SU1693514A1 - Способ электрофоретического анализа нуклеиновых кислот и устройство дл его осуществлени - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к физико-химическим методам анализа нуклеиновых кислот, в частности к методу электрофоретического анализа первичной структуры (секвенирова- ни ) ДНК или РНК и найдет применение в молекул рно-биологических исследовани х, биотехнологии, медицине и сельском хоз йстве . Целью изобретени   вл етс  повышение производительности и качества разделени . Дл  этого полиакриламидный гель 2 размещают в держателе 1 по внутренней vi/или наружной его цилиндрической поверхности с образованием спо  гел  в виде полого цилиндра. Пробы нанос т на торец сло  гел  по его окружности. Осуществл ют термостатирование гел  средством , содержащим стакан 16, теплообменник 18 и непол рную жидкость 17. На стакане 16 ы СП S

Description

у кромки и на дне установлены электроды 5 и 6, погруженные в электродные растворы, расположенные над и под жидкостью 17. В держателе 1 готов т слой гел  из раствора мономеров. Дл  этого держатель 1 снабжен приводом 13 его вращени , кольцевой вставкой 14 с пазами дл  нанесени  проб, гребенкой и крышкой. Однородный по толщине слой гел  получают путем вращени  держател  со скоростью 800-900 оборотов в минуту и поворота оси его вращени  в горизонтальное положение. В держателе 1 возможно приготовление пластины гел  с разной концентрацией акриламида. Дл 

этого он снабжен группой перегородок и тороидальной вставкой, содержащей отверсти  и группу камер дл  растворов мономеров , Дл  регистрации меченных флюорофорами молекул луч 8 источника 7 направлен в торец сло  2 гел . Приемник 9 флюоресцентного излучени  своим выходом подключен к входу вычислительного блока 11. При этом держатель 1 вращаетс  приводом 13 со скоростью 20-30 об в минуту . Изобретение позвол ет повысить произ- водительность и качество анализа и упростить устройство дл  его осуществлени . 2 с. и 1 з.п.ф-лы, 9 ил.

Изобретение относитс  к физико-химическим методам анализа нуклеиновых кислот , а точнее к методу электрофоретического анализа первичной структуры (секвенировани ) ДНК или РНК, и найдет применение в молекул рно-биоло- гических исследовани х и биотехнологии, а также в медицине и сельском хоз йстве.

Цель изобретени  - повышение производительности и качества разделени .

Цель достигаетс  существенным изменением операций электрофоретического разделени  анализируемых проб и конструкции электрофоретической системы.

На фиг. 1 изображено устройство дл  осуществлени  способа электрофоретического анализа нуклеиновых кислот, общий вид, разрез, слой гел  расположен на внутренней поверхности стакана держател ; на фиг. 2 - то же, слой гел  расположен на наружной поверхности стакана держател ; на фиг. 3 -устройство ; перед

приготовлением ге евых пластин, общий вид, разрез; на фиг. 4 - сечение А-А на фиг, 3; на фиг. 5 - съемна  гребенка; на фиг, 6сечение Б-Б на фиг. 3; на фиг. 7 - тороидальна  вставка в держателе перед приготовлением пластин гел  с .различной концентрацией акриламида, разрез; на фиг. 8 - сечение В-В на фиг. 7; на фиг. 9устройство дл  осуществлени  предлагаемого способа, общий вид, разрез, слой гел  размещен на внутренней и наружной поверхност х стакана держател .

Устройство содержит установленный вертикально держатель 1 гел  цилиндрической формы (фиг. 1) с размещенным в нем гелем 2, электродные растворы 3 и 4, расположенные в верхней и нижней част х держател  1 и наход щиес  в электрическом контакте с гелем. Устройство содержит электроды 5 и 6, погруженные в электродные растворы 3 и 4 и подключенные к источнику тока (не показан) дл  создани  в геле электрического пол , поддействием которого меченные флюрофором молекулы нуклеиновых кислот мигрируют в нижнюю часть гел , где производитс  регистраци  флюоресценции компонетов анализируемой пробы . Дл  осуществлени  такой регистрации устройство содержит источник 7 монохроматического излучени , луч 8 которого направлен в нижнюю часть гел  2 дл  возбуждени  флюоресценции молекул, приемник 9 монохроматического излучени , оптически ориентированный на освещаемый источником 7 участок 10 гел  дл  регистрации флюоресцентного излучени  молекул, и вычислительный блок 11, вход которого подключен к выходу приемника 9. Таким образом , электрические импульсы, свидетельствующие о наличии в участке 10 гел  флюоресцирующих молекул, накапливаютс  в запоминающем устройстве вычислительного блока 11. После окончани  анализа эта последовательность сигналов приемника 9 преобразуетс  в йычислитель- ном блоке 11 в удобную дл  оператора форму , отрахоющую первичную структуру анализируемых нуклеиновых кислот.

Держатель 1 выполнен в виде стакана из диэлектрического материала, например полистирола. Возможно также выполнение держател  1 из нескольких материалов. Например , внутренн   цилиндрическа  поверхность его выполнена из стекла дл  улучшени  адгезии сло  гел  и поверхности держател , а остальна  его часть - из пол- иметилметакрилата. При этом часть из стекла представл ет собой цилиндр, закрепленный в стакане из указанной пластмассы . Наружна  и внутренн   боковые поверхности держател  выполнены цилиндрическими . По меньшей мере на внутренней цилиндрической поверхности держател  1 расположен слой гел  2 (фиг. 1) в виде полого цилиндра с лунками 12 дл  нанесени  анализируемых проб. Лунки 12 выполнены на верхнем торце сло  гел  по окружности. Держатель 1 гел  снабжен при водом 13 его вращени  вокруг оси, при этом держатель закреплен на валу 14 привода 13 посредством фланца 15, Привод 13 снабжен механическим генератором опорных импульсов , количество которых на оборот вала 14 равно количеству дорожек дл  анализируемых проб в геле 2. Кроме того один из опорных импульсов - начальный и имеет длительность больше, чем все остальные опорные импульсы. Он соответствует положению первой дорожки в позиции оптического входа приемника 9. Выход генератора опорных импульсов подключен к входу вычислительного блока 11.

Устройство снабжено средством термо- статировани , содержащим стакан 16 из диэлектрического материала, например полиметилметакрилата, установленный ко- аксиально со стаканом держател  1 и с зазором между боковыми стенками и дном относительно этого стакана. В указанном зазоре расположены неполррна  жидкость 17, например смесь гексанз и четыреххло- ристого углерода с плотностью 1,06 ± С,01 г/см , и теплообменник 18 лз стекл нной трубки, закрепленный на стакане 15 и подключенный через патрубки 19 и 20 к вод ному термостату (не показан). Стрелкам / показано направление протекани  воды через теплообменник. На стакане 16 установлены электроды 5 и б, выполненные из платиновой проволоки в виде колец. Стакан 16 имеет на дне выступ 21, на котором установлен нижний электрод 5. При размещении сло  гел  на внутренней цилиндрической поверхности держатели 1 электрод 5 установлен с наружной стороны стакана 16(фиг. 1). Электродные растворы 3 и 4 расположены в зазоре между стаканом держатели 1 и стаканом 16 под непол рной жидкостью 17 и над ней. Лини ми 22 и 23 показаны границы между непол рной жидкостью 17 и электродными растворами 3 и 4. Плотность нижнего электродного раствора 3 составл ет 1,10 ±0,01 г/см, что достигаетс  за счет присутстви  в нем. сахарозы, плотность раствора 4 около 1,0 г/см3. Таким образом раствор 3, непол рна  жидкость и раствор 4 располагаютс  в стакане 1 в необходимой последовательности (фиг. 1).

При размещении сло  гел  на наружной цилиндрической поверхности стакана 1 держател  (фиг. 2) последний установлен внутри стакана 16 средства термостатировани . В качестве сло  гел  используютс  готоьые пластины гел  2 с лунками 12 дл  анализируемых проб, которые закрепл ютс  на по- верхности стакана держател  с помощью м гких пружинных колец (не показаны). Электрод 5(фиг. 2)установлен с внутренней стороны стакана 16 на выступе 21.

При размещении гел  на внутренней

0 поверхности стакана держател  путем заливки в него раствора мономеров, образующего при полимеризации гель, стакан держател  1 (фиг. 3 и 4) содержит в верхней части кольцевую вставку 24, выполненную,

5 например, из политетрафторэтилена. На наружной ее цилиндрической поверхности выполнены идентичные пазы 25 (фиг. 4 и 3) в форме кольцевых сегментов, образующих щели между внутренней поверхностью ста0 кана держател  1 и вставкой 24. Дл  образовани  лунок 12 (фиг. 1) при полимеризации гел  в стакане держател  1 он снабжен схемными гребенками 26 (фиг. 5) с выступами 27, расположенными в ука5 занных щел х. Дл  установки гребенок 26 в стакан держател  1 на наружной поверхности кольцевой встацки 24 выполнена также кольцева  проточка 28 (фиг. 1) ка глубину пазов 25. Стакзн держател  1 снабжен так0 же герметизирующим кольцом 29, выполненным , например, из вакуумной резины, и крышкой 30 стакана держател  1. Гребенки 26, кольцо 29 и крышка 30 установлены последовательно при формировании сло  гел 

5 из раствора мономеров. Крышка 30 скабжа- . нэ отверстием 31 дл  заливки этого раствора Б стакан держател  1. Крышка закрепл етс  с помощью фиксаторов (не показаны ) за выступ 32 стакана держател  1.

0 Привод 13 вращени  держател  гел  установлен на поворотной платформе 33 (фиг. 3)дл  поворота оси вращени  держател  на 90°. С этой целью устройство снабжено приводом 34 платформы 33, с которым она сое5 динена посредством вала 35. Платформа снабжена фиксаторами крайних положений (не показаны).

Стакан держател  1 содержит группу перегородок 36 (фиг. 3) из диэлектрического

0 ма ериала, например полиметилметакрилата , установленных равноудаленно на его внутренней поверхности вдоль образующей от дна стакана до кольцевой вставки 24. Перегородки 36 выполнены Т-образными в

5 сечении (фиг. 6).

При формировании сло  гел , состо щего из отдельных пластин, устройство дополнительно снабжено тороидальной вставкой 37, закрепленной на крышке 30 посредст- - вом четыре стоек 38, и содержит выполненные из полиметилметакрилата корпус 39, крышку 40 и перегородки 41, количество которых равно количеству перегородок 36 (фиг. 8). Перегородки 41 образуют в полости вставки 37 камеры равного объема. В верхней части наружной боковой стенки тороидальной вставки 37 в месте соеденени  крышки 40 и корпуса 39 в последнем выполнены пр моугольные отверсти  42 (фиг, 7 и В ) дл  выхода растворов мономеров из камер вставки 37 при вращении стакана держател . Дл  внесени  растворов мономеров в камеры тороидальной вставки 37 в крышке 30 выполнены отверсти  43.

Возможно выполнение стакана держател , при котором его внутренн   бокова  поверхность равномерно расшир етс  от его верхнего торца ко дну (не показано). Конусность при таком выполнении составл ет около 0,07° или 0,001 рад.

В устройстве (фиг.. 1 и 2) источник 7 монохроматического излучени  установлен так, что луч 8 от него направлен вдоль образующей стакана держател  в нижний торец сло  гел , а приемник 9 закреплен в боковой стенке стакана 16 или средства термостати- ровани  и оптически ориентирован перпендикул рно слою гел .

При размещении сло  гел  на внутренней и наружной цилиндрической поверхност х стакана держател  1 (фиг. 9) устройство содержит модул тор 44 луча света источника 7 монохроматического излучени  дл  направлени  луча 8 попеременно (лучи 45 и 46} в торец каждого из слоев гел . Дл  регистрации флюоресценции, возникающей в геле 2, устройство содержит также дополнительный приемник 47 монохроматического излучени , выход которого подключен к входу 48 блока 11, при этом выход приемника 9, регистрирующего излучение сло  гел  2, подключен к входу 49 этого блока.

При таком выполнении устройства стакан держател  1 (фиг. 9) снабжен цапфой 50 на дне стакана и фланцем 51 в его верхней части дл  обеспечени  возможности его вращени . С этой целью стакан установлен цапфой 50 в опоре 52 и снабжен подшипником 53, установленным вблизи фланца 51. Фланец 51 выполнен в виде шкива зубчато- ременной передачи, осуществл емой также посредством зубчатого ремн  54 и ведущего шкива 55, закрепленного на валу 56 привода 13 вращени  держател  вокруг оси. Опора 52 установлена в выступе 21 стакана 16 средства термостатировани .

Стакан держател  1 установлен коакси- ально внутри стакана 16 средства термостатировани  (фиг. 9), В стакане 1 установлен коаксиально стакан 16 средства термостатировани . В зазорах между этими стаканами наход тс  электродные растворы 3 и 4 и непол рна  жидкость 17, а также теплообменники 18, подключенные через патрубки

19 и 20 к вод ному термостату, На стаканах 16 установлены кольцевые электроды 5 и G, подключенные к источнику тока,

Устройство работает следующим образом .

0В стакан держател  1 в его вертикальном положении устанавливают кольцевую вставку 24 до соприкосновений ее нижнего торца с перегородками 36 (фиг. 3) и так, чтобы кольцева  проточка 28 (фиг, 1) оказа5 лась сверху. Затем в эту проточку и в щели, образованные пазами 25, устанавливают гребенки 26 (Фиг, 5), после чего - кольцо 29 v, крышку 30 (фиг 3). Последнюю закрепл ют в держателе фиксаторами за выступ 32,

0 что обеспечивает герметичное прижатие кольца 29 к стакану держател  1.

Через отверстие 31 в крышке 30 ввод т до дна держател  трубку дл  подачи инертного газа или азота и осуществл ют ззпол5 нение стакана держател  этим газом в течение 2-3 мин при расходе газа 5-10 л в минуту.

Затем газовую трубку удал ют и через отверстие 31 в стакан заливают смесь моно0 меров. Объем смеси предварительно рассчитывают , исход  из необходимости толщины сло  гел . Сразу после заливхи смеем включают привод 13 вращени  держател  и увеличивают скорость его вращз5 нил до 80,0-900 об. в минуту. В результате раствор мономерог покрывает всю внутреннюю цилиндрическую поверхность стакана, но толщина сло  гел  при этом неодинакова по высоте стакана. Затем включают привод

0 34 (фиг. 3) и одновременно отключают фиксатор вертикального положени  стакана держател  1 дл  перевода оси его вращени  в горизонтальное положение. По достижении стаканом держател  1 этого положени 

5 включают фиксатор горизонтального положени  стакана держател  1. В этом положении смесь мономеров покрывает поверхность стакана держател  1 равномерным слоем одинатоковой толщины и за0 текает также в щели, образованные пазами 25 кольцевой вставки 24 и стаканом держатели 1. При этом пузыри воздуха из этих щелей выдавливаютс  через участки соприкасающихс  поверхностей гребенки, пазов

5 25 и стакана держател  1 раствором мономера за счет действи  на него центробежных сил,

Вращение стакана держател  1 в гор- зонтальном его положении провод т в течение 20-30 мин, за это врем  происходит

полимеризаци  мономеров с образованием сло  гел . Затем стакан держател  возвращают в вертикальное положение приводом 34 и снимают крышку 30 и кольцо 29. На этом заканчиваютс  операции размещени  сло  гел  на внутренней цилиндрической поверхности стакана держател  1 путем заливки в него раствора мономеров.

Дл  продолжени  анализа в стакане держател  1 (фиг. 1) подвешивают и жестко закрепл ют коаксиально с ним и с зазором стакан 16 средства термостатировани  с закрепленными на нем электродами 5 и 6, теплообменником 18 и приемником 9. В зазор заливают сначала нижний электродный раствор 3 до уровн , расположенного немного ниже оптического входа приемника 9, после чего заливают непол рную жидкость примерно до половины высоты кольцевой вставки 24, затем верхний электродный раствор до выступа 32 (фиг. 1 и 3). Пинцетом извлекают из проточки 28 гребенки 26 и шприцом промывают гелевые торцы в лунках 12, использу  дл  этого раствор 4.

Включают термостат и прогревают непол рную жидкость до необходимой температуры , равной обычно 323 К, на торцы гел  в лунках 12 нанос т капилл ром анализируемые пробы в объеме 1-2 мкл и подают необходимое напр жение на электроды 5 и 6. Затем включают привод 13 стакана держател  1 и устанавливают скорость его вращени  равной 20-30 об. в минуту. После этого включают источник 7, приемник 9 и вычислительны и блок 11. В результате начинаетс  электрофоретическое разделение анализируемых проб при контролируемых температурных услови х и прогрев блоков регистрации (источника 7, приемника 9 и вычислительного блока 11).

Под действием электрического пол  молекулы нуклеиновых кислот мигрируют в направлении анодного торца гел  (фиг. 1). В зависимости от величины зар да и размеров молекулы приобретают разные скорости , что приводит к разделению смеси молеку/; на отдельные ее компоненты, кажда  из которых представлена в геле зоной, содержащей одинаковые молекулы, мигрирующие с одной скоростью. В нижней части гел  2 (фиг. 1) достигаетс  оптимальное разделение этих зон и они могут быть зарегистрированы раздельно. Дл  регистрации молекул нуклеиновых кислот в процессе их электрофоретического разделени  к ним перед анализом ковалентно присоедин ют молекулы флюоренсцирующего вещества, служащего меткой анализируемых молекул.

По достижении лидирующей зоной участка 10 гел  начинаетс  автоматическа  регистраци  компонентов анализируемых проб. При этом по опорным и начальному импульсам, поступающим в блок 11 от привода 13, в группы  чеек пам ти блока 11, количество которых равно количеству дорожек дл  анализируемых проб, занос тс  импульсы , поступающие от приемника 9. За врем  электрофоретического прохождени  любой из зон участка 10 гел  проводитс 

0 несколько дес тков измерений интенсивности флюоресценции каждой из зон. Это позвол ет уменьшить статистическую погрешность результатов анализа.

С целью повышени  производительно5 сти анализа путем сокращени  времени его выполнени  в устройстве возможно проведение анализа одновременно в нескольких пластинах гел , имеющих различную концентрацию акриламида. Анализ в устройст0 ве в этом случае выполн ют следующим образом.

После установки в стакан держател  1 кольцевой вставки 25 (фиг, 3-5), гребенки 26 и кольца 29 з него устанавливают крышку 30

5 (фиг. 7)с закрепленной на ней тороидальной вставкой 37. Крышку 30 поворачивают вокруг оси стакана держател  1 так, чтобы перегородки 41 оказались напротив перегородок 36 стакана держател  1 (фиг. 8),

0 после чего крышку 30 закрепл ют фиксаторами аналогично указанному. Осуществл ют заполнение стакана держател  1 инертным газом или азотом и затем через отверстие 43 в крыщке 30 (фиг. 7) заливают

5 в камеру вставки 37 растворы мономеров. . Количество отдельно приготовленных растворов равно количеству камер, а растворы с одинаковой концентрацией акриламида заливают в камеры, расположенные во

0 вставке 37 одна напротив другой. Таким образом с помощью вставки 37 (фиг. 7 и 8) заливают четыре пластины гел , из которых две имеют низкую, например 8%, а две - высокую, например 16%, концентрации ак5 риламида.

Включают привод 13 и по мере увеличени  оборотов стакана держател  1 растворы мономеров выливаютс  за счет центробежных сил из камер через отверсти  42 на

0 позерхность стакана держател  1, причем каждый раствор - на участок, ограниченный перегородками 36, дном стакана держател  1, вставкой 24 и гребенкой 26. Быстро возрастающие центробежные силы преп тст5 вуют стеканию растворов на дно стакана держател  1. Дальнейша  работа устройства аналогична указанной за исключением операции внесени  в лунки 12 (фиг. 1) анализируемых проб. Каждую пробу раздел ют на две части, одну из которых нанос т на

гель с низкой концентрацией акриламида, а другую - на гель с высокой его концентрацией .

Возможно использование готовых пластин гел , При размещении пластин гел  на наружной цилиндрической поверхности стакана держател  1 устройство работает следующим образом.

П р и м е р 1. Подготовку устройства к заливке в стакан держател  1 раствора мономеров провод т по (фиг. 1). Раствор мономеров готов т из расчета получени  сло  гел  толщиной 0,3 мм, объемом 36 мл в стакане держател , имеющем внутренний диаметр 200 мм и высоту поверхности дл  сло  гел  200 мм. Раствор мономеров дл  проведени  секвенирующего электрофореза в 8%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих услови х содержит в 36 мл раствора 2,9 г акриламида, 0,15 г бисакриламида, 0,036 мл ТЕМЕД, 0,018 г персульфата аммони , 0,39 г трис-ОН, 0,2 г борной кислоты, 0,035 г ЭДТА (натриева  соль) и 15,1 г мочевины.

Затем раствор мономеров сразу после приготовлени  (персульфат аммони  и ТЕМЕД добавл ют в последнюю очередь) заливают в стакан держател  1 и выполн ют операции полимеризации сло  гел . Слой гел  после полимеризации раствора мономеров имеет гладкую поверхность без остатков жидкой фазы.

Используют электродные растворы следующего состава. Раствор 4 (верхний); 1 л раствора содержит 10,8 Трио ОН, 5,5 г борной кислоты, 0,93 г ЭДТА Na2 2НаО и рН 8,3, раствор 3 (нижний) - те же компоненты и дополнительно в 1 л 260 г сахарозы. 8 качестве непол рной жидкости используют смесь гексана и четыреххлористого углерода с плотностью 1,06±0,01 г/см3.

Растворы заливают в указанной последовательности , после чего выполн ют остальные операции до нанесени  анализируемых проб на гель.

В каждую лунку 12 (фиг. 1) внос т по 1,5 мкл раствора 4, содержащего мочевину (7 М) и по 0,025% маркерных красок: бромфено- лового голубого и ксиленцианолового, после чего на электроды подают напр жение. Электрофорез ведут при напр жении 650 В, при этом величина тока через слой гел  составл ет 70-75 мА. Скорость движени  красителей составл ет дл  бромфенолового голубого, имеющего электрофоретическую подвижность, эквивалентную молекулам ДНК или РНК длиной в 25-30 нуклеотидов, 175 мм в час, дл  ксиленцианолового, имеющего подвижность, эквивалентную молекулам длиной 70-85 нуклеотидов. 93 мм в

час. Результаты замеров рассто ний, пройденных красками через 1 и 2 ч во всех дорожках сло  гел  дали разбор значений 0,3-0,5 мм, что при разрешении зон, оавном

1,2-1,4, достигаемом в пластине используемой длины, соответствует погрешности электрофоретического анализа менее 0,5%. П р и м е р 2. Подготовку проб, меченных флюорофором, дл  определени  первичной

0 структуры ДНК по предлагаемому способу провод т следующим образом.

Набор фрагментов секвенируемой молекулы ДНК получают методом терминировани  реакции полимеразного копировани 

5 ДНК по Сенгеру. Дл  мечени  фрагментов ДНК флюорофором используют химически синтезированную олинонуклеотидную затравку . Синтез фрагментов ДНК ведут в системе фага М13. Затравку коньигируют с

0 флюоресцеином.

К 2 мкл раствора, содержащего около 0,2 пмоль анализируемой ДНК, добавл ют 0,6 пмоль меченной затравки в объеме 0,5 мкл. Затравка должна быть растворена в

5 дес тикратном буферном растворе следующего состава: 0,5 М NaCI, 66 мМ трис-НС1, рН 7,4, 66 мМ MgCia, Ю мМ ДТТ. Тщательно перемешивают полученную смесь и помещают ее в кип щую вод ную баню объемом

0 500 мл на 3 мин. Затем баню выключают и оставл ют остывать до комнатной температуры , что происходит примерно в течение двух часов. По окончании в реакционной смеси образуютс  гибридные молукулы

5 ДНК + затравка. Затем к смеси добавл ют до конечного объема 10 мкл буферный раствор состава; 50 мМ трис-HCI, рН 8,5 мМ MgCl2, 2 . Разбавленную таким образом смесь дел т по 2 мкл в четыре пробир0 ки дл  проведени  реакции терминировани  полимеразного копировани  по четырем основани м.

В каждую пробирку добавл ют по 1 мкл смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов

5 (dN TP), конценраци  каждого 0,125 мМ, и по 1 мкл соответствующих дидезоксирибо- нуклеозидтрифосфатов (ddN TP) в следующих мол рных соотношени х: d A/dd , dT/dd , dG/ddG 6, dC/ddC 2,5. В каж0 дую пробирку добавл ют по 1 мкл раствора . обратной транскриптазы с удельной активностью 1 ед./мкл, тщательно перемешивают и инкубируют при 37° С в течение 15 мин. Затем в каждую пробу добавл ют по 1 мкл

5 смеси dN TP в концентрации 0,5 мМ каждого и инкубируют еще 15 мин. Реакцию останавливают добавлением 5 мкл 99%-ного раствора формамида с красками: бромфеноловым голубым и ксиленцианоло- вым (0,5% каждого) и 20 мМ ЭДТА.

Провод т полимеризацию сло  гел  в держателе 1 (фиг. 1) и заливку электродных растворов непол рной жидкости по примеру 1. Пробы, полученные ранее, кип т т в течение 3 мин и нанос т на гель. В каждую лунку 12 внос т по 2 мкл анализируемой пробы и провод т злектрофоретическое разделение и регистрацию компонентов анализируемых проб указанным образом. При регистрации в устройстве используют аргоновый лазер в качестве источника 9 монохроматического излучени . Дл  выделени  флюоресцентного излучени  используют интерференционный фильтр на 520 нм.

В изобретении использование радиаль- но-симметричного принципа при размещении сло  гел  в держателе, при его термостатировании и регистрации компонентов анализируемых проб позвол ет повысить производительность и качество анализа и упростить устройство дл  его проведени . Например, при диаметре стакана держател , равном 240 мм, анализ можно вести по 160 дорожкам, т.е. параллельно анализировать первичную структуру 40 фрагментов ДНК длиной по 300 нуклеоти- дов каждый. Это соответствует производительности секвенировани , равной 25-30 тыс. нуклеотидов в сутки, т.е. в 25-30 раз выше, чем при использовании известного устройства. При этом увеличение ширины гел  с целью дальнейшего повышени  производительности анализа приводит к увеличению диаметра стакана держател  лишь на 1 /3. Таким образом, в устройстве луч источника монохроматического излучени  направлен в нижнюю часть гел , приемник монохроматического излучени  оптически ориентирован на освещаемый источником монохроматического излучени  участок гел , вычислительный блок входом подключен к выходу приемника монохроматического излучени , держатель гел  выполнен в виде стакана из диэлектрического материала, по меньшей мере на внутренней цилиндрической поверхности которого расположен слой гел  в виде полого цилиндра с лунками дл  анализируемых проб на его торце по окружности, держатель гел  снабжен приводом его вращени  вокруг оси, имеетс  средство тер- мостатировани , содержащее стакан из диэлектрического материала, установленный коаксиально со стаканом держател  и с зазором между боковыми стенками и дном относительно этого стакана, непол рную жидкость и теплообменник, расположенные в зазоре между стаканами, электроды выполнены кольцевыми и установлены коаксиально со стаканом средства

термостатировани  один в верхней части этого стакана, а другой - на дне этого же стакана снаружи или внутри, при этом электродные растворы расположены в зазоре между стаканами под непол рной жидкостью и над ней,

Такое выполнение способа электрофоре гического анализа нуклеиновых кислот и устройства дл  его осуществлени  позвол 0 ет резко поьысить производительность анализа за счет увеличени  ширины пластины гел  и, следовательно, количества дорожек дл  анализируемых проб.

Благодар  радиально-симметричному

5 расположению гел , электродов и элемента термостатировани  и выбору направлени  электрофореза вдоль образующей обеспечиваютс  идентичные дл  всех дорожек услови  разделени  анализируемых молекул.

0 Вследствие этого повышаетс  качество анализа: улучшаютс  достоверность и воспроизводимость результатов и повышаетс  их точность.

Вращение держател  вокруг его оси в

5 процессе электрофореза, осуществл емое с целью регистрации компонентов анализируемых проб, обеспечивает вместе с тем посто нное и равномерное перемешивание как буферных растворов, так и непол рной

0 жидкости, что также способствует повышению качества анализа за счет поддержани  однородного состава буферных растворов, удалени  пузырьков газа с электродов и улучшени  теплопередачи непол рной жид5 кости.

Перемещение гел  относительно луча источника монохроматического излучени , осуществл емое путем вращени  держател , обеспечивает одинаковые и геометриче0 ски правильные стартовые участки гелевой пластины. Кроме того, упрощение устройства достигаетс  за счет простых и надежных средств герметизации и исключени  необходимости в спейсе-рэх (прокладках, опре5 дел ющих толщину гелевой пластины).

Заливку раствора мономеров в держатель и его вращение до достижени  скорости , при которой раствор мономеров покрывает всю внутреннюю цилиндриче0 ск/ю поверхность держател , осуществл ют при вертикальном расположении оси вращени  держател , а окончательную полимеризацию гел  - при горизонтальном ее расположении. Дл  этого в устройстве при5 вод вращени  держател  гел  установлен на поворотной платформе дл  поворота оси вращени  держател  и, следовательно, повышает качество анализа.

При формировании сло  гел , состо щего из отдельных пластин, оно дополнительно снабжено тороидальной вставкой дл  размещени  раствора мономеров, закрепленной на крышке стакана держател , с радиальными перегородками по количеству перегородок стакана держател  и с отвер- ста ми, выполненными э верхней части ее наружной боковой стенки.

Это позвол ет сформировать в одном держателе несколько пластин гел , имеющих различную пористость и. следователь- но,оказывающихразличное

задерживающее воздействие на низкомолекул рные и высокомолекул рные компоненты анализируемых проб, Тем самым достигаетс  выравнивание разрешени  ука- занных компонентов проб, т.е, повышение качества анализа. Возможность осуществлени  этого в одном держателе и в ходе одного и того же анализа обеспечивает повышение производительности работы и уп- рощение устройства дл  осуществлени  анализа. Вместе с тем использование пластин гел  с разной концентрацией акрила- мида дл  анализа одной и той же пробы позвол ет сократить врем  его проведени , так как высокомолекул рные компоненты пробы можно регистрировать в пластине с низким содержанием акриламида, где их подвижность выше, чем в пластине с низкой пористостью. Необходимое разделение низкомолекул рной части анализируемой пробы достигаетс  за то же врем  в пластине с высоким содержанием акриламида. Таким образом, за счет сокращени  времени анализа достигаетс  повышение его произ- водительности.

Внутренн   бокова  поверхность стакана держател  выполнена равномерно расшир ющейс  от его верхнего торца к дну. Благодар  этому возможно получение пла- стины гел , у котброй сечение равномерно возрастает от стартовой зоны в направлении миграции анализируемых молекул. Это приводит к постепенному снижению плотности тока в указанном направлении, что способствует выравниваю разрешени  дл  коротких и длинных полимерных цепей нуклеиновых кислот. Таким образом достигаетс  повышение качества анализа.

Источник монохроматического излуче- ни  установлен так, что луч света от него направлен вдоль образующей стакана держател  в нижний торец сло  гел , а прием- ник монохроматического излучени  закреплен в боковой стенке средства термо- статировани  вблизи его дна и оптически ориентирован, перпендикул рно слою гел .

Такое выполнение системы регистрации компонентов анализируемых проб позвол ет устранить вли ние флюоресценции

материала стакана держател  на результаты измерени  флюоресценции анализируемых молекул благодар  тому, что участок держател , освещаемый источником излучени , пространственно отделен от участка, на который сориентирован приемник монохроматического излучени . Это обеспечивает повышение качества анализа.

Ошибка анализа при использовании изобретени  в 2-3 раза ниже, чем при использовании известного. Однако это не единственный показатель повышени  хачз- ства, необходимо также учитывать факторы, не поддающиес  пр мой количественной оценке. Это уменьшение веро тности критических ситуаций и сбоев и снижение вли ни  дестабилизирующих факторов на процесс анализа.

Claims (3)

1.Способ электрофоретического анализа нуклеиновых кислот, включающий приготовление гел  полимеризацией в держателе из раствора мономеров, нанесение на гель анализируемых проб, вохдействие на них электрического пол  и регистрацию проб в процессе электрофоретического разделени , отличающийс  тем, что, с целью повышени  производительности и качества разделени , разделение провод т в геле, выполненном в виде полого цилиндра, причем анализируемые пробы нанос т на торец сло  гел  по окружности, воздействие на пробы электри- ческо о пол  осуществл ют вдоль образующей цилиндрического гел , а регистрацию компонентов гел  осуществл ют при вращении его вокруг оси, причем перед заливкой раствора мономеров держатель заполн ют инертным газом или азотом.

2.Устройство дл  электрофоретического анализа нуклеиновых кислот, содержащее установленный вертикально держатель гел  цилиндрической формы с размещением в нем гел , электродные растворы, расположенные в верхней и нижней част х держател  и наход щиес  в электрическом контакте с гелем, электроды, погруженные в электродные растворы и подключенные к источнику тока, средство дл  формировани  сло  гел , источник монохроматического излучени , луч которого направлен в нижнюю часть гел , приемник монохроматического излучени , оптически ориентированный на освещаемый источником монохроматического излучени  участок гел , и вычислительный блок, вход которого подключен к выходу приемника монохроматического излучени , отличающеес  тем, что, с целью повышени  производительности и качества анализа, держатель дл  гели  и средство дл  термостатировани  выполнен

в виде коаксиально расположенных стаканов из диэлектрического материала, установленных с зазором, в котором циркулирует хладагент, в качестве которого использована непол рна  жидкость, причем электродные растворы расположены в зазоре между стаканами над непол рной жидкостью и под ней, электроды выполнены кольцевыми и установлены коаксиально по отношению к центральной оси, при этом стакан держател  содержит в верхней части кольцевую вставку с выполненной на ее наружной цилиндрической поверхности группой индентичных пазов в форме кольцевых сегментов, образующих щели между внутренней поверхностью стакана держател  и вставкой, и группу Т-образных перегородок

0

5

из диэлектрического материала, установленных равноудаленно на его внутренней поверхности вдоль образующей от дна стакана до кольцевой вставки, причем внутренн   бокова  поверхность стакана держател  выполнена равномерно расшир ющейс  от его верхнего торца ко дну.

3. Устройство поп. 2,отличающее- с   тем, что средство дл  формировани  сло  гел  выполнено в виде тороидальной вставки дл  раствора мономеров, снабжено радиальными перегородками по количеству перегородок держател  гел  и отверсти , выполненными в верхней части ее наружной боковой стенки, и расположено на крышке стакана - держател .

2

Фиг. 2

35

L

гИ

У.

35

34

Ј

Фиг 4

16

4 Хй

W2.J

Фиг.&

43

40/

Фиг. 6

43

Фаг, 7

© с

го «ха

ч