- Elektrophorese anwendbar sind. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die dynamisch vernetzten Zusammensetzungen zwischen 0,01 Gewichtsprozenten und 1,5 Gewichtsprozenten Polyäthylenoxyd (PEO), zwischen 0,0% und weniger als 2,00 Gewichtsprozente Polyäthylenglykol, zwischen 0,0% und 2,0 Gewichtsprozent eines oberflächenaktiven Mittels, zwischen 0,0% und 99 Gewichtsprozenten eines Polyols und zwischen 0,0 M und 1,0 M eines pH-Puffers, wobei der pH-Wert der Zusammensetzung zwischen 2,0 und 10,0 liegt. Vorzugsweise ist die Viskosität der dynamisch vernetzten Zusammensetzung kleiner als 4 Pa s (4000 Zentipoise), bevorzugter weniger als ungefähr 0,5 Pa s (500 zentipoise) und vorzugsweise ungefähr 0,15 Pa s (150 Zentipoise). Die Zusammensetzungen sind besonders für die Analyse von SDS-Proteinkomplexen unter Verwendung von Kapillar-Elektrophoresesystemen auf der Grundlage einer UV-Detektion brauchbar, obwohl auch andere Detektionssysteme auf der Grundlage von beispielsweise einer radioaktiven oder Fluoreszenz-Detektion in gleicher Weise anwendbar sind. Die Kapillarsäulen können entweder unbehandelt sein oder mit einem üblichen Beschichtungsmaterial beschichtet sein.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die folgenden zeichnungen sind zum Zweck der Bezugnahme in Verbindung mit der ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung vorgesehen.
Fig. 1 ist ein Elektropherogramm der Trennung einer ein niedriges Molekulargewicht aufweisenden SDS-Protein- Standardmischung unter Verwendung einer dynamisch vernetzten 1,0 Gewichtsprozent PEO/1,0 Gewichtsprozent PEG-Zusammensetzung.
Fig. 2 ist ein Elektropherogramm der Trennung einer ein hohes Molekulargewicht aufweisenden SDS-Protein-Standardmischung unter Verwendung der dynamisch vernretzten Zusammensetzung nach Fig. 1, und
Fig. 3 ist eine Eichkurve der ein niedriges und ein hohes Molekulargewicht aufweisenden SDS-Proteine nach den Fig. 1 und 2 auf der Grundlage ihrer relativen Wanderungszeiten gegenüber einem internen Standard, Orange G.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Hier werden Kapillarsäulen offenbart, die dynamisch vernetzte Zusammensetzungen enthalten, und zwar besonders bevorzugt für die Analyse von oberflächenaktiven:proteinhaltigen Materialkomplexen unter Verwendung von Kapillar-Elektrophorese-Techniken.
Der Ausdruck 'dynamisch vernetzte Zusammensetzung', wie er hier verwendet wird, bedeutet eine gelartige Lösung, die ein dreidimensionales Netzwerk von Polymerketten aufweist, die durch eine Wasserstoffbindung zusammengehalten werden und in einer flüssigen Phase dispergiert sind. Die dynamisch vernetzte Zusammensetzung ist eine viskose Flüssigkeit mit einer ausreichenden Struktur für ein Ausmaß von Steifigkeit, die unter anderem ein molekulares Sieben auf der Grundlage der zu trennenden Materialien ermöglicht. Vorzugsweise ist die Viskosität der Zusammensetzung kleiner als ungefähr 4 Pa s (4000 zentipolse) und insbesondere vorzugsweise kleiner als ungefähr 0,5 Pa s (500 Zentipoise). Wenn die Zusammensetzung nicht PEG enthält, so ist sie eine lineare, im Gegensatz zu einer vernetzten Zusammensetzung. PEG wird vorzugsweise der Zusammensetzung hinzugefügt, um das PEO dynamisch zu vernetzen. Entsprechend enthält eine 'dynamisch vernetzte Zusammensetzung', wie die Bezeichnung hier verwendet wird, lineare Zusammensetzungen, wie z.B. Zusammensetzungen, die nicht PEG einschließen, wie dies weiter oben beschrieben wurde.
Der Ausdruck 'Kapillarsäule', wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine Kapillare, die einen Innenhohlraum umfaßt, der durch eine Wand mit einer Innenoberfläche umgrenzt ist, wobei der Innendurchmesser-Bereich der Kapillare zwischen ungefähr 2 µm und 2000 µm liegt. Wenn das Detektionssystem des Kapillar-Elektrophorese-Systems auf der UV-Absorption beruht, so besteht die Kapillare vorzugsweise aus einem UV- transparenten Material, wie z.B. aus Glas oder geschmolzenem Siliziumdioxyd, wobei geschmolzenes Siliziumdiocyd am stärksten bevorzugt wird. Wenn das Detektionssystem des Kapillar- Elektrophorese-Systems beispielsweise auf einer radioaktiven Detektion oder einer Fluoreszenz-Detektion beruht, so ist die Kapillare vorzugsweise aus einem Material hergestellt, das derartigen Systemen förderlich ist. Aluminiumoxyd-, Beryllium-, TEFLON -beschichtete Materialien, Glas und geschmolzenes Siliziumdioxyd stellen Beispiele für derartige Materialien dar. Die Kapillarsäule sollte in der Lage sein, einem weiten Bereich von angelegten Elektrophorese-Feldern von zwischen ungefähr 10 Volt pro Zentimeter ('V/cm') bis zu ungefähr 1000 V/cm wiederstehen zu können. Die Kapillarsäule kann auf der Außenseite (unter Verwendung von beispielsweise einem Polyamidmaterial) zur Erleichterung der Handhabung beschichtet sein. Die Innenwand der Kapillare kann unbehandelt oder mit einem Beschichtungsmaterial beschichtet sein, das verfügbar ist oder dem Fachmann bekannt ist. Ein Beispiel eines bevorzugten Beschichtungsmaterials ist in der US-Patentanmeldung 07/688 182 beschrieben. Vorzugsweise liegt der Innendurchmesser der Kapillarsäule zwischen ungefähr 2 µm und 2000 µm und beträgt in besonders bevorzugter Weise ungefähr 100 µm.
Der Ausdruck 'UV-transparent', wie er hier verwendet wird, bedeutet, daß sich eine vernachlässigbare Absorption über den gesamten US-Wellenlängenbereich von zwischen ungefähr 195 nm und ungefähr 350 nm ergibt.
Der Ausdruck 'oberflächenaktiv', wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine Substanz, die hydrophobe und hydrophile Eigenschaften aufweist und entweder eine negative Ladung, eine positive Ladung oder eine neutrale Ladung bei einer Ionisation aufweist. Der hydrophobe Teil des oberflächenaktiven Mittels kann mit einem proteinhaltigen Material über hydrophobe Wechselwirkungen in Wechselwirkung treten, derart, daß das Material von dem hydrophilen Teil des oberflächenaktiven Mittels umgeben ist. Beispielhafte anionische oberflächenaktive Mittel schließen beispielsweise Natriumdodecylsulfat ('SDS'), Decyl-Sulfat und Deoxycholat ein. Beispielhafte kationische oberflächenaktive Mittel schließen beispielsweise Cetyltrimethylammoniumbromid ('CTAB') und Cetylpyridin-Chlorid ('CPC') ein. Beispielahfte nichtionische oberflächenaktive Mittel schließen beispielsweise Polyoxyäthylen-Ester, wie z.B. Triton X 100 und Triton DF-16T und Polyoxyäthylensorbitante, wie z.B. BRIJ-35 , die TWEEN -oberflächenaktiven Mittel und LUBROL W ein. Alle die vorstehenden, mit Warenzeichen bezeichneten oberflächenaktiven Mittel sind von der Firma Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. erhältlich. Von den oberflächenaktiven Mitteln werden anionische oberflächenaktive Mittel bevorzugt, wenn sie in Verbindung mit unbehandelten, aus geschmolzenem Siliziumdioxyd bestehenden Säulen verwendet werden. Besonders bevorzugt wird, daß das oberflächenaktive Mittel SDS ist.
Der Ausdruck 'proteinhaltiges Material', wie er hier verwendet wird, bezeichnet Proteine (sowohl natürliche Proteine als auch solche, die über eine rekominierende Nukleinsäuretechnologie abgeleitet werden), Peptide, Polypeptide, Nukleinsäuren und Oligonukleotide. Es sei verständlich, daß obwohl die beschriebene dynamisch vernetzte Zusammensetzung eine besondere Anwendbarkeit bei der Analyse von proteinhaltigen Materialien und insbesondere von Proteinen aufweist, die vorliegende Beschreibung nicht auf der artige Materialien beschränkt ist. Entsprechend kann die beschriebene dynamisch vernetzte Zusammensetzung für die Analyse von anderen Materialien verwendet werden, die mit Hilfe von Kapillar-Elektrophorese-Techniken analysiert werden können. Weil die hier definierten proteinhaltigen Materialien bei einer Ionisation geladen werden können, ist es weiterhin verständlich, daß die dynamisch vernetzte Zusammensetzung kein oberflächenaktives Mittel enthalten muß. Beispielsweise haben Deoxyribonukleinsäure(DNA-) Moleküle das gleiche Ladungs-/Massen-Verhältnis; daher ist ein oberflächenaktives Mittel nicht erforderlich, um dieses Ergebnis zu erzielen. Es wird jedoch bevorzugt, daß die Zusammensetzung ein oberflächenaktives Mittel für die Analyse von proteinhaltigen Materialen einschließt.
Die dynamisch vernetzte Zusammensetzung umfaßt die folgenden Materialien: i) zwischen ungefähr 0,01 Gewichtsprozenten und ungefähr 1,5 Gewichtsprozenten Polyäthylenoxyd ('PEO'); ii) zwischen ungefähr 0,0% und weniger als ungefähr 2,0 Gewichtsprozenten Polyäthylenglykol ('PEG'); iii) zwischen ungefähr 0,0% und ungefähr 2,0 Gewichtsprozenten eines oberflächenaktiven Mittels; iv) zwischen ungefähr 0,0% und ungefähr 99 Gewichtsprozenten eines Polyols; und v) zwischen ungefähr 0,0 M und ungefähr 1,0 M eines pH-Puffers, wobei die Zusammensetzung einen pH-Wert von zwischen ungefähr 2,0 und ungefähr 10,0 aufweist und die Viskosität der Zusammensetzung kleiner als ungefähr 4 Pa s (4000 Zentipoise) ist.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt die dynamisch vernetzte Zusammensetzung ungefähr 1,0 Gewichtsprozente PEO; ungefähr 1,0 Gewichtsprozente PEG, ungefähr 0,1 Gewichtsprozente des gleichen oberflächenaktiven Mittels, wie es bei der Bildung des oberflächenaktiven:proteinhaltigen Materialkomplexes verwendet wird, und 100 mM eines pH-Puffers, wobei die Zusammensetzung einen pH-Wert von zwischen ungefähr 8,0 und ungefähr 9,0 und eine Viskosität von weniger als ungefähr 0,5 Pa s (500 Zentipoise) aufweist.
Unbeschichtete oder unbehandelte Kapillarsäulen können in Verbindung mit den Zusammensetzungen verwendet werden. Wenn unbeschichtete Kapillarsäulen verwendet werden, so umfaßt die dynamisch vernetzte Zusammensetzung weiterhin zwischen 0,01 Gewichtsprozenten und 99,0 Gewichtsprozenten eines Polyols. Das Polyol zirkuliert im Ergebnis durch das gesamte Polymer- Material, um die Stellen der Innenwand der Kapillare zu 'beschichten', die nicht von der dynamisch vernetzten Zusammensetzung bedeckt sind. Beispielhafte Polyole schließen ohne jede Beschränkung Äthylenglykol und Glyzerin ein. Ein bevorzugtes Polyol ist Äthylenglykol. In besonders bevorzugter Weise umfaßt die Zusammensetzung ungefähr 1,0% Äthylenglykol. Es ist verständlich, daß die Zusammensetzung Polyol umfassen kann (und diese vorzugsweise auch tut), selbst wenn sie in Verbindung mit beschichteten Kapillarsäulen verwendet wird.
Wenn das Detektionssystem des Kapillar-Elektrophorese-Systems auf der UV-Absorption beruht, so sollte der pH-Puffer für Ultraviolettstrahlung transparent sein. Beispiele für für Ultraviolettstrahlung transparente Puffer schließen beispielsweise die sogenannten 'Good'-Puffer ein (siehe Good, N. E. et al, 'Hydrogen Ion Buffers for Biological Research', Biochemestry 5/2: 467-477 (1966). Die Good-Puffer können als zwitterionische Puffer beschrieben werden, die den Bereich von pKa von 6,15 bis 8,75 überdecken und 2-(N-Morpholin) Äthansulfonsäure ('MES'), N-(2-Acetamid-) Iminodiessigsäure ('ADA'), Piperazin-N,N'-bis(2-Äthansulfonsäure (PIPES'), n-(Acetamido)- 2-Aminoäthansulfonsäure ('ACES'), (2-Aminoäthyl-)-Trimethyl- Ammoniumchlorid-Hydrochlorid ('Cholamin'), N,N-bis(Hydroxy- Äthyl-) -2-Aminoäthan-Sulfonsäure ('TES'), N-2-Hydroxy-Äthylpiperazin-N'-2-Äthansulfonsäure ('HEPES'), Tris-Hydroxymethyl- Aminomethan ('TRIS'), N-TRIS-(Hydroxyl-Methyl)Methylglyzerin ('Tricin'), N,N-bis(2-Hydroxyäthyl-)-Glyzin ('Bicine'), 2-(N- Zyklohexylamino-)-Äthansulfonsäure ('CHES') und Mischungen der vorstehenden einschließen. Ein besonders bevorzugter pH-Puffer für UV-Detektionszwecke ist TRIS-CHES.
Obwohl die vorstehenden Puffer zur Verwendung in Verbindung mit der UV-Detektion bevorzugt werden, ist es verständlich, daß derartige Puffer auch bei Instrumenten mit beispielsweise radioaktiver Detektion oder Fluoreszenzdetektion verwendet werden können. Zusätzlich werden, wenn die UV-Detektion nicht verwendet wird, Puffer, die Bestandteile einschließen, die aromatische Ringe oder Peptidbindungen aufweisen, für den pH-Puffer verwendet. TRIS-Histidin ist ein Beispiel eines derartigen Puffers.
Der pH-Wert des Puffers wird prinzipiell bezüglich der Art des verwendeten oberflächenaktiven Mittels ausgewählt. Für kationische oberflächenaktive Mittel sollte der pH-Wert des Puffers im sauren Bereich liegen (d.h. zwischen 2,0 und 5,0); für anionische oberflächenaktive Mittel sollte der pH-Wert des Puffers im alkalischen Bereich liegen (d.h. zwischen 8,0 und 10,0); für nichtionische oberflächenaktive Mittel liegt der pH-Wert des Puffers zwischen 5,0 und 8,0. Hinsichtlich des bevorzugten SDS-oberflächenaktiven Mittels beträgt der besonders bevorzugte pH-Wert ungefähr 8,8.
Für die Analyse von proteinhaltigen Materialien unter Verwendung unbehandelter Kapillarsäulen auf der Grundlage eine UV-Detektion umfaßt eine besonders bevorzugte Ausführungsform der dynamisch vernetzten Zusammensetzung ungefähr 1,0 Gewichtsprozente PEO; ungefähr 1,5 Gewichtsprozente PEG; ungefähr 0,1 Gewichtsprozente SDS; ungefähr 1,0 Gewichtsprozente Äthylenglykol und ungefähr 100 mM TRIS-CHES-Puffer, mit einem pH-Wert von 8,8 und einer Viskosität von weniger als ungefähr 0,5 Pa s (500 Zentipoise).
Die kapillare Elektrophorese unter Verwendung der vorstehend offenbarten dynamisch vernetzten Zusammensetzung schließt die Schritte der Einführung einer Teilmenge einer Probe, die zu trennende Bestandteile enthält, in die Säule gemäß der Erfindung, das Anlegen eines elektrischen Feldes von zumindestens ungefähr 10 V/cm an die Säule, das Fließenlassen eines Stromes von zwischen 1,0 bis 100 Mikroampere (µA) durch die Säule und die Detektion der Bestandteile der Probe ein, während sie an dem an der Strecke angeordneten Detektor vorbeiwandert. Die Einführung der Proben kann mit Hilfe des elektrokinetischen Injektionsverfahrens oder durch Druckinjektion erfolgen, wobei vorzugsweise eine Druckinjektion verwendet wird. Das elektrische Feld kann ein kontinuierliches oder impulsförmiges elektrisches Feld sein; der Fachmann ist sich dem Unterschied zwischen diesen beiden Arten von Feldern bewußt. Vorzugsweise wird ein kontinuierliches elektrisches Feld verwendet.
Der kapillare 'Fließpuffer' hängt hauptsächlich von dem Detektionssystem ab. Für eine UV-Detektion sollte der Fließpuffer UV-transparent sein. Vorzugsweise ist der Fließpuffer der gleiche Puffer, wie er in der dynamisch vernetzten Zusammensetzung verwendet wird. Wenn die Zusammensetzung keinen pH- Puffer einschließt, wird der Fließpuffer auf der Grundlage des Detektionssystems ausgewählt, wie dies weiter oben angegeben wurde. Entsprechend können die vorstehend beschriebenen pH-Puffer für den Fließpuffer verwendet werden.
Die die dynamisch vernetzte Zusammensetzung enthaltenden Kapillarsäulen sind besonders für die Analyse von proteinhaltigen Materialien über ungefähr 50 bis 100 Läufe geeignet. Wie dies erwähnt wurde, kann die Kapillarsäule entweder beschichtet oder unbehandelt sein. Bei unbehandelten Säulen sollte eine Deaktivierungslösung durch die Kapillare nach ungefähr allen 10 Analyseläufen geleitet werden. Der Begriff 'Deaktivierungslösung', wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine Lösung, die die Oberfläche der unbehandelten Kapillarsäule deaktiviert. Beispielsweise sollten bei geschmolzenem Siliziumdioxyd die SiO&supmin;-Gruppen, die die Innenoberfläche der Kapillarwand während der Elektrophorese einnehmen, über die Deaktivierungslösung in SiOH&supmin;-Gruppen umgewandelt werden. Die am stärksten bevorzugte Deaktivierungslösung ist 1M HCl.
Die Analyse von proteinhaltigen Materialien kann mit UV-Wellenlängen von 214 nm unter Verwendung der offentbarten Zusammensetzung durchgeführt werden. Dies stellt einen deutlichen Vorteil gegenüber Polyacrylamid-Gelen dar. Zusätzlich kann das beschriebene dynamisch vernetzte Polymermaterial für eine quantitative Analyse von beispielsweise proteinhaltigen Materialien über große Molekulargewichtsbereiche verwendet werden. Wie dies für den Fachmann erkennbar ist, sind derartige Eichdiagramme für Polyacrylamid-Gele sehr schwierig zu erzielen, so daß derartige quantative Analysen unerwünscht sind.
Die folgenden Beispiele werden lediglich zu Erläuterungszwecken angegeben und sind nicht als Beschränkung der vorstehenden Beschreibung oder der nachfolgenden Ansprüche vorgesehen und sollten auch nicht so aufgefaßt werden.

Beispiele

Eine Kapillar-Elektrophorese der in den folgenden Beispielen beschriebenen Proben wurde auf einem PACE -Hochleistungs- Kapillar-Elektrophorese-System der Firma Beckmann Instruments, Inc. durchgeführt. Dieses System enthält eingebaute Schmalbandfilter für 200, 214, 254, 260, 280 und 415 nm für eine Detektion an der Strecke. Das Detektionsfenster befand sich ungefähr 7,0 cm vom Säulenauslaß und 40 cm vom Säuleneinlaß entfernt.
Die Proben wurden auf die Eingabeschale des oben genannten Kapillar-Elektrophorese-Systems aufgebracht. Die Proben wurden automatisch in die dynamisch vernetzte Polymer-Kapillarsäule unter Verwendung der Druckinjektionsbetriebsart für 1-90 Sekunden injiziert.
Kapillarsäulen, die gemäß der Beschreibung der US-Patentanmeldung 07/688 182 beschichtet waren, hatten eine Säulenlänge von 47 cm, eine effektive Säulenlänge von 40 cm und einen Innendurchmesser von 100 pm. Die elektrische Feldstärke betrug 300 V/cm (14,1 kV für 47 cm) und der verwendete Strom betrug 25-30 µA.

BEISPIEL 1

Materialzubereitung

A. Schließpufferlösung

Ein 0,5 M TRIS-CHES-Puffer (pH 8,8) wurde durch Lösen von 12,1 g TRIS (ICN Biochemicals, Irvine, CA, Produktnummer 189620) in 100 ml entionisiertem Wasser zubereitet. Festes CHES (ICN, Produktnummer 1014434) wurde unter dauerndem Rühren hinzhugefügt, bis ein pH-Wert von 8,8 erzielt wurde. Ein abschließendes Volumen vom 200 ml wurde unter Verwendung von entionisiertem Wasser erreicht.

B. Protein-Modellproben-Zubereitung

Ein 0,3 M TRIS-Probenpuffer wurde mit 1:1 HCl auf einen pH-Wert von 6,6 eingestellt, gefolgt von der Hinzufügung von 10% SDS hierzu wie folgt: 36,3 g TRIS wurde in 500 ml entionisiertem Wasser gelöst, gefolgt von der Hinzufügung von 1:1 verdünnter HCl (VWR, San Francisco, CA, Produktnummer VW 3110-3) unter kontinuierlichem Rühren und Überwachung des pH-Wertes, bis ein pH-Wert von 6,6 erzielt wurde. 100 g SDS (ICN, Produktnummer 811034) wurde unter dauerndem Rühren hinzugefügt, und ein abschließendes Volumen von 1000 ml wurde unter Verwendung von entionisiertem Wasser erreicht.
Model-Protein-SDS-Protein-Standards waren wie folgt:
1) Bio-Rad Labs, Richmond, CA, Katalog Nr. 161-0303 (Molekulargewichtsbereich von 14000 bis 97000 Dalton:Lysozym, Sojabohnen- Trypsin-Inhibitor, Karbonanhydrase; Ovalbumin; Bovinserumalbumin; Phosphorylase b.); und
2) Bio-Rad Labs, Katalog Nr. 161-0304 (Molekulargewicht mit oberer Grenzen von 200000 Dalton: Ovalbumin; Bovinserumalbumin, Phosphorylase b; Betagalaktosidase; Myosin).
Orange G -Farbstoff (7-Hydroxy-8-Phenylazo-1,3-Naphtalendisulfonsäure; Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO., Produktnummer 03756) wurde als interner Standard verwendet. Eine 0,1-prozentige Lösung in entionisiertem Wasser wurde für die Beispiele verwendet.
Protein-Disulfid-Bindungen wurden unter Verwendung von 2- Mercaptoäthanol (ICN, Produktnummer 190242) aufgebrochen). Wie dies für den Fachmann erkennbar ist, binden bei Vorhandensein eines oberflächenaktiven Mittels und eines reduzierenden Mittels die meisten mehrkettigen Proteine das oberflächenaktive Mittel mit einem konstanten Wert, und die Disulfid-Bindungen werden durch das Reduziermittel aufgebrochen. Somit geht die sekundäre Struktur des Proteins verloren, und es wird angenommen, daß der oberflächenaktive Mittel-Protein-Komplex eine zufällige spiralförmige Form annimmt. Entsprechend weisen auf diese Weise behandelte Proteine eine gleichförmige Form und identische Massen-/Ladungsverhältniss auf. Somit ist es verständlich, daß irgendein Reduziermittel anwendbar ist, wie z.B. Dithioerythrit (DTT) und Mercaptoäthanol.
Die Proben wurden durch zumischen von 0,1 bis 0,2 mg der Modelproteine (d.h. 20 µl der Bio Rad-Materialien), 40 µl des Probenpuffers; 10 µl der Orange G-Lösung und 5 µl von 2-Mercaptoäthanol zubereitet. Ein abschließendes Lösungsvolumen von 1,25 µl wurde unter Verwendung von entionisiertem Wasser erzielt. Diese abschließende Mischung wurde in einem Wasserbad (100ºC) über 15 Minuten in einer geschlossenen Mikrozentrifugen-Ampulle gekocht und dann in Eiswasser für 2 Minuten gekühlt, bevor sie in die Kapillarsäule eingeführt wurde.

C. Dynamisch vernetzte Zusammensetzung

10 g PEO (Molekulargewicht 900000, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI., Produkt Nr. 18945-6) und 10 g PEG (Molekulargewicht 35000, Fluka, Ronkonkoma, NY., Produkt Nr. 81310) wurden mit 10 ml Äthylenglykol (VWR, Produkt Nr. EM-EX0564-1) und 50 ml entionisiertem Wasser für 10 Minuten in einem 1,2- Liter-Flakon mit weitem Hals gemischt. Danach wurden 700 ml entionisiertes Wasser hinzugefügt, gefolgt von einem Rühren mit einem magnetischen Stab bei 50ºC über drei Stunden. Danach wurden 200 ml des Fließpuffers hinzugefügt, gefolgt von einem Rühren über eine Stunde. 10 ml von 10 Gewichtsprozenten SDS (1,0 g SDS vollständig gelöst in 10 ml entionisiertem Wasser) wurden dann hinzugefügt, gefolgt von der Hinzufügung von entionisiertem Wasser, um ein abschließendes Volumen von 100 ml zu erzielen, worauf ein Rühren bei Raumtemperatur über Nacht folgte. Vor der Verwendung wurde die dynamisch vernetzte Zusammensetzung über 5 Minuten hinweg beschallt, um Luftblasen zu entfernen.
Die Viskosität der dynamisch vernetzten Zusammensetzung wurde unter Verwendung eines ELV-8 -Viskometers (Col-Parmer Inc., Chicago, Ill.) unter Verwendung von 100 ml der Zusammensetzng bestimmt. Die Viskosität wurde zu 0,15 Pa s (150 Zentipoise) bei 25ºC bezogen auf gleiche Volumen von destilliertem Wasser (0,02 Pa.s) und Glyzerol (1,1 Pa.S), gemessen bei der gleichen Temperatur, bestimmt.

BEISPIEL II

Analyse einer ein niedriges Molekulargewicht aufweisenden SDS-Protein-Standard-Mischung

Eine ausgezeichnete Trennung und Spezifität wurde in weniger als 20 Minuten für die Analyse der ein niedriges Molekulargewicht aufweisenden Standardprobe unter den vorstehenden Parametern erreicht. Fig. 1 gibt die Elektropherogramm-Ergebnisse einer derartigen Analyse an, wobei 'O.G.' der interne Orange G- Standard ist, '1' Lysozym ist, '2' der Sojabohnen-Trypsin- Inhibitor ist, '3' Karbonanhydrase ist, '4' Ovalbumin ist, '5' Bovinserumalbumin ist und '6' Phosphorylase b ist.

BEISPIEL III

Analyse einer ein hohes Molekulargewicht aufweisenden SDS-Protein-Standard-Mischung

Eine ausgezeichnete Trennung und Spezifität wurde in weniger als 20 Minuten für die Analyse von ein hohes Molekulargewicht aufweisenden Standardproben unter der vorstehenden Parametern erzielt. Fig. 2 gibt die Elektropherogramm-Ergebnisse dieser Analyse an, wobei OG wie in Beispiel II definiert ist, '1' Ovalbumin ist, '2' Bovinserumalbumin ist, '3' Phosphorylase b ist, '4' Betagalaktosidase ist, und '5' Myosin ist.

BEISPIEL IV

Eichkurve

Wie erwähnt, eignen sich SDS-PAGE-Protokolle nicht ohne weiteres für die Erzeugung von Eichkurven über einen weiten Bereich von Molekulargewichten. Wie dies zu erkennen ist, können derartige Kurven unter anderem für die Bestimmung des Molekulargewichtes einer unbekannten Probe verwendet werden. Weil die beschriebene dynamisch vernetzte Zusammensetzung zur wirkungsvollen Trennung von Proteinen mit niedrigem bis hohem Molekulargewicht (d.h. 10000 bis 200000 Dalton) verwendet werden kann, kann eine derartige Eichkurve erzeugt werden.
Fig. 3 zeigt eine derartige Eichkurve, wobei jeder Punkt die Wanderungszeit jedes SDS-Protein-Komplexes bezogen auf den internen Standard darstellt. In Fig. 3 ist '1' Lysozym, '2' ein Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor, '3' Karboanhydrase, '4' Ovalbumin, '5' Bovimserumalbumin, '6' Phosphorylase b, '7' Betagalaktosydase und '8' Myosin. Die relative Standardabweichung (RSD) für die Eichkurve nach Fig. 3 ist 0,98.
Eine derartige Eichkurve weist eine unendliche Vielzahl von brauchbaren Anwendungen auf, unter Einschluß der Bestimmung der Molekulargewichte unbekannter Proteine und der vergleichenden Analyse zwischen natürlichen Proteinen und Proteinen, die über rekombinierende DNA-Technologien abgeleitet wurden, ohne daß sich eine Beschränkung hierauf ergibt.
Obwohl die vorstehend erwähnte Kapillarsäule, die die dynamisch vernetzte Zusammensetzung enthält, und das Verfahren zu deren Verwendung mit beträchtlicher Ausführlichkeit beschrieben wurde, ist es verständlich, daß die Erfindung nicht auf die bevorzugten oder beschriebenen Ausführungsformen beschränkt ist. Die Erfindung sollte in ihrer Anwendbarkeit nicht als auf das spezielle Hochleistungs-Kapillar-Elektrophorese-System beschränkt betrachtet werden. Modifikationen und Änderungen, die im Ermessen des Fachmanns liegen, sollen in den Schutzumfang der folgenden Ansprüche fallen.

Claims

1. Kapillarsäule, die eine dynamisch vernetzte Zusammensetzung enthält, mit:

a) einer Kapillarsäule, die einen Innenhohlraum aufweist, der durch eine Wand mit einer Innenoberfläche umgrenzt ist,

b) einer dynamisch vernetzten Zusammensetzung, die den Innenhohlraum füllt, wobei die Zusammensetzung:

i) zwischen 0,1 Gewichtsprozenten und 1,5 Gewichtsprozenten Polyäthylenoxyd,

ii) zwischen 0,0% und weniger als 2,0 Gewichtsprozente Polyäthylenglykol,

iii) zwischen 0,0% und 2,0 Gewichtsprozenten eines oberflächenaktiven Mittels,

iv) zwischen 0,0 M und 1,0 M eines pH-Puffers, und

v) zwischen 0,0 und 99 Gewichtsprozenten eines Polyols enthält,

worin der pH-Wert der Zusammensetzung zwischen 2,0 und 10,0 liegt und die Viskosität der Zusammensetzung kleiner als ungefähr 4,0 Pa s ist.

2. Kapillarsäule nach Anspruch 1, die weiterhin eine Schicht aus Beschichtungsmaterial auf der Innenoberfläche der Wand umfaßt.

3. Kapillarsäule nach Anspruch 1, bei der die Kapillare aus einem Material aufgebaut ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Glas, Aluminiumoxyd, Berylliumoxyd, geschmolzenem Siliziumdioxyd und TEFLON besteht.

4. Kapillarsäule nach Anspruch 1, bei der die Kapillare aus geschmolzenem Siliziumdioxyd hergestellt ist.

5. Kapillarsäule nach Anspruch 1, bei der der Innendurchmesser der Kapillare zwischen 2 µm und 2000 µm liegt.

6. Kapillarsäule nach Anspruch 1, bei der die Zusammensetzung ungefähr 1,0 Gewichtsprozente Polyäthylenoxyd umfaßt.

7. Kapillarsäule nach Anspruch 1, bei der die Zusammensetzung ungefähr 1,0 Gewichtsprozente Polyäthylenglykol umfaßt.

8. Kapillarsäule nach Anspruch 1, bei der das oberflächenaktive Mittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Natriumdodecylsulfat, Decylsulfat, Polyoxyäthylenester, Polyoxyäthylensorbitanzmitteln, Deoxycholat, Cetyltrimethyl-Amoniumbromid und Cetylperidinchlorid besteht.

9. Kapillarsäule nach Anspruch 1, bei der da oberflächenaktive Mittel Natriumdodecylsulfat ist.

10. Kapillarsäule nach Anspruch 9, bei der die Zusammensetzung ungefähr 0,1 Gewichtsprozente Natriumdodecylsulfat umfaßt.

11. Kapillarsäule nach Anspruch 1, bei der der pH-Puffer für ultraviolettes Licht transparent ist.

12. Kapillarsäule nach Anspruch 1, bei der der pH-Puffer zwitteronische Puffer ufmaßt.

13. Kapillarsäule nach Anspruch 1, bei der der pH-Puffer aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 2-(N-Morpholin) Äthylsulfonsäure, N-(2-Acetamido-Iminodiessigsäure, Piperazin-N,N'- bis(2 Äthylsulfonsäure, N-(2-Acetamido-)2-Aminoäthansulfonsäure, (2-Aminoäthyl-)Dimethyl-Amoniumchlorid-Hydrochlorid, N,N-bis(2-Hydroxy-Äthyl-)-2-Aminoäthan-Sulfonsäure, N-2- Hydroxy-Äthylpiperazin-N'-2-Äthylsulfonsäure, TRIS-Hydroxymethyl-Aminomethan, N-tris(Hydroxymethyl-)-Methylglyzin, N,N- bis(2-Hydroxyäthyl-)-Glyzin, 2-(N-Cyclohexalamin-)Äthylsulfonsäure und Mischungen der vorstehenden besteht.

14. Kapillarsäule nach Anspruch 1, bei der der pH-Puffer ein TRIS-Hydroxymethyl-Aminomethan/2-(N-Cyclohexylamino-)Äthylsulfonsäure-Puffer ist.

15. Kapillarsäule nach Anspruch 14, bei der die Molarität des Puffers 100 mM ist.

16. Kapillarsäule nach Anspruch 15, bei der der pH-Wert der Zusammensetzung zwischen 8,0 und 9,0 liegt.

17. Kapillarsäule mit einer dynamisch vernetzten Zusammensetzung, mit:

i) ungefähr 1,0 Gewichtsprozente Polyäthylenoxyd,

ii) ungefähr 1,0 Gewichtsprozente Polyäthylenglykol,

iii) ungefähr 0,1 Gewichtsprozente Natriumdodecylsulfat,

iv) ungefähr 100 mM TRIS-CHES-Puffer und

v) ungefähr 1,0 Gewichtsprozente Äthylenglykol umfaßt,

worin der pH-Wert der Zusammensetzung zwischen 8,0 und 9,0 liegt und die Viskosität der Zusammensetzung kleiner als ungefähr 0,5 Pa s ist.

18. Verfahren zur Durchführung einer Kapillar-Elektrophorese mit den folgenden Schritten:

a) Einführen einer Teilmenge einer Probe, die voneinander zu trennende Bestandteile enthält, in eine Kapillarsäule, die eine dynamisch vernetzte Zusammensetzung umfaßt, wobei die Kapillarsäule:

i) eine Kapillarsäule mit einem Innenholraum, der durch eine Wand mit einer Innenoberfläche umgrenzt ist, und

ii) eine dynamisch vernetzte Zusammensetzung umfaßt, die den Innenhohlraum füllt, wobei die Zusammensetzung

a) zwischen 0,1 Gewichtsprozenten und 1,5 Gewichtsprozenten Polyäthylenoxyd,

b) zwischen 0,0% und weniger als 2,0 Gewichtsprozenten Polyäthylenglykol,

c) zwischen 0,0% und 2,0 Gewichtsprozenten eines oberflächenaktiven Mittels,

d) zwischen 0,0 M und 1,0 M eines pH- Puffers, und

e) zwischen 0,0% und 99 Gewichtsprozenten eines Polyols umfaßt, wobei der pH-Wert der Zusammensetzung zwischen 2,0 und 10,00 liegt und die Viskosität der Zusammensetzung kleiner als ungefähr 4,0 Pa s ist;

b) Anlegen eines elektrischen Feldes von zumindestens 10 Volt pro Zentimeter an die Kapillarsäule,

c) Trennen der Probe in ihre Bestandteile, und

d) Feststellen der Bestandteile der Probe.

19. Verfahren zur Durchführung der Kapillar-Elektrophorese auf Proben, die Natrium-Dodecyl-Sulfat-Proteinkomplexe umfassen, mit den folgenden Schritten:

a) Einführen einer Teilmenge einer Probe, die Natrium- Dodecyl-Sulfat-Proteinkomplexe umfaßt, in eine Kapillarsäule, die eine dynamisch vernetzte Zusammensetzung umfaßt, wobei die Kapillarsäule:

i) eine Kapillarsäule mit einem Innenhohlraum, der durch eine Wand mit einer Innenoberfläche umgrenzt ist, und

ii) eine dynamisch vernetzte Zusammensetzung umfaßt, die den Innenhohlraum füllt, wobei die Zusammensetzung:

a) ungefähr 1,0 Gewichtsprozente Polyäthylenoxyd,

b) ungefähr 1,0 Gewichtsprozente Polyäthylenglykol,

c) ungefähr 0,1 Gewichtsprozente Natriumdodecylsulfat,

d) ungefähr 100 mM TRIS-CHES-Puffer und

e) ungefähr 1,0 Gewichtsprozente Äthylenoxyd umfaßt,

worin der pH-Wert der Zusammensetzung zwischen 8,0 und 9,0 liegt und die Viskosität der Zusammensetzung kleiner als ungefähr 0,5 Pa s ist,

b) Anlegen eines elektrischen Feldes mit zumindestens ungefähr 10 Volt pro Zentimeter and die Kapillarsäule,

c) Trennen der Komplexe, und

d) Feststellen der Komplexe.