JPH06506779A

JPH06506779A - 動的架橋組成物を含む毛管カラムおよびその使用方法

Info

Publication number: JPH06506779A
Application number: JP5513389A
Authority: JP
Inventors: ガットマン、アンドラス
Original assignee: ベックマン　インスツルメンツ　インコーポレーテッド
Priority date: 1992-01-31
Filing date: 1993-01-25
Publication date: 1994-07-28
Also published as: EP0578814B1; DE69304000T2; DE69304000D1; EP0578814A1; WO1993015395A1; US5213669A; US5370777A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】管電気泳動技術を使用した蛋白質物質の分析に関する。本発明は、特定の実施態様においては、毛管電気泳動による界面活性剤：蛋白質物質複合体の分析において有用な動的架橋組成物を含む毛管カラムに関する。

及肛立！１毛管ゲル電気泳動は、生物学関連科学において最も広く使用されている分離技術の１つである。蛋白質、ペプチド、核酸及びオリゴヌクレオチドのような分子種は、電界の影響下にある緩衝溶液において種を泳動させることにより分離される。緩衝溶液は、通常は、低ないし中程度の濃度の、アガロースあるいはポリアクリルアミドのような適宜のゲル化剤とともに使用され、分離を行なっている種の混合の可能性を最少にしている。主な混合機構には、ａ）種の有効電荷に基づく分離と、ｂ）分子の大きさに基づく分離との２つがある。

これらの機構の第１の°ものは、一般に、小さいオリゴヌクレオチド（長さが約１〜約５０のヌクレオチド）のような低〜中程度の分子量の物質に制限される。

これは、高分子量の物質の有効電荷には一般に有意な差がなく、分離作業が困難あるいは不可能になるからである。

分子の大きさに基づく分離は、一般に、分子篩じｓｉｅｖｉｎｇ”）と云われている０分子篩は、制御された細孔サイズを有するゲルマトリックスを分離媒体として利用する。大きさの異なる分子種がゲルマトリックスを透明することができる相対的な能力により行なわれ、小さな分子は大きな分子よりも、所定の細孔サイズのゲルを一１迅速に移動する。

（長さが約５０ヌクレオチドよりも大きい）中程度〜高分子量のオリゴヌクレオチド、ポリペプチド及び蛋白質は通常、分子篩電気泳動により分離される。蛋白質は、ヘテロ高分子電解質（即ち、分子全体が正味の中和電荷を有する略等量数の負に帯電した成分と正に帯電した成分）である、かくして、蛋白質は、帯電した毛管カラムを通過するときに帯電した分子となる。従って、分子の大きさに基づいて蛋白質物質を分離するためには、これらの物質は毛管カラムを通過するときに同じ有効な荷電対質量比を有するものでなければならない。

同じ有効荷電対質量比は、一般に、蛋白質物質をドデシル硫酸ナトリウム（ｒＳＤＳＪ　）のような界面活性剤で処理し、かつ、ポリアクリルアミドゲルを篩媒体として利用することにより行なうことができる。かかる手順は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｒＳＤＳ−ＰＡＧＥＪ　）と云われる０例えば、ビー・ディー・ハーネス（Ｂ、　Ｄ、　Ｈａｒｎｅｓ）およびディー・リックウッド（Ｄ、　Ｒｉｃｋｗｏｏｄ）　ｍ、アイアールエル・プレス（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）　、オックスフォード大学出版部（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ）　１９９０年発行のゲル・エレクトロフォレシス・オン・プロテインズ：ア・プラクティスト０アプローチ（Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：　Ａ　Ｐｒａｃ−ｔｉｃｅｄ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）　（第２版）を参照されたい。更に、ティー・イー・ジョージェンソン（Ｔ、Ｅ、　Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ）およびエム・フィリップス（Ｍ、　Ｐｈ１ｌｌｉｐｓｌ＆ｉで、ワシントン・ディーシーのアメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ）により１９８７年に発行された「ニュー・ディレクションズ・イン・エレクトロフォレテー＋’ツク６メソツズＪ　（Ｎｅｗ　Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃＭｅｔｈｏｄｓ）を参照されたい。水明細書においては、これらの文献を引用してその説明に代える。

ＳＤＳのような界面活性剤は、疎水性（嫌水）の「尾部」と、親水性（吐水）の「頭部」とを備えている。かくして界面活性剤は、界面活性剤の疎水性「尾部」と蛋白質種との間の疎水相互作用を介して蛋白質種と相互作用を行なう、イオン化すると、蛋白質種を囲む界面活性剤の親水性「頭部」は、負または正に帯電するようになりあるいは中性を保持し、イオン化すると、ＳＤＳは負に帯電するようになる。従って、ＳＤＳ　：蛋白質複合体は、均一な荷電分布を有し、かかる複合体は、細孔サイズ分布に対するサイズに基づき、ゲルマトリックスを介して分離することができる。

Ｐ／ＡＣＥ　（商標）高性能毛管電気泳動システム［アメリカ合衆国、カリフォルニア州、フラートン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）のベックマン・インスツルメンツ・インコーホレイテッド（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ。

Ｉｎｃ、）　］のような闇集的◆こ入手することができる毛管電気泳動装置は、紫外（ＵＶ）線吸収に基づく検出システムを利用している。ポリアクリルアミドを充填した毛管の５ＤＳ−蛋白質複合体のＵＶ検出は可能であるが、かかる検出は約２５０ｎｍ以上の特定波長の検出に制限される。これは、高ＵＶ吸光度が架橋ポリアクリルアミドゲルと未架橋ポリアクリルアミドゲルの双方と関連するからである。

かかる検出上の制約は、特に蛋白質の分析に対して著しく不利となる。これは、蛋白質が蛋白質内のペプチド結合により２１４ｎｍでｔＪＶ線を著しく強く吸収するからである。かくして、蛋白質のＵから、ポリアクリルアミドゲルを使用すると２５０ｎｍ以上では検出上の制約が生ずるので、ポリアクリルアミドをベースとしたゲル系を使用する蛋白質物質のＵＶ検出の感度および選択性が制限を受ける。

従って、界面活性剤、蛋白質物質のＵＶ検出は、オン・カラム（ｏｎ−ｃｏｌｕｍｎ）検出がより低いＵｖ波長で行なわれるならば、著しく改良されるものと考えられる。これには、上記説明に照らせば、ポリアクリルアミドゲルの欠点を受けない分子篩物質が必要となる。

ｌ肛ｍここに開示されているのは動的架橋組成物（”ｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ　ｃｒｏｓｓ−１ｉｎｋｅｄ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ”）を含む毛管カラムであり、このカラムは毛管電気泳動による界面活性剤：蛋白質物質複合体（ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）の分析に適用することができる。好ましい実施態様においては、動的架橋組成物は、約０．０１％〜約１．５％のポリエチレンオキサイド、約０．０％〜約２．・００％未満のポリエチレングリコール、約○、○％〜約２．０％の界面活性剤、約０．０％〜約９９．０％のポリオール、約０．０Ｍ　〜１．０Ｍ（１）ｐＨ１ｉ！！衝剤を含んでなり、組成物のｐＨは約２．０〜約１０．Ｏである。好ましくは、動的架橋組成物の粘度は約４，０００センチポアズ未満であり、より好ましくは約５００センチポアズ未満であり、好ましくは約１５０センチポアズである０組成物は、ＵＶ検出に基づく毛管電気泳動システムを使用する５ＤＳ−蛋白質複合体の分析において特に有用であるが、例λば、放射線又は蛍光検出に基づく他の検出システムも同等に適用することができる。毛管カラムは、未処理とすることができ、あるいは通常のコーテイング物質でコーティングを行なうことｍ呈皇皇ユ主以下の図面は、本発明の好ましい実施態様の詳細な説明に関する説明のためのものである。

図１は、１．○％ＰＥＯ／１．Ｏ％ＰＥＧ動的架橋組成物を使用した低分子量５ＤＳ−蛋白質標１：Ｉ！混合物の分離の電気泳動図（ｅｌｅｃ−ｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）であり、図２は、図１の動的架橋組成物を使用した高分子量５ＤＳ−蛋白質標準混合物の分離の電気泳動図であり、図３は、内部標準のオレンジＧに対する相対移行時間に基づく図１及び２の低及び高分子量５ＤＳ−蛋白質の検量線である。

ま　い　熊　の・　な− ここに開示されているのは、最も好ましくは、毛管電気泳動技術を使用した界面活性剤：蛋白質物質複合体の分析において使用する動的架橋組成物を含む毛管カラムである。

ここに使用されている「動的架橋組成物」なる語は、水素結合により互いに保持されかつ液相に分散された３次元網状構造のポリマ鎖を有するゲル状溶液を意味するものである。動的架橋組成物は、特に、分離されるべき物質の大きさに基づ（分子篩を許容する程度の剛性を呈するのに十分な構造を有する粘性のある液体である。好ましくは、組成物の粘度は、約４，０００センチポアズ未満てあリ、より好ましくは約５００センチポアズ未満である０組成物がＰＥＧを含まない場合には、架橋組成物とは反対に線状となる。ＰＥＯを動的に架橋させるようにＰＥＧを組成物に加えるのが好ましい、従って、「動的架橋組成物」とは、ここに用いられているように、上記したよりなＰＥＧを含まない組成物のような線状組成物を含むものである。

ここに使用されている「毛管カラム」なる語は、内面を有する壁により画定される内部キャビティを備えた毛管を意味するもので、毛管の内径は約２μｍ〜２０００Ｌｚｍの範囲にある０毛管電気泳動システムの検出システムがＵＶ吸光度に基づくものでれば、毛管は、例久ば、ガラスまたは溶融シリカのようなＵＶ透明物質からつくるのが好ましく、溶融シリカが最も好ましい１毛管電気泳動システムの検出システムが、例えば放射線検出又は蛍光検出に基づく場合には、毛管はかかるシステムに有効な材料から造るのが好ましい。例＾ば、アルミナ、ベリリウム、テフロン（商標）被覆の材料、ガラスおよび溶融シリカを挙げることができる０毛管カラムは１０ボルト／センチメートル（７７０ｍ）〜約ＬＯＯＯＶ／ｃｍに亘る広い範囲の印加電気泳動場に耐えることができるようにすべきである０毛管カラムは、取扱いを容易にするように（例久ば、ポリアミド物質を使用して）外側にコーティングを施すことができる。

毛管の内面は、未処理であっても、あるいは当業者が入手することができあるいは当業者に公知のコーティング材料でコーティングを施してもよい、好ましいコーティング材料の例が、米国特許出願第０７／６８８，１８２号に開示されており、この米国特許出願を引用してその説明に代える。好ましくは、毛管カラムの内径は約２μｍ〜２０００ＬＬｍであり、最も好ましくは約１００μｍである。

ここに使用されているｒｕｖ透明性」じＵＶ　ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ”）なる語は、約１９５ｎｍ〜約３５０ｎｍのＵＶ波長範囲に亘って無視することができる吸光度を有することを意味する。

ここに使用されている「界面活性剤」なる語は、疎水性および親水性を有するとともに、イオン化したときに負電荷、正電荷または中和電荷を有する物質を云う、界面活性剤の疎水性部分は、疎水相互作用を介して蛋白質物質と相互作用を行なうことができ、これにより蛋白質物質は界面活性剤の親水性部分により囲まれる０代表的な陰イオン界面活性剤には、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デシル−スルフェート（ｄｅｃｙｌ−ｓｕｌｐｈａｔｅ）及びデオキシコレート（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）がある０代表的な陰イオン界面活性剤には、例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）及び塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）がある１代表的な非イオン界面活性剤には、例えば、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ　１００　（商標）及びトリトンＤＦ−１６（商標）のようなポリオキシエチレンエーテル類、ＢＲＩＪ−３５（商標）のようなポリオキシェチレンソルビタン類、ツウィーン（ＴＷＥＥＮ）　（商標）界面活性剤並びにルブロール・ダブリニ（ＬＵＢＲＯＬ　Ｗ）　（商標）があら、上記した商標が付されている界面活性剤は全て、ミズーリ州、セントルイスに所在するシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）から入手することができる。これらの界面活性剤のうち、陰イオン界面活性剤は、未処理の溶融シリカカラムとともに使用するときに好ましい、最も好ましくは、界面活性剤はＳＤＳである。

ここで使用されている「蛋白質物質Ｊ　（”ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅａｕｓ　ｍａｔｅｒｉａｌ“）なる語は、蛋白質（天然と組換久核酸技術により得られたものとの双方）、ペプチド、ポリペプチド、核酸及びオリゴヌクレオチドを意味する。開示されている動的架橋組成物は蛋白質物質、特に蛋白質、の分析において特に適用性が見出されているが、本発明はかかる物質に限定されるものではない。

かくして、開示されている動的架橋組成物は、毛管電気泳動技術により分析することができる他の物質の分析に利用することができる。ここに定義されている蛋白質物質はイオン化すると帯電することができるので、動的架橋組成物は界面活性剤を組み入れる必要がないものと理解されるべきである０例λば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子は、同じ荷電対質量比を有しており、従って、界面活性剤はかかる結果を得るためには必要とはされない、しかしながら、組成物は蛋白質物質の分析には界面活性剤を含むのが好ましい。

動的架橋組成物は、次の物質、即ち、ｉ）約０．０１％〜約１．５％のポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ）、ｉｉ）約ｏ、ｏ％〜約２゜０％未満のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　、　１ｉｉ）約ｏ、ｏ％〜約２．０％の界面活性剤、ｉｖ）約０．０％〜約９９％のポリオール、■）約０．０Ｍ〜約１．０ＭのｐＨＭ衝剤を含んでなり、組成物は約２．０〜約１０．０のｐＨを有するとともに、組成物の粘度は約４，０００センチポアズ未満である。

特に好ましい実施態様においては、動的架橋組成物は、約１．０％のＰＥ０１約１．０％のＰＥＧ、約０．１％の、界面活性剤；蛋白質物質複合体の形成においで使用されているのと同じ界面活性剤、１００ｍＭのｐＨＭ衝剤を含有してなり、組成物は約８．０〜約９．０のｐ）（と、約５００センチポアズ未溝の粘度を有する。

コーティングされていない即ち未処理の毛管カラムを、組成物とともに利用することができる。コーティングされていない毛管カラムを使用する場合には、動的架橋組成物は更に、約０．０１％〜約９９．００％のポリオールを含む、ポリオールは実際には、ポリマー全体に循環して、動的架橋組成物により覆われていない毛管の内壁の部分に「コーティングを行なう」０代表的なポリオールにはエチレングリコールおよびグリ七ロールがあるが、これらに限定されるものではない。好ましいポリオールは、エチレングリコールである。最も好ましくは、組成物は約１．０％のエチレングリコールを含む。組成物は、コーティングされた毛管カラムとともに使用される場合には、ポリオールを含むことができる（とともに含むのが好ましい）ものと理解されるべきである。

毛管電気泳動システムの検出システムがＵＶ吸光度に基づ（場合には、ｐＨ緩衝剤はＵＶ透明性とすべきである。ＵＶ透明性緩衝剤には、例えば、いわゆる「グツド」（”Ｇｏｏｄ”）緩衝剤［バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅａ＋１ｓｔｒｙ）第５／２巻、第４６７−４７７頁（１９６６年）に掲載のグツド・エン・イー（Ｇｏｏｄ、Ｎ、　Ｅ、　）等の「ハイドロジエン・イオン・バッファース・フォア・バイオロジカル・リサーチ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎ　Ｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ”ｌ　Ｊと題する論文参照、この論文を引用してその説明に代えるコがある。グツド緩新剤は、６．１５〜８．７５のｐＫａ範囲をカバーする両性イオン緩衝液として説明することができ、２−（Ｎ−モルホリン）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、（２−アミノエチル）トリメチル−アンモニウムクロライド塩酸塩（Ｃｈｏｌａｍｉｎｓ）、Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシ−エチル）− ２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）　、Ｎ−２−ヒドロキシ−エチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン（ＴＲＩＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシ−メチル）メチルグリシン（７ｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、２−（Ｎ−シクロへキシルアミノ）エタン−スルホン酸（ＣＨＥＳ緩衝剤は、ＴＲｌ５−ＣＨＥＳである。

上記した緩衝剤はＵＶ検出に関して使用するのに好ましいが、かかる緩衝剤は、例えば、放射線検出装置または蛍光検出装置とともに利用することもできると理解されるべきである。更に、ＵＶ検出が利用されない場合には、芳香環またはペプチド結合を有する成分を含む緩衝剤をｐＨ緩衝剤として利用することができる。ＴＲｒＳ−ヒスチジンは、かかる緩衝剤の一例である。

緩衝剤のｐＨは、原則として、利用される界面活性剤のタイプに対して選択される。陽イオン界面活性剤の場合には、緩衝剤のｐＨは酸性範囲（即ち約２．０〜５．０）にすべきであり、陰イオン界面活性剤の場合には、緩衝剤のｐＨはアルカリ性範囲（約８．０〜１０．０）にすべきであり、非イオン界面活性剤の場合には、緩衝剤のｐＨは約５．０〜８．０である。好ましいＳＤＳ界面活性剤に対しては、最も好ましいｐＨは約８．８である。

未処理の毛管カラムを使用した蛋白質物質のＵＶ検出に基づ（分析の場合には、動的架橋組成物の特に好ましい実施態様は、約１゜０％のＰＥＯと、約１．０％（７）ＰＥＧと、約０．１％（７）ＳＤＳと、約１．０％のエチレングリコールと、約１００ｍＭのＴＲｌ５−ＣＨＥＳ緩衝剤とを含有してなり、８．８のｐＨと約５００センチポアズ未溝の粘度とを有する。

上記した動的架橋組成物を使用する毛管電気泳動は、分離されるべき成分を含むサンプルのアリコートを本発明のカラムに導入する工程、少なくとも約１０Ｖ／ｃｍの電場をカラムに印加する工程、約１，０〜約１ｏＯマイクロアンペア（μ Ａ）の電流をカラムに通す工程、サンプルの成分がオンライン検出器を移行するときに該成分を検出する工程とを含んでいる。サンプルの導入は、動電学的注入法又は圧力注入により行なうことができ、好ましくは動電学的注入が利用される。電場は、連続またはパルス化電場とすることができ、当業者であれば、これらのタイプの電場の区別をすることができるものである。好ましくは、連続電場が利用される。

毛管ｒランニング緩衝剤」は、主として検出システムによる。

ＵＶ検出の場合には、ランニング緩衝剤はＵｖ透明性であるべきである。好ましくは、ランニング緩衝剤は、動的架橋組成物において利用されるのと同じ緩衝剤である０組成物がｐＨ緩衝剤を含まない場合には、ランニング緩衝剤は上記したように、検出システムに基づいて選択される。従って、上記したｐＨ緩衝剤は、ランニング緩衝剤に利用することができる。

毛管カラムを含む動的架橋組成物は、約５０−１００回に亘る蛋白質物質の分析操作に特に適している。上記のように、毛管カラムはコーティングしたものであっても、未処理のものであってもよい。未処理のカラムの場合には、約１０回の分析操作ごとに失活溶液を毛管に通すようにすべきである。ここに使用されている「失活溶液」とは、未処理の毛管カラムの表面を失活する溶液である。例えば、溶融シリカの場合には、電気泳動の際に毛管壁の内面を占める５ｉＯ−を失活溶液を介して５ｉＯＨ基に変換すべきである。最も好ましい失活溶液はＩＭのＨＣＩである。

蛋白質物質の分析は、開示されている組成物を使用して２１４ｎｍのＵＶ波長で行なうことができる。これは、ポリアクリルアミドゲルと比べて著しく有利である。更に、開示されている動的架橋ポリマは、広い分子量範囲に亘って、例えば、蛋白質物質を定量分析するのに使用することができる。当業者であれば理解することができるように、ポリアクリルアミドゲルに関するかかる検量プロットは実施するのが著しく困難であり、かくして、これまでは定量分析は回避されていた。

以下の例は単に例示のためのものであって、上記説明あるいは下記の請求の範囲に制限を加えるものではな（、また制限を加えるものと解釈すべきではない。

伝以下の例に記載のサンプルの毛管電気泳動は、ベックマン・インスツルメンッ・インコー、ポレイテッドのＰＡＧＥ　（商標）高性能毛管電気泳動システムに関して行なった。このシステムは、オンライン検出用の２００．２１４．２５４．２６０．２８０および４１５ｎｍの狭帯域のフィルタを内蔵するものである。検出窓がカラム出口から約７．０ｃｍでかっカラム入口から４０ｃｍの位置に配役されていた。

サンプルを、上記した毛管電気泳動システムの入口トレーに載置した。圧力注入モードを１〜９０秒間使用することにより、サンプルを動的架橋ポリマ毛管カラムに自動的に注入した。

米国特許出願第０７／６８８，１８２号の開示に従ってコーティングを施した毛管カラムは、カラム長が４７ｃｍで、有効カラム長が４０ｃｍで、内径が１００ μｍであった。電場強度は３００　Ｖ／ｃｍ　（４７ｃｍに対して１４．ＩＫＶ）であり、利用された電流は２５−３０μＡであった。

医工椎！二■ＩＡ、ランニング９゛１２、　１ｇのＴＲｌ５　［カリフォルニア州、アービン（Ｉｒｖｉｎｅ）に所在するアイシーエン・バイオケミカルズ（ＩＣＮ　Ｂｉｏｃｈｅｏ＋１ｃａｌｓ）の製品番号８１９６２０Ｆを脱イオン水Ｌ　ＯＯｍ　１に溶解して０．５ＭのＴＲＩ　５−ＣＨＥＳ！ｉ衝液（ｐＨ８，８）を調製した。連続して撹拌しながら固形のＣＨＥＳ　（アイシーエンの製品番号１０１４３４）を加え、ｐＨを８．８にした。脱イオン水を使用して最終容量を２００ｍ１とした。

Ｂ、モデル　サンプルの・０．３ＭのＴＲｌ５す・ンブル緩衝液を、ｌ　：　ＩＭＣＩを用いてｐＨ６，６に調整し、次いで、１０％ＳＤＳを次のようにして添加した。ＴＲｌ５３６．３ｇを脱イオン水５００ｍ１に溶解し、次いで連続して撹拌しかつｐＨを監視しなから１：１希釈ＨＣ１［カリフォルニア州、サンフランシスコに所在するヴイダブリ二アール（ＶＷＲ）の製品番号ＶＷ３１１０−３１を加え、ｐＨを６．６にした。連続して攪拌しながらＳＤＳ　（アイシーエンの製品番号８１１０３４）１００ｇを加え、脱イオン水を使用して最終容量を１０１００Ｏとした。

モデル蛋白質５ＤＳ−蛋白質標準は次の通りであった。

オ・ラッド・ラブダ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｓ）のカタログ番号１６１−０３０３（分子量範囲１４，０００−９７．ＯＯＯドルトン：　’）ゾチーム：大豆トリプシンインヒビター；カルボニックアンヒドラーゼ：オボアルブミン；ウシ血清アルブミン；ホスホリラーゼｂ）、及び２）バイオ・ラッド・ラブダのカタログ番号１６１−０３０４（分子量上限２００，０００ドルトン：オボアルブミン；ウシ血清アルブミン：ホスホリラーゼｂ；ベータガラクトシダーゼ：ミオシン）。

オレンジＧ（商標）染料［７−ヒドロキシ−８−フェニルアゾ−１，３−ナフタレンニスルホン酸；ミズーリ州、セントルイスのシグマ・ケミカル・コーポレイション（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　（：ｏｒｐ、）の製品番号０３７５６　］を内部標準として利用した。脱イオン水の０．　１％溶液を例に利用した。

蛋白質ジスルフィドの結合を、２−メルカプトエタノール（アイシーエタの製品番号１９・０２４２）を使用して切断した。当業者であれば理解することができるように、界面活性剤と還元剤の存在下では、はとんどの長鎖（ｍｕｌｔｉｃｈａｉｎ）蛋白質が界面活性剤を一定値にし、ジスルフィド結合が還元剤により切断される。か（して、蛋白質の二次構造は失われ、界面活性剤−蛋白質複合体はランダムコイルコンフォーメイション（ｒａｎｄｏｍ　ｃｏｉｌ　ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）を採用するものと考えられる。従って、このようにして処理される蛋白質は、均一な形状と同じ質量対荷電比を有する。かくして、例久ば、ジチオトレイトール、　（ＤＴＴ）及びメルカプトエタノールのような任意の還元剤を適用することができるのである。

０．１〜０．２ｍｇのモデル蛋白質（即ち、バイオラッドの物質２０μｍ）と、サンプル緩衝液４０μｍと、オレンジＧ溶液１０μｍと、２−メルカプトエタノール５μｍとを混合することによりサンプルを調製した。脱イオン水を使用して最終溶液容量を１２５μｍとした。この最終混合物を密閉したマイクロ遠心分離バイアルに入れて水浴（１００℃）中で１５分間煮沸し、次いで、氷水で２分間冷却してから、毛管カラムに導入した。

Ｃ−１脛！１皿底量ＰＥＯ［分子量９００，０００、ウィスコンシン州、ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅ＋ｗｉｃａｌＣｏ、ンの製品番号１８，９４５−６］ＬｏｇとＰＥＧ　［分子量３５゜ＯＯＯ、ニューヨーク州、ロンコンコマ（Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ）のフル力（Ｆｌｕｋａ）の製品番号８１３１０〕　Ｌｏｇとを、エチレングリコール（ヴイーダプリュアールの製品番号ＥＭ−ＥＸＯ５６４−１）１０ｍｌおよび脱イオン水５０ｍ１と１０分間１，２リツトルの広口フラスコにおいて混合した。その後、脱イオン水７００　ｍ　ｌを和犬、次いで、磁気バーを用いて５０℃で３時間撹拌を行なった。その後、ランニング緩衝液２００ｍ１を加え、１時間撹拌した。次に、１０％ＳＤＳ１０ｍｌ　（脱イオン水１０ｍ１に完全に溶解した５ＤＳ１．０ｇ）を加え、脱イオン水を加えて最終容量をｌｏｏｏｍｌとし、室温で一晩撹拌した。使用に先立ち、動的架橋組成物を５分間音波処理して気泡を除去した。

動的架橋組成物の粘度の測定を、イリノイ州、シカゴのコル・パーマ−・インコーホレイテッド（Ｃｏｌ−Ｐａｒｍｅｒ、　Ｉｎｃ、　）のＥＬＶ−８（商標）粘度計と組成物１００ｍ１とを使用して行なった。２５℃ズ）とグリセロール（１１００センチポアズ）に対して１５０センチポアズであった。

例ｌｌ５ＤＳ−ｆｉ”−の上記したパラメータの下で低分子量標準の分析に関して、２０分未満で優れた分離と特異性とが得られた。図１は、かかる分析の電気泳動図の結果を示し、ｒＯ，Ｇ、ＪはオレンジＧ内部標準であり、「１」はリゾチームであり、「２」は大豆トリプシンインヒビターであり、　「３」はカルボニックアンヒドラーゼであり、「４」はオボアルブミンであり、「Ｓ」はウシ血清アルブミンであり、「６」はホスホリラーゼｂである。

例ｌｌｌ５ＤＳ−虐・人の上記したパラメータの下で高分子量の標準の分析に関して、２０分未満で優れた分離と特異性とが得られた０図２は、かかる分析の電気泳動図の結果を示し、ＯＧは例ＩＩにおいて定義した通りであり、「１」はオボアルブミンであり、「２」はウシ血清アルブミンであり、「３」はホスホリラーゼｂであり、「４」はベータガラクトシダーゼであり、「５」はミオシンである。

例ＩＶ知られているように、５ＤＳ−ＰＡＧＥプロトコールは、広い分子量範囲に亘る検量線の作成に容易に寄与し得ない。理解されるべきであるように、かかる曲線は、特に、未知のサンプルの分子量の測定に利用することができる。開示されている動的架橋組成物は低〜高分子量の蛋白質（即ち、１０，０００〜２００，０００ドルトン）を効率的に分離するのに使用することができるので、かがる検量線を作成することができる。

図３は、かかる検量線を示すもので、各ポイントは内部標準に対する相対的な各５ＤＳ−蛋白質複合体の移行時間を示す１図３において、「１」はりゾチームであり、「２」は大豆トリプシンインヒビターであり、「３」はカルボニックアンヒドラーゼであり、「４」はオボアルブミンであり、「５」はウシ血清アルブミンであり、「６」はホスホリラーゼｂであり、「７」はベータガラクトシダーゼであり、「８」はミオシンである１図３の検量線の相対標準偏差（Ｒ３Ｄ）ば、０．９８Ｔあ６゜かかる検量線は、未知の蛋白質分子量の測定および天然蛋白質と組換えＤＮＡ技術により得られる蛋白質との比較分析をはじめとする無数の用途を有しているが、かかる用途に限定されるべきではない。

動的架橋組成物を含む上記した毛管カラム及びその使用方法をかなり詳細に説明したが、本発明は好ましい又は開示されている実施態様に限定されるべきではない０本発明は、説明した特定の高性能毛管電気泳動への適用に限定されると解釈されるべきではない、当業者の範囲内にある修正と変更は、以下の請求の範囲に含まれるものである。

５．００　＆ＯＯ１２，００１６，００２０，００時速５．００　８．００　１２．００　１６．００　２０．００時間ＳＤＳ検量線ＲｌｖｌＴ　日Ｒ−ＬＲ−ＨＲ，Ｐｌｏ　３０　１００ＭＷ　（１０Ｅ３）

Claims

【特許請求の範囲】

１．ａ）内表面を有する壁により画定される内部キャビティを有する毛管カラムと、ｂ）ｉ）約０．１％〜約１．５％のポリエチレンオキサイド、ｉｉ）約０．０％〜約２．０％未満のポリエチレングリコール、ｉｉｉ）約０．０％〜約２．０％の界面活性剤、ｉｖ）約０．０Ｍ〜約１．０ＭのｐＨ緩衝剤、およびｖ）約０．０％〜約９９％のポリオールを含んでなり、ｐＨが約２．０〜約１０．０で、粘度が約４，０００センチポアズ未満であり、前記内部キャビティを充填する動的架橋組成物とを含んでなることを特徴とする動的架橋組成物を含む毛管カラム。
２．前記壁の前記内表面にコーティング物質の層をさらに含んでなることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の毛管カラム。
３．前記毛管はガラス、アルミナ、酸化ベリリウム、溶融シリカおよびテフロンよりなる群から選ばれる材料から構成されていることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の毛管カラム。
４．前記毛管は溶融シリカから構成されていることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の毛管カラム。
５．前記毛管の内径は約２μｍ〜約２０００μｍであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の毛管カラム。
６．前記組成物は約１．０％のポリエチレンオキサイドを含むことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の毛管カラム。
７．前記組成物は約１．０％のポリエチレングリコールを含むことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の毛管カラム。
８．前記界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウム、デシル−スルフェート、ポリオキシエチレンエーテル類、ポリオキシエチレンソルビタン類、デオキシコレート、臭化セチルトリメチルアンモニウムおよび塩化セヂルピリジニウムよりなる群から選ばれることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の毛管カラム。
９．前記界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウムであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の毛管カラム。
１０．前記組成物は約０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを含むことを特徴とする請求の範囲第９項に記載の毛管カラム。
１１．前記ｐＨ緩衝剤は紫外線透明性であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の毛管カラム。
１２．前記ｐＨ緩衝剤は両性イオン緩衝剤を含むことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の毛管カラム。
１３．前記ｐＨ緩衝剤は２−（Ｎ−モルホリン）エタンスルホン酸、Ｎ−（２− アセトアミド）イミノ二酢酸、ピペラジン−Ｎ，Ｎ′ −ビス（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、（２−アミノエチル）トリメチル−アンモニウムクロライド塩酸塩、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシ−エチル）−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−２−ヒドロキシ−エチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸、トリスーヒドロキシメチルアミノメタン、Ｎ−トリス（ヒドロキシル−メチル）メチルクリシン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−クリシン、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタン−スルホン酸およびこれらの混合物よりなる群から選ばれることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の毛管カラム。
１４．前記ｐＨ緩衝剤はＴＲＩＳ−ＣＨＥＳ緩衝剤であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の毛管カラム。
１５．前記緩衝剤のモル濃度は１００ｍＭであることを特徴とする請求の範囲第１４項に記載の毛管カラム。
１６．前記組成物のｐＨは約８．０〜約９．０であることを特徴とする請求の範囲第１５項に記載の毛管カラム。
１７．ａ）内表面を有する壁により画定される内部キャビティを有する毛管カラムと、ｂ）ｉ）約１．０％のポリエチレンオキサイド、ｉｉ）約１．０％のポリエチレングリコール、ｉｉｉ）約０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、ｉｖ）約１００ｍＭのＴＲＩＳ−ＣＨＥＳ緩衝剤、およびｖ）約１．０％のエチレングリコールを含んでなり、ｐＨが約８．０〜約９．０で、粘度が約５００センチポアズ未満であり、前記内部キャビティを充填する動的架橋組成物とを含んでなることを特徴とする動的架橋組成物を含む毛管カラム。
１８．ａ）分離されるべき成分を含むサンプルのアリコートを、ｉ）内表面を有する壁により画定される内部キャビティを有する毛管カラムと、ｉｉ）（ａ）約０．１％〜約１．５％のポリエチレンオキサイド、（ｂ）約０．０％〜約２．０％未満のポリエチレングリコール、（ｃ）約０．０％〜約２．０％の界面活性剤、（ｄ）約０．０Ｍ〜１．０ＭのｐＨ緩衝剤、および（ｅ）約０．０％〜約９９．０％のポリオールを含んでなり、ｐＨが約２．０〜約１０．００で粘度が約４，０００センチポアズ未満の、前記内部キャビティを充填する動的架橋組成物とを含んでなる動的架橋組成物を含む毛管カラムに導入する工程、ｂ）少なくとも約１０ボルト／センチメートルの電場を毛管カラムに印加する工程、ｃ）サンプルをその構成部分に分離する工程、及びｄ）サンプルの成分を検出する工程とを含んでなることを特徴とする毛管電気泳動を行なう方法。
１９．前記サンプルは界面活性剤−蛋白質複合体を含むことを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の方法。
２０．前記界面活性剤−蛋白質複合体の前記界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウム、デシル−スルフェート、ポリオキシエチレンエーテル類、ポリオキシエチレンソルビタン類、デオキシコレート、臭化セチルトリメチルアンモニウムおよび塩化セチルピリジニウムよりなる群から選ばれることを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の方法。
２１．前記サンプルはドデシル硫酸ナトリウムー蛋白質複合体を含むことを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の方法。
２２．前記検出はＵＶ吸光分光分析、放射線検出および蛍光検出よりなる群から選ばれることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の方法。
２３．前記検出は１９５−３５０ｎｍの範囲のＵＶ波長におけるＵＶ吸光分光分析であることを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の方法。
２４．前記壁の前記内表面にコーティング物質の層をさらに含むことを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の方法。
２５．前記毛管はガラス、アルミナ、酸化ベリリウム、溶融シリカおよびテフロンよりなる群から選はれる材料から構成されていることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の方法。
２６．前記毛管は溶融シリカから構成されていることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の方法。
２７．前記毛管の内径は約２μｍ〜約２０００μｍであることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の方法。
２８．前記組成物は約１．０％のポリエチレンオキサイドを含むことを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の方法。
２９．前記組成物は約１．０％のポリエチレングリコールを含むことを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の方法。
３０．前記界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウム、デシル−スルフェート、ポリオキシエチレンエーテル類、ポリオキシエチレンソルビタン類、デオキシコレート、臭化セチルトリメチルアンモニウムおよび塩化セチルピリヂニウムよりなる群から選ばれることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の方法。
３１．前記界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウムであることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の方法。
３２．前記組成物は約０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを含むことを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の方法。
３３．前記ｐＨ緩衝剤は紫外線透明性であることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の方法。
３４．前記ｐＨ緩衝剤は両性イオン緩衝剤を含んでなることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の方法。
３５．前記ｐＨ緩衝剤は２−（Ｎ−モルホリン）エタンスルホン酸、Ｎ−（２− アセトアミド）イミノ二酢酸、ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、（２−アミノエチル）トリメチルーアンモニウムクロライド塩酸塩、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシ−エチル）−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−２−ヒドロキシ−エチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸、トリスーヒドロキシメチルアミノメタン、Ｎ−トリス（ヒドロキシル−メチル）メチルグリシン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−グリシン、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタン −スルホン酸およびこれらの混合物よりなる群から選はれることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の方法。
３６．前記ｐＨ緩衝剤はＴＲＩＳ−ＣＨＥＳ緩衝剤であることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の方法。
３７．前記緩衝剤のモル濃度は１００ｍＭであることを特徴とする請求の範囲第３６項に記載の方法。
３８．前記組成物のｐＨは約８．０〜約９．０であることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の方法。
３９．ａ）ｉ）内表面を有する壁により画定される内部キャビティを有する毛管カラムと、ｉｉ）（ａ）約１．０％のポリエチレンオキサイド、（ｂ）約１．０％のポリエチレンクリコール、（ｃ）約０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、（ｄ）約１００ｍＭのＴＲＩＳ−ＣＨＥＳ緩衝剤、および（ｅ）約１．０％のエチレンオキサイドを含んでなり、ｐＨが約８．０〜約９．０で、粘度が約５００センチポアズ未満の、前記内部キャビティを充填する動的架橋組成物とを含んでなる動的架橋組成物を含む毛管カラムにドデシル硫酸ナトリウムー蛋白質複合体を含むサンプルのアリコートを導入する工程、ｂ）少なくとも約１０ボルト／センチメートルの電場を毛管カラムに印加する工程、ｃ）複合体を分離する工程、及びｄ）複合体を検出する工程とを含んでなることを特徴とするドデシル硫酸ナトリウムー蛋白質複合体を含んでなるサンプルに対して毛管電気泳動を行なう方法。