JP6714278B2 - 基質抗原同時検出バイオセンサ、基質抗原同時検出方法、および、プログラム - Google Patents

基質抗原同時検出バイオセンサ、基質抗原同時検出方法、および、プログラム Download PDF

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Description

本発明は、基質抗原同時検出バイオセンサ、電極、基質抗原同時検出方法、および、プログラムに関する。
従来から、バイオセンサに関する技術が開示されている。
特許文献１に記載の酵素−免疫化学的試験方法においては、内在性キャリブレーターを用いるアナライトの連結された酵素−免疫化学的検出方法による、酵素反応および免疫反応を検出することが開示されている。
また、特許文献２に記載のフローセルにおいては、表面プラズモン共鳴測定と電気化学測定を同一金属表面で同時に測定することが開示されている。
また、非特許文献１に記載のキャピラリセンサにおいては、酵素結合免疫吸着（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）を用いて酵素と抗原とを同時に蛍光で検出することが開示されている。
また、非特許文献２に記載の電気化学的バイオセンサにおいては、導電性高分子を用いて抗原およびグルコースを検出することが開示されている。
特表２００９−５３６０２３号公報 特開２０１０−０２５６８１号公報
Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ＥＬＩＳＡ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｓｅｎｓｏｒ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｕｒｆａｃｅ−ｂｏｎｄｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ， ａｎｔｉｂｏｄｙ， ａｎｄ ｐｈｙｓｉｃａｌｌｙ−ａｄｓｏｒｂｅｄ ＰＥＧ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｔｅｒｅｎｃｅ Ｇ． Ｈｅｎａｒｅｓ， Ｅｒｉｎａ Ｔｓｕｔｓｕｍｉ， Ｈｉｒｏｍｉ Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ， Ｋｕｎｉｏ Ｋａｗａｍｕｒａ， Ｔｏｓｈｉｏ Ｙａｏ， Ｈｉｄｅａｋｉ Ｈｉｓａｍｏｔｏ， Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ， Ｖｏｌ． １４９， ｐｐ．３１９−３２４， ２０１０ Ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｆｏｒ ｇｌｕｃｏｓｅ， ＤＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｓｉｎｇ ｇｏｌｄ−ｐｏｌｙａｎｉｌｉｎｅ ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ ａｓ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｍａｔｒｉｘ． Ａｎｋａｎ Ｄｕｔｔａ Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ， Ｒｕｐａｌｉ Ｇａｎｇｏｐａｄｈｙａｙ， Ａｍｉｔａｂｈａ Ｄｅ， Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ， Ｖｏｌ． １９０， ｐｐ．３４８−３５６， ２０１４
しかしながら、特許文献１に記載の従来の試験方法においては、事前の試料調整等の処理を必要とするため、測定に時間がかかり作業の手間がかかるという問題点を有していた。
また、特許文献２に記載のフローセルにおいては、抗原と酵素の基質とを同時に検出することや、導電性高分子上に抗体と酵素とを同時に固定化することができないという問題点を有していた。
また、非特許文献１に記載の従来のキャピラリセンサにおいては、蛍光の情報からのみ２つの情報を得ようとするため、一種類の測定による両方の定量化が困難であるという問題点を有していた。
また、非特許文献２に記載の従来の電気化学的バイオセンサにおいては、抗原およびグルコースの検出が別々の電気化学的測定であるため、同時にそれぞれの情報を定量的に検出することが困難であるという問題点を有していた。
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたもので、体液等の液体中の糖等の基質とタンパク質等の抗原とを同時に定量的、且つ、簡便に測定することができる基質抗原同時検出バイオセンサ、電極、基質抗原同時検出方法、および、プログラムを提供することを目的とする。
このような目的を達成するため、本発明の基質抗原同時検出バイオセンサは、酵素と、抗体と、が固定された導電性高分子を堆積させた電極と、前記導電性高分子における酵素反応に基づく、前記導電性高分子上での電流値の変化を検出する電流値検出手段と、前記導電性高分子における抗原抗体反応に基づく、前記電極により反射される光の反射率の変化を検出する反射率検出手段と、を備えたことを特徴とする。
また、本発明の基質抗原同時検出バイオセンサは、上記記載の基質抗原同時検出バイオセンサにおいて、前記導電性高分子に接する液体を満たした溶液漕、を更に備えたことを特徴とする。
また、本発明の基質抗原同時検出バイオセンサは、上記記載の基質抗原同時検出バイオセンサにおいて、前記液体は、体液を含むことを特徴とする。
また、本発明の基質抗原同時検出バイオセンサは、上記記載の基質抗原同時検出バイオセンサにおいて、前記体液は、尿、生体液、または、血液であることを特徴とする。
また、本発明の基質抗原同時検出バイオセンサは、上記記載の基質抗原同時検出バイオセンサにおいて、前記酵素は、グルコースオキシダーゼ、または、クレアチナーゼであることを特徴とする。
また、本発明の基質抗原同時検出バイオセンサは、上記記載の基質抗原同時検出バイオセンサにおいて、抗原は、アルブミン、前記アルブミン以外のタンパク質、または、タンパク質の分解産物であるペプチドであることを特徴とする。
また、本発明の基質抗原同時検出バイオセンサは、上記記載の基質抗原同時検出バイオセンサにおいて、前記導電性高分子は、ポリピロールカルボン酸であることを特徴とする。
また、本発明の基質抗原同時検出バイオセンサは、上記記載の基質抗原同時検出バイオセンサにおいて、前記反射率検出手段は、表面プラズモン共鳴法を用いて、前記導電性高分子における前記抗原抗体反応に基づく、前記電極により反射される前記光の前記反射率の変化を検出することを特徴とする。
また、本発明の基質抗原同時検出バイオセンサは、上記記載の基質抗原同時検出バイオセンサにおいて、前記電流値検出手段は、電気化学測定法を用いて、前記導電性高分子における前記酵素反応に基づく、前記導電性高分子上での前記電流値の変化を検出することを特徴とする。
また、本発明の基質抗原同時検出バイオセンサは、上記記載の基質抗原同時検出バイオセンサにおいて、前記電流値の変化、および、前記反射率の変化に基づく解析結果を取得する解析手段と、前記解析結果を出力させる解析結果出力手段と、を更に備えたことを特徴とする。
また、本発明の電極は、酵素と、抗体と、が固定された導電性高分子を堆積させたことを特徴とする。
また、本発明の基質抗原同時検出方法は、酵素と、抗体と、が固定された導電性高分子を堆積させた電極上の前記導電性高分子における酵素反応に基づく、前記導電性高分子上での電流値の変化を検出する電流値検出ステップと、前記導電性高分子における抗原抗体反応に基づく、前記電極により反射される光の反射率の変化を検出する反射率検出ステップと、を含むことを特徴とする。
また、本発明のプログラムは、酵素と、抗体と、が固定された導電性高分子を堆積させた電極上の前記導電性高分子における酵素反応に基づく、前記導電性高分子上での電流値の変化を検出する電流値検出ステップと、前記導電性高分子における抗原抗体反応に基づく、前記電極により反射される光の反射率の変化を検出する反射率検出ステップと、を実行させることを特徴とする。
この発明によれば、導電性高分子における酵素反応に基づく、導電性高分子上での電流値の変化を検出し、導電性高分子における抗原抗体反応に基づく、電極により反射される光の反射率の変化を検出するので、これまでは別々に測定する必要があった別の情報である酵素の基質と抗原とを、同時に定量的に測定することができ、測定時間も短縮することができるという効果を奏する。
この発明によれば、導電性高分子に接する液体を満たした溶液漕を備えるので、簡便な測定をすることができるという効果を奏する。
この発明によれば、液体は、体液を含むので、これまで別々で測定していた体液中の主要成分を同時に測定することが可能となり、今後の簡便な体液センサに応用することができるという効果を奏する。
この発明によれば、体液は、尿、生体液、または、血液であるので、今後の簡便な尿センサ、生体液センサ、または、血液センサ等の利用目的に合致したバイオセンサに応用することができるという効果を奏する。
この発明によれば、酵素は、グルコースオキシダーゼ、または、クレアチナーゼであるので、尿中の主要成分である尿糖などの糖量を定量的に測定することができるという効果を奏する。
この発明によれば、抗原は、アルブミン、アルブミン以外のタンパク質、または、タンパク質の分解産物であるペプチドであるので、尿中の主要成分である尿タンパク質などタンパク質量を定量的に測定することができるという効果を奏する。
この発明によれば、導電性高分子は、ポリピロールカルボン酸であるので、安定性があるだけでなく、電気化学反応を促進して定量測定を容易にするという効果を奏する。
この発明によれば、表面プラズモン共鳴法を用いて、導電性高分子における抗原抗体反応に基づく、電極により反射される光の反射率の変化を検出するので、光学的測定を簡便に行えるという効果を奏する。
この発明によれば、電気化学測定法を用いて、導電性高分子における酵素反応に基づく、導電性高分子上での電流値の変化を検出するので、電気化学的測定を簡便に行えるという効果を奏する。
この発明によれば、電流値の変化、および、反射率の変化に基づく解析結果を取得し、解析結果を出力させるので、迅速な病気の診断およびセンシング等への活用を促進することができるという効果を奏する。
図１は、本実施形態の基本原理を示すフローチャートである。 図２は、本実施形態における基質抗原同時検出バイオセンサの構成の一例を示すブロック図である。 図３は、本実施形態における制御部の構成の一例を示すブロック図である。 図４は、本実施形態の基質抗原同時検出バイオセンサの処理の一例を示すフローチャートである。 図５は、本実施形態における抗体・グルコースオキシダーゼ固定化の一例を示す図である。 図６は、本実施形態におけるプリズム／金薄膜界／誘電体１０ｎｍ界面における、表面プラズモンの分散関係、および、フレネル式を用いた反射率理論計算カーブの一例を示す図である。 図７は、本実施形態における抗原・グルコース同時検出の一例を示す図である。 図８は、本実施形態における同時検出される電流値変化の一例を示す図である。 図９は、本実施形態における同時検出される反射率変化の一例を示す図である。
以下に、本発明にかかる基質抗原同時検出バイオセンサ、電極、基質抗原同時検出方法、および、プログラムの実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。
［本発明の実施の形態の概要］
以下、本発明の実施の形態の概要について図１を参照して説明し、その後、本実施形態の構成および処理等について詳細に説明する。図１は、本実施形態の基本原理を示すフローチャートである。本実施形態は、概略的に、以下の基本的特徴を有する。
すなわち、本実施形態において、ユーザは、図１に示すように、基質抗原同時検出バイオセンサに検体（サンプル）となる液体を注入（セット）する（ステップＳＡ−１）。
そして、基質抗原同時検出バイオセンサは、酵素と、抗体と、が固定された導電性高分子を堆積させた電極上の導電性高分子における酵素反応に基づく、導電性高分子上での電流値の変化を検出（電気化学的検出）する（ステップＳＡ−２）。
そして、基質抗原同時検出バイオセンサは、導電性高分子における抗原抗体反応に基づく、電極により反射される光の反射率の変化を検出（光学的検出）し（ステップＳＡ−３）、処理を終了する。なお、ステップＳＡ−２と、ステップＳＡ−３と、は同時に実行されてもよく、どちらが先に実行されてもよい。
以上で、本実施形態の概要の説明を終える。
［基質抗原同時検出バイオセンサ１００の構成］
次に、本実施形態における基質抗原同時検出バイオセンサ１００の構成の詳細について、図２および図３を参照して以下に説明する。図２は、本実施形態における基質抗原同時検出バイオセンサ１００の構成の一例を示すブロック図であり、該構成のうち本発明に関係する部分のみを概念的に示している。
図２に示すように、基質抗原同時検出バイオセンサ１００は、概略的に、基板１０、作用電極２０、ポテンショスタット３０、対電極３１、参照電極３２、溶液槽４０、ガラスプリズム５０、レーザ発振器５１、偏光子５２、および、ディテクタ５３を備える。
ここで、基板１０は、表面に作用電極２０を形成するものであり、金属、ガラス、プラスチック、または、金属酸化物等から構成される。
作用電極２０は、酵素２２と、抗体２３と、が固定された導電性高分子２１を堆積させた電極である（図５参照）。ここで、酵素２２は、グルコースオキシダーゼ、または、クレアチナーゼ等であってもよい。また、抗体２３に作用する抗原は、アルブミン、アルブミン以外のタンパク質、タンパク質の分解産物であるペプチド、または、クレアチニン等であってもよい。また、導電性高分子２１は、ポリピロールカルボン酸（ＰＰ３Ｃ）等であってもよい。また、作用電極２０は、金薄膜等から構成されてもよい。また、作用電極２０上の導電性高分子２１は、溶液槽４０中の液体と接していてもよい。
ポテンショスタット３０は、作用電極２０、対電極３１、および、参照電極３２に接続され、作用電極２０と対電極３１との間の電流（電流値）を測定する電流検出器である。ここで、ポテンショスタット３０は、作用電極２０の電位を参照電極３２に対して一定にしてもよい。また、ポテンショスタット３０は、参照電極３２に電流を流さないようにしてもよい。
対電極３１は、白金、金、カーボン、または、水銀等であってもよい。
参照電極３２は、水素電極、または、銀‐塩化銀電極等であってもよい。
溶液槽４０は、作用電極２０に接する液体を満たした容器である。ここで、液体は、体液を含んでもよい。また、体液は、尿、生体液、または、血液であってもよい。また、溶液槽４０中の液体は、対電極３１、および、参照電極３２と接していてもよい。
ガラスプリズム５０は、基板１０の作用電極２０が設けられていない面に接している。ここで、図２に示すように、ガラスプリズム５０の誘電率（εｐ）は、溶液槽４０中の液体の誘電率（εｄ）よりも大きくてもよい。
レーザ発振器５１は、レーザ光を発生させる機器である。ここで、レーザ発振器５１は、作用電極２０にレーザを照射してもよい。
偏光子５２は、自然光や円偏光から直線偏光を作り出すものである。ここで、偏光子５２は、レーザ発振器５１とガラスプリズム５０との間に設置されてもよい。
ディテクタ５３は、作用電極２０により反射される光、および／または、光の反射率を検出する反射光検出器である。
また、図２では省略しているが、基質抗原同時検出バイオセンサ１００は、更に、制御部１０２、記憶部１０６、入出力部１１２、入出力インターフェース部、および、通信インターフェース部を備えていてもよい。これら基質抗原同時検出バイオセンサ１００の各部は任意の通信路を介して通信可能に接続されている。
ここで、図３を参照して、本実施形態における制御部１０２の構成について説明する。図３は、本実施形態における制御部１０２の構成の一例を示すブロック図である。
制御部１０２は、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）等の制御プログラムや、各種の処理手順等を規定したプログラム、および、所要データを格納するための内部メモリを有する。そして、制御部１０２は、これらのプログラム等により、種々の処理を実行するための情報処理を行う。なお、制御部１０２は、入出力部１１２、入出力インターフェース部、および、通信インターフェース部を制御してもよい。
図３に示すように、制御部１０２は、機能概念的に、電流値検出部１０２ａ、反射率検出部１０２ｂ、解析部１０２ｃ、および、解析結果出力部１０２ｄを備える。
このうち、電流値検出部１０２ａは、導電性高分子２１における酵素反応に基づく、導電性高分子２１上での電流値の変化を検出する電流値検出手段である。ここで、電流値検出部１０２ａは、電気化学測定法を用いて、導電性高分子２１における酵素反応に基づく、導電性高分子２１上での電流値の変化を検出してもよい。なお、電流値検出部１０２ａは、ポテンショスタット３０に備えられていてもよい。
反射率検出部１０２ｂは、導電性高分子２１における抗原抗体反応に基づく、作用電極２０により反射される光の反射率の変化を検出する反射率検出手段である。ここで、反射率検出部１０２ｂは、表面プラズモン共鳴法を用いて、導電性高分子２１における抗原抗体反応に基づく、作用電極２０により反射される光の反射率の変化を検出してもよい。なお、反射率検出部１０２ｂは、ディテクタ５３に備えられていてもよい。
解析部１０２ｃは、電流値の変化、および、反射率の変化に基づく解析結果を取得する解析手段である。ここで、解析部１０２ｃは、電流値の変化に基づく酵素２２の基質、および、反射率の変化に基づく抗原の量に関する解析結果を取得してもよい。
解析結果出力部１０２ｄは、解析結果を出力させる解析結果出力手段である。ここで、解析結果出力部１０２ｄは、解析結果を入出力部１１２を介して出力させてもよい。
また、記憶部１０６は、各種のデータベースやテーブルなどを格納する装置である。
記憶部１０６に格納される各種のデータベースやテーブルは、固定ディスク装置等のストレージ手段である。例えば、記憶部１０６は、各種処理に用いる各種のプログラム、テーブル、ファイル、データベース、および、ウェブページ等を格納する。
ここで、記憶部１０６は、電流値、電流値の変化、光の反射率、光の反射率の変化、および／または、解析結果等を記憶してもよい。
また、入出力部１１２は、データの入出力（Ｉ／Ｏ）を行う。ここで、入出力部１１２は、例えば、キー入力部、タッチパネル、コントロールパッド（例えば、タッチパッド、および、ゲームパッド等）、マウス、キーボード、および、マイク等であってもよい。また、入出力部１１２は、アプリケーション等の表示画面を表示する表示部（例えば、液晶または有機ＥＬ等から構成されるディスプレイ、モニタ、および、タッチパネル等）であってもよい。また、入出力部１１２は、音声情報を音声として出力する音声出力部（例えば、スピーカ等）であってもよい。
また、入出力インターフェース部は、入出力部１１２に接続されるインターフェースである。入出力インターフェース部は、制御部１０２と入出力部１１２とを接続し、入出力部１１２の制御を行う。
また、通信インターフェース部は、通信回線等に接続されるルータ等の通信装置に接続されるインターフェースである。通信インターフェース部は、基質抗原同時検出バイオセンサ１００とネットワーク（またはルータ等の通信装置）との間における通信制御を行う。すなわち、通信インターフェース部は、外部システム、および、他の端末等と通信回線を介してデータを通信する機能を有する。更に、この基質抗原同時検出バイオセンサ１００は、ルータ等の通信装置および専用線等の有線または無線の通信回線を介して、ネットワーク（インターネット等）に通信可能に接続されている。
以上で、本実施形態における基質抗原同時検出バイオセンサ１００の構成の一例の説明を終える。
［基質抗原同時検出バイオセンサ１００の処理］
次に、このように構成された本実施形態における基質抗原同時検出バイオセンサ１００の処理の詳細について、以下に図４乃至図９を参照して詳細に説明する。図４は、本実施形態における基質抗原同時検出バイオセンサ１００の処理の一例を示すフローチャートである。
まず、図４に示すように、ユーザは、作用電極２０上の導電性高分子２１に接する液体（緩衝溶液）で満たされた基質抗原同時検出バイオセンサ１００の溶液槽４０に、検体（サンプル）となる体液を注入する（ステップＳＢ−１）。ここで、体液は、尿、生体液、または、血液であってもよい。
ここで、図５を参照して、本実施形態における抗体・グルコースオキシダーゼ固定化の一例について説明する。図５は、本実施形態における抗体・グルコースオキシダーゼ固定化の一例を示す図である。
図５に示すように、本実施形態における抗原・グルコース同時検出のための試料作製においては、作用電極（金薄膜）２０上に、電解重合法により導電性高分子（ポリピロールカルボン酸（ＰＰ３Ｃ）薄膜）２１の堆積を行った（ステップＳＣ−１）。すなわち、本試料作製においては、電解重合法により、カルボキシル基をもつ導電性高分子２１を作用電極２０上に堆積させている。
ここで、電解重合は、サイクリックボルタンメトリー法により行ってもよい（例えば、０．５Ｍ硫酸水溶液中で０．１Ｍピロールカルボン酸（Ｐ３Ｃ）を、０Ｖ−０．８Ｖの電位範囲且つ掃引速度２０ｍＶ／ｓで５サイクル行ってもよい）。
そして、本試料作製においては、ＰＢＳ溶液中でＰＰ３Ｃ薄膜２１上のカルボキシル基を０．４ＭＥＤＣ／０．１ＭＮＨＳを用いて活性化したのち、１ｍｇ／ｍＬの酵素（グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ））２２を、活性化したＰＰ３Ｃ薄膜２１表面に反応吸着（固定化）させる（ステップＳＣ−２）。すなわち、本試料作製においては、グルコース検出用に、グルコースオキシダーゼ２２の固定化をさせている。
そして、本試料作製においては、その上にもう一度ＰＰ３Ｃ薄膜２１を、同様の条件で電解重合法により堆積させた（ステップＳＣ−３）。すなわち、本試料作製においては、電解重合法によりカルボキシル基をもつ導電性高分子２１をさらに堆積させている。
そして、本試料作製においては、新たに堆積したＰＰ３Ｃ薄膜２１のカルボキシル基を０．４ＭＥＤＣ／０．１ＭＮＨＳを用いて活性化し、活性化した部位に抗体（Ａｎｔｉ−ＩｇＧ）２３を固定化させている（ステップＳＣ−４）。すなわち、本試料作製においては、抗原検出用に、抗体２３の固定化を行っている。
更に、本試料作製においては、抗体２３が固定化されずに残った活性化部位に抗原（ＩｇＧ）が吸着することを防ぐため、エタノールアミンを用いて残った活性化部位を不活性化させ、抗原−グルコース同時検出のための試料としてもよい。
このように、本試料作製においては、導電性高分子２１中に、抗原と特異的に吸着反応を起こす抗体２３と、グルコースの検出に必要なグルコースオキシダーゼ２２と、を同時に固定化している。
すなわち、本実施形態における作用電極（金電極）２０上の導電性高分子２１へのグルコースオキシダーゼ２２と抗体２３との固定化法においては、カルボキシル基を有するピロールを電解質溶液中で電解重合させ、金電極上へポリピロール誘電体を堆積させてもよい。その後、本実施形態における固定化法においては、カルボキシル基を活性化させ、グルコースオキシターゼを固定化させ、ポリピロール誘電体を堆積・活性化した後、抗体２３を固定化させてもよい。
図４に戻り、電流値検出部１０２ａは、電気化学測定法を用いて、ポテンショスタット３０にて測定された作用電極２０と対電極３１との間の電流（電流値）を用いて、抗体２３が固定された導電性高分子２１における酵素反応に基づく、導電性高分子２１上での電流値の変化を検出（電気化学的検出）する（ステップＳＢ−２）。
そして、反射率検出部１０２ｂは、表面プラズモン共鳴法を用いて、レーザ発振器５１から偏光子５２を介してガラスプリズム５０を通して作用電極２０に照射され、且つ、作用電極２０により反射されてガラスプリズム５０を通して到達した光に基づいて、ディテクタ５３にて検出された光の反射率を用いて、酵素２２が固定された導電性高分子２１における抗原抗体反応に基づく、作用電極２０により反射される光の反射率の変化を検出（光学的検出）する（ステップＳＢ−３）。
ここで、酵素２２は、グルコースオキシダーゼ、または、クレアチナーゼ等であってもよい。なお、ステップＳＢ−２と、ステップＳＢ−３と、は同時に実行されてもよく、どちらが先に実行されてもよい。
ここで、図２および図６を参照して、本実施形態における表面プラズモン共鳴励起測定法の一例について説明する。図６は、本実施形態におけるプリズム／金薄膜界／誘電体１０ｎｍ界面における、表面プラズモンの分散関係、および、フレネル式を用いた反射率理論計算カーブの一例を示す図である。
表面プラズモン共鳴励起測定法（表面プラズモン共鳴法）は、金属薄膜／誘電体界面の光学情報を高感度に得ることのできる測定法である。そして、本実施形態における電気化学測定と組み合わせた表面プラズモン共鳴法は、表面プラズモン励起のために利用される金属薄膜が、同時に電気化学測定での作用電極としても用いることができるため、金属薄膜表面の光学情報と電気化学情報とを同時に得ることができる。
このような本実施形態における電気化学測定法と組み合わせた表面プラズモン共鳴法は、導電性高分子を媒介としたセンシングにおいては、光と電気化学信号の両方を高感度に検出できる非常に有効な測定法でもある。
図２に示すように、本実施形態においては、光が、屈折率の大きい媒質であるガラスプリズム（プリズム）５０から、屈折率の小さい媒質に、入射角θ０＝臨界角θｃ以上で入射した場合、光は全反射される。この際、プリズム５０表面近傍には、ｚ方向に指数関数的に減衰し、ｘ方向へ伝搬する電磁波，エバネッセント波（表面プラズモン波）１が存在する。
このエバネッセント波１は、近接場顕微鏡を用いて実験的に検出することができ、マクスウェルの方程式からも理論的にも導出することができる。ここで、プリズム５０底面に十分に薄い貴金属薄膜（４５〜５０ｎｍ）が存在する時、このエバネッセント波１は金属／液体界面に浸み出す。
金属中の表面プラズモンの分散関係から得られる波数ベクトルは、空気中からの入射光の波数ベクトルよりも常に大きいが、屈折率の大きなプリズム５０を通すことにより入射光の波数ベクトルを大きくすることが可能となる。
ここで、本実施形態においては、入射角度を変化させ、入射光の波数ベクトルのｘ成分が金属中に局在する表面プラズモンの波数ベクトルと一致する場合、表面プラズモンが共鳴励起される。
この際、入射光のエネルギーは、表面プラズモンのエネルギーとして奪われるために、ディテクタ（フォトディテクタ）５３により反射光が検出されると、図６に示すように、反射率の鋭い減衰として観測される。
また、図６に示すように、導電性高分子（誘電体薄膜）２１が作用電極（金属薄膜）２０上に存在する場合、表面プラズモンの分散関係が変化し、これに対応してディップ角度は高角度へシフトする。
更に、図２に示すように、３電極の電気化学セルを取り付けた場合、金属薄膜は、作用電極２０として働く。そして、導電性高分子２１の薄膜は、バイオセンサまたは化学センサへの応用も盛んに行われている。
また、導電性高分子２１の可逆的なドーピング−脱ドーピングは、電気化学的に行われ、電極との間の電子の授受が行われることにより金属−絶縁体転移を起こし、その誘電率が大きく変化し、光学特性が大きく変化する場合が多い。
このように、本実施形態における作用電極２０は、特性変化を利用して表面プラズモン共鳴特性のセンシング高感度化材料としても用いることができ、電気（化学）信号および光信号の両方での検出に使用可能である。
また、図７を参照して、本実施形態における抗原・グルコース同時検出の一例について説明する。図７は、本実施形態における抗原・グルコース同時検出の一例を示す図である。
図７に示すように、本実施形態においては、抗体２３と酵素（グルコースオキシダーゼ）２２とを、カルボキシル基を有する導電性高分子２１を堆積させた金電極上に固定化して、この金電極を電気化学測定の作用電極２０として使用し、同時に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）用基板として使用している。
そして、本実施形態においては、作用電極２０且つ表面プラズモン共鳴用基板である金電極上で生じる２つの現象を、電流値、および、光の反射率変化として検出している。
また、図８および図９を参照して、本実施形態における同時検出される測定値の一例について説明する。図８は、本実施形態における同時検出される電流値変化の一例を示す図である。図９は、本実施形態における同時検出される反射率変化の一例を示す図である。
図８および図９に示す測定においては、最初に抗原（５μｇ／ｍＬ）とグルコース（２０ｍＭ）とを同時にＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）の満たされた溶液槽（セル）４０に注入し、電流値と表面プラズモン共鳴反射率とを測定している。
続いて、本測定においては、ＰＢＳでリンス後、グルコース（２０ｍＭ）のみをＰＢＳの満たされた溶液槽（セル）４０に注入し、電流値と表面プラズモン共鳴反射率とを測定している。
更に続いて、本測定においては、ＰＢＳでリンス後、抗原（５μｇ／ｍＬ）のみをＰＢＳの満たされた溶液槽（セル）４０に注入し、電流値と表面プラズモン共鳴反射率とを測定している。
図８に示すように、グルコースと抗原とを同時に注入した場合、および、グルコースのみを注入した場合は、電流値が変化しており、抗原のみを注入した場合は、電流値が反応していない。これにより、電流値変化は、グルコースによるもの（グルコースオキシダーゼとの酸化還元反応）であることが確認された。
一方、図９に示すように、導電性高分子の形状変化によるベースラインの上昇はあるが、グルコースと抗原とを同時に注入した場合は、反射率が増加している。ここで、ＰＢＳでのリンス後は、吸着物質の脱離による反射率の減少が観測されるが、吸着前に比べて反射率が増加しているため、リンスされずに抗原が残っていることが確認された。
次に、図９に示すように、グルコースのみを注入した場合は、反射率が一旦上昇しているが、ＰＢＳでのリンス後に反射率が元に戻っている。すなわち、一旦、グルコースとグルコースオキシダーゼとが物理吸着するが、リンスにより完全に洗い流されて表面に残っていないことが確認された。
そして、図９に示すように、抗原のみを入れた場合は、反射率が増加している。すなわち、ＰＢＳでのリンス後もほとんど洗い流されずに残っており、抗原が抗体に特異的に吸着していることが確認された。これらの結果から、ＰＢＳでのリンス後は、抗原のみ光学的検出（ＳＰＲ）により検出することができることが確認された。
すなわち、図８および図９に示すように、セル４０へのグルコースおよび抗原の同時注入の場合は、電流（電気化学的検出）およびＳＰＲ（光学的検出）がともに増加することが測定された。
また、図８および図９に示すように、セル４０へのグルコースの注入の場合は、電流（電気化学的検出）が増加することが測定され、ＳＰＲ（光学的検出）が変化しないことが測定された。
また、図８および図９に示すように、セル４０への抗原の注入の場合は、電流（電気化学的検出）が変化しないことが測定され、ＳＰＲ（光学的検出）が増加することが測定された。
このように、本実施形態においては、電流変化によるグルコース検出と、ＳＰＲ反射率による抗原検出と、に関するそれぞれの情報を分離して検出できることが示された。
図４に戻り、解析部１０２ｃは、電流値の変化に基づく酵素２２の基質、および、反射率の変化に基づく抗原の量に関する解析結果を取得する（ステップＳＢ−４）。ここで、基質は、グルコース、または、クレアチニンであってもよい。また、抗原は、アルブミン、アルブミン以外のタンパク質、タンパク質の分解産物であるペプチド、または、クレアチニン等であってもよい。
そして、解析結果出力部１０２ｄは、解析結果を入出力部１１２を介して出力させ（ステップＳＢ−５）、処理を終了する。そして、本実施形態において、医師（または獣医師）などは、出力された解析結果を参照することで、検体を提供したヒト（または動物）に対する、種々の病気等（例えば、糖尿病、痛風、妊娠、心臓病、または、種々の生活習慣病など）、または、健康状態の診断を行ってもよい。
このように、本実施形態においては、タンパク質と糖とを別々に測定していた従来の手法の課題を解決するために、導電性高分子上に抗原を検出するための抗体とグルコースとを検出するためのグルコースオキシダーゼを同時に固定化している。
ここで、グルコースとグルコースオキシダーゼとの反応は、導電性高分子表面での屈折率は変化しないが、電子の移動を伴う。これに対して、抗原抗体反応は、電子の移動は伴わないが、導電性高分子表面に化学的に結合するため屈折率の変化を伴う。
そこで、本実施形態においては、これらのそれぞれ異なる現象を利用して、電気化学測定と表面プラズモン共鳴分光法とを組み合わせた電気化学−表面プラズモン共鳴分光法で電気化学的情報と光学的情報とをそれぞれ同時に別々で検出している。
すなわち、電気化学−表面プラズモン共鳴分光法を用いることにより、導電性高分子により促進されたグルコース−グルコースオキシダーゼの反応を電流検出により行い、抗原抗体反応を表面プラズモン共鳴法による光検出により行うことで、それぞれ情報を分けて取得することを可能としている。
このように、本実施形態においては、同じ基板上での抗原とグルコースとの同時検出を可能としている。これは、尿中の主要な物質である尿糖、アルブミン、および、クレアチニンの情報をそれぞれ分けて検出する尿センサに応用可能となる。
以上で、本実施形態における基質抗原同時検出バイオセンサ１００の処理の一例の説明を終える。
［他の実施の形態］
さて、これまで本発明の実施の形態について説明したが、本発明は、上述した実施の形態以外にも、特許請求の範囲に記載した技術的思想の範囲内において種々の異なる実施の形態にて実施されてよいものである。
例えば、基質抗原同時検出バイオセンサ１００がスタンドアローンの形態で処理を行う場合を一例に説明したが、基質抗原同時検出バイオセンサ１００は、クライアント端末（基質抗原同時検出バイオセンサ１００とは別筐体である）からの要求に応じて処理を行い、その処理結果を当該クライアント端末に返却するようにしてもよい。
また、実施の形態において説明した各処理のうち、自動的に行われるものとして説明した処理の全部または一部を手動的に行うこともでき、あるいは、手動的に行われるものとして説明した処理の全部または一部を公知の方法で自動的に行うこともできる。
このほか、上記文献中や図面中で示した処理手順、制御手順、具体的名称、各処理の登録データや検索条件等のパラメータを含む情報、画面例、データベース構成については、特記する場合を除いて任意に変更することができる。
また、基質抗原同時検出バイオセンサ１００に関して、図示の各構成要素は機能概念的なものであり、必ずしも物理的に図示の如く構成されていることを要しない。
例えば、基質抗原同時検出バイオセンサ１００の各装置が備える処理機能、特に制御部１０２にて行われる各処理機能については、その全部または任意の一部を、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）および当該ＣＰＵにて解釈実行されるプログラムにて実現してもよく、また、ワイヤードロジックによるハードウェアとして実現してもよい。尚、プログラムは、後述する、コンピュータに本発明に係る方法を実行させるためのプログラム化された命令を含む、一時的でないコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されており、必要に応じて基質抗原同時検出バイオセンサ１００に機械的に読み取られる。すなわち、ＲＯＭまたはＨＤＤ（Ｈａｒｄ Ｄｉｓｋ Ｄｒｉｖｅ）などの記憶部１０６などには、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）と協働してＣＰＵに命令を与え、各種処理を行うためのコンピュータプログラムが記録されている。このコンピュータプログラムは、ＲＡＭにロードされることによって実行され、ＣＰＵと協働して制御部を構成する。
また、このコンピュータプログラムは、基質抗原同時検出バイオセンサ１００に対して任意のネットワークを介して接続されたアプリケーションプログラムサーバに記憶されていてもよく、必要に応じてその全部または一部をダウンロードすることも可能である。
また、本発明に係るプログラムを、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納してもよく、また、プログラム製品として構成することもできる。ここで、この「記録媒体」とは、メモリーカード、ＵＳＢメモリ、ＳＤカード、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＤＶＤ、および、Ｂｌｕ−ｒａｙ（登録商標） Ｄｉｓｃ等の任意の「可搬用の物理媒体」を含むものとする。
また、「プログラム」とは、任意の言語や記述方法にて記述されたデータ処理方法であり、ソースコードやバイナリコード等の形式を問わない。なお、「プログラム」は必ずしも単一的に構成されるものに限られず、複数のモジュールやライブラリとして分散構成されるものや、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）に代表される別個のプログラムと協働してその機能を達成するものをも含む。なお、実施の形態に示した各装置において記録媒体を読み取るための具体的な構成、読み取り手順、あるいは、読み取り後のインストール手順等については、周知の構成や手順を用いることができる。
記憶部１０６に格納される各種のデータベース等は、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリ装置、ハードディスク等の固定ディスク装置、フレキシブルディスク、および、光ディスク等のストレージ手段であり、各種処理やウェブサイト提供に用いる各種のプログラム、テーブル、データベース、および、ウェブページ用ファイル等を格納する。
また、基質抗原同時検出バイオセンサ１００は、既知の装置に任意の周辺装置を接続して構成してもよい。また、基質抗原同時検出バイオセンサ１００は、既知の装置に本発明の方法を実現させるソフトウェア（プログラム、データ等を含む）を実装することにより実現してもよい。
更に、装置の分散・統合の具体的形態は図示するものに限られず、その全部または一部を、各種の付加等に応じて、または、機能負荷に応じて、任意の単位で機能的または物理的に分散・統合して構成することができる。すなわち、上述した実施の形態を任意に組み合わせて実施してもよく、実施の形態を選択的に実施してもよい。
以上詳述に説明したように、本発明によれば、体液等の液体中の糖等の基質とタンパク質等の抗原とを同時に定量的、且つ、簡便に測定することができる基質抗原同時検出バイオセンサ、電極、基質抗原同時検出方法、および、プログラムを提供することができるので、特に医療、製薬、創薬、および、生物学研究等の様々な分野において極めて有用である。
１ エバネッセント波
１０ 基板
２０ 作用電極
２１ 導電性高分子
２２ 酵素
２３ 抗体
３０ ポテンショスタット
３１ 対電極
３２ 参照電極
４０ 溶液槽
５０ ガラスプリズム
５１ レーザ発振器
５２ 偏光子
５３ ディテクタ
１００ 基質抗原同時検出バイオセンサ
１０２ 制御部
１０２ａ 電流値検出部
１０２ｂ 反射率検出部
１０２ｃ 解析部
１０２ｄ 解析結果出力部
１０６ 記憶部
１１２ 入出力部

Claims (10)

  1. 酵素および抗体が固定されたポリピロールカルボン酸の膜を堆積させた作用電極と、
    前記膜における酵素反応に基づく、前記膜上での電流値の変化を検出する電流値検出手段と、
    光源から前記作用電極への偏光子を介した光の照射による表面プラズモン共鳴法を用いて、前記膜における抗原抗体反応に基づく、前記作用電極により反射される光の反射率の変化を検出する反射率検出手段と、
    を備えたことを特徴とする、基質抗原同時検出バイオセンサ。
  2. 前記ポリピロールカルボン酸に接する液体を満たした溶液漕、
    を更に備えたことを特徴とする、請求項１に記載の基質抗原同時検出バイオセンサ。
  3. 前記液体は、
    体液を含むことを特徴とする、請求項２に記載の基質抗原同時検出バイオセンサ。
  4. 前記体液は、
    尿、生体液、または、血液であることを特徴とする、請求項３に記載の基質抗原同時検出バイオセンサ。
  5. 前記酵素は、
    グルコースオキシダーゼ、または、クレアチナーゼであることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか一つに記載の基質抗原同時検出バイオセンサ。
  6. 抗原は、
    アルブミン、前記アルブミン以外のタンパク質、または、タンパク質の分解産物であるペプチドであることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか一つに記載の基質抗原同時検出バイオセンサ。
  7. 前記電流値検出手段は、
    電気化学測定法を用いて、前記膜における前記酵素反応に基づく、前記膜上での前記電流値の変化を検出することを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか一つに記載の基質抗原同時検出バイオセンサ。
  8. 前記電流値の変化、および、前記反射率の変化に基づく解析結果を取得する解析手段と、
    前記解析結果を出力させる解析結果出力手段と、
    を更に備えたことを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか一つに記載の基質抗原同時検出バイオセンサ。
  9. 基質抗原同時検出バイオセンサにおいて実行される基質抗原同時検出方法であって、
    酵素および抗体が固定されたポリピロールカルボン酸の膜を堆積させた作用電極上の前記膜における酵素反応に基づく、前記膜上での電流値の変化を検出する電流値検出ステップと、
    光源から前記作用電極への偏光子を介した光の照射による表面プラズモン共鳴法を用いて、前記膜における抗原抗体反応に基づく、前記作用電極により反射される光の反射率の変化を検出する反射率検出ステップと、
    を含むことを特徴とする、基質抗原同時検出方法。
  10. 基質抗原同時検出バイオセンサに実行させるためのプログラムであって、
    酵素および抗体が固定されたポリピロールカルボン酸の膜を堆積させた作用電極上の前記膜における酵素反応に基づく、前記膜上での電流値の変化を検出する電流値検出ステップと、
    光源から前記作用電極への偏光子を介した光の照射による表面プラズモン共鳴法を用いて、前記膜における抗原抗体反応に基づく、前記作用電極により反射される光の反射率の変化を検出する反射率検出ステップと、
    を実行させるためのプログラム。
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