DE69221980T2 - Verfahren und vorrichtung zur bestimmung von dns-nukleotid-sequenzen - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur bestimmung von dns-nukleotid-sequenzen

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Description

    GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Molekularbiologie und insbesondere auf ein Verfahren zum Bestimmen der DNA Nucleotidsequenz und eine Vorrichtung für die Durchführung dieses.
    • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Bis jetzt sind verschiedene Techniken zum Untersuchen einer Nucleotidsequenz und Identifizieren einzelner Basensubstitutionen mittels Hybridisierungstechniken (Cotton, R.G.H. Biochem. J. 1989, Band 263, Seite 1-10) beschrieben worden.
  • Die am verbreitesten Techniken sind diejenigen, bei denen ein Test DNA Fragment an eine Membran angeheftet und mit markierten Oligonucleotiden daran hybridisiert wird (Wallace, P.B., Shaffer, J., Murphy, R.F., Bonner, J., Hirose, T., Itakura, K. Nucleic Acid Res., 1979, Band 6, Seiten 3543- 3557).
  • In der Technik sind ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Bestimmen einer DNA Nucleotidsequenz (E. Southern et al., WO-A-8910977) bekannt, wobei das Verfahren umfaßt: Synthetisieren von Oligonucleotiden auf einem Glasträger, Bewirken der Hybridisierung mit radioaktiv oder fluoreszierend markierter Test DNA, Waschen bei Doppelstrangdissoziationsbedingungen, Nachweisen des Vorhandenseins individueller Substitutionen in der Testsequenz durch Analysieren der Autoradiographiemuster oder der Fluoreszenzintensität bei einzelnen Flecken und Rekonstruieren der DNA Nucleotidsequenz auf der Basis von Datenanalyse. Eine Vorrichtung zum Durchführen des Verfahrens umfaßt einen Trägerfilm oder Glasplatte und eine Matrix, die kovalent an die Oberfläche davon gebunden ist, wobei die Matrix den gesamten Satz oder einen ausgewählten Teil von Oligonucleotiden der gewünschten Länge umfaßt, wobei die zuletzt genannten Oligonucleotide dazu fähig sind, an den Hybridisierungsreaktionen teilzunehmen. Die Oberfläche des Trägers, an den die Oligonucleotide angeheftet sind, ist aus Glas hergestellt. Ein weiteres Verfahren der DNA Sequenzierung basiert auf der Hybridisierung eines DNA Fragments mit einem vollständigen Satz von Oligonucleotiden mit festgesetzter Länge, welche als Flecken auf einer Matrix einzeln unbeweglich gemacht sind. Die Sequenz des DNA Fragments wird auf Basis der Dissoziationskurven der immobilisierten Doppelstränge festgelegt. (K.R. Khrapko et al, FEBS Lett, 256, 118-122, 1989).
  • Die zuvor genannten Verfahren und Vorrichtungen haben jedoch eine geringe Empfindlichkeit.
  • Der Wert des Signals der markierten, von jedem individuellen Matrixelement erhaltenen DNA (herausgestellt in der nahen Oberflächenschicht des Trägers), ist durch die Substratoberflächenkapazität begrenzt (was die kovalent angehefteten Oligonucleotide anbelangt), und er kann nicht ohne Vergrößern von entweder der Fläche des Matrixelements oder der Empfindlichkeit des Markierungsmarkers erhöht werden. Diese Begrenzungen reduzieren die Auflösekraft des Verfahrens und der Vorrichtung, machen es schwierig, die Matrix in Miniatur zu gestalten, erhöhen die Anforderungen, die an die Empfindlichkeit und Auflösekraft des Detektors gestellt werden, und erhöhen den Verbrauch der Reagenzien. Das Verfahren ist ziemlich kompliziert, weil es selbst beim Prüfen eines Test DNA Fragments erforderlich macht, daß eine Reihe von aufeinanderfolgenden Hybridisierungen durchgeführt wird, wobei zusätzliche Abläufe von Oligonucleotidmatrixsynthese bei einer Ein-Buchstabenstufe für jeden Fleck durchzuführen sind, wo Hybridisierung nicht unzweifelhaft Information in Bezug auf die Sequenz ergeben hat, und deshalb müssen jedes Mal neue optimale Hybridisierungsbedingungen (Temperatur, Reagenzkonzentrationen, etc.) gewählt werden, welches weiteres Experimentieren und beträchtliche Aufwendung an Zeit und Reagenzien umfaßt.
  • Es ist eine Aufgabe der Erfindung, das Verfahren und die Vorrichtung in einer derartigen Weise zu ändern, daß ihre Wirksamkeit verbessert wird, Empfindlichkeit, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit erhöht wird, das Erkennen von Punktmutationen in der Nucleotidsequenz vereinfacht wird und der Aufwand an Reagenzien reduziert wird.
  • Bei dem vorliegenden Verfahren zum Bestimmen der DNA Nucleotidsequenz, welches Bildung einer Reihe von Oligonucleotiden, ihre Hybridisierung mit der markierten Test DNA, Waschen unter Doppelstrangdissoziationsbedingungen, Identifizierung jeder Einzelbasensubstitution in der Test DNA durch Analysieren der Verteilung des markierten Markers und letzlich computergesteuerte Rekonstruktion der DNA Nucleotidsequenz umfaßt, wird die zuvor genannte Aufgabe dadurch gelöst, daß das erfundene Verfahren Bildung einer Reihe von Oligonucleotiden bei derartigen Konzentrationen davon umfaßt, welche die gleiche Temperatur der Doppelstrangdissoziation für alle vollständig komplementären Doppelstränge gewährleisten.
  • Um verläßliche Unterscheidung von vollständig komplementären Doppelsträngen von Doppelsträngen mit Punktmutationen (Mismatching) zu erzielen, wird es bevorzugt, die Waschstufe bei einem festgelegten Temperaturgradienten durchzuführen.
  • Um Genauigkeit zu verbessern und die Dauer der Datenanalyse zu reduzieren, wird es während des Waschens bevorzugt, die Abhängigkeit der Menge der verbleibenden Doppelstränge von der Temperatur, welche mit der Abhängigkeit für die bekannte Sequenz der perfekten doppelhelikalen DNA zu vergleichen ist, aufzuzeichnen.
  • Um die Dauer der Analyse zu reduzieren, ist es vorteilhaft, eine Reihe von Oligonucleotiden bei Konzentrationen zu bilden, die die Hybridisierung und Waschen der vollständig komplementären Doppelstränge, welches bei der gleichen Temperatur durchzuführen ist, ermöglichen.
  • Das vorliegende Verfahren macht es möglich, das Verfahren im Vergleich zu dem Verfahren des Standes der Technik beträchtlich zu vereinfachen, und dessen Empfindlichkeit, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu verbessern. Das gegenwärtige Verfahren hilft dabei, die Wirksamkeit des Verfahrens zu erhöhen, indem es dieses ökonomischer in Bezug auf Zeit, Arbeit und verwendete Reagenzien macht. Darüber hinaus werden die Größe der Zellen und die Zwischenräume zwischen ihnen so gewählt, daß sie geeigneterweise die Vorrichtung der Erfindung mit der existierenden technologischen und Meßausrüstung kombinieren.
  • Das Ziel der Erfindung wird weiterhin dadurch erreicht, daß die Vorrichtung zum Bestimmen der DNA Nucleotidsequenz einen festen Träger und eine Matrix umfaßt, die eine Reihe von Oligonucleotiden mit gewünschter Länge enthält, wobei die Matrix gemäß der Erfindung an den Träger mithilfe einer Gel schicht mit einer Dicke von nicht mehr als 30 µm angeheftet ist.
  • Vorzugsweise besteht die Gelschicht aus einem Satz von mit Abstand angeordneten "Flecken" gemäß der Anzahl der Matrixelemente. Die Gelschicht liefert eine dreidimensionale Anheftung der Oligonucleotide mit einer Kapazität, die beträchtlich die Kapazität einer molekularen Schicht übersteigt, indem die Gelschicht, die eine Vielzahl von mit Abstand angeordneten Flecken umfaßt, es der gewünschten Anzahl von Oligonucleotiden ermöglicht, innerhalb eines ausgewählten Gelvolumens gelegen zu sein.
  • All dies macht es möglich, die Matrix in Miniatur zu gestalten, und die Geschwindigkeit all der Verfahren zu erhöhen und somit die Dauer des Verfahrens zu reduzieren und die Empfindlichkeit, Auflösungskraft, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des Verfahrens und der Vorrichtung zu verbessern und den Verbrauch der Reagenzien zu erniedrigen.
  • Die gegenwärtige Vorrichtung ist eine Vorrichtung, bei der die Oberfläche jedes Teils der Gelschicht ("Zelle") die Form eines quadrats mit einer Seitenlänge von 25 bis 100 µm und dem Abstand zwischen den Quadraten gleich bis doppelt der Seitenlänge hat. Dieses Design ermöglicht, daß ein dynamisches Gleichgewicht rasch während des Hybridisierungsverfahrens begründet wird, der Verbrauch der Reagenzien erniedrigt wird, die Empfindlichkeit erhöht wird, und nicht toxische, nicht radioaktive Marker verwendet werden.
  • Bei all den Ausführungsformen der Vorrichtung ist es bevorzugt, die Schicht eines Polyacrylamidgels herzustellen, welches geeignet bei der Verwendung, leicht verfügbar und reproduzierbar ist.
  • Die vorliegende Vorrichtung hilft dabei, das Verfahren zum Bestimmen einer DNA Nucleotidsequenz zu vereinfachen, dessen Dauer zu reduzieren, die Empfindlichkeit, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu verbessern und den Verbrauch der Reagenzien zu erniedrigen.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die Erfindung wird im nachfolgenden mithilfe einer detaillierten Beschreibung ihrer Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen folgendermaßen erkl ärt.
  • Fig. 1 ist ein Schema der Vorrichtung zum Bestimmen der DNA Nucleotidsequenz, von oben betrachtet;
  • Fig. 2 ist eine longitudinale Abschnittsansicht von Fig. 1;
  • Fig. 3 ist ein Schema von während der Immobilisierung eines Oligonucleotids in einem Polyacrylamid auftretenden chemischen Reaktionen;
  • Fig. 4 zeigt die Waschkurven von AT-reichen Doppelsträngen (a) und GC-reichen Doppelsträngen (b), wobei die Menge der verbleibenden Doppelstränge auf der Y-Achse in % geplottet sind, und die Waschtemperatur auf der X-Achse in ºC;
  • Fig. 5 zeigt die Abhängigkeit der Doppelstrangwaschtemperatur (der Doppelstrang am obersten Ende dargestellt, M steht für Matrix) von der Konzentration des immobilisierten Oligonucleotids. Die verbleibenden Doppelstränge sind auf der Y-Achse in % aufgetragen, und die Waschtemperatur auf der X-Achse in ºC;
  • Fig. 6 zeigt die Abhängigkeit der Waschtemperaturen von AT-reichen und GC-reichen Doppelsträngen von der Konzentration von in dem Gel immobilisierten Oligonucleotiden. Die Menge der verbleibenden Doppelstränge in % sind auf der Y-Achse und die Waschtemperatur in ºC auf der X-Achse aufgetragen;
  • Fig. 7 ist ein Vergleichsdiagramm zum Unterscheiden von Punktmutationen in Doppelsträngen von unterschiedlicher GC Zusammensetzung auf einer Matrix mit ausgewählten Konzentrationen von immobilisierten Oligonucleotiden;
  • Fig. 8 Das Schema der Mikromatrix veranschaulicht die Hybridisierungsspezifität und Empfindlichkeit des Verfahrens.
    • BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Vorrichtung zum Bestimmen der DNA Nucleotidsequenz umfaßt einen Träger 1 (Figuren 1 und 2), vorzugsweise eine Glasplatte, und eine mithilfe einer Gelschicht von weniger als 30 µm Dicke an deren Oberfläche angeheftete Matrix 2. Die Gelschicht kann eine Vielzahl von Teilen 3 gemäß der Anzahl der Elemente in der Matrix 2 umfassen, die mit Abstand voneinander durch Zwischenräume 4 angeordnet sind. Die Zwischenräume 4 können unterschiedliche Dimensionen haben. Die Gelteile 3 können unterschiedliche Formen haben.
  • Eine bevorzugte Vorrichtung ist eine, in der jedes Teil 3 die Form eines Quadrats mit einer Seitenlänge von 25 bis 100 µm hat, und die Zwischenabstände 4 zwischen den quadraten das Doppelte der Seitenlänge sind. Die Schicht kann aus verschiedenen Gelen, vorzugsweise einem Polyacrylamidgel hergestellt sein.
  • Die Matrix kann folgendermaßen hergestellt werden:
  • Zwei Objektträger, einer davon ist mit Bind Silane vorbehandelt und der andere mit Repel Silane, der zuletzt genannte Objektträger wurde mit einer dünnen Schicht von Triton X-100 eingefettet. Die Objektträger sind unter Verwendung von Spacern mit weniger als 30 µm Dicke gestapelt, der sich ergebende Zwischenraum zwischen ihnen ist mit einer Gellösung gefüllt, und man läßt das Gelverfahren fertig werden, wonach der Oberflächenobjektträger entfernt wird. Der gelüberzogene untere Objektträger wird getrocknet, Teil des Gels wird entfernt, beispielsweise mechanisch, so daß die durch Zwischenräume getrennten Gelteile (Zellen) auf der Objektträgeroberfläche verbleiben. Die auf diese Weise erhaltene Oberfläche wird 2 bis 5 Minuten mit Repel Silane behandelt, zuerst mit Alkohol und anschließend mit bidestilliertem Wasser gewaschen und getrocknet. Oligonucleotide, die 3-Methyluridin an dem 3'-Ende enthalten, werden mit 1mM Natriumperiodat 10 Minuten bis 1 Stunde bei Raumtemperatur oxidiert, mit 10 Volumen 2% LiClO&sub4; in Aceton gefällt und in Wasser gelöst. Dann werden die Oligonucleotide in dem Gel immobilisiert. Zu diesem Zweck werden die Zellen der luftgetrockneten Matrix mit Mikrodosierungen von oxidierten Oligonucleotiden mit identischem Volumen (ein Typ in eine Zelle) aus dem verfügbaren Vorrat gefüllt.
  • Die Reihe der Oligonucleotide wird in einer derartigen Weise gebildet, daß ihre Konzentrationen die gleiche Dissoziationstemperatur für alle vollständig komplementären Doppelstränge gewährleisten, oder bei Konzentrationen, die anschließende Hybridisierungen und Waschen der vollständig komplementären Doppelstränge, welches bei der gleichen Temperatur durchzuführen ist, erlauben. Ein mit radioaktivem oder Fluoreszenzmarker markiertes Test DNA Fragment in einer Pufferlosung wird auf die Matrix mit der vorher gebildeten Reihe von Oligonucleotiden aufgebracht (bei dem Verfahren bedeckt die Lösung vollständig alle Bereiche, die immobilisierte Oligonucleotide enthalten). Die Reihe von Oligonucleotiden wird anschließend mit der hinzugefügten markierten Test DNA hybridisiert, und die Doppelstränge werden bei Dissoziationsbedingungen weggewaschen. Einzelne Basensubstitutionen in der Test DNA werden durch Analysieren der Verteilung des Markers identifiziert.
  • Die Test DNA Sequenz wird auf der Basis der Datenanalyse rekonstruiert. Um zuverlässig vollständig komplementäre Doppelstränge mit Punktmutationen (Mismatching) zu unterscheiden, wird Doppelstrangwaschen bei dem vorliegenden Verfahren bei einem festgelegten Temperatugradienten bewirkt. Um die Dauer zu reduzieren und Genauigkeit dieser Analyse zu verbessern, wird es bevorzugt, daß im Verlauf des Waschens die Abhängigkeit der Menge verbleibender Doppelstränge von der Temperatur bestimmt und mit der Abhängkeit für die bekannte DNA Sequenz perfekter Doppelstränge verglichen wird. Es ist festgestellt worden, daß beinahe immer eine Temperatur gefunden werden konnte, bei der das Verhältnis von Hybridisierungssignalen aus einem vollständig komplementären Doppelstrang und einem entsprechenden Doppelstrang, welcher Punktmutationen enthält, ausreichend hoch ist (zumindest 10:1), um zuverlässig einen von dem anderen zu unterscheiden. Die Ausnahme wird durch einige Endmutationen geliefert, welche eine hohe Stabilität haben können. Dieses beschränkt jedoch nicht den Umfang des vorliegenden Verfahrens. Tatsächlich ist es beim Verfahren mit bekannten Sequenzen (beispielsweise Nachweisen von Mutationen in ihnen), immer möglich, für die Immobilisierung ein derartiges Oligonucleotid auszuwählen, bei dem die erwartete Basensubstitution innerhalb des Doppelstranges gelegen sein würde.
  • Andererseits kann bei der Analyse einer unbekannten Nucleotidsequenz (beispielsweise beim DNA Sequenzieren) das Problem der Endfehlpaarungen leicht gelöst werden, indem etwas Information geopfert wird, während die Hybridisierungsdaten zwischen einem DNA Fragment und einer Oligonucleotidmatrix mithilfe eines Computers verarbeitet werden. Unsere Berechnungsmethoden sind durch eine hohe Stabilität aufgrund von Information im Übermaß gekennzeichnet.
  • Für ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung werden einige Aspekte ihrer tatsächlichen Realisierung im nachfolgenden beispielhaft dargestellt.
    • BEISPIEL 1 Herstellung einer Matrix mit einer Reihe von Oligonucleotiden:
  • Oligonucleotide werden mithilfe eines Festphasenphosphoramiditverfahrens (Schutz wird in einer gesättigten wäßrigen Ammoniaklösung bei 55ºC 12 Stunden entfernt) synthetisiert und mithilfe von Elektrophorese in einem Polyacrylamidgel gereinigt. Oligonucleotide wurden mithilfe von ([y-³²P]ATP mit Polynucleotidkinase T4) an dem 5'-Ende markiert, wobei eine spezifische Aktivität von 3 µCi/pMol erzielt wurde.
  • Zwei Objektträger, einer von ihnen mit Bind Silane und der andere mit Repel Silane (LKB) vorbehandelt und mit einer dünnen Schicht von Triton X- 100 eingefettet, werden mit Abstand zueinander mithilfe von 30 µm dicken Abstandshaltern angeordnet. Der sich ergebende Abstand zwischen den Objektträgern wird mit 8% Acrylamidlösung, 30:1 N,N'-Methylenbisacrylamid, Ammoniumpersulfat und TEMED gefüllt, welches man 1 Stunde polymerisieren läßt. Als Ergebnis wird eine 30 µm dicke Gelschicht zwischen den Objektträgern gebildet, wobei die Dimensionen der Schicht durch die Größe der Objektträger bestimmt werden. Bei Beendigung der Polymerisation wird der obere Objektträger entfernt. Der mit einer Polyacrylamidschicht überzogene untere Objektträger wird mit 50% Hydrazin eine Stunde bei Raumtemperatur behandelt.
  • Oligodesoxynucleotide, welche 3-Methyluridin an dem 3'-Ende enthalten, werden mit 1 mM Natriumperiodat 1 Stunde bei Raumtemperatur oxidiert, mit 10 Volumen 2% LiClO&sub4; in Aceton gefällt und in Wasser gelöst. Die für die Immobilisierung fertige luftgetrocknete Matrix wird tropfenweise mithilfe eines Mikromanipulators, der mit einem Kapillarspitzenspender ausgerüstet ist, mit 0,5 µl Tropfen von oxidiertem Oligonucleotid (bei einer Konzentration von 10 µmol/µl) bedeckt. Die Platten werden dann vier Stunden in einer feuchten Kammer ausgesetzt, 0,5 Stunden an offener Luft getrocknet, mit einem Hybridisierungspuffer (1M NaCl, 10 mM Na-phosphat, pH 7,0, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure) gewaschen, mit Wasser gespült und bei 20ºC trocken gelagert. Die Oligonucleotide werden in Zellen einer Quadratmatrix immobilisiert.
  • Der Linker wird durch 3-Methyluridin dargestellt, welches durch eine 5'-3'-Internucleotidphosphodiesterbindung an das zu immobilisierende Oligonucleotid angeheftet ist. 3-Methyluridin wurde aufgrund der Tatsache gewählt, daß es keine starken Wasserstoffbindungen mit irgendwelchen natürlichen Basen bildet. Das Schema der in Polyacrylamidgel während der Oligonucleotidimmobilisierung auftretenden chemischen Reaktionen ist in Figur 3 dargestellt.
  • Die Oxydation des 3'-terminalen Ribonucleosids des Oligonucleotids 1 (Fig. 3) mit NaIO&sub4; erzeugt ein Derivat 2, welches eine Dialdehydgruppe an dem 3'-Ende trägt. Wenn andererseits Polyacrylamid 3 mit Hydrazin behandelt wird, wird Teil der Amidgruppen durch Hydrazidgruppen 4 ersetzt, welche leicht mit 3'-Dialdehyd reagieren, wobei ein relativ stabiles Morpholinderivat 5 erzeugt wird.
  • Der Verlauf der Immobilisierung wird durch den (5'-³²P) Marker angezeigt, welcher mithilfe einer Kinase in die zu immobilisierenden Oligonucleotide eingeführt ist. Die Ausbeute der Immobilisierung (das heißt der Anteil von irreversibel an das Gel gebundenen Oligonucleotiden) beträgt 80%. Gleichzeitig überschreitet die Ausbeute für das als eine nicht spezifische Sorptionskontrolle verwendete nicht oxidierte Oligonucleotid nicht 2%. Deshalb beträgt der Anteil der spezifisch durch ihr 3'-Ende gebundenen Moleküle 98%.
  • Die Bindung zwischen einem Oligonucleotid und Polyacrylamid ist stabil genug für die Matrix, um mindestens 5 bis 7 Hybridisierungs/Waschzyklen ohne bemerkenswerte Änderung in ihren Hybridisierungseigenschaften zu widerstehen. Die Halbwertszeit der Oligonucleotid-Gelbindung bei 60ºC beträgt 2 Stunden und bei 25ºC 36 Stunden.
  • Die Kapazität eines Trägers wird bestimmt, indem die gleiche Menge an ³²P-markiertem Oligonucleotid, welches mit nicht markiertem Oligonucleotid auf verschiedene spezifische Aktivitäten verdünnt ist, immobilisiert wird. 100 pMol eines kalten Oligonucleotids pro einem Fleck (d.h. pro 1 mm² Oberflächenbereich oder 0,03 mm³ Gelvolumen) sättigen nicht die Bindung. Ähnliche Experimente mit einem oxidierten Periodat (α-³²P]UTP haben gezeigt, daß die Gelkapazität gleich etwa 1 nMol pro 1 mm² Geloberfläche ist, welches der 30 mM Konzentration aktiver Gruppen entspricht (Konzentration der Amidgruppen beträgt 1 M in 8% Polyacrylamid).
    • BEISPIEL 2 Rekonstru ktion der Nucleotidsequenz eines 17 gliedrigen Desoxyoligonucleotids
  • Hybridisierung der vier Heptadecanucleotide des Phagen M13 Sequenzprimeren: 5'-d(GTAAAACGACGCCAGT und dessen drei Derivate, die sich durch eine Base (unterstrichen) unterscheiden:
  • 5'-d(GTAAAACGATGGCCAGT),
  • 5'-d(GTAAAACGAAGGCCAGT), und
  • 5'-d(GTAAAACGACGGCCAGT)
  • mit immobilisierten Oligonucleotiden (die 7, 8, 9, 12 oder 15 Monomereinheiten enthalten), welche vollständig oder teilweise komplementär zu unterschiedlichen Teilen von Heptadecameren sind, wird auf einer Oligonucleotidmatrix bewirkt, die, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt ist.
  • Das markierte DNA Fragment (0,01 µCi, 30 fMole) in 1 µl eines Hybridisierungspuffers (1 M NaCl, 10 mM Na-phosphat, pH 7,0, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure) wird auf eine Matrix von immobilisierten Oligonucleotiden so aufgebracht, daß jeder Tropfen der hybridisierten Mischung genau den Fleck des immobilisierten Oligonucleotids bedeckt, und 1 Stunde bei 0ºC inkubiert. Die Matrix wird mit dem Hybridisierungspuffer bei 0ºC gespült und anschließend 10mal jeweils 1 Minute mit 20 ml des gleichen Puffers bei einer Temperatur, die bei jeder Waschstufe um 5ºC erhöht wird, gewaschen. Bei jeder Stufe wird das Hybridisierungssignal in jeder Zelle der Matrix durch einen Bleikollimator mit einem radioaktiven Zähler (Minimonitor 125, Victoreen, USA), der mit einem Pulsgeber ausgerüstet ist, registriert.
  • Das Verhältnis der restlichen Radioaktivität zu der Ausgangsradioaktivität an einem gegebenen Punkt wird in einem logarithmischen Maßstab gegen Temperatur aufgetragen (Fig. 4).
  • Fig. 4 zeigt die Waschkurven von Doppelsträngen, die durch den M13 Primer oder seinem Analogen mit GC- (Fig. 4a) und AT-reichen (Fig. 4b) Octanucleotiden, immobilisiert im Gel, komplementär zu den beiden unterschiedlichen Teilen des M13 Primeren gebildet sind, aber defekte Doppelstränge mit ihren Derivaten produzieren (alle die Doppelstränge sind in Fig. 4 dargestellt).
  • Als Indikator der Doppelstrangstabilität ist die Waschtemperatur (Tw) so gewählt, daß das Hybridisierungssignal bei dem entsprechenden Punkt um einen Faktor 10 im Vergleich zu dem Ausgangsniveau abnimmt. Die Waschkurven der Doppelstränge wurden für verschiedene Volumenkonzentrationen des immobilisierten Oligonucleotids im Gel festgelegt. Wie aus Fig. 5 klar ist, hängt Tw eines Doppelstranges stark von der Menge des in dem Fleck einer gegebenen Größe immobilisierten Oligonucleotids ab. In dem untersuchten Konzentrationsbereich erhöht sich die Doppelstrangwaschtemperatur innerhalb des experimentellen Irrtums um eine bestimmte Anzahl von Graden, wenn die immobilisierte Oligonucleotidkonzentration mehrfach höher wird. Diese Regel ist für alle untersuchten Doppelstränge wahr. Auf diese Weise kann die Stabilität jedes Oligonucleotids variiert werden. In diesem Beispiel hält die Konzentration von 5 pMol pro Punkt die Doppelstränge innerhalb des Bereichs von 20 bis 40ºC stabil.
  • Neben den in Fig. 4 dargestellten Oligonucleotiden sind eine große Anzahl von 7-, 8-, 9-, 12- und 15-gliedrigen Substanzen, vollständig oder teilweise komplementär zu dem M13 Primeren, und Doppelstränge, die andere Fehl paarungstypen enthalten, untersucht worden. Die Ergebnisse des Waschens der Doppelstränge von Heptadecadesoxynucleotiden mit immobilisierten Octadesoxynucleotiden sind in der Tabelle dargestellt.
  • Wie aus Fig. 4 und der Tabelle deutlich ist, gibt es beinahe immer eine Temperatur, bei der das Verhältnis der Hybridisierungssignale eines vollständig komplementären Doppelstranges und eines entsprechenden defekten Doppelstranges ausreichend hoch (mindestens 10) ist, um sie zuverlässig zu unterscheiden. Die Ausnahme liegt in einigen Endfehlpaarungen mit abnorm hoher Stabilität.
  • Im Falle der Hybridisierung mit Octanucleotiden wird ein siebenfacher Überschuß an Information erhalten. Jedes Nucleotid eines DNA Fragments bildet ein inneres Paar mit einem immobilisierten Oligonucleotid in sechs von acht Fällen, wobei es nur in zwei Fällen ein Endpaar herstellt. Ein Vergleich wird zwischen den Waschkurven gemacht, um vollständig komplementäre Doppelstränge von Doppelsträngen, die Punktmutationen tragen, zu unterscheiden, und auf diese Weise werden Einzel substitutionen von Basen in der DNA nachgewiesen. Ein anfängliches Heptadecamer wird aus dem Überlappen der vollständig komplementären Doppelstränge hergestellt.
    • BEISPIEL 3
  • Die Abhängigkeit der Doppelstrangwaschtemperatur von der Konzentration eines immobilisierten Oligonucleotids kann folgendermaßen bestimmt werden:
  • Das Verfahren ist ähnlich zu demjenigen des Beispiels 1. Die Abhängigkeit der Doppelstrangwaschtemperatur Tw von der Konzentration eines immobilisierten Oligonucleotids wird in einem Fleck von 0,03 mm³ Volumen in dem Oligonucleotidkonzentrationsbereich von 5,0, 1,5, 0,5 und 0,15 pMol bestimmt.
  • Die Abhängigkeit von Doppelstrangwaschkurven von der Volumenkonzentration eines immobilisierten Oligonucleotids im Gel ist in Fig. 5 (Fleckvolumen 0,03 mm³, Oligonucleotidkonzentration 5,0 (1), 1,5 (II), 0,5 (III) und 0,15 (IV) pMol) dargestellt. Wie aus der graphischen Darstellung in Fig. 5 deutlich ist, hängt Tw eines Doppelstranges stark von der Menge der in einem Fleck gegebener Größe immobilisierten Oligonucleotide ab. Für den untersuchten Konzentrationsbereich nimmt die Doppelstrangwaschtemperatur innerhalb des experimentellen Irrtums um eine bestimmte Anzahl von Graden zu, während die Konzentration von immobilisierten Oligonucleotiden sich um eine bestimmte Anzahl von Malen erhöht. Diese Regel gilt für alle untersuchten Doppelstränge (Fig. 5 zeigt ein Beispiel). TABELLE Wärmedissoziation von perfekten Doppelsträngen und Doppelsträngen, welche einzelne Fehlpaarungen enthalten
  • * Abnahme in der Waschtemperatur eines defekten Doppelstranges im Vergleich zu einem perfekten.
  • Anmerkung: Fehlpaarungen sind in Fettdruck dargestellt, M steht für Matrix, und Symbol "d" ist aus Gründen der Vereinfachung weggelassen.
    • BEISPIEL 4
  • Die Stabilität vollständig komplementärer Doppelstränge kann folgendermaßen ausgeglichen werden:
  • Das Verfahren ist das Gleiche wie in Beispiel 2, aber die Konzentration variiert im Hinblick auf unterschiedliche immobilisierte Oligonucleotide: 90 pMol für AT und 0,3 pMol für GC.
  • Die Abhängigkeit der Stabilität (Dissoziationstemperatur) der Doppelstränge von der Konzentration immobilisierter Oligonucleotide im Gel macht es möglich, Fehlpaarungen in Doppelsträngen von unterschiedlicher GC Zusammensetzung "auf einer einzigen Platte" nachzuweisen. In Fig. 4 sind die zwei dargestellten immobilisierten Oligonucleotide sehr unterschiedlich in ihrem GC Gehalt, und als ein Ergebnis ist der vollständig komplementäre Doppelstrang des AT-reichen Oligonucleotids (Fig. 4a, Kurve 1) im wesentlichen weniger stabil als der Doppelstrang des GC reichen Oligonucleotids, welcher Fehlpaarungen (Fig. 4b, Kurven II und III) enthält. Es muß klar sein, daß in dieser Situation Hybridisierung bei einer festgesetzten Temperatur eines DNA Fragments mit einer Matrix, welche beide Oligonucleotide enthält, es nicht ermöglicht, mit der Genauigkeit einer Base zu sagen, ob oder ob nicht dieses Fragment komplementäre Sequenzen dazu hat.
  • Die Abhängigkeit der Tw von der immobilisierten Oligonucleotidkonzentration kann verwendet werden, um Dissoziationstemperaturen von Doppelsträngen mit unterschiedlicher GC Zusammensetzung auszugleichen. Wie in Fig. 6 dargestellt ist, können die Waschkurven der AT- und GC-reichen Doppelstränge (ΔTw = 30ºC bei der gleichen Konzentration) in Übereinstimmung gebracht werden, indem die Konzentrationen von immobilisierten Oligonucleotiden bei entsprechenden Punkten richtig gewählt werden.
  • Man kann die Waschkurven einer Reihe von Oligonucleotiden ausgleichen und somit eine "normalisierte" Oligonucleotidmatrix erhalten. Die Waschtemperaturen von vollständig komplementären (perfekten) Doppelsträngen für alle Punkte einer derartigen Matrix liegen nahe beieinander, und deshalb wird ein einzelnes Waschen bei einer optimalen Temperatur ausreichen, unzweifelhaft die Punkte der Matrix festzulegen, wo das in Analyse befindliche DNA Fragment perfekte Doppelstränge gebildet hat.
    • BEISPIEL 5
  • Die Hybridisierungs- und Waschstufen kännen bei der gleichen Temperatur bei einer "normalisierten" Matrix, welche vorher ausgewählte Konzentrationen immobilisierter Oligonucleotide enthält, folgendermaßen durchgeführt werden:
  • Das Verfahren wird ähnlich zu Beispiel 4 durchgeführt.
  • Die "normalisierte" Matrix zweier Oligonucleotide (drei Punkte für jedes Nucleotid) wird hybridisiert und bei 35ºC gewaschen. Das Prinzip kann aus dem Vergleichsdiagramm in Fig. 7 verstanden werden. Vergleich der restlichen Signale zeigt unzweifelhaft die Punkte an, wo die Doppelstränge vollständig komplementär waren, wenn auch eine Endfehlpaarung GT, sehr stabil ist.
    • BEISPIEL 6
  • Empfindlichkeit, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des gegenwärtigen Verfahrens und der Vorrichtung werden folgendermaßen veranschaulicht:
  • Eine Oligonucleotidmatrix wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, daß vor Behandlung mit 50% Hydrazin die mit einer Gelschicht überzogene Glasplatte luftgetrocknet wird, und Teil des Gels beispielsweise mechanisch entfernt wird, wobei Quadrate mit einer Seite von 25 bis 100 µm, welche mit Zwischenabständen zwischen ihnen von 50 bis 200 µm angeordnet sind, gebildet werden.
  • Hybridisierung wird mit Fragmenten durchgeführt, welche an dem 3' Ende durch den fluoreszierenden Tetramethylrhodaminmarker markiert sind, welcher mit Hilfe einer terminalen Polynucleotidtransferase eingeführt ist (Vergleich der entsprechenden Waschkurven zeigte, daß Tetramethylrhodamin keinen Einfluß auf die Doppelstrangstabilität ausübte).
  • Die Verwendung eines fluoreszierenden Markers ermöglicht, daß Hybridisierung in einem Mikromaßstab durchgeführt wird. Fig. 8 zeigt ein Schema einer Mikromatrix, in der ein Octanucleotid 5'd(GGCCGTGG) in Gelquadraten mit Seiten von 100 µm mit 200 µm Abständen zwischen ihnen immobilisiert ist. Wie in Fig. 8, a, gesehen werden kann, macht eine Hybridisierung mit diesem Marker es möglich, zuverlässig Substitutionen von individuellen Basen in der Sequenz (in Fig. 8), im Quadrat 1 (perfekter Doppelstrang) und in Quadraten 2, 3 und 4 (Doppelstränge mit Fehlpaarungen GA, GT und bzw. CC) nachzuweisen.
  • Ähnliche Experimente wurden auf Mikromatrixen durchgeführt, bei denen Gelquadrate eine Seite von 25 µm, 30 µm, 50 µm und 75 µm mit Zwischenabständen zwischen ihnen von 50 µm, 60 µm, 100 µm bzw. 140 µm hatten.
  • Weil die Verteilung des fluoreszierenden Markers bei einer sehr hohen Empfindlichkeit und räumlichen Auflösung (oder beispielsweise mithilfe des Fluoreszenzmikroskops) gemessen werden kann, ist der Nachweis von Hybridisierungssignalen nur durch das Signal/Hintergrundsverhältnis begrenzt und hängt nicht von der Größe des Objekts ab, dessen Fluoreszenzintensität gemessen wird. Deshalb ist die Empfindlichkeit umgekehrt proportional zu dem Bereich des Objekts (= Oligonucleotidmatrixzelle). Miniaturausgestaltung der Matrix ermöglicht, daß die Empfindlichkeit des Verfahrens verbessert wird. Beispielsweise enthalten die Quadrate "d" in Fig. 8, 1 fMol, 100 aMol und 10 aMol des Tetramethylrhodaminderivats von Desoxyuridin. Das Signal/Hintergrundsverhältnis für das Quadrat "d3" ist gleich 2, welches ausreichend ist, um zuverlässig die Menge der Substanz zu schätzen.
    • INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
  • Das beanspruchte Verfahren und die Vorrichtung können in der Medizin, Molekularbiologie und Landwirtschaft für die Zwecke genetischer Diagnostiken, DNA Sequenzieren und Kartieren und Mutationsnachweis verwendet werden.

Claims (6)

1. Verfahren zum Bestimmen der DNA Nukleotidsequenz, umfassend die folgenden Stufen:
Bildung einer Reihe von Oligonukleotiden, wobei die Oligonukleotidkonzentrationen so gewählt sind, daß die gleiche Dissoziationstemperatur für alle vollständig komplementären Doppelstränge gewährleistet ist,
Hybridisierung der Oligonukleotidreihe mit einer mit einem Marker markierten Test DNA,
Waschen bei Bedingungen, die Doppelstrangdissoziation gewährleisten,
Unterscheidung von Einzelbasen-Substitutionen in der Test DNA durch Analysieren der Verteilung des Markers,
Rekonstruktion der Test DNA Nukleotidsequenz auf einer Basis von Datenanalyse.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Reihe von Oligonukleotiden bei derartigen Konzentrationen gebildet wird, die gewährleisten, daß Hybridisierung und Waschen der vollständig komplementären Doppelstränge bei der gleichen Temperatur im Verlauf des Waschens durchgeführt werden kann.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Waschen bei einem festgelegten Temperaturgradienten bewirkt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Abhängigkeit von der Menge verbleibender Doppelstränge von der Temperatur im Verlauf des Waschens festgelegt und mit der entsprechenden Abhängigkeit für eine DNA mit einer bekannten Sequenz verglichen wird.
5. Eine Vorrichtung zum Bestimmen von DNA Nukleotidsequenz, umfassend einen festen Träger (1) und eine Matrix (2), die an den Träger gebunden ist und eine Reihe von Oligonukleotiden mit gegebener Länge trägt, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix (2) an den Träger (1) durch eine Gelschicht mit einer Dicke, die 30 µm nicht übersteigt, angeheftet ist und aus einer Vielzahl von Gelteilen (3) gemäß der Anzahl von Matrixelementen zusammengesetzt ist, welche voneinander durch Zwischenräume (4) getrennt sind, wobei jedes Gelteil ein Quadrat von 25-100 µm in Länge ist, wobei die Zwischenräume zwischen den Quadraten zweimal die Länge jedes Quadrats sind.
6. Eine Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Gelschicht aus einem Polyacrylamidgel hergestellt ist.
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