DE69924010T2

DE69924010T2 - Verfahren zur herstellung eines biochip sowie biochip

Info

Publication number: DE69924010T2
Application number: DE69924010T
Authority: DE
Inventors: Charles Rosilio; Patrice Caillat
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1998-12-16
Filing date: 1999-12-15
Publication date: 2006-04-13
Anticipated expiration: 2019-12-16
Also published as: WO2000036145A1; EP1141391B1; EP1141391A1; JP2002532699A; DE69924010D1; FR2787582A1; US6803228B1; FR2787582B1; ATE290103T1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Biochips sowie auf einen Biochip, der insbesondere besteht aus biologischen Sonden bzw. Messfühlern, die auf ein elektrisch leitendes Polymer aufgepfropft sind.
Biologische DNA-Analyseneinrichtungen, wie z.B. solche vom DNA-Sonden-Typ, stellen Hochleistungs-Werkzeuge für die parallele Analyse einer großen Anzahl von Genen oder DNA- oder RNA-Sequenzen dar. Ihr Funktionsprinzip beruht auf der Hybridisierungs- oder Paarbildungs-Eigenschaft von zwei komplementären Sequenz-Strängen zur Wiederherstellung der Doppelhelix der DNA. Um dieses Ziel zu erreichen, werden Oligonucleotid-Sonden einer bekannten Sequenz, die auf einem Trägersubstrat immobilisiert sind, mit Targets, die aus einer zu analysierenden biologischen Probe extrahiert worden sind, kombiniert und mit Hilfe von fluoreszierenden Markern markiert.
Die Hybridisierung wird anschließend lokalisiert (markiert) und die Sequenz wird nachgewiesen durch Analyse der Oberfläche des Biochips durch einen geeigneten Marker, der beispielsweise den Nachweis der Sequenz durch Fluoreszenz ermöglicht.
Zur Herstellung dieser Sonden-Matrices werden bereits sehr unterschiedliche Technologien angewendet. Verschiedene Methoden der Immobilisierung oder der Aufpfropfung der Sonden auf unterschiedliche Substrate sind bereits Gegenstand von Untersuchungen und industriell wichtigen Entwicklungen.
Stand der Technik
Es gibt im Wesentlichen drei Verfahren zur Adressierung von chemischen Sonden, die unterschiedliche Methoden zur Herstellung und Verwendung von Sonden auf unterschiedlichen Anwendungsgebieten darstellen. Es handelt sich dabei um die photochemische Adressierung, die mechanische Adressierung, beispielsweise durch Mikropipettierung mit Hilfe eines Dispergier-Roboters, und die elektrochemische Adressierung.
So kann die elektrochemische Adressierung beispielsweise angewendet werden auf Oligonucleotid-Sonden. Um dieses Ziel zu erreichen, werden individuell adressierte Elektrodenmatrices auf einem Glassubstrat hergestellt.
Das Prinzip der Immobilisierung von biologischen Sonden beruht auf einer Abscheidung durch Elektropolymerisation eines Copolymers aus Pyrrol und einem durch ein Nucleotid substituierten Pyrrol (Py-ODN), das ein Oligonucleotid trägt, das auf einen Pyrrolkern entweder direkt oder indirekt mittels eines dazwischenliegenden Abstandhalters aufgepfropft ist.
Um das Ziel zu erreichen, parallele biologische Analysensysteme mit einer hohen Kapazität oder Dichte der aktiven Stellen zu entwickeln, ist es erforderlich, eine große Anzahl von Sonden individuell adressieren zu können.
Die Verfahren, bei denen eine elektrochemische Adressierung angewendet wird, erfordern sowohl eine große Matrix für Elektroden und Verbindungsstellen und einen Multiplexer, um jede der Stellen der Biosonde elektrisch indexieren zu können. Darüber hinaus muss bei diesen Verfahren eine Elektropolymerisation durch aufeinanderfolgendes Eintauchen des gesamten Biochips in Lösungen jedes der Py-ODN, die in der Zelle enthalten sind, durchgeführt werden. Diese Verfahren sind somit beschränkt auf Biochips mit einer geringen Dichte, d.h. mit etwa 100 Sonden für begrenzte und spezifische Anwendungsgebiete.
In dem Stand der Technik sind auch bereits andere Verfahren beschrieben, in denen die individuelle elektrische Adressierung in vorteilhafter Weise ersetzt wird durch eine mechanische Adressierung. Es bleibt jedoch der Nachteil bestehen, dass Elektropolymerisationen in Mikroküvetten mit einem Lösungsvolumen in der Größenordnung von Nanoliter durchgeführt werden müssen, bei denen es erforderlich ist, die Verdampfung nach der Mikropipettie rung der Gesamtheit der Sonden auf die Platte hinauszuzögern, damit die Elektropolymerisation ablaufen kann.
In dem Dokument US-A-5 837 859 ist ein Biochip beschrieben, der eine Gruppe von Mikroelektroden umfasst, auf denen Pyrrol und funktionalisiertes Pyrrol elektropolymerisiert worden sind. In dem Dokument "Nucleic Acids Research", Band 22(15), 1994, Seiten 2915–2921, ist die Herstellung einer DNA-Matrix durch eine elektrochemische Copolymerisation von Pyrrol und Oligonucleotiden, die eine Pyrrol-Gruppe tragen, auf einer Vielzahl von Elektroden beschrieben, die unter Anwendung von mikroelektronischen Technologien hergestellt worden sind. In den Dokumenten "Biosensor & Bioelectronics", Band 13, 1998, Seiten 629–634, und "Analytical Biochemistry", Band 255, 1998, Seiten 188–194, sind elektrisch leitende Polymere für die Herstellung von DNA-Matrices oder Peptiden auf einem Biochip auf Basis von Silicium beschrieben. Der Träger umfasst eine Matrix von Mikroelektroden, die auf einem Silicium-Substrat durch Anwendung mikroelektronischer Technologien gebildet worden sind. In dem Dokument "Langmuir", Band 11, 1995, Seiten 1768–1776, ist ein Verfahren zur Identifizierung von Molekülstrukturen in einer Probe beschrieben. Insbesondere ist darin eine chemische Modifizierung beschrieben, welche die Verstärkung der Adhäsion eines Polypyrrolfilms, der auf Matrices von parallel geschalteten Goldelektroden auf Borsilicatglas und/oder oxidiertem Silicium gebildet worden ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es insbesondere, die oben genannten Probleme zu lösen durch Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Biochips, der insbesondere aus biologischen Sonden (Messfühlern) besteht, die auf ein elektrisch leitendes Polymer aufgepfropft sind, wobei dieses Verfahren insbesondere den Vorteil bietet, dass nur die Verwendung einer einzigen Lösung einer Mischung von Pyrrol und substituiertem Pyrrol (Py und Py-R-F, worin F eine reaktive chemische Funktion darstellt, und R eine aliphatische oder aromatische Abstandhaltergruppe darstellt) in einem geeigneten Mengenverhältnis für eine einzige kollektive Elektroabscheidung (Galvanisierung) auf der Gesamtheit der Mikroküvetten erforderlich ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Stufen umfasst:

a) Strukturierung eines Substrats, um auf diesem Substrat Mikroküvetten zu erzeugen, die auf ihrem Boden eine Schicht aus einem Material umfassen, das die Haftung eines Films aus einem Copolymer von Pyrrol und funktionalisiertem Pyrrol daran durch Elektropolymerisation initiieren und fördern kann,
b) gemeinsame Elektropolymerisation zur Bildung eines elektropolymerisierten Films aus einem Copolymer von Pyrrol und funktionalisiertem Pyrrol auf dem Boden der genannten Mikroküvetten auf der Schicht aus dem genannten Material, ausgehend von einer Lösung von Pyrrol und funktionalisiertem Pyrrol in Gegenwart von chemischen Reagentien, die für die genannte Elektropolymerisation geeignet sind, und
c) direkte oder indirekte Fixierung einer biologischen Sonde auf dem funktionalisierten Pyrrol durch Injektion einer Lösung der biologischen Sonde je nach Wunsch in eine oder mehrere Mikroküvetten in Gegenwart von chemischen Reagentien, die für die direkte oder indirekte Fixierung dieser biologischen Sonde auf dem funktionalisierten Pyrrol erforderlich sind.

Erfindungsgemäß kann die Schicht des Materials, das in der Lage ist, die Haftung des Copolymer-Films von Pyrrol und funktionalisiertem Pyrrol durch Elektropolymerisation auf demselben zu initiieren und zu fördern, eine Metallschicht sein, wobei die oben genannte Stufe (a) dann eine Stufe zur Abscheidung der genannten Metallschicht auf dem Substrat und eine Stufe zur Abscheidung einer Harz- oder Polymerschicht auf der Metallschicht und zur Entwicklung oder Eingravierung der genannten Schicht in der Weise umfasst, dass Mikroküvetten gebildet werden, deren Boden mindestens zum Teil aus der Metallschicht besteht.
Erfindungsgemäß kann die Metallschicht beispielsweise eine Goldschicht, eine Kupferschicht oder eine Silber- oder Aluminiumschicht sein.
Erfindungsgemäß kann das Substrat beispielsweise ein Siliciumplättchen, ein Glasplättchen oder ein Kunststoffträger sein, der erforderlichenfalls flexibel ist.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann die Stufe (a) außerdem eine Stufe der Behandlung der Goldschicht auf dem Boden der Mikroküvetten in Gegenwart eines beispielsweise mit einer Thiolgruppe funktionalisierten Pyrrols umfassen, sodass eine Pyrrol-Monoschicht auf der genannten Metallschicht, beispielsweise auf der genannten Goldschicht, auf dem Boden der genannten Mikroküvetten gebildet wird. Diese Monoschicht kann die Haftung eines Polypyrrolfilms durch Elektropolymerisation initiieren und fördern, wie R. Simon et al. in "J. Am. Chem. Soc.", 1982, 104, 2031, gezeigt haben. Es handelt sich dabei um eine autokombinierte Monoschicht (SAM) aus einem funktionalisierten Pyrrol zu seiner Verankerung auf dem Boden der Mikroküvetten.
Erfindungsgemäß kann das funktionalisierte Pyrrol ein Pyrrol sein, das eine chemische Gruppe darstellt, die seine Fixierung durch kovalente Bindung an der Metallschicht und/oder an der biologischen Sonde erlaubt. Im Falle seiner Fixierung an der Metallschicht, beispielsweise an der Goldschicht, kann ein Pyrrol, das mit einer Thiol- oder Disulphidgruppe funktionalisiert ist, ebenfalls verwendet werden.
Beispielsweise kann das Pyrrol, das mit einer Thiolgruppe funktionalisiert ist, die folgende chemische Formel haben:
in der n einen Wert von 1 bis 10 haben kann, beispielsweise kann n 6 bedeuten.
Für eine Metallelektrode aus Aluminium kann man ein Pyrrol wählen, das mit einer -COOH-Gruppe funktionalisiert ist.
Bei einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Substrat ein Silicium-Plättchen (Silicium-Wafer) sein und die Schicht, welche die Haftung eines Polypyrrolfilms durch Elektropolymerisation an demselben initiieren und fördern kann, kann eine Silanschicht sein, die eine Ausrichtung der Pyrrol-Stellen aufweist. Die Stufe (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann auch eine Stufe der Ablagerung einer Harzschicht auf dem Silicium-Plättchen umfassen, wobei das Silicium-Plättchen von einem SiO₂-Film be deckt ist, und sie kann eine Stufe zur Ätzung der genannten Harzschicht umfassen, um die Mikroküvetten zu bilden, deren Boden mindestens zum Teil aus dem SiO₂-Film besteht; und sie kann eine Stufe der Behandlung der Mikroküvetten mit einem Silanierungsmittel umfassen, das mit einem Pyrrol funktionalisiert ist, um auf dem SiO₂-Film im Boden der Mikroküvetten die Silanschicht zu fixieren, die eine Ausrichtung von Pyrrol-Stellen umfasst.
Erfindungsgemäß kann das Silanierungsmittel ausgewählt werden aus einer Gruppe, die umfasst N-(3-(Trimethoxysilyl)propyl)pyrrol oder irgendein anderes Pyrrol, das mit einer -SiCl₃- oder -Si(OMe)₃-Gruppe funktionalisiert ist. Der SiO₂-Film kann ein natürlicher Film aus SiO₂ sein, der auf den Silicium-Plättchen vorhanden ist.
Erfindungsgemäß kann unabhängig von der Ausführungsform das Harz ein lichtempfindliches Harz sein, dessen Maskierung, Isolierung und Entwicklung die Bildung der Mikroküvetten erlaubt.
Erfindungsgemäß kann die kollektive Elektropolymerisation in der Stufe (b) des Verfahrens beispielsweise durchgeführt werden durch Eintauchen des in der oben genannten Stufe (a) erhaltenen strukturierten Substrats in ein elektrolytisches Bad, das eine Lösung von Pyrrol, funktionalisiertem Pyrrol und für die Elektropolymerisation geeigneten chemischen Reagentien umfasst, in Gegenwart einer Gegenelektrode zu der Arbeitselektrode, die in das elektrolytische Bad eingetaucht ist und von dem strukturierten Substrat unabhängig ist, durchgeführt werden.
Erfindungsgemäß kann in dieser Stufe (b) das funktionalisierte Pyrrol ein Pyrrol sein, das eine Gruppe aufweist, ausgewählt aus einer Gesamtheit, die umfasst eine NH₂-, Thiol-, Succinimidester-, Trimethoxysilyl-, Carboxyl-, Aldehyd- und Isothiocyanat-Gruppe.
Erfindungsgemäß kann das durch Elektropolymerisation funktionalisierte Pyrrol beispielsweise ausgewählt werden unter den folgenden Verbindungen:
PYRROL
N-ETHYLAMINPYRROL
N(3-(TRIMETHOXYSILYL)PROPYL)PYRROL
PYRROL, das mit einem Thiol funktionalisiert ist
PYRROL, das in 3'-Stellung durch einen Succinimydylester funktionalisiert ist.
Erfindungsgemäß kann das elektrolytische Bad eine Mischung von Pyrrol und funktionalisiertem Pyrrol in Mengenverhältnissen sein, die geeignet sind für die Bildung eines Films, der die gewünschte Anzahl von funktionalisierten Pyrrol-Einheiten aufweist. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht auf diese Weise die Auswahl der Anzahl von biologischen Sonden pro Mikroküvette, weil bei diesem Verfahren die biologischen Sonden entweder direkt oder indirekt auf diesen funktionalisierten Pyrrolen fixiert werden.
Die Stufe (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in einer direkten oder indirekten Fixierung einer biologischen Sonde auf dem funktionalisierten Pyrrol.
Erfindungsgemäß kann dann, wenn die Fixierung der biologischen Sonde auf indirekte Weise erfolgt, die Stufe (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens außerdem vor der Fixierung der biologischen Sonde eine kollektive Fixierung eines Vernetzungsmittels auf dem funktionalisierten Pyrrol in Gegenwart von geeigneten chemischen Reagentien umfassen, wobei das genannte Vernetzungsmittel eine erste Funktion, die seine Fixierung auf dem funktionalisier ten Pyrrol erlaubt, und eine zweite Funktion, welche die Fixierung der biologischen Sonde auf dem genannten Vernetzungsmittel erlaubt, umfasst.
Erfindungsgemäß kann das Vernetzungsmittel beispielsweise ein bifunktionelles Vernetzungsmittel sein.
Das Vernetzungsmittel kann beispielsweise eine Ester-Funktion von N-Hydroxysuccinimid und eine Maleimid-Funktion aufweisen.
Erfindungsgemäß kann das Vernetzungsmittel beispielsweise unter den folgenden Verbindungen ausgewählt werden:
SMPB Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat
GMBS N-Maleimidobutyryloxysuccinimidester, ein Dialdehyd vom Typ
GLUTARALDEHYD, ein Diisothiocyanat vom Typ
1,4-PHENYLENDIISOTHIOCYANAT,
BERNSTEINSÄUREANHYDRID ODER BERNSTEINSÄURE oder ein Derivat dieser Verbindungen.
Alle oben genannten bifunktionellen Vernetzungsmittel sind gut geeignet für die mit der Gruppe -CH₂-CH₂-NH₂- in der Position 1 an dem Stickstoffatom funktionalisierten Polypyrrole. Eine Elektropolymerisation mit einem Pyrrol, das mit anderen Gruppen funktionalisiert ist, sind aber ebenfalls möglich. Beispielsweise erlauben Py-CH₂-CH₂-NH₂, Py-SH, der Py-Succinimidylester (in 3-Stellung), Py-hydrazin mit einer Substitution in 1-Stellung an dem Stickstoffatom oder in 3-Stellung an dem Pyrrol-Ring die Immobilisierung der Oligonucleotide entweder direkt oder mittels eines Vernetzungsmittels, wie z.B. eines bifunktionellen Vernetzungsmittels.
Die folgenden Vernetzungsmittel können daher in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden:

a) ein Dialdehyd vom Glutaraldehyd-Typ, der mit den NH₂-Funktionen des Polypyrrolfilms (kollektive Stufe) reagieren kann und dann mit der NH₂-Funktion eines Oligonucleotids reagieren kann, das beispielsweise durch ein Phosphat abgeschlossen ist, das eine Amingruppe trägt, durch eine individuelle Stufe in den Mikroküvetten;
b) ein Diisothiocyanat, das ebenfalls mit der Amin-Funktion des Polypyrrols reagieren kann, das an einem Ende funktionalisiert ist (kollektive Stufe), dann mit einer Amin-Funktion eines Oligonucleotids reagieren kann, das durch ein Phosphat abgeschlossen ist mit einer Abstandhaltergruppe, die mit NH₂ funktionalisiert ist;
c) ein Bernsteinsäureanhydrid, das durch Öffnung zwei Säurefunktionen ergibt, die mit den NH₂-Gruppen des Polypyrrols und andererseits mit den NH₂-Gruppen eines Oligonucleotids, das mit NH₂ funktionalisiert ist, reagieren können.

Erfindungsgemäß kann die biologische Sonde, die die Ursache für die Spezifität der hergestellten Biochips darstellt, ausgewählt werden beispielsweise aus einem Oligonucleotid, einer DNA, einer RNA, einem Peptid, einem Glucid, einem Lipid, einem Protein, einem Antikörper, einem Antigen.
Erfindungsgemäß ist die biologische Sonde vorzugsweise funktionalisiert, um direkt oder indirekt an dem funktionalisierten Pyrrol fixiert werden zu können. Ziel dieser Funktionalisierung ist es, an der biologischen Sonde eine chemische Gruppe zu fixieren, die eine kovalente Bindung zwischen der biologischen Sonde und dem funktionalisierten Pyrrol bilden kann.
Sie kann beispielsweise funktionalisiert sein mit einer Thiolgruppe, mit einer NH₂-Gruppe, einer Aldehyd-Gruppe, einer Gruppe der Formel -COOH oder auch einer sauren Phosphat-Gruppe.
Wenn beispielsweise die biologische Sonde ein Oligonucleotid ist, kann sie funktionalisiert sein mit einer Thiol-Gruppe (SH). Die mit S-H funktionalisierten Oligonucleotide können nach einem bekannten Verfahren hergestellt werden, beispielsweise am Ende einer automatisierten Oligonucleotid-Synthese.
Für den Fall, dass es leichter ist, über Oligonucleotide zu verfügen, die mit NH₂ funktionalisiert sind, ist es beispielsweise möglich, ein Pyrrol zu synthetisieren, das mit einem S-H funktionalisiert ist, für die Copolymerisation beispielsweise SMPB mit seinen beiden spezifischen Funktionen zu verwenden und die mit NH₂ funktionalisierten Oligonucleotide zu immobilisieren durch kovalente Bindung mit der Succinamid-Funktion dieses Vernetzungsmittels.
Im Falle von Oligonucleotiden, die in 3'-Stellung durch ein N-Methyluridinnucleotid abgeschlossen sind, erlaubt eine Oxidationsreaktion an dieser Funktion die Herstellung eines Oligonucleotids, das mit einer Aldehyd-Funktion funktionalisiert ist, die direkt reagieren kann, d.h. beispielsweise ohne bifunktionelles Agens an dem mit NH₂ funktionalisierten Polypyrrol.
Um ein Oligonucleotid mit einer NH₂-Funktion zu funktionalisieren, kann eine der Methoden, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren angewendet werden können, darin bestehen, eine Kupplung zwischen dem Oligonucleotid und dem N-Trifluoracetyl-6-aminohexyl-2-cyanoethyl-NN'-diisopropylphosphoramidit, das im Handel erhältlich ist, durchzuführen.
Außerdem kann beispielsweise ein mit NH₂ funktionalisiertes Oligonucleotid in ein Oligonucleotid umgewandelt werden, das durch ein Thiol abgeschlossen ist, durch Umsetzung mit dem Dithiobis(succinimidylpropionat).
Die funktionalisierten Oligonucleotid-Sonden können beispielsweise durch Mikropipettierung aus den Mikrovertiefungen entnommen und in die Mikroküvetten injiziert werden beispielsweise mittels eines Mikroroboter-Dispensors oder durch Strahl-Drucken. Diese Apparaturen sind dem Fachmann allgemein bekannt.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt in vorteilhafter Weise die Auswahl der Anzahl von Sonden pro aktiver Stelle, d.h. pro Mikroküvette, indem man den Mengenanteil von funktionalisiertem Pyrrol in Abhängigkeit von Pyrrol einstellt.
Die gewünschte Dichte der Sonden kann beispielsweise gesteuert (eingestellt) werden durch Fixierung von Oligonucleotiden, die am Ende der Ketten durch ein Biotin markiert sind, und durch Ausnutzung der Wiedererkennung durch Streptavidin-Cy3 durch eine Oberflächenanalyse des Biochips nach klassischen Nachweisverfahren durch Fluoreszenz.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die beiden kollektiven Arbeitsgänge, die Elektropolymerisation und gegebenenfalls die Fixierung des Vernetzungsmittels, pro Charge an einer großen Anzahl von Plättchen parallel durchgeführt werden können.
Die Plättchen, die den Stufen (a) und (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens unterworfen worden sind, werden auch als "Biochip-Rohlinge" bezeichnet. Sie sind bereit, um der Stufe der direkten oder indirekten Fixierung einer biologischen Sonde, beispielsweise eines Oligonucleotids, gemäß der vorliegenden Erfindung unterworfen zu werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt somit beispielsweise die Herstellung eines Oligonucleotid-Biochips, der in der genannten Reihenfolge umfasst:

– ein Siliconsubstrat, das von Siliciumdioxid und einer Schicht aus Silan, das mit Pyrrolen funktionalisiert ist, bedeckt ist,
– oder eine Goldschicht oder eine Silanschicht, die Pyrrol-Stellen aufweist,
– oder eine Goldschicht mit oder ohne eine Schicht zur Förderung und Haftung der Elektropolymerisation (auf Basis eines mit einem Thiol-SH funktionalisierten Pyrrols),
– oder eine Aluminiumschicht mit einem Pyrrol, das mit einem -COOH funktionalisiert ist,
– und eine Harzschicht, in der Mikroküvetten in der Weise gebildet worden sind, dass der Boden der Mikroküvetten mindestens zum Teil aus der Goldschicht oder der Silanschicht, die Pyrrol-Stellen aufweist, besteht,
– und einer Schicht aus einem Copolymer von Pyrrol und funktionalisiertem Pyrrol, die an der Goldschicht oder an der Silanschicht, die Pyrrolstellen aufweist, fixiert ist, die den Boden der Mikroküvetten darstellen, wobei das funktionalisierte Pyrrol an ein difunktionelles Vernetzungsmittel gebunden ist oder nicht gebunden ist,
– und ein Oligonucleotid, das direkt an das funktionalisierte Pyrrol gebunden ist oder indirekt über das mit Pyrrol verbundene Vernetzungsmittel an das funktionalisierte Pyrrol gebunden ist.

Weitere Vorteile und Charakteristika der vorliegenden Erfindung gehen aus der Lektüre der nachfolgenden Beschreibung, die lediglich zur Erläuterung der Erfindung dient und auf welche die Erfindung keineswegs beschränkt ist, unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen hervor.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt ein Schema einer Schnittansicht eines strukturierten Substrats gemäß einer ersten Ausführungsform der Stufen (a) und (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens dar;
2 stellt ein Schema einer Schnittansicht eines strukturierten Substrats gemäß der in der 1 dargestellten Ausführungsform dar und das außerdem ein Vernetzungsmittel umfasst, um ein biologisches Molekül indirekt zu fixieren;
3 stellt ein Schema einer Schnittansicht eines strukturierten Substrats wie es in 2 dargestellt ist, dar, das die indirekte Fixierung eines Oligonucleotids an dem Vernetzungsmittel erläutert;
4 stellt ein Schema einer Schnittansicht eines strukturierten Substrats einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dar; und
5 stellt ein Schema einer Schnittansicht eines strukturierten Substrats gemäß einer dritten Ausführungsform der Stufen (a) und (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens dar.
Beispiele
Beispiel 1
Herstellung eines Biochips, der insbesondere aus Oligonucleotiden besteht, die auf ein elektrisch leitendes Polymer aufgepfropft sind gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
Bei dieser ersten Ausführungsform wird in der Stufe (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Goldschicht auf einem Silicium-Plättchen abgeschieden zur Bildung einer Arbeitselektrode für die Elektropolymerisation eines Copolymers von Pyrrol und funktionalisiertem Pyrrol. Diese Goldschicht wird unter Anwendung eines klassischen Vakuum Aufdampfungsverfahrens oder durch Kathodenzerstäubung abgeschieden. Sie hat eine Dicke von etwa 1000 bis 5000 Å (100–500 nm) und stellt die kollektive (gemeinsame) Arbeitselektrode dar.
Ein lichtempfindliches Harz wird auf der Goldelektrode abgeschieden und eine Fotolithographie-Stufe erlaubt die Erzeugung von Öffnungen in dem Harz zur Bildung von Mikroküvetten, die auf ihrem Boden die Arbeitselektrode aufweisen, wobei diese Mikroküvetten gleichzeitig adressiert werden können.
Bei dem verwendeten Harz handelt es sich vorzugsweise um:

a) ein lichtempfindliches Harz vom positiven Typ (Novolak + Diazonaphthochinon für die Entwicklung in einem alkalischen Medium);
b) ein lichtempfindliches Harz vom negativen Polyimid-Typ (OLIN) für die Entwicklung in einem organischen Lösungsmittel;
c) oder ein Polymer, das durch trockene oder feuchte Ätzung geätzt worden ist.

Die gebildeten Mikroküvetten haben eine Dimension von 100 μm × 100 μm × 30 μm.
Das Harz wird auf der Goldelektrode durch Anwendung einer klassischen Schleuderbeschichtung ("Spinnen") abgeschieden. Dabei erhält man ein strukturiertes Substrat gemäß Stufe (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die Stufe (b) zur kollektiven Elektropolymerisation wird durchgeführt unter Verwendung einer Lösung von Pyrrol und funktionalisiertem Pyrrol.
In diesem Beispiel handelt es sich bei dem funktionalisierten Pyrrol um N-Ethylaminpyrrol und die für die Elektropolymerisation verwendete Lösung ist eine wässrige/ethanolische oder Acetonitril-Lösung, die 0,1 mol Pyrrol und funktionalisiertes Pyrrol in einem Molverhältnis von funktionalisiertem Pyrrol zu Pyrrol von 5 bis 0,5 Gew.-% enthält. Diese Lösung wird nachstehend als elektrolytisches Bad bezeichnet.
Die Herstellung des funktionalisierten Pyrrol-Monomers mit einer NH₂-Funktion ist einfach und beispielsweise von I. Jirkowsky und R. Baudy in "Synthesis" 1981, Seite 481, beschrieben.
Die Elektropolymerisation wird durchgeführt durch Eintauchen (Imprägnieren) des oben erhaltenen strukturierten Substrats in das elektrolytische Bad mit für die Elektrochemie geeigneten Reagentien. Diese Reagentien sind beispielsweise Elektrolytsalze (Li⁺ClO₄-, quaternäre Ammoniumsalze, Li-Toxylat oder Lithium-, Kalium- oder Natriumpolystyrolsulfonat).
Bei den Lösungsmitteln für die Elektropolymerisation handelt es sich beispielsweise um Ca₃CN, Wasser, Ethanol und Ethanol-Wasser-Mischungen. Das in dem Bad enthaltene Pyrrol liegt in einer Konzentration von 10^–1 bis 10^–3 M/l vor.
Eine Gegenelektrode aus Platinum und eine Referenzelektrode aus Calomel sind in das elektrolytische Bad eingetaucht und sie sind unabhängig von dem Silicium-Plättchen, nur die Arbeitselektrode ist in die Struktur des Plättchens integriert.
Ein Film aus einem Copolymer von Pyrrol und funktionalisiertem Pyrrol wird auf diese Weise gebildet und nur auf dem Boden der Mikroküvetten durch Elektroabscheidung abgeschieden.
Die 1 zeigt ein Schema einer Schnittansicht des bei dieser ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Substrats. In dieser Figur bezieht sich die Bezugsziffer 1 auf das in diesem Beispiel gebildete strukturierte Substrat, das aus einem Silicium-Plättchen 3, einer Goldschicht 5 und einer lichtempfindlichen Harzschicht 7 besteht. Die Bezugsziffer 9 bezieht sich auf die Verbindung der Goldschicht mit einem Stromerzeuger für die Elektropolymerisation, die Bezugsziffer 10 bezieht sich auf eine Mikroküvette und die Bezugsziffern 11 und 13 beziehen sich auf ein Copolymer von Pyrrol (Bezugsziffer 11) und N-Ethylaminpyrrol (Bezugsziffer 13), das durch Elektrobeschichtung (Galvanisierung) auf der Goldschicht 5 am Boden der Mikroküvetten 10 abgeschieden worden ist.
In diesem Beispiel handelt es sich bei der Stufe (c) zur Fixierung des biologischen Moleküls um eine indirekte Fixierungsstufe. Sie umfasst die Fixierung eines Vernetzungsmittels an der NH₂-Funktion des auf dem Boden der Mikroküvetten elektrisch abgeschiedenen N-Ethylaminpyrrols.
Das in diesem Beispiel verwendete Vernetzungsmittel ist Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat) (SMPB), wie es vorstehend beschrieben worden ist.
Diese Fixierung wird erzielt durch Bildung einer kovalenten Bindung zwischen der NH₂-Funktion des funktionalisierten Pyrrols und der Succinat-Funktion von SMPB.
Sie wird bewirkt durch Eintauchen des vorher gebildeten Substrats in eine 10^–3 M Lösung von SMPB in einem Lösungsmittel (Dimethylformamid).
Das gebildete Polypyrrol ist in dieser Lösung und in der Mehrzahl der gängigen Lösungsmittel unlöslich.
Die 2 stellt ein Schema einer Schnittansicht des so erhaltenen strukturierten Substrats dar. In diesem Schema bezieht sich die Bezugsziffer 1 auf das in der 1 dargestellte funktionalisierte Substrat und die Bezugsziffer 15 bezieht sich auf das Vernetzungsmittel SMPB. Diese 2 zeigt außerdem die Reaktion zwischen der Succinimid-Gruppe des Vernetzungsmittels und der Amin-Funktion des Pyrrols.
Auf diese Weise erhält man in diesem Beispiel Mikroküvetten, die von einem Polypyrrol bedeckt sind, das eine Funktionalisierung der Oberfläche aufweist, aufgrund von SMBP, mit reaktiven Gruppen vom Maleimid-Typ.
Diese Maleimid-Gruppen von SMBP erlauben die Fixierung der biologischen Sonde an dem vorher elektrisch abgeschiedenen Polypyrrolfilm.
Die in diesem Beispiel verwendete biologische Sonde ist eine Mischung von Oligonucleotiden, die mit einer Thiolgruppe SH funktionalisiert sind.
Die Oligonucleotide wurden vorher hergestellt durch eine automatisierte klassische Synthese und sie wurden mit einer Thiolgruppe funktionalisiert. Die funktionalisierten Oligonucleotide wurden durch Mikropipettierung aus Mikrovertiefungen entnommen und mittels eines Mikroroboter-Dispensors in die Mikroküvetten injiziert.
Die 3 stellt ein Schema einer Schnittansicht des in der 2 dargestellten strukturierten Substrats dar, das die Fixierung des Oligonucleotids an dem Vernetzungsmittel erläutert. In dieser Figur bezieht sich die Bezugsziffer 1 auf das in diesem Beispiel gebildete strukturierte Substrat, die Bezugsziffern 11 und 13 beziehen sich wie in in den 1 und 2 auf das Copolymer von Pyrrol und N-Ethylaminpyrrol, die Bezugsziffer 15 bezieht sich auf das in der 2 dargestellte Vernetzungsmittel SMBP und die Bezugsziffer 17 bezieht sich auf ein Oligonucleotid. Diese 3 zeigt außerdem die Reaktion zwischen der Maleimid-Funktion des Vernetzungsmittels und dem Oligonucleotid -SH.
Die Dichte der Sonden wurde analysiert durch Fixieren von Oligonucleotiden, die durch ein Biotin markiert worden sind (Bezugsziffer 19 in der 3) unter Ausnutzung einer Wiedererkennung durch Streptavidin Cy3 (Bezugsziffer 21 in der 3).
Die Analyse wurde durchgeführt durch Anwendung eines klassischen Verfahrens zum Nachweis durch Fluoreszenz, angewendet auf das Paar Biotin/Streptavidin.
Beispiel 2
Herstellung eines Biochips, der insbesondere aus Oigonucleotid-Sonden besteht, die auf ein elektrisch leitendes Polymer aufgepfropft sind nach einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
Bei dieser zweiten Ausführungsform wird in der Stufe (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens ein lichtempfindliches Harz vom negativen Typ auf einem Silicium-Plättchen abgeschieden, das von einem Film aus natürlichem SiO₂ bedeckt ist.
Wie in Beispiel 1 werden Mikroküvetten dann gebildet durch Fotolithographie in der Weise, dass der Boden der Mikroküvetten, auch als "Stellen" bezeichnet, aus der Siliciumdioxid-Schicht besteht.
Anschließend wird eine Funktionalisierung der Stellen durch Silanierung durchgeführt: diese Funktionalisierung ist eine kollektive Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens, sie wird durchgeführt durch Eintauchen des Silicium-Plättchens, das die vorher hergestellten Mikroküvetten umfasst, in eine Lösung eines Silanierungsmittels, das mit einem Pyrrol funktionalisiert worden ist, in einem geeigneten Lösungsmittel. Bei dem Silanisierungsmittel handelt es sich um N-(3-(Trimethyoxysilyl)propyl)pyrrol und das Lösungsmittel ist eine Ethanol/Wasser (95/5)-Mischung oder Toluol.
Am Boden der Mikroküvetten oder an den aktiven Steifen erhält man eine Silan-Monoschicht, die eine regelmäßige Ausrichtung der Pyrrol-Stellen aufweist.
Diese Monoschicht ist in der Lage, die Adhäsion eines Polypyrrolfilms durch Elektropolymerisation zu initiieren und zu fördern: sie bildet eine Arbeitselektrode für die kollektive Elektropolymerisation des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die Elektropolymerisation auf einer solchen Monoschicht ist beispielsweise in dem Artikel von R. Simon et Coll. in "J. Am. Chem. Soc." 1982, 104, 2031, beschrieben.
Die nachfolgende Stufe ist die Stufe (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Elektropolymerisation eines Copolymers von Pyrrol und N-Ethylaminpyrrol, nachstehend als Py und Py-R-F bezeichnet, worin R und F jeweils für eine Abstandhaltergruppe bzw. eine chemisch reaktionsfähige Funktion stehen.
Das Silicium-Plättchen, das durch Silanpyrrol funktionalisiert worden ist, stellt nämlich die Anode einer Elektrolysezelle dar. Sie ist in ein geeignetes elektrolytisches Bad eingetaucht, das die beiden Polymeren, eine Gegenelektrode und eine Referenzelektrode enthält.
Das elektrolytische Bad enthält außer Py und Py-R-F elektrolytische Li⁺-Salze in einem Wasser/Ethanol- oder Acetonitril-Lösungsmittel.
Die Gegenelektrode ist eine Platinelektrode. Im Verlaufe der Elektropolymerisation werden die Pyrrol- und substituierten Pyrrol-Kerne eingeführt und verbinden sich mit den Pyrrol-Einheiten der Silan-Monoschicht.
Die beiliegende 4 erläutert das dabei erhaltene Produkt, sie zeigt außerdem die Bildung von kovalenten Bindungen zwischen den verschiedenen Pyrrolringen.
In dieser Figur bezieht sich die Bezugsziffer 32 auf das Silicium-Plättchen, die Bezugsziffer 34 bezieht sich auf die lichtempfindliche Harzschicht, die Bezugsziffer 35 bezieht sich auf eine Mikroküvette, die Bezugsziffer 36 bezieht sich auf die Silan-Monoschicht und die Bezugsziffer 38 bezieht sich auf die Schicht aus einem Copolymer von Pyrrol und funktionalisiertem Pyrrol.
Die Herstellung des Biochips erfolgt wie in Beispiel 1 angegeben:

– durch Reaktionen mit dem bifunktionellen Vernetzungsmittel: kollektive Stufe,
– durch Immobilisierung der Oligonucleotid-Sonden, die mit einer Thiolgruppe (-S-H) funktionalisiert sind, durch mechanische Adressierung mit einem Roboter durch Bedrucken mit einem Flüssigkeitsstrahls (piezoelektrischer Kopf) vom GESIM-Typ oder mit einem Roboter vom BROWN-Typ.

Beispiel 3
Herstellung eines Biochips der insbesondere aus Oligonucleotid-Sonden besteht, die auf ein elektrisch leitendes Polymer aufgepfropft worden sind, nach einer dritten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
Bei dieser beispielhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden die Mikroküvetten hergestellt durch Fotolithographie eines Harzes, das auf einer Goldelektrode auf der Oberfläche eines Siliciumdioxid-Plättchens abgeschieden worden ist, wie im dem vorhergehenden Beispiel 1 beschrieben.
Anschließend wurde eine Thiolisierung der Goldschicht am Boden der Mikroküvetten durch ein Pyrrol durchgeführt, das mit einer -SH-Gruppe der folgenden Formel funktionalisiert ist:
Die Reaktion wurde durchgeführt durch Eintauchen des genannten Plättchens in eine Lösung, die das mit einem Thiol funktionalisierte Pyrrol in einem Lösungsmittel wie z.B. Dimethylformamid (DMH) enthält.
Das Thiol verankert sich auf dem Gold am Boden der Mikroküvetten unter Bildung einer Pyrrol-Monoschicht.
Die Anordnung von Goldschicht und Pyrrol, das auf dieser fixiert ist, bildet eine Arbeitselektrode für die kollektive Elektropolymerisation der Stufe (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens. Tatsächlich dient die Probe als Anode zum kollektiven Start der Elektropolymerisation.
Die Stufen (b) und (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden dann wie in den vorhergehenden Beispielen 1 und 2 beschrieben durchgeführt.
Die beiliegende 5 stellt ein Schema dar, welches das in diesem Beispiel erhaltene Produkt erläutert. Es handelt sich dabei um eine Schnittansicht eines funktionalisierten Substrats 40, das ein Silicium-Plättchen 42, eine Goldschicht 44, eine Schicht aus einem lichtempfindliche Harz 46, in der Mikroküvetten 48 gebildet worden sind, eine Pyrrol-Monoschicht 50, die an dem Gold am Boden der Mikroküvetten verankert ist, und einen Film 52 aus einem Copolymer von Pyrrol (Py) und funktionalisiertem Pyrrol
umfasst. In dieser Figur zeigen die gekrümmten Pfeile die elektrolytische Abscheidung des genannten Films auf dem funktionalisierten Pyrrol 50 an, das durch Thiolgruppen auf dem Gold am Boden der Mikroküvette verankert ist.
Beispiel 4
Ergänzungen
Ein anderes Verfahren besteht darin, eine Abscheidung von funktionalisiertem Polypyrrol zu verwenden:

• entweder als Träger zur Immobilisierung von Oligonucleotiden,
• oder als Träger für den Start einer in situ-Synthese des Oligonucleotids.

Diese Methode erlaubt es, in vorteilhafter Weise eine Silanierungsstufe, in der eine Monoschicht schwieriger herzustellen ist, durch einen Polymerfilm zu ersetzen, der eine Dicke und eine Anzahl von funktionellen Stellen aufweist, die gut kontrolliert sind.
Um dies zu erreichen, stellt man durch Elektropolymerisation Filme aus einem Copolymer her, das einen gegebenen Mengenanteil von funktionalisiertem Pyrrol in Bezug auf Pyrrol enthält. Diese Polypyrrolfilme, die auf einer Goldelektrode anstatt auf Silicium oder Glas abgeschieden worden sind, zeigen eine Nebenfluoreszenz mit einer Intensität, die weit niedriger ist als diejenige, die bei den anderen Substraten zu beobachten ist.
Die Funktionalisierung kann wie folgt durchgeführt werden:

1. an dem Stickstoffatom von Pyrrol durch eine NH₂- oder Epoxyfunktion, wie z.B.
Diese Funktionen können gleichzeitig der Immobilisierung von Sonden und der in situ-Synthese dienen;
2. in der 1-, 2- oder 3-Position des Pyrrols durch eine Oxyamin-Funktion (R-ONH₂) oder eine Carbonyl-Funktion (R, R'C=O, wobei R' vorzugsweise für CH₃ steht). In diesem Fall dienen diese Funktionen lediglich der Immobilisierung der Sonden. Das Oligonucleotid weist vorzugsweise entweder eine Carbonyl-Funktion oder eine Oxyamin-Funktion, je nach Substrat, auf. Die Oxyamin-Carbonyl-Kupplungsreaktion hat den Vorteil, dass sie sehr schnell abläuft und zu Immobilisierungszeiten von weniger als 10 min führt im Gegensatz zu dem vorher beschriebenen Fall, der einige Stunden dauert;
3. an dem Stickstoffatom des Pyrrols durch ein Nucleotid, das vorzugsweise eine Base T aufweist. Diese Funktionalisierung dient dazu, Sonden zu immobilisieren, die eine Psoralen-Gruppe in der 5'-Stellung aufweisen. Diese Gruppe reagiert unter der Einwirkung von Licht mit 365 nm unter Erzielung einer Ringaddition zwischen der Doppelbindung des Psoralens und der 5,6-Doppelbindung des Thymins; die Reaktionszeit ist verhältnismäßig kurz: etwa 15 min.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Biochip-Rohlings, dadurch gekennzeichnet, dass es die nachstehend angegebenen aufeinanderfolgenden Stufen umfasst: a) Strukturierung eines Substrats, um auf diesem Substrat Mikroküvetten zu erzeugen, die in ihrem Boden eine Schicht aus einem Material umfassen, das die Haftung eines Films aus einem Copolymer von Pyrrol und funktionalisiertem Pyrrol daran durch Elektropolymerisation initiieren und fördern kann, b) gemeinsame Elektropolymerisation zur Bildung eines elektropolymerisierten Films aus einem Copolymer von Pyrrol und funktionalisiertem Pyrrol auf dem Boden der genannten Mikroküvetten auf der Schicht aus dem genannten Material, ausgehend von einer Lösung von Pyrrol und funktionalisiertem Pyrrol in Gegenwart von chemischen Reagentien, die für die genannte Elektropolymerisation geeignet sind.
Verfahren zur Herstellung eines Biochips, das umfasst die Herstellung eines Biochip-Rohlings nach den Stufen (a) und (b) des Anspruchs 1 und anschließend eine Stufe (c) zur direkten oder indirekten Fixierung einer biologischen Sonde an dem funktionalisierten Pyrrol durch Injektion einer Lösung der biologischen Sonde, je nach Wunsch, in eine oder mehrere Mikroküvetten in Gegenwart von chemischen Reagentien, die für die direkte oder indirekte Fixierung dieser biologischen Sonde an dem funktionalisierten Pyrrol erforderlich sind.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Schicht des Materials, das die Haftung des Polystyrol-Films durch Elektropolymerisation initiieren und fördern kann, eine Metallschicht ist, dass die Stufe (a) eine Stufe zur Abschei dung der genannten Metallschicht auf dem Substrat und eine Stufe zur Abscheidung einer Harzschicht auf der Metallschicht und zur Ätzung der Harzschicht zur Bildung von Mikroküvetten umfasst, deren Boden mindestens zum Teil aus der Metallschicht besteht.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die Metallschicht eine Goldschicht ist.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, bei dem die Stufe (a) außerdem eine Stufe zur chemischen Behandlung der Goldschicht am Boden der Mikroküvetten in Gegenwart eines mit einer Thiolgruppe funktionalisierten Pyrrols umfasst zur Bildung einer Pyrrol-Monoschicht auf der genannten Goldschicht am Boden der genannten Mikroküvetten.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem das mit einer Thiolgruppe funktionalisierte Pyrrol die folgende chemische Formel hat:
in der n einen Wert von 2 bis 10 hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem das Substrat ein Silicium-Wafer ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Substrat ein Silicium-Wafer ist und bei dem die Schicht, welche die Haftung des Polypyrrol-Films an derselben durch Elektropolymerisation initiieren und fördern kann, eine Silanschicht ist, in der die Pyrrol-Zentren aufeinander ausgerichtet sind, die Stufe (a) eine Stufe zur Abscheidung einer Harzschicht auf dem Silicium-Wafer, wobei der genannte Silicium-Wafer von einem SiO₂-Film bedeckt ist, und zur Ätzung der genannten Harzschicht zur Bildung der Mikroküvetten, deren Boden mindestens teilweise aus dem SiO₂-Film besteht, und eine Stufe zur Behandlung der Mikroküvetten mit einem Silanierungsmittel, das mit einem Pyrrol funktionalisiert ist, umfasst, um auf dem SiO₂-Film am Boden der Mikroküvetten die Silanschicht zu fixieren, in der die Pyrrol-Zentren aufeinander ausgerichtet sind.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem das Silanierungsmittel ausgewählt wird aus der Gruppe, die N-(3-(Trimethoxysilyl)propyl)pyrrol oder ir gendein anderes Pyrrol, das mit einer -SiCl₃- oder -Si(OMe)₃-Gruppe funktionalisiert ist, umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem die gemeinsame Elektropolymerisation durchgeführt wird durch Eintauchen des in der Stufe (a) erhaltenen strukturierten Substrats in ein elektrolytisches Bad, das eine Lösung von Pyrrol, funktionalisiertem Pyrrol und chemischen Reagentien, die für die Elektropolymerisation geeignet sind, umfasst, in Gegenwart einer Gegenelektrode, die in das elektrolytische Bad eintaucht und unabhängig von dem strukturierten Substrat ist, wobei die Schicht aus dem Material, das die Haftung des Films aus dem Copolymer von Pyrrol und funktionalisiertem Pyrrol initiieren und fördern kann, eine Arbeitselektrode bildet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem das funktionalisierte Pyrrol ein Pyrrol ist, das eine Gruppe umfasst, die ausgewählt wird aus einer Gesamtheit, die eine NH₂-Gruppe, eine Thiol-Gruppe, eine Ester-Gruppe von N-Hydroxysuccinimid, eine Trimethoxysilyl-Gruppe, eine Carboxyl-Gruppe, eine Aldehyd-Gruppe und eine Isothiocyanat-Gruppe umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem das funktionalisierte Pyrrol ausgewählt wird aus einer der folgenden Verbindungen:
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Fixierung der biologischen Sonde indirekt erfolgt, wobei das Verfahren in der Stufe (c) vor der Fixierung der biologischen Sonde außerdem eine kollektive Fixierung eines Vernetzungsmittels an dem funktionalisierten Pyrrol in Gegenwart von geeigneten chemischen Reagentien umfasst, wobei das genannte Vernetzungsmittel umfasst eine erste Funktion, die seine Fixierung an dem funktionalisierten Pyrrol erlaubt, und eine zweite Funktion, welche die Fixierung der biologischen Sonde an dem Vernetzungsmittel erlaubt.
Verfahren nach Anspruch 13, bei dem das Vernetzungsmittel ausgewählt wird aus einer Gesamtheit, die umfasst einen Dialdehyd, ein Diisothiocyanat, eine Disäure und ein Bernsteinsäureanhydrid.
Verfahren nach Anspruch 13, bei dem das Vernetzungsmittel ausgewählt wird aus einer der folgenden Verbindungen:
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die biologische Sonde ausgewählt wird aus einem Oligonucleotid, einer DNA, einer RNA, einem Peptid, einem Glucid, einem Lipid, einem Protein, einem Antikörper und einem Antigen.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die biologische Sonde ein Oligonucleotid ist, das funktionalisiert ist, um direkt oder indirekt an einem funktionalisierten Pyrrol fixiert zu werden.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem das Oligonucleotid mit einer Thiol-Gruppe funktionalisiert ist.
Biochip-Rohling, der in der genannten Reihenfolge umfasst: – ein Substrat (42), – eine Schicht (44) aus einem Material, das die Haftung eines Films aus einem Copolymer von Pyrrol und funktionalisiertem Pyrrol an demselben durch Elektropolymerisation initiieren und fördern kann, – eine Harzschicht (46), welche die Schicht aus dem Material bedeckt, das die Haftung eines Films aus einem Copolymer von Pyrrol und funktionalisiertem Pyrrol an demselben initiieren und fördern kann, in der Mikroküvetten (48) so gebildet worden sind, dass der Boden dieser Mikroküvetten mindestens zum Teil aus der Schicht (44) des genannten Materials besteht, und – eine Schicht (52) aus einem Copolymer von Pyrrol und funktionalisiertem Pyrrol, die an dem Material fixiert ist, das den Boden der Mikroküvetten darstellt.
Biochip, der in der genannten Reihenfolge umfasst: – einen Biochip-Rohling nach Anspruch 19, in dem das Substrat (42) ein Silicium-Substrat ist, in dem die Schicht aus dem Material, das die Haftung eines Films aus einem Copolymer von Pyrrol und funktionalisiertem Pyrrol an demselben initiieren und fördern kann, eine Goldschicht (44) oder eine Silanschicht ist, die Pyrrol-Zentren aufweist, und in der das funktionalisierte Pyrrol an ein bifunktionelles Vernetzungsmittel gebunden oder nicht gebunden ist; und – ein Oligonucleotid, das am Boden der Mikroküvetten fixiert ist entweder direkt an dem funktionalisierten Pyrrol oder indirekt an dem funktionalisierten Pyrrol über ein Vernetzungsmittel, das an das Pyrrol gebunden ist.