DE3839871A1 - Verfahren und einrichtung zur elektrophoretischen bestimmung der primaeren struktur von nukleinsaeuren - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf elektrophoretische Verfahren und betrifft insbesondere ein Verfahren zur elektrophoretischen Bestimmung der primären Struktur der Nukleinsäuren sowie eine Einrichtung für seine Durchfüh­ rung.

Die Erfindung kann in der Molekularbiologie und Bio­ technologie erfolgreich verwendet werden.

Die Entwicklung der Verfahren zur Bestimmung der pri­ mären Struktur, der Aufeinanderfolge der DNS und RNS bestimmt in vielem die Erfolge der Gentechnik, die in den moleku­ lar-biologischen Forschungen und in der Biotechnologie zum Einsatz kommt. Von den Ergebnissen dieser Branchen der Forschungen hängt der Fortschritt auf dem Gebiet der medizinischen Versorgung der Bevölkerung und die Effektivität der Landwirtschaft ab.

Die Bestimmung der Aufeinanderfolge der DNS und RNS er­ möglichst es, die Struktur der einzelnen Gene eines tierischen, pflanzlichen oder bakteriellen Genoms zu bestimmen. Da die funktionellen Eigenschaften biologischer Moleküle durch ihre Struktur bestimmt werden, gibt das Wissen von dieser Struk­ tur die Möglichkeit, Moleküle mit erforderlichen Eigenschaf­ ten zu entwickeln. Mikroorganismen, in die man die erfor­ derlichen Gene einführen kann, können zu "Fabriken" für die Erzeugung großer Mengen von Arzneimitteln, Wachstums­ hormonen und anderen nützlichen Produkten werden.

Die Aufgabe einer wesentlichen Verbesserung der be­ stehenden Technologie der Sequenz-Bestimmung entstand im Zu­ sammenhang mit der Notwendigkeit, die Genome des Menschen, der Haustiere, der Pflanzen und einiger Mikroorganismen zu entziffern. Die Ergebnisse können zwei wichtige Fol­ gen haben. Einerseits wird die Kenntnis der Struktur des ganzen Genoms ausreichendes Material für die Untersuchung der Organisation der Erbinformation in einem lebenden Organismus und der Gesetzmäßigkeiten ihrer Realisierung geben. Es wird möglich sein, viele experimentelle Anga­ ben, die beispielsweise von der Molekularbiologie in den vergangenen Jahren erzielt wurden, zu ordnen. Neben ei­ ner rein wissenschaftlichen Bedeutung erschließt die Sequenz­ Bestimmung neue praktische Möglichkeiten. Es wird mög­ lich sein, sowohl einzelne Gene als auch Gruppen von Ge­ nen mit dem Ziel der Behandlung von Erbkrankheiten eines Menschen, der Erhöhung der Resistenz von Pflanzen bezie­ hungsweise der Verbesserung der Produktivität von Haus­ tieren und Pflanzen zu rekonstruieren. Von Bedeutung ist ebenfalls die Tatsache, daß es die gentechnische Metho­ de im Unterschied zu den klassischen Methoden der Medi­ zin und Selektion ermöglicht, nützliche Ergebnisse prak­ tisch in einer wesentlich kürzeren Zeit zu erzielen.

Der Träger der genetischen Information, die DNS, stellt ein Polymer dar, das sich aus vier Monomeren, Nukleotiden, zusammensetzt. Sie werden üblicherweise mit den Buchstaben A, T, G und C bezeichnet. Die Aufeinander­ folge ihrer Anordnung in der Polymerisationskette einer DNS bestimmt die Information, die den Genen und einem Ge­ nom insgesamt zugrundeliegt. Die Genome verschiedener Or­ ganismen enthalten von einigen Millionen bis Milliarden Nukleotiden. Bei der bestehenden Technologie werden in­ nerhalb eines Jahres in der ganzen Welt Abschnitte der Genome mit einer Länge lediglich von 1 Million der Nukleo­ tide sequenciert. Für die Entschlüsselung, beispielsweise lediglich eines menschlichen Genoms, das 3 Milliarden Nu­ kleotide aufweist, würden demzufolge 3000 Jahre benötigt. Deshalb sind zur Lösung der Aufgabe der Sequencing ganzer Genome mit realer Dauer und mit realen Aufwendungen in er­ ster Linie hochleistungsfähige automatisierte und relativ billige Einrichtungen erforderlich, die auf der Grundlage von prinzipiell neuen Technologien arbeiten.

Die Sequencing der DNS und RNS sieht eine Reihe von Etappen vor, von denen das Verfahren zur elektrophore­ tischen Bestimmung der primären Struktur der Nukleinsäu­ ren besonders bedeutungsvoll ist. Die Hauptprobleme dieser Etappe, die beim Übergang zur großtechnischen Se­ quenz-Bestimmung entstehen, sind auf die beschränkten Möglichkei­ ten zur Erhöhung der Leistung des Verfahrens, auf die niedrige Präzision und auf die Kompliziertheit der einzu­ setzenden Einrichtungen zurückzuführen.

Bekannt ist ein Verfahren zur elektrophoretischen Bestimmung der primären Struktur der Nukleinsäuren (J. Hindley, "DNA sequencing", in "Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology, vol. 10, 1983, El­ sevier biomedical press, Amst., N. Y., Oxford, p. 78-83), das darin besteht, daß man Proben der Nukleinsäure in Form von Fragmenten der Abschnitte ihrer Polymerisations­ kette, die radioaktive Markierungen aufweisen, in einer Schicht von Gel in Form einer vertikal angeordneten Plat­ te, an ihrem oberen Ende unterbringt. Die Herausbildung der Gelschicht erfolgt mittels seiner Polymerisation aus einer Monomerenlösung, die in eine Küvette eingegossen wird. Die Küvette wurde in Form von zwei Glasplatten aus­ geführt, zwischen denen zwei Zwischenlagen angebracht sind, deren Stärke die Stärke der Gelschicht, üblicherweise von 0,25 bis 0,35 mm vorgibt. Für die Montage der Küvette verwendet man eine abdichtende Folie. Vor der Polymeri­ sation der Gelschicht wird die Oberfläche einer der Plat­ ten mit einer Lösung behandelt, die ihr hydrophobe Eigen­ schaften verleiht, wonach man die Zusammenstellung der Küvette auf eine solche Weise vornimmt, daß die behandel­ te Oberfläche dem Innern der Küvette zugewandt war.

An die Gelschicht wird Spannung angelegt, was eine elektrophoretische Trennung der Fragmente in der Höhe der Gelschicht gemäß der Größe der Fragmente hervorruft, die ihr Wanderungsvermögen bestimmt. Wenn das kleinste Frag­ ment das untere Ende der Gelschicht erreicht, worüber man nach der Lage des jeweiligen Farbstoffes urteilt, der zu­ sammen mit den Proben eingetragen wird und der elektro­ phoretische Beweglichkeit aufweist, die der Beweglichkeit des kleinsten der Fragmente gleich ist, wird die Span­ nung abgeschaltet. Dann wird die Küvette auseinanderge­ nommen, die behandelte Platte wird abgenommen. Die Gelschicht, die auf der zweiten Platte übrigbleibt, wird getrocknet und an sie wird Röntgenfilm zur Registrierung der Radioaktivität der Band der abgetrennten Fragmente angelegt. Die Expositionszeit dauert von 1 bis 3 Tagen. Dann wird der Film entwickelt. Nach der Lage der Schwär­ zungsbande am Film urteilt man über die Sequenz der Nu­ kleotide in einem Molekül der zu analysierenden Nuklein­ säure.

Bekannt ist eine Einrichtung für die Durchführung des Verfahrens zur elektrophoretischen Bestimmung der primären Struktur der Nukleinsäuren (T. Hindley, "DNA se­ quenving" in "Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology", vol. 10, 1983 Elsevier biomedical press, Amst., N. Y., Oxford, p. 78-83), die eine vertikal aufgestellte Küvette zur Anbringung der Gelschicht mit den Proben der Nukleinsäure enthält. Die Küvette ist in Form einer rechteckigen Kammer ausgeführt, die durch zwei po­ lierte Gläser mit zwei Zwischenlagen gebildet wird. Die Platten sind miteinander mit einem Klebeband verbunden. Für die Bildung von Aushöhlungen in der Gelschicht zum Eintragen von Proben ist die Kammer mit einem Mittel zur Ausbildung der Aushöhlungen versehen.

Die Einrichtung enthält auch Kammern mit Elektroden­ lösungen, die im oberen und im unteren Teil der Küvette befestigt sind und so ausgeführt werden, daß die Lösungen mit der Küvette kommunizieren. In den Kammern mit den Elektrodenlösungen liegen Elektroden, die an eine Strom­ quelle angeschlossen sind.

Zur Registrierung der Ergebnisse der elektrophoreti­ schen Trennung ist die Einrichtung mit Röntgenfilm ver­ sehen.

In dem genannten Verfahren ist eine Reihe von Opera­ tionen vorgesehen: Zusammenstellung der Küvette, die An­ bringung der Gelschicht in der Küvette, die mitels ein­ gießens einer Monomerenlösung in dieselbe erfolgt, die das Auseinandernehmen der Küvette und die Vorbereitung der Gelschicht zur Autoradiografie sind äußerst arbeitsauf­ wendig, was eine niedrige Leistung des Verfahrens bestimmt. Diese Arbeitsgänge verlangen außerdem hohe Arbeitsfertig­ keiten vom Bedienungspersonal. Beim Eingießen der Monomeren­ lösung in die Küvette ist, beispielsweise, die Entste­ hung von Luftblasen in der Gelschicht möglich, was zu ei­ ner wesentlichen Krümmung der Linien des Stromfeldes im Gel führt und die Interpretation der Ergebnisse der Trennung erschwert, und bei der Abtrennung der Platte während des Auseinandernehmens der Küvette nach der Elek­ trophorese zur Autoradiografie des Gels ist die Beschädi­ gung der Gelschicht möglich, was zum Verlust eines Teils beziehungsweise aller Ergebnisse der Analyse führt. Das setzt auch die Leistung des Verfahrens herab.

Das beschriebene Verfahren zeichnet sich durch eine langwierige Registrierung aus, die 1 bis 3 Tage be­ trägt. Das schränkt wesentlich die Leistung des Verfah­ rens, insbesondere in solchen Fällen ein, wenn alle nächst­ folgenden Operationen unter Berücksichtigung der voran­ gegangenen durchgeführt werden müssen, beispielsweise bei den Arbeiten zur Ermittlung der primären Struktur der Nuk­ leinsäuren.

Die Ursache dafür besteht in der Anwendung einer ra­ dioaktiven Markierung, was eine langwierige autoradiogra­ fische Registrierung verursacht. Die Verwendung der ra­ dioaktiven Markierung verursacht außerdem die Instabili­ tät der markierten Verbindungen, die bei der Sequenz-Be­ stimmung eingesetzt werden, sowie eine niedrigere Auflösung der Banden als im Gel, da ihre Breite im Gel geringer als am Röntgenfilm nach der Autoradiografie ist.

Die aufgezählten Nachteile sind auch für eine ande­ re Einrichtung zur Durchführung des genannten Verfahrens kennzeichnend, insbesondere in bezug auf die Konstruktion der Küvette. Neben den Schwierigkeiten mit der Anbringung des Gels in derselben und mit der Vorbereitung der Küvet­ te zur Autoradiografie bestimmt ihre Konstruktin die Un­ gleichmäßigkeit der Temperatur des Gels von Probe zu Probe infolge einer ungleichmäßigen Wärmeableitung im mittleren Teil der Küvette und an ihrer Peripherie. Das verursacht eine be­ trächtliche Krümmung der Bänder und Fehler in der Inter­ pretation der Ergebnisse.

Bekannt ist ebenfalls ein Verfahren zur elektrophoreti­ schen Bestimmung der primären Struktur der Nukleinsäuren (GB-A-21 55 176), das darin besteht, daß die Proben der Nukleinsäure in Form von Fragmenten der Abschnitte ihrer Polymerisationskette, die ihrem Spektrum nach unterschied­ liche Fluoreszenzmarkierungen enthalten, am Gel, einem vertikal angeordneten Stäbchen, an seinem oberen Ende un­ tergebracht werden. Das Gehl erhält man durch Polymerisa­ tion aus einer Monomerenlösung in einer Küvette zylind­ rischer Form, die aus einem optisch transparenten Mate­ rial ausgeführt wird. An die Gelschicht wird eine Span­ nung zur elektrophoretischen Trennung der Fragmente in der Richtung des Stromflusses, das heißt in der Höhe des Stäbchens des Gels, gemäß der Größe der Tragmente ange­ legt. Man registriert die Fragmente nach jeder der Fluores­ zenzmarkierungen für die Ermittlung der relativen Lage der Fragmente im Gelstäbchen, nach dem man über die Sequenz der Nukleotide in einem Molekül der zu analysierenden Nuk­ leinsäure urteilt.

In dem bekannten Verfahren verwendet an vier unter­ schiedliche Fluoreszenzmarkierungen, die sich sowohl nach den Anregungsspektren als auch nach dem Emissionsspektren un­ terscheiden, was es ermöglicht, diese getrennt zu registrie­ ren.

Bekannt ist eine Einrichtung zur Durchführung des Verfahrens zur elektrophoretischen Bestimmung der primären Struktur der Nukleinsäuren (GB-A-21 55 176), die eine vertikal aufgestellte Küvette zylindrischer Form aus einem dielektrischen Werkstoff für die Unterbringung des Gels mit den Proben der Nukleinsäure aufweist, in deren oberen und unteren Teil Kammern mit Elektrodenlösungen liegen, in denen Elektroden angebracht sind, die an eine Stromquelle angeschlossen sind und die mit der Küvette zwecks Errei­ chung des elektrischen Kontaktes der Elektrodenlösungen mit dem Gel kommunizieren. Die Einrichtung enthält eine Quelle der monochromatischen Strahlung, deren Lichtbündel durch ein System aus vier Anregungsfiltern, die unter­ einander steif verbunden und mit einem Versetzungsan­ trieb zur Aufstellung des einen oder des anderen Filters an der optischen Achse der Quelle versehen sind, auf den Abschnitt der Küvette gerichtet ist, der in ihrem unte­ ren Teil liegt. Beim Passieren durch das Filter ruft das Lichtbündel in einem Bereich der Wellenlängen, der durch dieses Filter vorgegeben wird und dem Anregungsspektrum einer bestimmten Fluoreszenzmarkierung entspricht, Fluores­ zenzstrahlung hervor.

Die Einrichtung enthält auch ein System auswechsel­ barer Emissionsfilter, die untereinander starr verbunden sind und mit einem Versetzungsantrieb für die Aufstellung des einen oder des anderen Emissionsfilters an einer op­ tischen Achse eines Empfängers der Fluoreszenzstrahlung der Markierungen unter einem Winkel von 0 < α 90° zur optischen Achse der Quelle der monochromatischen Strah­ lung versehen sind. Ein Fühlelement des Empfängers der Fluoreszenzstrahlung der Markierungen ist dem mit der Qu­ elle der monochromatischen Strahlung bestrahlen Abschnitt des Gels zugewandt. Die Einrichtung ist mit einem Geber der Filterlage zur Kontrolle der Arbeit der beiden Fil­ tersysteme versehen. Der Geber der Filterlage ist an den Adresseneintritt des Registriergerätes und der Empfänger der Fluoreszenzstrahlung an den Informationseintritt des Registriergerätes angeschlossen. Bei der Registrierung er­ folgt der Anschluß eines der vier Kanäle der Angaben des Registriergerätes an den Informationseintritt. Die Wahl des Kanals wird nach der Adresse bestimmt, als solche gilt ein Signal des Gebers der Filterlage.

Durch die Verwendung von Fluoreszenzmarkierung er­ möglichen es das genannte Verfahren und die genannte Ein­ richtung, eine Reihe von arbeitsaufwendigen Arbeitsgän­ gen (Auseinandernehmen der Küvette, Vorbereitung des Gels zur Autoradiografie) auszuschließen, die in dem obenbe­ schriebenen Verfahren und in der Einrichtung vorkommen. Diese Markierungen sind außerdem stabil, und bei ihrer Registrierung erfolgt keine Verschlechterung der Auflö­ sung im Gel. Der Hauptvorteil des beschriebenen Verfahrens und der Einrichtung besteht in einer wesentlichen, auf das 3- bis 5fache, Steigerung ihrer Leistung infolge der Vermeidung des langwierigen Prozesses der Autoradio­ grafie.

Eine Reihe von Faktoren erschwert jedoch die Inter­ pretation der Ergebnisse der elektrophoretischen Bestim­ mung der primären Struktur der Nukleinsäuren, die unter Verwendung von vier Fluoreszenzmarkierungen durchgeführt wird. Der erste Faktor besteht darin, daß sich die Emis­ sionsspektren verschiedener Markierungen in einem bedeu­ tenden Maße überdecken. Hierdurch sind die Signale des Empfängers der Fluoreszenzstrahlung von einer Markierung mehr als in einem Kanal des Registriergerätes vertreten. Dadurch ist es notwendig, den quantitativen Gehalt der vier Markierungen, die im Gel vorhanden sind, zu jedem Zeitabschnitt festzulegen. Der zweite wichtige Faktor, der das Verfahren kompliziert, besteht darin, daß die Mo­ leküle verschiedener Fluoreszenzmarkierungen unterschied­ liche elektrophoretische Wanderungsvermögen aufweisen. Dem­ zufolge verändert sich auch das Wandervermögen der Frag­ mente, die mit verschiedenen Fluorophoren markiert sind, was zur Verschlechterung der Auflösung der Fragmentenbän­ der und folglich zum Vorhandensein eines wesentlichen Feh­ lers der Bestimmung der Sequenz der Nukleotide der Nuk­ leinsäuren führt. Der dritte Faktor ist mit bedeutenden Variationen in der Anzahl der Fragmente mit einer bestimm­ ten Größe für jede der Reaktionen ihrer Synthese bei der Vorbereitung der Proben verbunden, was auf die Intensität der Bänder im Gel wirkt, und was unter Berücksichtigung des ersten Faktors noch mehr die Analyse der angefallenen Angaben erschwert. All das führt zur Notwendigkeit, kom­ plizierte Computer-Programme für die Bearbeitung der Er­ gebnisse des elektrophoretischen Verfahrens einzusetzen, bei deren Anwendung man den Fehler bei der Bestimmung der Sequenz der Nukleotide der Nukleinsäuren lediglich bis auf 1% reduzieren kann, was für ein solches Verfahren wie Sequenz-Bestimmung unzureichend ist.

Obwohl das Verfahren und die Einrichtung die Leistung im Vergleich zum Radioisotopen-Verfahren erhöhen, ist sie jedoch unzureichend, und eine weitere Steigerung der Lei­ stung ist durch folgende Gründe erschwert. Im Gelstäbchen kann man vier Proben gleichzeitig analysieren. Wenn das Verfahren in einer Gel-Platte durchgeführt wird, was in der Einrichtung realisiert ist, die im Artikel von I. M. Prober et al, "A system for rapid DNA Sequencing with Fluores­ cent Chain - Terminating Dideoxynucleotides", vol. 238, 1987, Science, S. 336-341 beschrieben wurde, kann man die Anzahl der gleichzeitig zu analysierenden Proben bis auf 48 bringen. Aber auch hier besteht eine Grenze, die durch den Einsatz eines speziellen Abtast-Sekundärelektronenver­ vielfachers als Empfänger der Fluoreszenzstrahlung be­ stimmt wird.

Die Verwendung von vier Fluoreszenzmarkierungen be­ stimmt die Notwendigkeit des Einsatzes komplizierter Ge­ räte zur Registrierung ihrer Spektren sowie komplizier­ ter Programme zur Ergebnisbearbeitung. Diese Kompliziert­ heit steigt bei der Notwendigkeit der Leistungsteigerung an. So werden in der im genannten Artikel beschriebenen Einrichtung zwei kostspielige Abtast-Sekundärelektronen­ vervielfacher und eine große Anzahl von kostspieligen In­ terferenzfiltern mit großen Abmessungen eingesetzt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfah­ ren zur elektrophoretischen Bestimmung der primären Struk­ tur der Nukleinsäuren sowie eine Einrichtung für seine Durchführung zu entwickeln, in denen mittels einer neuen Form des Gels und entsprechend einer neuen Form der Küvette für seine Unterbringung sowie mittels Schaffung gleicher Bedingungen für die elektrophoretische Trennung für alle zu analysierenden Proben und entsprechend eines neuen Mittels für die Schaffung solcher Bedingungen die Erhöhung der Leistung der Bestimmung der primären Struk­ tur der Nukleinsäuren um mehr als um eine Größenordnung, die Senkung des jeweiligen Fehlers bei der Bestimmung der Sequenz der Nukleotide in den Nukleinsäuren um eine Größen­ ordnung gewährleistet und die Konstruktion der Einrichtung vereinfacht wird.

Die gestellte Aufgabe wird dadurch gelöst, daß im Verfahren zur elektronphoretischen Bestimmung der primären Struktur der Nukleinsäuren, das darin besteht, daß die Proben der Nukleinsäure in Form von Fragmenten ihrer Poly­ merisationskette, die Markierungen enthalten, an einem Gel untergebracht werden, an das Gel eine Spannung zwecks elektrophoretischen Trennung der Fragmente in Richtung des Stromflusses in Übereinstimmung mit ihrer Größe angelegt wird und die Fragmente nach den Markierungen zwecks Fest­ legung ihrer relativen Lage im Gel registriert werden, nach der man über die Sequenz der Nukleotide im Molekül der Nukleinsäure urteilt, erfindungsgemäß, man dem Gel die Form eines Hohlzylinders verleiht, man die Proben der Nukleinsäure in Aushöhlungen unterbringt, die man an sei­ ner Stirnseite am Umfang angeordnet, man die Spannung zur elektrophoretischen Trennung der Fragmente in Richtung des Stromflusses in Übereinstimmung mit ihrer Größe an die Stirnseiten des Hohlzylinders anlegt, eine ständige Temperatur des Gels in Form des Hohlzylinders auf dem Ni­ veau unterhält, bei dem die Wanderung der Fragmente der Polymerisationskette der Nukleinsäure ohne ihre chemische Verbindung über Wasserstoffbindungen mit Hilfe einer Schicht aus nichtpolarer Flüssigkeit erfolgt und ihre Tem­ peratur reguliert, man diese Schicht seitens einer der Seitenoberflächen des Hohlzylinders anbringt, dessen Höhe man ungefähr gleich der Höhe des Hohlzylinders wählt und die Registrierung der Fragmente der Abschnitte der Poly­ merisationskette der Nukleinsäure vornimmt, indem man das Gel in Form des Hohlzylinders rings um seine Ache dreht.

Vorzugsweise soll im Verfahren zur elektrophore­ tischen Bestimmung der primären Struktur der Nukleinsäure erfindungsgemäß das Gel in Form eines Hohlzylinders mit unterschiedlicher Porosität in den einzelnen Abschnitten, die an seinem Umfang liegen, herausgebildet werden sol­ len mindestens zwei Proben der Nukleinsäure genommen wer­ den, die gleiche Fragemente der gleichen Abschnitte der Polymerisationskette enthalten, die an den Gelabschnitten in Form des Hohlzylinders untergebracht sind, die unter­ schiedliche Porosität aufweisen.

Vorzugsweise soll im Verfahren zur elektrophore­ tischen Bestimmung der primären Struktur der Nukleinsäu­ re erfindungsgemäß zwischen dem Gel in Form des Hohlzy­ linders und der Schicht der nichtpolaren Flüssigkeit eine Schicht aus Polymermaterial untergebracht werden, das ge­ gen die nichtpolare Flüssigkeit resistent ist.

Die gestellte Aufgabe wird auch dadurch gelöst, daß in der Einrichtung zur elektrophoretischen Bestimmung der primären Struktur der Nukleinsäuren, die eine vertikal aufgestellte Küvette zylindrischer Form aus einem dielek­ trischen Werkstoff zur Unterbringung des Gels mit den Pro­ ben der Nukleinsäure enthält, in deren oberem und unterem Teil Kammern mit Elektrodenlösungen angeordnet sind, in denen die Elektroden liegen, die an eine Stromquelle an­ geschlossen werden und die mit der Küvette zur Herbeifüh­ rung des elektrischen Kontaktes der Elektrodenlösungen mit dem Gel kommunizieren, eine Quelle der monochromati­ schen Strahlung enthält, deren Lichtbündel auf den Ab­ schnit der Küvette gerichtet ist, der in ihrem unteren Teil liegt, und in den Nukleinsäureproben eine Fluores­ zenzstrahlung der Fragmentmarkierungen der Abschnitte ihrer Polymerisationskette anregt, und einen Empfänger der Fluoreszenzstrahlung enthält, dessen Fühlelement dem mit der Quelle der monochromatischen Strahlung bestrahlten Ab­ schnitt des Gel zugewandt ist, der an den Informations­ eintritt eines Registriergerätes angeschlossen ist, an dessen Adresseneintritt Signale eintreten, die den Proben­ nummern entsprechen, erfindungsgemäß, die Küvette in Form einer Hülse ausgeführt ist, die mit einem Antrieb für die Drehung rings um die Achse, der auf einer Plattform auf­ gestellt wird, und mit einem Geber des Drehwinkels ver­ sehen ist, dessen Austritt an den Adresseneintritt des Registriergerätes angeschlossen ist, die Kammern durch die Seitenwand und durch den Boden der genannten Hülse und durch die Seitenwand und den Boden einer zusätzlichen Hülse aus dielektrischem Werkstoff gebildet sind, die ko­ axial zur Haupthülse aufgestellt und auf der Plattform be­ festigt ist, und es ein Mittel für die Unterhaltung einer konstanten Temperatur des Gels gibt, das eine nichtpola­ re Flüssigkeit enthält, die zwischen den Elektrodenlö­ sungen am Abschnitt zwischen den Seitenwänden der Haupt- und der Zusatzhülse angebracht sind, und einen in der nichtpolaren Flüssigkeit liegenden Wärmetaustauscher ent­ hält, wobei die unter der nichtpolaren Flüssigkeit ange­ brachte Elektrodenlösung eine größere Dichte im Vergleich zur Dichte der nichtpolaren Flüssigkeit aufweist, und die über der nichtpolaren Flüssigkeit liegende Elektroden­ lösung eine geringere Dichte aufweist, die Elektroden ringförmig ausgeführt werden und koaxial zur Haupt- und zur Zusatzhülse angebracht sind und mit der Zusatzhülse steif verbunden sind.

Durch die radiale Symmetrie in der Anbringung des Gels, der Ringelektroden und des Mittels zur Unterhaltung der konstanten Temperatur des Gels sowie durch die Wahl der Richtung der Elektrophorese längs der Erzeugenden des Hohlzylinders werden für alle Bänder identische Be­ dingungen der Trennung der zu analysierenden Moleküle ge­ währleistet. Hierdurch wird der Fehler bei der Bestimmung der Sequenz der Nukleotide der Nukleinsäuren verringert.

Die Drehung der in Form einer Hülse ausgeführten Küvette rings um ihre Achse während der Elektrophorese, die mit dem Ziel der Registrierung der Probenkomponenten der Nukleinsäure erfolgt, bewirkt gleichzeitig eine kon­ stante und gleichmäßige Vermischung sowohl der Elektroden­ lösungen als auch der nichtpolaren Flüssigkeit, was auch zur Verringerung des Fehlers bei der Bestimmung der Sequenz der Nukleotide infolge der Unterhaltung einer homogenen Zusammensetzung der Elektrodenlösungen, zur Entfernung von Gasbläschen von den Elektroden und zur Verbesserung der Wärmeabgabe durch die nichtpolare Flüssigkeit beiträgt.

Die Versetzung des Gels gegenüber dem Lichtbündel der monochromatischen Strahlungsquelle, die mittels Dreh­ ung der Hülse erfolgt, gewährleistet ein besonders ein­ faches Verfahren zur Abtastung des Gels, weil in der Praxis die Ausführung der Drehbewegung einfacher als die der fortschreitenden Bewegung ist, und dabei ist die Prä­ zision der ersten höher als die der zweiten. Demzufolge wird die Verringerung des Fehlers auch auf Kosten der Be­ sonderheiten der Registrierung der Komponenten der zu analysierenden Proben gesichert. Zu gleicher Zeit wird auch die Vereinfachung der Einrichtung gewährleiset.

Durch die Verbesserung des Kontaktes des Wärmeträ­ gers, als solcher dient die nichtpolare Flüssigkeit, mit dem Gel sowie durch die Vermischung des Wärmeträgers wird es möglich, die primäre Struktur bei einer maximal zu­ lässigen Geschwindigkeit zu bestimmten, ohne dabei die Überhitzung des Gels bei der Elektrophorese zu befürch­ ten; es besteht die Möglichkeit, die Leistung des Ver­ fahrens und der Einrichtung zusätzlich zu erhöhen.

In der Einrichtung fehlen spezielle Behälter für die Elektrodenlösungen. Ihre Rolle erfüllen die Haupt- und die Zusatzhülsen, was die Vereinfachung der Einrichtung bewirkt.

Vorzugsweise soll in der Einrichtung zur elek­ trophoretischen Bestimmung der primären Struktur der Nu­ kleinsäuren, erfindungsgemäß, die Quelle der monochroma­ tischen Strahlung so aufgestellt werden, daß ihr Licht­ bündel auf den Boden der Haupthülse beziehungsweise der Zusatzhülse gerichtet wird, der aus einem Werkstoff aus­ geführt werden soll, der für die monochromatische Strah­ lung optisch transparent ist.

Es ist vorteilhaft, wenn die Einrichtung zur elektrophoretischen Bestimmung der primären Struktur der Nukleinsäuren erfindungsgemäß ein Mittel für die Her­ ausbildung des Gels aus den Monomerenlösungen in Form eines Hohlzylinders aufweist, als solches dient die Haupt­ hülse mit dem Antrieb für die Drehung rings um die Achse, und ein Mittel für die Herausbildung von Aushöhlungen an der Stirnseite des Hohlzylinders enthält, das ein im obe­ ren Teil der Haupthülse einmontiertes ringförmiges Ein­ satzstück mit Längsnuten aufweist, die an seiner zylin­ drischen Außenoberfläche angeordnet sind, die Schlitze zwi­ schen dem ringförmigen Einsatzstück und der inneren Ober­ fläche der Seitenwand der Haupthülse bilden, ein ringför­ miges Einsatzstück mit Vorsprüngen enthält, die an seiner Stirnseite am Umfang ausgeführt sind, die in den Schlit­ zen liegen, ein Dichtungsring enthält, der über dem ring­ förmigen Einsatzstück mit den Vorsprüngen liegt, und ei­ nen Deckel mit einer Öffnung enthält, der an der Stirn­ seite der Haupthülse angebracht ist.

Das ermöglicht, Gel in Form eines Hohlzylinders aus­ zubilden und dadurch die erforderlichen Bedingungen für die Steigerung der Leistung, für die Verringerung von Fehlern bei der Bestimmung der Sequenz der Nukleotide und Vereinfachung der Einrichtung zugewährleisten. Dabei wird die Verringerung des möglichen Fehlers auch durch die gleichen Bedingungen, die für die Erhaltung des homo­ genen Gels erforderlich sind, auf Kosten der Ausschließung der Wahrscheinlichkeit der Bildung von Gasbläschen im Gel, die aus der Lösung unter Einwirkung von Fliehkräf­ ten entfernt werden, sowie durch Vorhandensein von Schlit­ ten für die Einführung von Proben und für die Montage ei­ nes ringförmigen Einsatzstückes mit Vorsprüngen erreicht, die die Herausbildung von gleichen und geometrisch regel­ mäßigen Startabschnitte des Gels gewährleisten.

Es ist vorteilhaft, wenn in der Einrichtung für elektro­ phoretische Bestimmung der primären Struktur der Nuklein­ säuren erfindungsgemäß die Plattform mit der Möglichkeit der Drehung um 90° in der vertikalen Ebene aufgestellt und mit Feststellern der Endstellungen versehen ist.

Das sichert die Herbeiführung einer gleichen Stärke des Gels längs der Erzeugenden der zylindrischen Hülse und verringert demzufolge den Fehler bei der Sequenzbestimmung der Nukleotide.

In der Einrichtung zur elektro­ phoretische Bestimmung der primären Struktur der Nuklein­ säuren hat erfindungsgemäß die innere Oberfläche der Seiten­ wand der Haupthülse die Form eines Kegelstumpfs der mit seiner größeren Grundplatte dem Boden der Haupt­ hülse zugewandt ist.

Dadurch ist die Gewinnung von Gel in Form eines Hohlzylinders möglich, dessen Wandstärke im Querschnitt von der Startzone in Richtung der Migration der Molekü­ le gleichmäßig ansteigt. Das führt zu einer schrittweisen Senkung der Stromdichte in der genannten Richtung, was zum Ausgleich der Auflösung der kurzen und der langen Poly­ merisationsketten der Nukleinsäure beiträgt. Hierdurch wird auch ein Fehler bei der Sequenzbestimmung der Nu­ kleotide verringert.

Es ist sinnvoll, daß in der Einrichtung zur elek­ trophoretischen Bestimmung der primären Struktur der Nukleinsäuren erfindungsgemäß an der inneren Oberfläche der Seitenwand der Seitenwand der Haupthülse längs der Erzeugenden vom Boden der Hülse bis zum Abschnitt der Aufstellung des ringförmigen Einsatzstückes mit den Längs­ nuten Vorsprünge ausgeführt werden, die gleichmäßig am Umfang angebracht sind.

Zweckmäßigerweise sollen die Vorsprünge an der in­ neren Oberfläche der Seitenwand der Haupthülse in der Einrichtung für die elektrophoretische Bestimmung der primären Struktur der Nukleinsäuren erfindungsgemäß T- artige Form im Querschnitt aufweisen.

Es ist auch zweckmäßig, daß die Einrichtung zur elek­ trophoretischen Bestimmung der primären Struktur der Nukleinsäuren erfindungsgemäß eine ringförmige Kammer enthält, die in ihrem Querschnitt eine Trapezform mit ra­ dialen Trennwänden gemäß der Anzahl der Vorsprünge an der inneren Oberfläche der Seitenwand der Haupthülse aufweist, die gleichmäßig am Umfang angebracht sind, und Hohlräume für die Unterbringung von Monomerenlösungen bilden, die unter dem ringförmien Einsatzstück mit den Längsnuten liegt und mit dem Deckel steif verbunden und diesem mit der größeren Grundplatte der Trapez zugewandt ist, dabei sollen im oberen Teil der Außenseitenwand der ringförmi­ gen Kammer Öffnungen zum Abfließen der Monomerenlösungen auf die entsprechenden Abschnitte der inneren Oberfläche der Seitenwand der Haupthülse ausgeführt werden, die mit den Vorsprüngen begrenzt sind.

Das erlaubt es, in einer Hülse Gel in Form eines Hohl­ zylinders auszubilden das unerschiedliche Porosität an verschiedenen Abschnitten, (unterschiedliche Konzen­ tration des Akrylamids) aufweist, die am Umfang angeordnet sind und demzufolge unterschiedliche "hemmende" Einwirkung auf niedermolekulare und hochmolekulare Fragmente der zu analysierenden Proben ausüben. Hierdurch wird der Aus­ gleich der Auflösung der genannten Fragmente der Proben, d. h. die Verringerung des Fehlers bei der Sequenzbe­ stimmung der Nukleotide erreicht. Die Möglichkeit der Ausführung dieses Arbeitsganges in einer Küvette und im Verlaufe eines und desselben Verfahrens gewährleistet die Steigerung der Leistung und die Vereinfachung der Ein­ richtung. Die Verwendung des Gels mit unterschiedlicher Konzentration des Akrylamids auf verschiedenen Abschnit­ ten einer und derselben Probe erlauben es gleichzeitig, die Dauer des Verfahrens zu reduzieren, weil man die hochmolekularen Fragmente der Probe auf dem Abschnitt mit einem niedrigen Gehalt an Akrylamid, wo ihre Beweglich­ keit höher als auf dem Abschnitt mit der niedrigen Poro­ sität ist, registrieren kann. Zu gleicher Zeit wird die erforderliche Trennung der niedermolekularen Fragmente der zu analysierenden Probe in der gleichen Zeit auf dem Abschnitt mit einem hohen Gehalt an Akrylamid erreicht. Hierdurch wird durch Reduzierung der Bestim­ mungszeit der primären Struktur die Leistung des Verfah­ rens gesteigert.

Nachstehend wird die Erfindung an hand konkreter Va­ rianten ihrer Ausführung und der Zeichnungen erläutert; es zeigt

Fig. 1 den Längsschnitt einer Einrichtung zur eletro­ phoretischen Bestimmung der primären Struktur der Nuklein­ säuren (Längsschnitt) und ein Blockschaltbild ihres Registriergerätes,

Fig. 2 den Längsschnitt einer abgewandelten Einrichtung zur elektrophoretischen Bestimmung der primären Struktur der Nukleinsäuren, bei der das Gel an der äußeren Oberfläche der Hülse angebracht ist,

Fig. 3 den teilweisen Längsschnitt einer Vorrichtung zur Bildung von Gel aus einer Monomerenlösung in Form eines Hohlzylinders,

Fig. 4 den Schnit IV-IV der Fig. 3,

Fig. 5 die isometrische Gesamtansicht eines ring­ förmigen Einsatzstückes mit Vorsprüngen, die an seiner Stirnseite am Umfang ausgeführt sind,

Fig. 6 den Schnitt VI-VI der Fig. 3,

Fig. 7 den Längsschnitt eines Abschnittes der Haupt­ hülse mit einer darin angeordneten ringförmigen Kammer, ei­ nem ringförmigen Einsatzstück mit Längsnuten, mit einem ringförmigen Einsatzstück mit Vorsprüngen und einem Deckel, und

Fig. 8 den Schnitt VIII-VIII der Fig. 7.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur elektrophoreti­ schen Bestimmung der primären Struktur der Nukleinsäure DNS oder RNS sieht die Zubereitung von Proben in Form von mar­ kierten Fragmenten der Abschnitte ihrer Polymerisationskette und die elektrophoretische Analyse dieser Fragmente vor. Eine besonders verbreitete Methode der Zubereitung von DNS- Proben ist die Methode der Terminierung der Reaktion des Polymeraskopierens (Sanger-Verfahren), gemäß dem die markier­ ten DNS-Fragmente mittels ihrer Synthese auf den zu ana­ lysierenden DNS-Abschnitt wie auf einer Matrix herge­ stellt werden. Dieser Abschnitt wird vorher mittels Klo­ nung im System eines Bakteriophages, der eine Einketten- DNS, beispielsweise Bakteriophage Ml3 aufweist, vermehrt. Hierdurch erhält man DNS-Moleküle der Phase mit dem da­ rin eingebauten zu analysierenden DNS-Abschnitt. Dann führt man eine komplementäre Bindung eines kurzen Oligonukle­ otid-Primers mit dem DNS-Abschnitt der Phage, der un­ mittelbar an den eingebauten DNS-Abschnitt angrenzt, durch. Hierdurch beginnt die Synthese jedes Fragmentes, die als das Ansetzen des Primers in Richtung des zu ana­ lysierenden DNS-Abschnittes vom 3′-Ende zum 5′-Ende erfolgt, von einer und derselben Stelle der DNS-Matrix. Für die Einführung eine Markierung in jedes der Frag­ mente verwendet man einen nach dem 5′-Ende fluoreszenz­ markierten Ml3-Primer. Als Fluoreszenzmarkierung verwendet man beispielsweise Tetramethylrhodamin, das ein Maxi­ mum des Anregungsspektrums bei 560 nm und ein Maxi­ mum des Emissionsspektrums bei 575 nm aufweist.

Faktisch stellt jedes Fragment der DNS lediglich eine komplementäre Kopie des zu analysierenden Abschnit­ tes der DNS dar. Es ist jedoch dank der Regel der kom­ plementären Wechselwirkung: A komplementär gegenüber T und G gegenüber C, nicht schwer, nach der Struktur der Fragmente die Sequenz der Nukleotide des zu analysieren­ den Abschnitts der DNS festzustellen.

Für die Erzeugung von Fragmenten mit unterschied­ licher Länge mit einem Intervall von einem Nukleotid wird die Synthese in Gegenwart von Nukleotidanalogen durchgeführt. Die Einbeziehung eines Nukleotidanaloges in die zu synthetisierende Polymerisationskette des je­ weiligen Fragmentes führt zur Einstellung ihres Wach­ stums. Man stellt vier einzelne Reaktionsmischungen her, von denen jede nur ein Nukleotidanaloges enthält, das heißt entweder Analoges A, oder T, oder G, oder C. In­ folge der Synthese erhält man in einer Mischung Frag­ mente, die nur mit A enden, in der anderen Mischung nur mit T enden und so weiter, und in den vier Reaktionsmi­ schungen treten nach der Beendigung der Reaktion Frag­ mente jeder der für den gegebenen Abschnitt der DNS mög­ liche Größen auf. Die Vorbereitung der Proben wird durch ihre Denaturierung abgeschlossen, was zur Trennung der Polymerisationskette der DNS-Matrix und der Fragmente führt, die einen markierten Primer aufweisen.

Die Herstellung der Proben zur elektrophoretischen Bestimmung der primären Struktur der DNS nach einer ande­ ren der sehr verbreiterten Maxam- und Gilbert-Methode be­ steht in der chemischen Behandlung der Moleküle eines be­ stimmten Abschnittes der Nukleinsäure bis zur Erzeugung von in ihrer Größe unterschiedlichen Fragmenten dieses Abschnitts, die denen analog sind, die man nach der San­ ger-Methode erzeugt. Dabei wird in die Moleküle eine Markierung entweder auf das 3′-Ende oder auf das 5′-En­ de eingeführt. Die Fragmente werden genauso wie in der Sanger-Methode in vier Reaktionen erzeugt, und demzu­ folge gelangen auch vier Proben von jedem zu analysieren­ den Abschnitt der Nukleinsäure zur Analyse. Die Vorbe­ reitung der RNS-Proben führt man nach einer Methode aus, die der Methode von Gilbert und Maxam ähnlich ist.

Die dadurch zubereiteten Proben der Nukleinsäure in Form von Fragmenten der Abschnitte ihrer Polymerisa­ tionskette, die Markierungen aufweisen, werden an das Gel in Form eines Hohlzylinders, in die Aushöhlungen un­ tergebracht, die man am Umfang an seiner Stirnseite an­ ordnet. Dabei wird jede Probe, die eine Extrareaktions­ mischung (nach A, nach T, nach G und nach C) darsellt, in eine gesonderte Aushöhlung eingebracht, wobei man ei­ ne bestimmte Reihenfolge der Eintragung der Proben, bei­ spielsweise ATGC oder ACGT, für alle einzutragenden Pro­ ben einhält.

Dabei wird das Gel entweder durch Polymerisation aus einer Monomerenlösung zubereitet oder man verwendet fertige Platten (Akiyoshi Wada, "Automated high-speed DNA-Sequencing, Nature, vol. 325, 1987, p. 771-772), die eine Schicht aus Polyakrylamidgel darstellten, das von beiden Seiten mit einem Polymerfilm bedeckt ist. An ei­ nem der Enden einer solchen Platte sind in der Gelschicht recht­ eckige Aushöhlungen für die Eintragung von Proben aus­ geführt. Für die Sequenz-Bestimmung verwendet man üblicherweise Polyakrylamidgel, das man durch die Polymerisation der Lösung erhält, die Monomere enthält: Akrylamid und Me­ thylenbisakrylamid sowie die die Polymerisation inizi­ ierenden Zusätze: Tetramethyläthylendiamin und Ammonium­ peroxosulfat. Bei der Polymerisation des Gels in Form des Hohlzylinders werden an einer seinen Stirnseiten rechteckige Aushöhlungen für die Unterbringung von Nuk­ leinsäure-Proben in derselben ausgeführt. Bei der Ver­ wendung von fertigen Gel-Platten werden diese so ange­ ordnet, daß die Aushöhlungen am Umfang an einer der Stirnseiten des Hohlzylinders liegen, der mittels Biegung der Gel-Platte bis zur Berührung ihres entgegengesetzten Endes ausgeführt wird.

Zur elektrophoretischen Trennung der Fragmente der DNS in Richtung des Stromflusses wird in Übereinstimmung mit der Größe dieser Fragmente an die Stirnseiten des Hohlzylinders Spannung durch die Elektrodenlösungen, die die beiden Stirnseiten benetzen, angelegt. Auf einer der Seitenoberflächen des Hohlzylinders wird eine Schicht der nichtpolaren Flüssigkeit für die Unterhaltung einer konstanten Temperatur der Gelschicht auf einem Niveau angebracht, bei dem die Wanderung der Fragmente der Poly­ merisationskette der Nukleinsäure ohne ihre chemische Bindung über Wasserstoffbrüchen erfolgt. Dabei wird die Temperatur der nichtpolaren Flüssigkeit reguliert. Als nichtpolare Flüssigkeit verwendet man beispielsweise ein Gemisch aus Hexan und Kohlenstofftetrachlorid mit einer Dichte von 1,06 ± 0,02 g/cm³. Die Schichtstärke der nicht­ polaren Flüssigkeit wählt man ungefähr gleich, und ge­ nauer gesagt, etwas geringer als die Höhe des Hohlzylin­ ders.

Bei der elektrophoretischen Trennung wandern die Fragmente, die gleiche Größe aufweisen, die nach der An­ zahl der zu ihnen gehörenden Nukleotide bestimmt wird, in Höhenrichtung des Hohlzylinders in Form einer Zone, die ein Band darstellt. Unter Einwirkung des elektrischen Stromes und der unterschiedlichen Bremsung der Fragmente mit unterschiedlicher Größe in den Poren, die durch die räumliche Struktur des Polyakrylamid-Gels gebildet wer­ den erfolgt die elektrophoretische Trennung der Frag­ mente. Die größte Trennung wird an der der Stelle der Auf­ tragung von Proben entgegengesetzten Stirnseite des Hohl­ zylinders erreicht; an der gleichen Stelle erfolgt die Registrierung der Fragmente, das heißt der Bänder.

Die Registrierung der Fragmente der Abschnitte der Polymerisationskette der Nukleinsäure erfolgt durch die Drehung des Gels in Form des Hohlzylinders rings um sei­ ne Achse. Dabei wird die Fluoreszenzstrahlung der Bän­ der jeder Probe im Maße der Wanderung der Fragmente in Höhenrichtung des Hohlzylinders registriert. Die im Er­ gebnis der Registrierung der Fluoreszenzstrahlung erziel­ te Sequenz der Signale bei der bekannten Anordnung jeder der vier Reaktionsmischungen in den Aushöhlungen ist der Sequenz der vier Nukleotide (A, T, G, C) an dem zu ana­ lysierenden Abschnitt der DNS adäquat.

Die Konzentration des Akrylamids im Gel bestimmt seine Porosität. Wenn sie beispielsweise gleich 10%, bezogen auf das Gewicht, ist, so kann man in der Schicht solchen Gels Fragmente mit einer Länge von 50 bis 200 Nukleotiden trennen. Da eine der Haupteinschränkungen des Verfahrens zur elektrophoretischen Bestimmung der primären Struktur der Nukleinsäuren in seinem Auflösungs­ vermögen besteht, wird es oft bevorzugt, die Porosität des Gels in Abhängigkeit von der Größe des analysierba­ ren Abschnitts der DNS zu ändern. Das Gel mit einer Kon­ zentration des Akrylamids beispielsweise von 6% ermög­ licht es, die Fragmente mit eine Länge über 250 Nukleo­ tide zu trennen.

Zur Erhöhung des Auflösungsvermögens des Verfahrens zur elektrophoretischen Bestimmung der primären Struk­ tur wird das Gel in Form des Hohlzylinders mit unter­ schiedlicher Porosität auf den einzelnen Abschnitten aus­ geführt, die an seinem Umfang angebracht sind. In dem Falle, wenn es zwei und mehr Abschnitte gibt, setzt sich das Gel in Form des Hohlzylinders aus zwei und mehreren gebogenen Platten zusammen. Dabei werden mindestens zwei Proben der Nukleinsäure genommen, die gleiche (entwe­ der nach A, oder nach T und so weiter) Fragmente der gleichen Abschnitte ihrer Polymerisationskette enthalten, und diese in den Aushöhlungen untergebracht, die an ver­ schiedenen Platten ausgeführt sind, die entsprechend un­ terschiedliche Porosität aufweisen. Mit anderen Worten, wird jede Reaktionsmischung, beispielsweise in zwei Tei­ le getrennt, von denen der eine in die Aushöhlung des Abschnittes mit größerer Porosität und der andere Teil der Mischung in eine Aushöhlung mit geringerer Porosität eingebracht wird.

Als nichtpolare Flüssigkeit können neben dem Ge­ misch aus Hexan und dem Kohlenstofftetrachlorid auch an­ dere Gemische oder eine Flüssigkeit mit erforderlicher Dichte verwendet werden. Diese Flüssigkeiten können eine negative Einwirkung auf das Gel oder auf die zu analy­ sierenden Fragmente ausüben. Zur Verhinderung dieser Ein­ wirkung und mit dem Ziel der Verwendung einer solchen nichtpolaren Flüssigkeit, die die beste Wärmeübertra­ gung gewährleistet, wird zwischen dem Gel in Form des Hohlzylinders und der Schicht der nichtpolaren Flüssig­ keit eine Schicht aus einem Polymermaterial, das gegen­ über der nichtpolaren Flüssigkeit resistent ist, ange­ bracht. Als solches Material kann man beispielsweise Polytetrafluoräthylen verwenden.

Die Einrichtung zur elektrophoretischen Bestimmung der primären Struktur der Nukleinsäuren, die das Ver­ fahren zur elektrophoretischen Bestimmung der primären Struktur der Nukleinsäuren realisiert, enthält eine ver­ tikal aufgestellte Küvette in Form einer Hülse 1 (Fig. 1) aus einem dielektrischen Werkstoff, beispielsweise aus Polystyrol beziehungsweise Polymethylmethakrylat. Sie kann auch aus zwei Hülsen ausgeführt werden, die mitein­ ander dicht verbunden sind: einer Außenhülse aus Titan oder aus einer Aluminiumlegierung und einer Innenhülse aus Polymethylmethakrylat oder Polystyrol. An der inne­ ren Oberfläche der Seitenwand der Hülse 1 ist Gel 2 in Form des Hohlzylinders angebracht. Die Hülse 1 ist mit einem Antrieb 3 für die Drehung des Gels rings um seine Achse versehen, der auf einer Plattform 4 montiert ist und mit einem Geber 5 des Drehwinkels versehen ist. Es gibt eine zusätzliche Hülse 6 aus einem dielektrischen Werkstoff, beispielsweise aus Polymethylmethakrylat, die koaxial gegenüber der Hülse 1 in der beschriebenen Va­ riante, innerhalb derselben aufgestellt ist. Die Hülse 6 ist auf einem Ausleger 7 befestigt, der auf der Platt­ form 4 montiert ist. Im oberen Teil der Hülse 1 gibt es Kammern 8 und 9 mit Elektrodenlösungen 10 und 11. Die Kammer 8 ist durch die Seitenwände der Hülsen 1 und 6 und die Kammer 9 durch die Seitenwände und durch den Bo­ den dieser Hülsen 1 und 6 gebildet.

In den Lösungen 10 und 11 sind ringförmige Elektro­ den 12 und 13 untergebracht, die aus einer Platte gefer­ tigt sind. Die ringförmigen Elektroden 12 und 13 sind an der Hülse 6 befestigt und koaxial gegenüber derselben angebracht. Die ringförmige Elektrode 12 ist an der Auß­ enoberfläche der Seitenwand der Hülse 6 in ihrem oberen Teil befestigt, und die ringförmige Elektrode 13 ist an dem äußeren zylindrischen Vorsprung 14 angebracht, der am Boden dieser Hülse 6 ausgeführt ist. Die ring­ förmigen Elektroden 12 und 13 sind an eine Stromquelle angeschlossen.

Im Gel 2 in Form des Hohlzylinders sind am Umfang seiner Stirnseite Aushöhlungen 15 angebracht, in denen sich die Proben der Nukleinsäure befinden. Unter Einwirk­ kung des elektrischen Stromes, der durch das Gel in Richtung von einer Stirnseite des Hohlzylinders zur an­ deren strömt, wandern die Komponenten der zu analysier­ enden Proben in den unteren Teil des Gels 2 und bilden Bänderbahnen, wo ihre Registrierung erfolgt.

Die Einrichtung enthält ein Mittel zur Unterhaltung einer konstanten Temperatur des Gels, das sich beim Durchströmen des elektrischen Stromes durch dasselbe er­ wärmt, das sich aus einer nichtpolaren Flüssigkeit 1, die zwischen den Elektrodenlösungen 10 und 11 am Ab­ schnitt zwischen den Seitenwänden durch Hülsen 1 und 6 angebracht wird und einem in der nichtpolaren Flüssig­ keit aufgestellten Wärmeaustauscher 17 zusammensetzt, bestehend aus einem in eine Spirale gebogenen Polytetra­ fluoräthylen-Rohr, der durch die Austrittsstutzen an einen Wasser-Thermostat angeschlossen wird (nicht gezeigt). Mit Pfeilen ist die Richtung des Durchfließens von Wasser durch den Wärmeaustauscher 17 angegeben. Die Elektrodenlösung 11 hat eine Dichte von 1,100 ± 0,015Ag/cm³, was durch die Anwesenheit von Saccha­ rose in derselben erreicht wird, die Dichte der Lösung 10 beträgt etwa 1,00 g/cm³. Hierdurch liegt die nicht­ polare Flüssigkeit 16, die, wie oben erwähnt, eine Dich­ te von 1,06 ± 0,02 g/cm² aufweist, zwischen den Elektroden­ lösungen 10 und 11. Die Grenzen der Flüssigkeitstren­ nung sind an den Linien 18 und 19 angegeben.

Zur Registrierung der mit einem Fluorophor markier­ ten Komponenten der Nukleinsäureproben weist die Einrich­ tung eine Quelle 20 der monochromatischen Strahlung, bei­ spielsweise einen Argon-Laser auf, dessen Lichtbündel 21 auf den unteren Teil der Hülse 1 gerichtet ist und in den mit dem Fluorophor markierten Fragmente die Fluo­ reszenzstrahlung der Markierungen hervorruft. Diese Strahlung wird von einem Empfänger 22 der Fluoreszenz­ strahlung der Markierungen detektiert, der im unteren Teil der Hülse 6 so aufgestellt ist, daß sein Fühlele­ ment 23 dem mit der Quelle 20 beleuchteten Abschnitt 24 des Gels 2 zugeandt ist. Der Empfänger 22 ist an den Informationseintritt 25 des Registriergerätes 26 ange­ schlossen, an dessen Adresseneingang 27 der Geber 5 des Drehwinkels der Hülse angeschlossen ist.

Der Geber 5 enthält in der beschriebenen Variante eine Scheibe 28, in der eine Reihe von von dem Zentrum gleichmäßig entfernten Öffnungen 29 ausgeführt ist, deren Anzahl der Anzahl der Aushöhlungen 15 des Hohlzylinders gleich ist, und deren Winkelabstand gleich dem Win­ kelabstand zwischen den Aushöhlungen 15 ist. Die Scheibe 28 ist an einer Welle 30 des Antriebs 3 befes­ tigt. Es ist in der Scheibe 28 außerdem noch eine Öff­ nung 31 ausgeführt, die zwischen den zwei Öffnungen 29, die der ersten und der letzten Aushöhlung 15 entsprechen, aber in einer geringeren Entfernung vom Zentrum der Scheibe 28 liegt. Der Geber 5 enthält eine Lumineszenz­ diodenblock 32, der gegenüber den Öffnungen 29 und 31 aufgestellt ist, und zwei Fotodioden: eine Referenz- Fotodiode 33, die an den Eintritt 34 des Registrierge­ rätes 26 angeschlossen ist, und eine Zähldiode 35, die an den Adresseneintritt 27 angeschlossen ist.

Das Registriergerät 26 enthält einen Speicherblock 36, der mit einem Zeilenkanal an das Adressenregister 37 und mit der Datenkanal an das Datenregister 38 ange­ schlossen ist. Seinerseits ist das Adressenregister 37 mittels eines Sammelkanals an den Zähler 39 und das Da­ tenregister 38 an den Eingang eines Analog-Digital-Wand­ lers 40 angeschlossen. Der Eingang des Analog-Digital- Wandlers 40 ist an den Informationseingang 25 des Re­ gistriergerätes 26 angeschlossen. Der Einstelleingang 41 des Zählers 39 ist durch einen Impulsformer 42 an den Eingang 34 und der Zähleingang 43 des Zählers 39 durch den Impulsformer 44 an den Adresseneingang 27 des Re­ gistriergerätes 26 angeschlossen. Das Registriergerät 26 enthält auch einen Impulsgenerator 45 zur Ablesung und Löschung, dessen Eingang an den Ausgang des Impulsfor­ mers 44 und dessen Ausgänge an die Eingänge 46 und 47 für Ablesung und an die Eingänge 48 und 49 für die Einstellung in die Nullstellung der Register 37 und 38 angeschlossen sind.

In der beschriebenen Variante der Einrichtung wird das Gel 2 in Form des Hohlzylinders an der Innenoberflä­ che der Seitenwand der Hülse 1 angebracht. Möglich ist eine andere Variante der Ausführung der Einrichtung, in der das Gel 2 an der Außenoberfläche der Seitenwand der Hülse 1 angebracht wird (Fig. 2). Dabei wird die Hülse 1 innerhalb einer zusätzlichen Hülse 50 koaxial zu dersel­ ben aufgestellt, und das Gel 51 in Form eines Hohlzylin­ ders wird mittels Biegung einer fertigen Platte der Gelplatten mit Aushöhlungen 52 für die Anbringung von Pro­ ben, beispielsweise der obenbeschriebenen Gelplatte, ausge­ bildet, die auf beiden Seiten mit einem Polymerfilm be­ deckt ist. Die Platten werden an der Seitenoberfläche der Hülse 1 unter Zuhilfenahme von weichen Federringen (in der Zeichnung nicht gezeigt) befestigt. Die Gelplatten werden so aufgestellt, daß die Aushöhlungen 52 am Umfang im oberen Teil der Hülse 1 liegen. Die ringförmige Elek­ trode 53 wird in dieser Variante an der Innenoberfläche der Seitenwnd der zusätzlichen Hülse 50 koaxial zu der­ selben und die ringförmige Elektrode 13 an dem inneren zylindrischen Vorsprung 54 aufgestellt. Für den Durch­ tritt eines Lichtbündels von der Quelle 20 ist am Boden der zusätzlichen Hülse 50 ein Fenster 55 aus einem licht­ durchlässigen Werkstoff ausgeführt.

Bei der Anbringung des Gels 2 (Fig. 1) an der inneren Oberfläche der Seitenwand der Hülse 1 mittels Eingießens einer Monomerenlösung in dieselbe, die bei der Polyme­ risation Gel bildet, weist die Einrichtung auch ein Mit­ tel für die Ausbildung des Gels 2 aus der Monomerenlö­ sung in Form eines Hohlzylinders - als solches dient die Hülse 1 mit dem Antrieb 3 für die Drehung rings um die Achse - und ein Mittel für die Ausbildung der Aushöh­ lungen 15 an der Stirnseite des Hohlzylinders auf. Das letztere enthält ein im oberen Teil der Hülse 1 angeord­ netes ringförmiges Einsatzstück 56 (Fig. 3 und 4), das aus Polymethylmethakrylat mit Längsnuten 57 ausge­ führt wird, die an seiner zylindrischen Außenoberfläche angebracht sind und Schlitze zwischen dem ringförmigen Einsatzstück 56 (Fig. 3) und der Innenoberfläche der Seitenwand der Haupthülse 1 bilden, ein ringförmiges Einsatzstück 58 mit Vorsprüngen 59 (Fig. 5), die an seiner Stirnseite am Umfang ausgeführt sind, die in den Schlitzen liegen, ein Dichtungsring 60 (Fig. 3), der über dem ringförmigen Einsatzstück 58 an­ geordnet ist, und einen Deckel 61 mit einer Öffnung 62. Der Deckel 61 wird unter Zuhilfenahme von Fest­ stellern (nicht gezeigt) an den Vorsprüngen 63 an der Stirnseite der Hülse 1 befestigt. Die Öff­ nung 62 ist für das Eingießen der Monomerenlösung ge­ dacht.

Die Plattform 4 ist in der vertikalen Ebene um 90° drehbar. Hier­ für wird sie an einer Welle 64 des Antriebes 65 mon­ tiert, und es gibt Feststeller 66 und 67 der Endstellung­ en der Plattform 4, die an einer mit dem Antrieb 65 ge­ meinsamen Grundlage befestigt sind: der Feststeller 66 ist für die Fixierung der Plattform 4 in der vertikalen Lage und der Feststeller 65 für die Fixierung in der horizontalen Lage gedacht.

An der Innenoberfläche der Seitenwand der Haupthül­ se 1 sind längs der Erzeugenden vom Boden der Hülse 1 bis zur Stelle der Montage des ringförmigen Einsatzstückes 56 Vorsprünge 68 ausgeführt, die gleichmäßig am Umfang angeordnet sind. Die Vorsprünge 68 werden beispiels­ weise aus Polymethylmethakrylat ausgeführt und weisen in ihrem Querschnitt eine T-artige Form auf (siehe Fig. 6).

Bei der Ausbildung von Gel in Form eines Hohlzy­ linders, das Abschnitte mit unterschiedlicher Porosität aufweist, enthält die Einrichtung eine ringförmige Kam­ mer 69 (Fig. 7 und 8) aus Polymethylmethakrylat, die sich aus einem Gehäuse 70 und einem Deckel 71 zusammen­ setzt und im Querschnitt eine Trapezform aufweist, mit radialen Trennwänden 72 nach der Anzahl der Vorsprünge 68, die gleichmäßig am Umfang liegen und Hohlräume 73 (Fig. 8) für die Unterbringung von Monomerenlösungen bil­ den. Die ringförmige Kammer 69 ist unter dem ringförmi­ gen Einsatzstück 56 (Fig. 7) angebracht und am Deckel 74 mit Hilfe von Ständern 75 befestigt. Dabei ist die größ­ ere Grundplatte des Trapezes dem Deckel 74 zugewandt. Zur Eintragung von Monomerenlösungen in die Hohlräume 73 sind am Deckel 74 Öffnungen 76 nach der Anzahl der Hohl­ räume 73 ausgeführt. Im oberen Teil der äußeren Seiten­ wand der ringförmigen Kammer 69 sind an der Stelle des Anschlusses des Gehäuses 70 und des Deckels 71 Öffnungen 77 rechteckiger Form zum Abfließen der Monomerenlösungen auf die entsprechenden Abschnitte der Innenoberfläche der Seitenwand der Hülse 1, die durch die Vorsprünge 68 begrenzt werden, bei der Drehung der Hülse 1 ausgeführt.

Eine Variante der Ausführung der Hülse 1 (Fig. 1), in der die Innenoberfläche ihrer Seitenwand die Form ei­ nes Kegelstumpfes aufweist, der mit der größeren Grund­ platte dem Boden der Hülse 1 zugewandt ist (nicht gezeigt), weil die Kegelförmigkeit be einer derartigen Ausführung etwa 0,07 des Winkelgrades oder 0,001 Radins beträgt.

Die Quelle 20 der monochromatischen Strahlung ist in der Einrichtung so angebracht, daß ihr Lichtbündel 21 auf den Boden der Hülse 1 oder der Hülse 50 (Fig. 2) gerichtet ist. Dabei ist der Boden der Hülse 50 mit dem Fen­ ster 55 für den Durchtritt des Lichtbündels 21 versehen.

Das Funktionsprinzip der Einrichtung zur elektro­ phoretischen Bestimmung der primären Struktur der Nuk­ leinsäuren wird an Hand der Beschrei­ bung mehrerer Varianten ihrer Arbeit erläutert.

Beim Ausbilden des Gels in Form eines Hohlzylinders unmittelbar in der Hülse 1 (Fig. 3) wird in diese Hül­ se 1 bei eingeschaltetem Feststeller 66, der für die Fixierung der Plattform 4 in der vertikalen Lage vor­ gesehen ist, das ringförmige Einsatzstück 56 bis zur Be­ rührung seiner unteren Stirnseite mit den Vorsprüngen 68, die an der Innenoberfläche der Seitenwand der Hül­ se 1 ausgeführt sind, angeordnet. In die durch die Längs­ nuten 57 gebildeten Schlitze wird das ringförmige Ein­ satzstück 58 eingesetzt, wonach man den Dichtungsring 60 und den Deckel 61 anbringt. Den letzteren befe­ stigt man in der Hülse 1 mit Hilfe von Feststellern am Vorsprung 63, was ein hermetisches Andrücken des Dich­ tungsringes 60 an die Hülse 1 gewährleistet.

Durch die Öffnung 62 am Deckel 61 führt man bis zum Boden der Hülse 1 ein Rohr ein, das mit einer Quelle von Inertgas kommuniziert (nicht gezeigt), um das Inertgas der Hülse 1 zuzuführen, und dann nimmt man ihre Ausfüllung mit diesem Gas innerhalb von 2 bis 3 Minuten bei einem Gasdurchsatz von 5 bis 10 Liter pro Minute vor.

Dann wird das Rohr entfernt und durch die Öffnung 62 gießt man in die Hülse 1 eine Monomerenmischung ein. Das Volumen des Gemisches wird im voraus, ausgehend von der erforderlichen Stärke des Gels in Form des Hohlzy­ linders, berechnet. Gleich nach dem Eingießen der Mi­ schung wird der Antrieb 3 zur Drehung der Hülse 1 eingeschaltet und ihre Drehzahl bis auf 800 bis 900 U/min vergrößert. Hierdurch bedeckt die Mo­ nomerenlösung die ganze Innenoberfläche der Seitenwand der Hülse 1, die Gelstärke ist dabei in Höhenrichtung der Hülse 1 ungleichmäßig. Dann wird der Antrieb 65 einge­ schaltet und gleichzeitig der Feststeller 66 zwecks Über­ führung der Dreachse der Hülse 1 in die horizontale La­ ge abgeschaltet. Nach Erreichen dieser Lage durch die Hülse 1 wird der Feststeller 67 eingeschaltet, der für die Fixierung der Plattform 4 in der horizontalen Lage gedacht ist. In dieser lage bedeckt die Monomeren­ mischung die Oberfläche der Hülse 1 mit einer gleich­ mäßigen Schicht gleicher Stärke und fließt in die Schlit­ ze ein, die durch die Längsnuten 57 des ringförmigen Einsatzstückes 56 und durch die Hülse 1 gebildet wer­ den. Dabei werden die Luftblasen aus den genannten Schlitzen durch die Abschnitte der sich berührenden Ober­ flächen des ringförmigen Einsatzstückes 58, der Nuten 57 und der Hülse 1 mit der Monomerenlösung durch Einwirkung von Fliehkräften auf dieselbe herausgedrückt. Die Drehung der Hülse 1 in ihrer horizontalen Lage führt man innerhalb von 20 bis 30 Minuten durch. Während dieser Zeitspanne erfolgt die Polymerisation der Mono­ mere unter Anfallen des Gels in Form des Hohlzylinders. Dann wird die Hülse 1 mit Hilfe des Antriebes 65 in die vertikale Lage zurückgebracht, man nimmt den Deckel 61 und den Dichtungsring 60 ab. Damit wird der Arbeitsgang der Ausbildung des Gels an der zylindrischen Innenoberflä­ che der Hülse 1 mittels Eingießens einer Monomerenlösung in dieselbe abgeschlossen.

Dann wird in die Hülse 1 (Fig. 1) die Hülse 6 mit den an ihr befestigten ringförmigen Elektroden 12 und 13, dem Wärmeaustauscher 17 und dem Empfänger 22 aufgestellt und steif koaxial zu ihr befestigt, indem man den Ausle­ ger 7 mit der Plattform 4 verbindet. In den Zwischenraum zwischen den Seitenwänden der Hülsen 1 und 6 gießt man zunächst die untere Elektrodenlösung 11 bis zu einem Ni­ veau ein, das beträchtlich niedriger unter dem Niveau des Fühlelementes 23 des Empfängers 22 liegt, dann wird die nichtpolare Flüssigkeit 16 ungefähr bis zur halben Höhe des ringförmigen Einsatzstückes 56 und dann die obe­ re Elektrodenlösung 10 bis zum Vorsprung 63 eingegossen. Mit einer Pinzette wird das ringförmige Einsatzstück 58 herausgeholt und mit Hilfe einer Spritze werden die Aus­ höhlungen 15 gespült, wofür man die Elektrodenlösung 10 verwendet.

Man schaltet den Wasser-Thermostat ein und wärmt die nichtpolare Flüssigkeit 16 bis zur erforderlichen Temperatur durch, die gewöhnlich 323 K (50°C) gleich ist, in die Aushöhlungen 15 bringt man mit einer Kapil­ lare die zu analysierenden Proben in einem Volumen von 1 bis 2 µl ein und führt die erforderliche Span­ nung zu den Endelektroden 12 und 13 zu, damit die elek­ trische Feldstärke von 40 bis 50 V/cm beträgt. Dann schaltet man den Antrieb 3 der Hülse 1 ein, dann wird ihre Drehzahl auf 20 bis 30 U/min eingestellt. Danach schaltet man die Quelle 20 der mono­ chromatischen Strahlung, den Empfänger 22 und das Re­ gistriergerät 26 ein. Hierdurch beginnt die elektropho­ retische Trennung von Proben unter den kontrollierbaren Temperaturbedingungen sowie die Durchwärmung der Quelle 20 und des Empfängers 22, um stabile Betriebsparameter zu erreichen.

Unter Einwirkung des elektrischen Feldes wandern die Fragmente der Abschnitte der Nukleinsäure in Richtung des Stromflusses, das heißt von Stirnseite zu Stirnseite. In Abhängigkeit von der Ladungsgröße und der Größe der Frag­ mente gewinnen sie verschiedene Geschwindigkeiten, was zur Trennung des Gemisches der Fragmente in einzelne Gruppen gleicher Fragmente führt, von denen jede im Gel durch eine Extrazone vertreten ist, und alle Fragmente einer Probe bilden im Gel eine Bahn, die sich aus den einzelnen Zonen zusammensetzt und von der Aushöhlung 15 zur unteren Stirnseite des Hohlzylinders läuft. Im unte­ ren Teil des Gels 2 wird eine optimle Trennung dieser Zonen erreicht und sie können getrennt registriert wer­ den. Zur Registrierung der Moleküle der Nukleinsäuren während ihrer elektrophoretischen Trennung werden an die­ selben bei der Zubereitung der Proben kovalent Moleküle eines Fluoreszenzstoffes, der als Markierung dient, an­ geschlossen.

Nach Erreichen des Abschnitts 24 des Gels durch die führende Zone beginnt die automatische Registrierung der Komponenten der analysierbaren Proben, die mittels Spei­ cherung von Signalen im Speicherblock 36 des Registrier­ gerätes 26 erfolgt, die von dem Empfänger 22 der Fluores­ zenzstrahlung der Markierungen eintreten, wobei von jeder der Bahnen die Signale in einem Extrabereich des Speicher­ blocks 36 gespeichert werden. Die gespeicherte Informa­ tion kann später auf einen Videomonitor gebracht und mit Hilfe eines Computers bearbeitet werden. Die hinterein­ anderfolgende Ablesung der in den Speicherblock 36 infol­ ge der Registrierung der Fluoreszenzstrahlung der Zonen der vier Bahnen eingetretenen Daten, auf denen Fragmente der vier Reaktionen der Terminierung enthalten sind, die für ein- und denselben Abschnitt der Polymerisationsket­ te der Nukleinsäure durchgeführt werden, ermöglicht es, die Sequenz der Nukleotide oder, mit anderen Worten ge­ sagt, die primäre Struktur des zu analysierenden Ab­ schnitts der Nukleinsäure zu ermitteln.

Die Registrierung erfolgt wie folgt. Beim eingeschal­ teten Antrieb 3 tritt das zum Eingang 34 des Registrier­ gerätes 26 von der Referenzdiode 33 kommenden Signale durch den Impulsformer 42 an den Eingang 41 des Zählers 39 ein und bringt diesen in die Nullstellung. Das nächste Signal, das vom Geber 5 des Drehwinkels der Hülse eintritt, stellt die Adresse der ersten Bahn dar. Dieses von der Fotodio­ de 35 eintretende Signal tritt durch den Impulsformer 44 zum Eingang 43 des Zählers 39 ein und wird in demselben als "I" aufgezeichnet und der parallele Kode des Zu­ standes des Zählers 39 wird durch einen Kanal auf das Adressenregister 37 übergeben. Gleichzeitig wird das Ana­ logsignal des Empfängers 22, das an den Informationsein­ gang 25 des Registriergerätes 26 und weiter an den Ein­ gang des Analog-Digital-Wandlers 40 eintritt, in dem­ selben in den Zifferkode umgewandelt, der an das Daten­ register 38 durch den entsprechenden Kanal gelangt. Das Signal von dem Impulsformer 44 tritt auch an den Eingang des Generators 45 ein, in dem mit Verzögerungen bezüglich seines Eintrittssignals ein Abtastungssignal gebildet wird, das an die Eingänge 46 und 47 der Register 37 und 38 gelangt, und ein Signal der Einstellung der Register 37 und 38 in die Nullstellung erzeugt wird, das an die Eingänge 48 und 49 mit einer Verzögerung und mit einer größeren Verzögerung der Abtastungssignale bezüglich des Eintrittssignals des Generators 45 gelangt. Dabei wird zunächst in einem Gebiet des Speicherblocks 36, dessen Adresse durch den Kode bestimmt wird, der vom Adressen­ register 37 abgelesen wird, der Inhalt des Datenregisters 38 aufgezeichnet und dann werden die Register 37 und 38 in die Nullstellung gebracht.

Im Maße der Drehung der Scheibe 28 tritt in die Foto­ diode 35 das nächste Signal ein, das um eine Einheit von dem vorangegangenen sich unterscheidet, das der Bahn Nr. 2 entspricht. Dieses Signal wird in dem Zähler 39 aufge­ zeichnet, sein Zustand wird auf das Adressenregister aus­ gegeben und die Registrierung von Daten wird für die zwei­ te Bahn wiederholt. Dabei werden die Daten für ein anderes Gebiet des Speicherblocks 36 aufgespeichert. Analog er­ folgt die Registrierung der Signale des Empfängers 22 der monochromatischen Strahlung für die übrigen analysierba­ ren Proben.

Die Drehzahl der Hülse 1 wurde so gewählt, daß die Messung der Fluoreszenzstrahlung jeder Zone etwa zehn Mal vorgenommen wurde. Das erlaubt es, den statischen Fehler der Ergebnisse der elektrophoretischen Bestimmung der Sequenz der Nukleotide der zu analysieren­ den Nukleinsäuren zu verringern.

Zur Steigerung der Leistung bei der Bestimmung der primären Struktur mittels Reduzierung der Dauer ihrer Aus­ führung ist in der Einrichtung für die Durchführung des Verfahrens gleichzeitig in mehreren Gelplatten, die unter­ schiedliche Konzentration an Akrylamid aufweisen, und die den Hohlzylinder bilden, möglich. Die Bestimmung der pri­ mären Struktur wird in diesem Fall in der Einrichtung wie folgt verwirklicht.

Nach der Montage der ringförmigen Einsatzstücke 56 und 58 und des Dichtungsringes 60 in der Hülse 1 wird in dieselbe der Deckel 74 (Fig. 7) mit der darauf be­ festigten ringförmigen Kammer (9 (Fig. 8) angebracht. Der Deckel 74 wird so angeordnet, daß die radialen Zwischen­ wände 72 (Fig. 8) gegenüber den Vorsprüngen 68 der Hülse 1 angebracht sind, wonach der Deckel 74, wie oben beschrieben, mit Feststellern befestigt wird. Es erfolgt die Ausfül­ lung der Hülse 1 mit Inertgas, wie bereits oben beschrie­ ben wurde, und dann werden durch die Öffnungen 76 (Fig. 7) am Deckel 74 in die Hohlräume 73 (Fig. 8) der ringförmi­ gen Kammer 69 Monomerenlösungen eingegossen. Die Anzahl der zubereiteten Lösungen ist der Anzahl der Hohlräume 73 gleich, und die Lösungen mit der gleichen Konzentra­ tion an Akrylamid werden in die Hohlräume 73 eingegossen, die in der ringförmigen Kammer 69 gegeneinander liegen. Hierdurch werden mit Hilfe der Kammer 69 vier Gelplatten übergossen, von denen zwei eine niedrige, beispielsweise 8%ige und die zwei übrigen eine hohe, beispielsweise 16%ige Konzentration an Akrylamid aufweisen.

Man schaltet den Antrieb 3 (Fig. 3) ein und die Mono­ merenlösungen fließen im Maße der Vergrößerung der Drehzahl der Hülse 1 infolge der Fliehkräfte aus den Hohl­ räumen 73 (Fig. 8) der Kammer 69 durch die Öffnungen 77 auf die Innenoberfläche der Seitenwand der Hülse 1 ab, wobei jede Lösung auf einen Abschnitt abfließt, der durch die Vorsprünge 68, den Boden der Hülse 1 und durch die ringförmigen Einsatzstücke 56 und 58 (Fig. 7) begrenzt ist. Die schnell ansteigenden Fliehkräfte verhindern das Abfließen der Lösungen auf den Boden der Hülse 1. Wei­ tere Funktionsweise der Einrichtung nach dieser Variante ist der obenbeschriebene Funktionsweise der Einrichtung, lediglich mit Ausnahme der Eintragung von den zu analy­ sierenden Proben in die Aushöhlungen 15 (Fig. 1), ähnlich. In der beschriebenen Variante wird jede Probe in zwei Teile geteilt, von denen man einen auf die Gelplatte mit einer niedrigen Konzentration an Akrylamid und den ande­ ren auf die Gelplatte mit einer hohen Konzentratin an Akrylamid aufträgt.

Wie oben hervorgehoben wurde, ist in der Einrichtung die Verwendung von Gel 51 (Fig. 2) in Form von Fertig­ platten möglich. Bei der Unterbringung des Gels 51 in Form von Fertigplatten an der Außenoberfläche der Seiten­ wand der Hülse 1 arbeitet die Einrichtung wie folgt.

Die Gelplatten werden an der Oberfläche der Hülse 1 mit Hilfe von elastischen Federringen befestigt, wonach die Hülse 1 mit dem Antrieb 3 in der zusätzlichen Hülse 50, wie in Fig. 2 gezeigt, angeordnet wird, das heißt koaxial zu derselben und mit einem Spielraum gegenüber dieser Hülse 50 starr befestigt wird. Im übrigen ist die Funktionsweise der Einrichtung und die Durchfüh­ rung des Verfahrens ähnlich den obenbeschriebenen.

Die Verwendung der fertigen Gelplatten in der Ein­ richtung ist außerdem auch bei ihrer Unterbringung an der Innenoberfläche der Seitenwand der Hülse 1 möglich. Da­ bei hat die Einrichtung folgende Funktionsweise.

Die fertigen Gelplatten werden so abgeschnitten, daß ihre Höhe etwas größer als die Länge der Vorsprünge 68 (Fig. 3) und die Breite der Länge des Bogens zwischen den zwei benachbarten Vorsprüngen 68 (Fig. 6) an der In­ nenoberfläche der Seitenwand der Hülse 1 gleich ist. Dann wird die Platte gebogen und mit ihren Seitenrändern in die Nuten eingeschoben, die durch die in ihrem Quer­ schnitt T-artigen Vorsprünge 68 und durch die Innenober­ fläche der Seitenwand der Hülse 1 gebildet werden, wonach man die Gelplatte an die Oberfläche der Hülse 1 andrückt. In diesem Fall ist das ringförmige Einsatzstück 56 (Fig. 3) überflüssig und es wird nicht in die Hülse 1 einmontiert. Die Arbeit der Einrichtung und die Bestimmung der primären Struktur der Nukleinsäuren erfolgt wie in der obenbeschriebenen Variante.

Nachstehend werden konkrete Beispiele für die Reali­ sierung des Verfahrens zur elektrophoretischen Bestimmung der primären Struktur der Nukleinsäuren mit Bezugnahme auf die obenbeschriebenen Varianten der Funktionsweise der Einrichtung angeführt, in der dieses Verfahren durchge­ führt wird.

Beispiel 1

Die Vorbereitung der Einrichtung zum Eingießen der Monomerenlösung in die Hülse 1 (Fig. 1) führte man gemäß der obenbeschriebenen Variante. Die Monomerenlösungen wurden mit einem Volumen von 36 ml, berechnet auf die Ge­ winnung von Gel 2 in Form eines Hohlzylinders mit einer Stärke von 0,3 mm in einer Hülse 1 zubereitet, die ei­ nen Innendurchmesser von 200 mm und eine Höhe der Fläche für die Unterbringung des Gels 2 von 200 mm hat.

Die Monomerenlösung für die Durchführung der Sequen­ cing-Elektrophorese in einem 8%igen Polyakrylamid-Gel un­ ter den Bedingungen der Denaturierung enthielt in 36 ml Lösung 2,9 g Akrylamid, 0,15 g Methylenbisakrylamid, 0,036 ml Tetramethyläthylendiamin, 0,018 g Ammoniumperoxo­ sulfat, 0,39 g tris-Hydroxyäthylaminomethan, 0,2 g Bor­ säure, 0,035 g Natrumäthylendiamintetraazetat und 15,1 g Harnstoff.

Dann wurde die Monomerenlösung gleich nach der Zu­ bereitung (Ammoniumperoxosulfat und Tetramethyläthylen­ diamin setzte man ganz zuletzt) in die Hülse 1 eingegos­ sen, und man führte die Polymerisation des Gels 2, wie bereits oben beschrieben. Das Gel 2 wies nach der Poly­ merisation der Monomerenlösung die Form eines Hohlzylin­ ders und eine glatte Oberfläche ohne Rückstände an der flüssigen Phase auf.

Man verwendete Elektrodenlösungen folgender Zusam­ mensetzung. Die Elektrodenlösung 10 (obere): 1 Liter der Lösung 10 enthielt 10,8 g tris-Hydroxyäthylaminomethan, 5,5 g Borsäure, 0,93 g Natriumäthylendiamintetraazetat und wies einen pH-Wert von 8,3 auf. Die Elektrodenlösung 11 (untere) enthielt die gleichen Komponenten und wies zu­ sätzlich in 1 Liter 260 g Saccharose auf. Als nichtpolare Flüssigkeit 16 verwendete man ein Gemisch aus Hexan und Kohlenstofftetrachlorid mit einer Dichte von 1,06 ± 0,02 g/cm³.

Die Lösungen wurden in der Reihenfolge eingegossen, die bei der Beschreibung der Funktionsweise der Einrich­ tung gemäß Fig. 1 genannt ist, wonach man die übrigen Arbeitsgänge bis zum Auftragen der Proben auf das Gel 2 ausführte.

In jede Aushöhlung 15 trug man je 15 µl Elektro­ denlösung 10, die Harnstoff (7 Mol) enthält, und je 0,025% Markierungsfarbstoff ein: Bromphenolblau und Xylenzyanol, wonach an die ringförmigen Elektroden 12 und 13 Spannung angelegt wurde. Die Elektrophorese führte man bei einer Spannung von 650 V aus, wobei durch das Gel 2 ein Strom von 70 bis 75 mA floß. Die Geschwin­ digkeit der Bewegung der Farbstoffe betrug: Für Brom­ phenolblau, das eine elektrophoretische Beweglichkeit aufweist, die den DNS- oder RNS-Molekülen mit einer Länge von 25 bis 30 Nukleotiden äquivalent ist, 175 mm/h; für Xylenzyanol-Farbstoff, der eine den Molekülen mit einer Länge von 70 bis 85 Nukleotiden äuqivalente Beweglichkeit aufweist, 93 mm/h. Die Ergebnisse der Messungen der Ent­ fernungen, die die Farbstoffe in 1 und in 2 Stunden an allen Bahnen des Gels 2 durchwanderten, gaben eine Streu­ ung der Werte von 0,3 bis 0,5 mm für 160 Bahnen, was beim Auflösungsvermögen der Zonen von 1,2 bis 1,4, das im Gel in Form des Hohlzylinders der genannten Länge erreicht wird, einem Fehler der elektrophoretischen Analyse un­ ter 0,2% für vier benachbarte Bahnen entspricht.

Beispiel 2

Die Vorbereitung der Proben, die mit einem Fluoro­ phor markiert sind, für die Bestimmung der primären Struk­ tur der DNS gemäß dem Verfahren der elektrophoretischen Bestimmung der primären Struktur der Nukleinsäuren in ei­ ner Einrichtung für seine Durchführung wurde wie folgt vorgenommen.

Den Satz der Fragmente eines der Sequencing ausge­ setzten DNS-Moleküls erhielt man mittels Terminierungs­ reaktion der Polymerase-Kopierung der DNS nach Sanger. Für die Markierung der DNS-Fragmente mit dem Fluorophor verwendete man chemisch synthetisierten Oligonukleotid- Primer, der mit Tetramethylrhodamin konjugiert wurde.

Die Synthese der DNS-Fragmente führte man im System des Phages M13 aus. Den 2 µl Lösung, die etwa 0,2 Pikamol der zu analysierenden DNS enthält, setzte man 0,6 Pikamol ei­ nes markierten Primers in einem Volumen von 0,5 ml zu. Den Primer löste man in einer zehnmaligen Pufferlösung fol­ gender Zusammensetzung auf; 0,5 Mol NaCl, 66 mMol tris- Hydroxäthyl-aminomethan, pH 7,4, 66 mMol MgCl₂, 10 mMol Dithiothreitol. Man vermischte das hergestellte Gemisch sorgfältig und es wurde in ein siedendes Wasserbad mit einem Volumen von 500 ml für 3 Minuten untergebracht. Dann wurde das Wasserbad abgeschaltet und man ließ dieses bis auf Raumtemperatur abkühlen, die Abkühlung dauerte ungefähr zwei Stunden. Nach der Beendigung der Abkühlung entstanden Hybridmoleküle der DNS + Primer im Reaktions­ gemisch. Dann setzte man dem Gemisch bis zum Endvolumen von 10 µl eine Pufferlösung folgender Zusammensetzung zu: 50 nMol tris-Hydroxyäthylaminomethan, pH 8,5, 5 mMol MgCl₂, 2 mMol Dithiothreitol. Das dadurch verdünnte Ge­ misch verteilte man zu je 2 µl in vier Reagenzgläser für die Durchführung der Reaktion der Terminierung der Poly­ merase-Kopierung nach vier Basen.

In jedes Reagenzglas setzte man je 1 µl eines Ge­ misches von Desoxyribonukleosidtriphosphaten (dATP, dCTP, dGTP, DTTP) mit einer Konzentration eines jeden von 0,125 mMol und je 1 µl entsprechender Didesoxyri­ bonukleosidtriphosphate (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) bei folgenden Molverhältnissen zu:

dATP/ddATP = 1, dCTP/ddCTP = 2,5, dGTP/ddGTP = 6, dTTP/ddTTP = 6.

In jedes Reagenzglas setzte man je 1 µl Polymerase­ lösung (Klenowsche-Fragment) mit einer Aktivität von 1 Ein­ heit/µl zu, vermischte sorgfältig und inkubierte bei 37°C innerhalb von 15 Minuten. Dann setzte man jeder Probe je 1 µl des Gemisches aus dATP, dCTP, dGTP, dTTP in einer Konzentratin von 0,5 mMol von jedem zu und in­ kubierte weitere 15 Minuten. Die Reaktin wurde durch Zugabe von 5 µl der 99%igen Formamidlösung mit folgen­ den Farbstoffen zum Stillstand gebracht: Bromphenolblau und Xylenzyanol (0,5% von jedem). Dabei erfolgt die Dena­ turierung der Moleküle der zu analysierenden DNS und der Fragmente.

Die Polymerisation des Gels 2 in der Hülse 1 und das Eingießen der Elektrodenlösungen 10 und 11 sowie der nicht­ polaren Flüssigkeit 16 wurden, wie oben beschrieben, aus­ geführt. Die früher erhaltenen Proben wurden innerhalb von drei Minuten gekocht und auf das Gel 2 aufgetragen. In jede Aushöhlung 15 wurden je 2 µl der zu analysierenden Probe eingebracht und man führte die elektrophoretische Trennung und die Registrierung der Fragmente der Proben, wie in der obenbeschriebenen Variante der Funktionsweise der Einrichtung, durch. Bei der Registrierung wurde in der Einrichtung ein Argon-Laser als Quelle 20 der mono­ chromatischen Strahlung verwendet. Zur Aussonderung der Fluoreszenzstrahlung verwendete man ein Interferenzfil­ ter mit einem Maximum des Transmissionsspektrums bei 520 nm.

In der vorgeschlagenen Erfindung ermöglicht es die Anwendung des Prinzips der radialen Symmetrie bei der Un­ terbringung von Gel in Form eines Hohlzylinders, bei sei­ ner Thermostatierung und Registrierung der Fragmente der Proben, die Leistung und das Qualitätsniveau des Verfah­ rens zu erhöhen und die Einrichtung für seine Realisie­ rung zu vereinfachen. Beispielsweise kann bei einem Durchmesser der Hülse, an deren Seitenoberfläche das Gel angebracht ist, gleich 240 mm, die Bestimmung der primä­ ren Struktur an 160 Bahnen führen, das heißt, parallel die primäre Struktur von 40 Fragmenten der DNS mit einer Länge je 300 Nukleotide jeder zu analysieren. Das ent­ spricht der Leistung der Sequencing, die gleich 25 bis 30 Tausend Nukleotide pro Tag ist, das heißt auf das 25fache bis 30fache höher als in der bekannten Einrich­ tung. Dabei wird die Vergrößerung des Durchmessers des Hohlzylinders mit dem Ziel der weiteren Steigerung der Leistung des Verfahrens zur Vergrößerung des Durchmes­ sers der Hülse lediglich um ¹/₃ führen.

Der Bestimmungsfehler der primären Struktur bei der Anwendung der Erfindung ist um das 10 bis 12fache nied­ riger als bei der Anwendung des bekannten Verfahrens und der bekannten Einrichtung. Das ist jedoch nicht die ein­ zige Kennziffer der Verbesserung der Qualität. Es ist not­ wendig, auch die Faktoren zu berücksichtigen, die sich nicht direkt quantitativ bewerten lassen. Zu ihnen gehören solche wie die Reduzierung der Wahrscheinlichkeit kriti­ scher Situationen und Fehler sowie die Verringerung des Einflusses destabilisierender Faktoren auf den Prozeß der Bestimmung der primären Struktur. Dazu kann man auch die Senkung der Anforderungen an die Qualifikation des Personals zählen. All das erlaubt es, die Fehler auf Kosten der Erhöhungder Zuverlässigkeit des Verfarens und der Einrichtung sowie ihrer Vereinfachung zusätzlich zu ver­ ringern.

Claims (13)

1. Verfahren zur elektrophoretischen Bestimmung der primären Struktur von Nukleinsäuren, bestehend darin, daß man

• - Proben einer Nukleinsäure in Form von Fragmenten ihrer Polymerkette, die Markierungen enthalten, in einem Gel unterbringt,
• - an das Gel eine Spannung zur elektrophoretischen Trennung der Fragmente in Richtung des Stromflusses in Übereinstimmung mit ihrer Größe anlegt,
• - die Fragmente nach den Markierungen zwecks Festle­ gung ihrer relativen Lage im Gel registriert, nach der man über die Reihenfolge der Nukleotide im Molekül der Nukleinsäure urteilt,

dadurch gekennzeich­ net, daß man

• - dem Gel (2, 51) die Form eines hohlen Zylinders verleiht,
• - die Proben der Nukleinsäure in Aushöhlungen unter­ bringt (15, 52),
• - die Aushöhlungen (15, 52) an der Stirnseite des Hohlzylinders an seinem Umfang anbringt,
• - die Spannung zur elektrophoretischen Trennung der Fragmente in Richtung des Stromflusses in Übereinstim­ mung mit ihrer Größe an die Stirnseiten des Hohlzylinders anlegt,
• - eine konstante Temperatur des Gels (2, 51) in Form des Hohlzylinders auf einem Niveau unterhält, bei dem die Wanderung der Fragmente der Polymerkette der Nukle­ insäure ohne chemische Bindung über Wasserstoffbrücken mit Hilfe einer Schicht einer nichtpolaren Flüssigkeit (16) erfolgt, wobei ihre Temperatur reguliert wird,
• - die Schicht der nichtpolaren Flüssigkeit (16) sei­ tens einer der Seitenoberflächen des Hohlzylinders an­ bringt,
• - die Höhe der Schicht der nichtpolare Flüssigkeit (16) ungefähr in der gleichen Höhe wie des Hohlzylinders wählt,
• - die Registrierung der Fragmente der Abschnitte der Polymerkette der Nukleinsäure durch die Drehung des Gels (2, 51) in Form des Hohlzylinders rings um seine Achse vornimmt.

2. Verfahren zur elektrophoretischen Bestimmung der primären Struktur nach Anspruch 1, dadurch ge­ kennzeichnet daß man

• - das Gel (2, 51) in Form des Hohlzylinders mit un­ terschiedlicher Porosität an den Einzelabschnitten aus­ bildet, die an seinem Umfang angeordnet sind,
• - mindestens zwei Proben der Nukleinsäure nimmt, die gleiche Fragmente der gleichen Abschnitte der Polymerket­ te enthalten, die man an den Abschnitten des Gels (2, 51) in Form des Hohlzylinders unterbringt, die unterschiedli­ che Porosität aufweisen.

3. Verfahren zur elektrophoretischen Bestimmung der primären Struktur nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zwischen de Gel (2, 51) in Form des Hohlzylinders und der Schicht der nicht­ polaren Flüssigkeit (16) eine Schicht aus polymerem Mate­ rial unterbringt, das gegenüber der nichtpolaren Flüssig­ keit (16) resistent ist.

4. Einrichtung zur Durchführung des Verfahrens zur elektrohporetischen Bestimmung der primären Struktur der Nukleinsäuren nach Anspruch 1, die folgendes enthält:

• - eine vertkal angeordnete Küvette zylindrischer Form aus dielektrischem Werkstoff zur Unterbringung des Gels mit den Proben der Nukleinsäure,
• - im oberen und im unteren Teil der Küvette an­ gebrachten Kammern (8 und 9)
  • -- mit Elektrodenlösungen (10 und 11),
  • -- mit Elektroden, die an eine Stromquelle ange­ schlossen sind,
• - die mit der Küvette zur Herbeiführung des elektri­ schen Kontaktes der Elektrodenlösungen (10, 11) mit dem Gel kommunizieren,
• - eine Quelle (20) der monochromatischen Strahlung, deren Lichtbündel (21) auf den Abschnitt der Küvette ge­ richtet ist, der in ihrem unteren Teil liegt, und in den Proben der Nukleinsäure Fluoreszenzstrahlung der Markie­ rungen der Fragmente der Abschnitte ihrer Polymerkette anregt,
• - einen Empfänger (22) der Fluoreszenzstrahlung der Markierungen, dessen Fühlelement (23) dem mit der Quelle (20) der monochromatischen Strahlung beleuchteten Abschnitt (24) des Gels zugewandt ist,
• - ein Registriergerät (26) an dessen Informations­ eingang (25) der Empfänger (22) der Fluoreszenzstrahlung der Markierungen angeschlossen ist, und an dessen Adressen­ eingang (27) Signale gelangen, die den Nummern der Proben entsprechen,

dadurch gekennzeichnet, daß

• - die Küvette in Form einer Hülse (1) aufgestellt ist,
  • -- die mit einem Antrieb (3) zur Drehung rings um die Achse versehen ist,
    • --- der an einer Plattform (4) aufgestellt ist,
  • -- die mit einem Geber (5) des Drehwinkels versehen ist, dessen Ausgang an den Adresseneingang (27) des Re­ gistriergerätes (26) angeschlossen ist,
• - die Kammern (8, 9) durch die Seitenwand und durch den Boden der Hülse (1) sowie durch die Seitenwand und durch den Boden einer zusätzlichen Hülse (6, 50) gebildet sind,
  • -- die aus einem dielektrischen Werkstoff ausgeführt ist,
  • -- die koaxial zur Haupthülse (1) angeordnet ist,
  • -- und an der Plattform (4) befestigt ist,
• - es ein Mittel zur Unterhaltung der konstanten Tem­ peratur des Gels (2, 51) gibt, das
• - eine nichtpolare Flüssigkeit (16) enthält, die zwi­ schen den Elektrodenlösungen (10, 11) am Abschnitt zwi­ schen den Seitenwänden der Haupt- und der Zusatzhülse (1, 6 und 50) untergebracht ist,
  • -- und einen in der nichtpolaren Flüssigkeit (1) liegenden Wärmeaustauscher (17) enthält, wobei
  • -- die Elektrodenlösung (11), die über der nichtpo­ laren Flüssigkeit (16) untergebracht ist, eine größere Dichte als die nichtpolare Flüssigkeit (16) aufweist, und die Elektrodenlösung (10), die über ihr un­ tergebracht ist, eine geringere Dichte aufweist,
• - Elektroden (12, 13 und 53) als Ringelektroden aus­ geführt sind,
  • -- die koaxial gegenüber den Haupt- und Zusatzhülsen (1, 6 und 50) angeordnet sind,
  • -- und die mit der Zusathülse (6, 50) steif verbun­ den sind.

5. Einrichtung zur Durchführung des Verfahrens zur elektrophoretischen Bestimmung der primären Struktur nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß

• - die Quelle (20) der monochromatischen Strahlung so aufgestellt ist, daß sein Lichtbündel (21) auf den Boden der Hauthülse beziehungsweise der Zusatzhülse (1 und 50) gerichtet ist,
  • -- der aus einem Werkstoff ausgeführt ist, der für die monochromatische Strahlung optisch transparent ist.

6. Einrichtung zur Durchführung des Verfahrens zur elektrophoretischen Bestimmung der primären Struktur nach Anspruch 4, dadurch gekennzeich­ net, daß sie

• - ein Mittel zur Ausbildung des Gels (2) aus einer Monomerenlösung in Form eines Hohlzylinders aufweist, als das die Haupthülse (1) mit dem Antrieb (3) für die Drehung rings um die Achse dient,
• - ein Mittel für die Ausbildung der Aushöhlungen (15) an der Stirnseite des Hohlzylinders aufweist,
  • -- das ein im oberen Teil der Haupthülse (1) mon­ tiertes ringförmiges Einsatzstück (56) mit Längsnuten (57) enthält, die an seiner zylindrischen Außenoberflä­ che angebracht sind, die Schlitze zwischen dem ringför­ migen Einsatzstück (56) und der Innenoberfläche der Sei­ tenwand der Haupthülse (1) bilden,
  • -- ein ringförmiges Einsatzstück (58) mit Vorsprün­ gen (59) enthält, die an seiner Stirnseite am Umfang aus­ geführt sind, und die in den Schlitze angeordnet sind,
  • -- einen Dichtungsring (60) enthält, der über dem ringförmigen Einsatzstück (58) mit den Vorsprüngen (59) montiert ist,
  • -- einen Deckel (61) mit einer Öffnung (62), der an der Stirnseite der Haupthülse (1) angeordnet ist.

7. Einrichtung zur Durchführung des Verfahrens zur elektrophoretischen Bestimmung der primären Struktur nach Anspruch 6, dadurch gekennzeich­ net, daß

• - die Plattform (4) mit der Möglichkeit der Drehung um 90° in der vertikalen Ebene montiert ist und
• - mit Fixierungsvorrichtungen (66 und 67) der End­ stellungen versehen ist.

8. Einrichtung zur Durchführung des Verfahrens zur elektrophoretischen Bestimmung der primären Struktur nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die innere Oberfläche der Seiten­ wand der Hülse (1) die Form eines Kegelstumpfs aufweist, der mit seiner größeren Grundplatte dem Boden der Haupt­ hülse (1) zugewandt ist.

9. Einrichtung zur Durchführung des Verfahrens zur elektrophoretischen Bestimmung der primären Struktur nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeich­ net, daß an der inneren Oberfläche der Seitenwand der Haupthülse (1) längs der Erzeugenden von dem Boden der Haupthülse (1) bis zum Abschnitt der Ausbildung des ring­ förmigen Einsatzstückes (56) mit den Längsnuten (57) vor­ sprünge (68) ausgeführt sind, die gleichmäßig am Umfang angebracht sind.

10. Einrichtung zur Durchführung des Verfahrens zur elektrophoretischen Bestimmung der primären Struktur nach Anspruch 9, dadurch gekennzeich­ net, daß die Vorsprünge (68) an der inneren Oberfläche der Seitenwand der Haupthülse (1) im Querschnitt eine T- artige Form aufweisen.

11. Einrichtung zur Durchführung des Verfahrens zur elektrophoretischen Bestimmung der primären Struktur nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die

• - eine ringförmige Kammer (69) aufweist,
• - die im Querschnitt eine Trapezform aufweist,
• - mit radialen Zwischenwänden (72) gemäß der Anzahl der Vorsprünge (68) an der inneren Oberfläche der Seiten­ wand der Haupthülse (1), die gleichmäßig am Umfang ange­ bracht sind und Hohlräume (73) für die Unterbringung der Monomerenlösungen bilden,
• - die unter dem ringförmigen Einsatzstück (56) mit den Längsnuten (57) liegt,
• - die mit dem Deckel (74) starr verbunden ist
• - und dem Deckel mit der größeren Grundplatte der Trapez zugewandt ist, wobei
• - im oberen Teil der Außenseitenwand der ringförmigen Kammer (69) Öffnungen (77) für das Ausströmen der Mono­ merelösungen auf die entsprechenden Abschnitte der inne­ ren Oberfläche der Seitenwand der Haupthülse (1) ausge­ führt sind, die durch die Vorsprünge (68) begrenzt werden.