JP5855246B2

JP5855246B2 - 校正不要分析による活性濃度の決定方法

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Publication number: JP5855246B2
Application number: JP2014518495A
Authority: JP
Inventors: カールソン，ロバート; ルース，ホーカン
Original assignee: GE Healthcare Bio Sciences AB; Amersham Bioscience AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 2011-06-30
Filing date: 2012-06-27
Publication date: 2016-02-09
Anticipated expiration: 2032-06-27
Also published as: CN103620410A; WO2013002717A1; EP2726876A1; CN103620410B; US20140141529A1; JP2014521062A; EP2726876B1; EP2726876A4

Description

本発明はタンパク質のような生物検体の濃度の決定に関し、さらに詳しくは生物検体の活性濃度の決定に関する。

タンパク質及び他の生体分子の濃度を決定するためには数多くの方法が存在しているが、かかる方法の大部分は試料と標準調製物との比較を必要とする。しかし、多くの場合、標準品が入手できないか、或いは標準品の活性が不確実である。

多くの機会に、機能的に不活性な分子を含むことがある総濃度ではなく、生物検体の活性濃度を知ることも重要となる。これは、例えば、バイオ治療薬の開発及び生産の場合に言える。しかし、タンパク質濃度を測定するための確立された方法の多くは、活性分子と不活性分子とを区別しない。

このように、例えばタンパク質の総濃度は通例、活性分子と不活性分子とを区別しないＵＶ又はＮＩＲ吸収分光分析によって測定される一方、生体分子の活性濃度はバイオセンサー技術によって簡便に測定できる。それによれば、生体分子を含む試料を特異的なリガンドが固定化されたセンサー表面に接触させ、その表面における会合／解離プロセスをモニターする。この場合、測定される活性を定義するのはリガンドの選択である。

通常、活性濃度は校正曲線を用いて測定される。しかし、バイオセンサー技術を用いて活性濃度の決定を実施する際には、検体の拡散性と検体濃度との関係を使用することで、校正標準への参照なしに検体濃度を決定することができる。したがって、検体の拡散係数を知れば検体濃度を計算できる。検討中の検体に対して満足すべき校正物質が入手できない場合に有用であり得るこのタイプの濃度測定は、通常は校正不要濃度分析（ＣＦＣＡ）といわれ、観察される結合速度がセンサー表面への検体分子の輸送によって部分的又は完全に制限される（即ち、拡散によって部分的又は完全に制御される）条件下において様々な流量で検体結合を測定することに基づいている。

表面プラズモン共鳴検出を用いて、ＣＦＣＡは最初にＫａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．，ｅｔａｌ．（１９９３），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１６６（１）：７５−８によって記載され、さらにＳｉｇｍｕｎｄｓｓｏｎ，Ｋ．，ｅｔａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４１（２６）：８２６３−７６によって記載された。この方法論は、（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社（ウプサラ、スウェーデン）から市販されている）商業的なＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムにおいて実行されてきた。

Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器では、試料はマイクロフローシステムに注入され、層流によってセンサー表面に輸送される。分子は拡散制御輸送プロセスによってバルク溶液からセンサー表面に到達する。輸送速度に影響する要因としては、検体分子の濃度に加えて、拡散係数、フローセル寸法及び流量がある。輸送速度と結合速度とのバランスにより、観察される結合が輸送制限されるか又は反応制限されるかが決定される。ＣＦＣＡの成功のためには、観察される結合速度は上述のように少なくとも部分的には輸送によって制限されなければならない。

部分的又は完全な輸送制限下での校正不要濃度分析のための上記方法の改良を提供することが本発明の目的である。

国際公開第２０１１／０４９５３０号パンフレット

上述の目的並びに他の目的及び利点は、上記に概述したＣＦＣＡ方法に基づく活性濃度の決定方法であるが、複数の試料希釈度で測定が行われ、いくつか（又は全部）の希釈度がグローバルフィット中に含まれ、いくつかの希釈度に同じ当てはめ基準が適用されるような方法によって達成される。これは分析をより頑強にし、ダイナミックレンジを拡大する。

したがって一態様では、本発明は、液体試料中の検体の活性濃度を決定する方法であって、
（ａ）検体と特異的に結合し得るリガンドを支持する固相表面又は表面領域に、試料の層流を２以上の異なる流量及び部分的又は完全な物質輸送制限条件下で接触させる段階、
（ｂ）リガンド支持表面又は表面領域におけるリガンドへの検体の初期結合速度ｄＲ／ｄｔを決定する段階、及び
（ｃ）段階（ｂ）で得られた初期結合速度データを、物質輸送に関する項を含む速度論的相互作用モデルに当てはめて活性検体濃度を得る段階
を含んでなり、
段階（ａ）及び（ｂ）は液体試料の複数の異なる希釈度で実施され、
段階（ｃ）では、液体試料の複数の希釈度の少なくともいくつかが速度論的相互作用モデルに対する初期結合速度データのグローバルフィット中に含まれる方法を提供する。

好ましい実施形態では、本方法は２つの実質的に異なる流量で実施される。

別の好ましい実施形態では、異なる流量が、単一の接触（例えば、注入）サイクル中に流量を変化させることによって得られる。

さらに別の好ましい実施形態では、３以上、好ましくは５以上の異なる試料希釈度が使用される。

なお一層別の好ましい実施形態では、本方法はさらに、それぞれに異なるリガンド密度を有する複数の固体表面又は表面領域に試料の層流を接触させ、初期結合速度から表面又は表面領域における輸送制限相互作用に対応する初期結合速度を決定し、その結合速度から活性検体濃度を決定することによって活性濃度を決定することを含んでいる。

他の好ましい実施形態は従属請求項に記載されている。

本発明の方法は、コンピューターのような電気的データ処理装置上で動作するソフトウェアによって簡便に実行できる。かかるソフトウェアは、記録媒体、読出し専用メモリ、或いは電気ケーブル若しくは光ケーブルを介して又は無線通信若しくは他の手段によって伝送し得る電気信号又は光学信号を含む任意適宜のコンピューター読取り可能な媒体に載せてコンピューターに提供できる。

したがって、本発明の別の態様は、上述した方法態様の方法段階をコンピューターに実施させるための命令を含むコンピュータープログラムに関する。

本発明のより完全な理解、並びにそのさらなる特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び添付の図面を参照することによって得られよう。

図１は、通常のＣＦＣＡにおいて２つの異なる流量に関して当てはめた結合対時間データのプロットである。図２は、同時に分析された複数の濃度においてグローバルに当てはめた結合対時間データのプロットである。

特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。また、単数形は特に断らない限り複数の場合も含めて意味する。

上述の通り、本発明は、流体試料中の検体（通例は生物検体）の活性濃度の決定に関する。簡単に述べれば、本方法は、濃度を決定すべき検体を含む液体試料の複数の希釈度に関して少なくとも部分的な輸送制限下で校正不要濃度分析を実施することを含んでなり、いくつか又は全部の希釈度を濃度データのグローバルフィット中に含め、いくつかの希釈度に同じ当てはめ基準が適用されるものである。

好ましくは、活性濃度決定に際して相互作用分析センサー（通例はバイオセンサー）が使用される。

本発明を一層詳しく説明する前に、バイオセンサーの概念及び相互作用速度論の検出を簡単に説明しよう。

バイオセンサーは通例標識を使わない技術に基づき、固定化された層の質量、屈折率又は厚さのようなセンサー表面の性質の変化を検出する。本発明の目的のための典型的なバイオセンサーはセンサー表面における質量検出に基づいており、特に光学的方法及び圧電又は音波方法を含んでいる。光学的検出方法に基づく代表的なセンサーには、質量表面濃度を検出するもの、例えば反射光学的方法に基づくセンサー、例えば、エバネッセント波に基づくセンサー（例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサー）、フラストレーテッド全反射（ＦＴＲ）センサー及び導波管センサー（例えば、反射干渉分光法（ＲＩｆＳ）センサー）がある。圧電及び音波センサーには、表面音波（ＳＡＷ）及び水晶マイクロバランス（ＱＣＭ）センサーがある。

ＳＰＲ及びその他の検出技法に基づくバイオセンサーシステムは商業的に入手可能である。例示的なかかるＳＰＲバイオセンサーには、フロースルーセルに基づくＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ、スウェーデン）及びＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲシステム（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州）があり、これらは試料中の分子と検知表面に固定化された分子構造との相互作用を検出するために表面プラズモン共鳴を使用している。試料がセンサー表面を通過する際、結合の進行は相互作用が起こる速度を直接反映する。通常、試料の注入後に緩衝液流が続き、その間には検出器の応答は表面上の複合体の解離速度を反映する。システムからの典型的な出力は、会合相部分と解離相部分を含む分子相互作用の経時的進行を記述するグラフ又は曲線である。通常、コンピュータースクリーン上に表示されるこの結合曲線は「センサーグラム」といわれることが多い。

したがって、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムを用いれば、標識化を使用せずに、また多くの場合に関連する物質を精製することなく、試料中の特定の分子又は検体の存在及び濃度ばかりでなく、分子相互作用における会合（結合）と解離の速度論的速度定数及び表面相互作用に対する親和性を含む追加の相互作用パラメーターもリアルタイムで決定することが可能である。

以下、限定ではなく例示のみのため、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム型のＳＰＲセンサーに関して本発明を詳細に説明する。

上述の通り、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム並びに類似のセンサーシステムは、検体の総濃度と区別して活性検体濃度を測定する。測定される活性の種類を定義するのはセンサー表面上のリガンドの選択である。

例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム型の層流システムに、検体をセンサー表面に接触するようにして注入した場合、それは結合イベントを引き起こす。検体／リガンド相互作用の速度は、相互作用速度論及びフローシステムの輸送効率によって決定される。

生化学的相互作用に関しては、相互作用が進行する速度は順方向（会合）プロセスと逆方向（解離）プロセスとの差によって与えられる。検体Ａと表面結合（固定化）捕獲分子又はリガンドＢとの間の可逆的１：１相互作用に関しては、それは拡散又は物質移動によって制限されない。

式中、ｋ_a及びｋ_dはそれぞれ会合及び解離に関する速度定数である。

会合速度はｋ_a[Ａ][Ｂ]によって与えられ、解離速度はｋ_d[ＡＢ]によって与えられる。したがって、正味結合速度（即ち、生成複合体Ｂの表面濃度の変化）は次のようになる。

時間ｔの後、表面における非結合リガンドＢの濃度は[Ｂ_T]−[ＡＢ]である。ここで、[Ｂ_T]はリガンドＢの総濃度又は最大濃度である。上記式（２）に挿入すれば、次の式が得られる。

検出器の応答単位（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムでは、複合体の生成は共鳴単位（ＲＵ）で測定される応答の増加として観察される。）を用いれば、これは次のように表すことができる。

式中、Ｒは応答単位で表された応答であり、Ｃは試料中の検体の濃度であり、Ｒ_maxは検体（Ａ）が表面上の全てのリガンド（Ｂ）に結合した場合に得られる応答（即ち、最大検体結合容量）である。

速度論的速度定数ｋ_a及びｋ_dは、通例、好ましくは複数の異なる検体濃度及びやはり好ましくはセンサー表面における１以上の他のリガンド密度に関する応答データを上記式（４）又は次のようなその積分形式に当てはめることによって計算される。

速度論的データ及び親和性データの分析のためのソフトウェアは商業的に入手可能である。したがって、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器によって生成された速度論的データ及び親和性データの評価は、通常、（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社（ウプサラ、スウェーデン）から供給される）専用のＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアにより、数値積分を用いて微分速度方程式を計算すると共に、非線形回帰を用いて、平方残差の和を最小に減少させる最も密接な当てはめを与える変数の値を見出すことによって速度論的パラメーター及び親和性パラメーターを当てはめることで実施される。「残差」とは各点における計算曲線と実験曲線との差であり、実験曲線の上方又は下方に偏差を等しく重み付けするために平方残差が使用される。平方残差の和は次の式によって表される。

式中、Ｓは平方残差の和であり、ｒ_fは所定の点における当てはめ値であり、ｒ_xは同じ点における実験値である。例えば、上記の分子相互作用に関しては、かかるソフトウェア支援データ分析が、バックグラウンドノイズの減算後に、上記の式（４）又は（５）によって表されるような上述の単純な１：１結合モデルを測定データに当てはめる試みを行うことで実施される。

通常、結合モデルは、異なる検体濃度Ｃを用いて（及び／又は異なるレベルの表面誘導体化Ｒ_maxを用いて）得られた複数の結合曲線に同時に当てはめられる。これは「グローバルフィッティング」といわれ、センサーグラムデータに基づき、かかるグローバルフィッティングは単一のグローバルｋ_a又はｋ_dが全てのデータに良好な当てはめを提供するか否かを確認する。

しかし、上記のことは、拡散又は物質移動によって制限されない反応についてのみ有効である。

したがって、センサー表面に結合すべき検体に関しては、分子をバルク溶液からセンサー表面に輸送しなければならないが、これは拡散制限プロセスである。Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）及び類似のバイオセンサーシステムに適用される層流条件下では、輸送速度はバルク溶液中の検体の濃度に比例する。

所定の分析状況では、任意の時点で観察される結合速度は、正味の生化学的相互作用速度及び物質輸送速度の相対的大きさによって決定される。相互作用が輸送よりずっと速ければ、観察される結合はもっぱら輸送プロセスによって制限される。このことはまた、検体が解離中に表面から十分に速く拡散せずに再結合を引き起こす場合にも言える。逆に、輸送が速くて相互作用が遅ければ、観察される結合は相互作用速度論のみを表す。２つのプロセスの速度が同程度の大きさである場合、結合は２つの速度特性の組合せによって決定される。

全体的な相互作用プロセスは、次のスキームによって表すことができる。

バルク溶液から表面への物質輸送速度は次の式によって与えられる。

式中、Ａ_surfaceはセンサー表面における検体濃度であり、Ａ_bulkはバルク溶液中の検体濃度であり、ｋ_mは物質輸送係数である。

したがって、結合相互作用を記述する微分方程式は、上記式（８）に対応した、表面への検体の物質移動に関する項を含んでいる。フローセルに関しては、１組の対になった常微分方程式からなりかつ例えばＭｙｓｚｋａ，Ｄ．Ｇ．ｅｔａｌ（１９９８）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７５，５８３−５９４に記載されている「２コンパートメント」モデルが、データが物質輸送によって影響される場合に結合速度論の合理的な説明を与えるものと考えられる。このモデルでは、フローセルは２つのコンパートメントに分けられると仮定され、一方では検体の濃度が一定であり、センサー表面に近い第２のものでは検体濃度が物質輸送速度、リガンドの表面密度及び反応速度定数に依存する。

固定化一価リガンドＢと反応する一価検体Ａの上記に例示された相互作用に関しては、このモデルは、上記式（３）に代えて以下の２つの微分方程式で表すことができる。

式中、ｋ_mは（コンパートメント間の検体の拡散的移動を記述する）物質輸送係数であり、Ｂ_Tは総リガンド濃度であり、Ａ_surfaceはセンサー表面における遊離検体の濃度であり、Ａ_bulkは注入（即ち、初期）検体濃度であり、ＡＢは複合体ＡＢの濃度（＝結合検体の表面密度）であり、ｋ_a及びｋ_dはそれぞれ会合速度定数及び解離速度定数である。

下記に一層詳しく説明されるように、物質輸送係数ｋ_mは計算することができ、応答データを式（９）及び（１０）に当てはめることで速度論的速度定数ｋ_a及びｋ_dが得られる。

上記に略述した速度論的特性決定は、従来、各試料濃度を独立のサイクルで流し、各サイクル間には表面の再生によって検体を除去する十分に確立された方法を用いて実施されてきた。しかし、「単一サイクル分析」といわれる最近開発されたアプローチでは、検体が単一のサイクルにおいて増加する濃度（又は他のやり方で変化する濃度）で注入され、表面は注入間に再生されない。かかる単一サイクル分析の一層詳しい説明については、Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．，ｅｔａｌ．（２００６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４９：１３６−１４７（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）を参照されたい。

上述した物質輸送係数ｋ_mに関しては、次の式が適用される。

式中、Ｄは検体の拡散係数（ｍ²／ｓ）であり、Ｆはフローセルを通る液体の体積流量（ｍ³／ｓ）であり、ｈ、Ｗ及びｌはフローセルの寸法（高さ、幅及び長さ（ｍ））である。

拡散係数Ｄは、分子の大きさ及び形状並びに当該溶媒の粘度によって与えられる摩擦抵抗の関数である。球状分子の場合、拡散係数は半径に反比例し、したがって分子量の立方根に比例する。しかし、タンパク質のような非常に大きい溶質分子の場合、拡散係数は分子量に対して比較的鈍感である。

拡散係数に関して文献値が存在しなければ、例えば分析超遠心又は光散乱によってそれを実験的に決定できる。別法として、拡散係数は次の式に従って分子量及び形状係数又は摩擦速度から推定できる。

式中、Ｄは拡散係数（ｍ²／ｓ）であり、Ｍは分子量（ダルトン）であり、ｆは摩擦比であり、η_relは２０℃の水と比較した溶媒の粘度である。

したがって、式（９）及び（１０）から、物質輸送係数ｋ_mを計算できる。

Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムに関しては、検体の分子量について調整し、（ＲＵで）測定された応答を濃度単位に変換することで、Ｂｉａｃｏｒｅ固有の物質移動定数ｋ_tを求めることができる。

ここで、変換定数１０⁹は近似値であって、タンパク質検体及び特定のセンサー表面ＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐＣＭ５（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ、スウェーデン）についてのみ有効である。他の検体／センサー表面に関しては、ＲＵ変換係数によるシステムの校正が必要となる（１ＲＵは×ｎｇ／ｍｍ²に等しい）。

検体の拡散性との関係を部分的な拡散制御条件下での結合速度の分析と共に用いて校正不要濃度測定結果を評価するためには、拡散係数から物質輸送係数を計算し、次いで物質輸送定数ｋ_tに変換し、これを用いて実験データを拡散制御相互作用モデルに当てはめ、それによって試料の検体濃度を求めることができる。

さらに詳しくは、校正不要濃度アッセイ（ＣＦＣＡ）に際しては、ＳＰＲ検出技術を用いるＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムの場合、検体（例えばタンパク質）を含む液体試料を複数の流量で固定化リガンドに沿って流し、各試行の初期結合速度（ｄＲ／ｄｔ）を決定する。次いで、通例は専用のソフトウェアにより、検体濃度に関してグローバル変数を有するモデルに結合データを当てはめることで検体濃度Ｃを評価する。即ち、当てはめるべきパラメーターとしての検体濃度及び既知定数としてのｋ_mを分子量Ｍｗと共に設定することで、モデルは同時に全ての結合曲線の最良当てはめを行う単一の濃度値を見出すように強制される。

通常、幅広く離れていれば、好ましくは使用するシステムが許す限り幅広く離れていれば、２つの流量を使用するだけで十分である。

このように、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムにおける技術の現行の実施では、検体を固定化リガンドに結合させる２つの結合実験が必要とされる。１つの実験は低い流量（多くは５又は１０μｌ／分）で行われ、１つの実験は高い流量（多くは１００μｌ／分）で行われる。分析に際しては、応答を輸送（拡散）制限挙動に関してチェックし、輸送係数が一定である速度論的モデルに応答を当てはめて検体の濃度を当てはめる。（詳細に関しては、２８−９７６８−７８８ＡＢｉａｃｏｒｅＴ２００ＳｏｆｔｗａｒｅＨａｎｄｂｏｏｋ［ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ、スウェーデン］（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）を参照されたい。）
一般に、結合速度は試料注入の開始から直ぐに測定すべきである。これは、結合が定常状態に近づくに従って速度はゼロに近づくからである。

通常必要とされる高い結合容量を得るため、校正不要アッセイは通常は直接結合方式で構成される。

本発明
典型的なＣＦＣＡ実験では、試料の複数の希釈度を分析して別々に評価する。本発明に従えば、いくつか（例えば３以上）又は全部の希釈度を濃度データのグローバルフィット中に含め、試料のいくつかの希釈度に同じ当てはめ基準が適用されるようにすることで、より頑強な分析及び拡大したダイナミックレンジを有する分析が得られる。これはまた、他の濃度値を用いて同一又は同様な品質のグローバル分析を得ることができるか否かを判定することが可能になるので、結果の感度分析も容易にする。

Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を用いて本発明の方法をどのように実施し得るかの例示として、専用のＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで使用されるスクリプト言語は例えば以下のようであり得る。

全応答は複合体生成及び屈折率変化ＡＢ＋＄１＊ＲＩから生じる。

短縮式は次のように定義される。

＄１−注入が行われる場合、＄１式はｔｏｎ１とｔｏｆｆ１との間の注入中には１に等しく、それ以外では０に等しい。
＄１＝（ｓｉｇｎ（ｔ−ｔｏｎ１）−ｓｉｇｎ（ｔ−ｔｏｆｆ１））／２；
＄２はセンサー表面への検体の輸送を記述する。ｋｔは１μｌ／分での輸送係数に対応する。Ｆ１は流量である。Ｃｏｎｃは試料の原液濃度である。Ｄｉｌは実際の試料中における濃度を与える希釈率である。Ａはセンサー表面における検体の濃度である。
＄２＝Ｆ１＾（１／３）＊ｋｔ＊（Ｃｏｎｃ／Ｄｉｌ＊＄１−Ａ）；
＄３は速度方程式そのものである。
＄３＝ｋａ＊Ａ＊Ｂ−ｋｄ＊ＡＢ；
Ａは、検体濃度が経時的にどうのように変化するかを記述する。出発値は０である。
Ａ＝＄２−＄３｜０；
Ｂは、リガンド濃度が経時的にどうのように変化するかを記述する。出発値はＲｍａｘである。
Ｂ＝−＄３｜Ｒｍａｘ；
ＡＢはいかにして複合体が生成されるかを示す。
ＡＢ＝＄３｜０；
ｋｔ、Ｆ１、Ｄｉｌ、ｔｏｎ１、ｔｏｆｆ１は定数である；
ｋａ、ｋｄ、Ｒｍａｘはグローバルに当てはめられる（複数のリガンド濃度を使用する場合、Ｒｍａｘはサブグループに対してローカル／グローバルに当てはめることができる）；
Ｃはグローバルに当てはめられる。

「グローバルデータ」を用いれば、当てはめの感度分析を実施することが可能になる。これは、速度論的分析におけるＵ値分析と同様であり得る。

これは、例えば、決定されたＣｏｎｃ値（例えば、１００ｎＭ）を取り、次いで定数として入力される変化したＣｏｎｃ（例えば、８０ｎＭ）を用いてデータを再当てはめし、前回と同じ浮動パラメーターを用いてデータを再当てはめすることによって行うことができる。顕著な変化が起こった場合、コンピュータールーチンはオーバーレイプロット、残差又はカイ２及びハイライトを表示することができる。

同様に、単一サイクルモードでのＣＦＣＡは次のようになる。
ＡＢ＋ｏｆｆｓｅｔ＊＄２；
＄１＝（ｓｉｇｎ（ｔ−ｔｏｎ１）−ｓｉｇｎ（ｔ−ｔｏｎｏｆｆ））／２；
＄２＝（ｓｉｇｎ（ｔ−ｔｏｎｏｆｆ）−ｓｉｇｎ（ｔ−ｔｏｆｆ２））／２；
＄３＝ｋｔ１＊＄１＊（Ｃｏｎｃ−Ａ）＋ｋｔ２＊＄２＊（Ｃｏｎｃ−Ａ）；
＄４＝ｋａ＊Ａ＊Ｂ−ｋｄ＊ＡＢ；
Ａ＝＄３−＄４｜０；
Ｂ＝−＄４｜Ｒｍａｘ；
ＡＢ＝＄４｜０。

本発明の方法では、異なる流量の各々について試料注入を行うことができるものの、１回の試料注入中に流量を変化させる上述の「単一サイクル」アプローチにより、２以上のサイクルで試料を注入する必要性を解消することができる。例えば、試料を１０μｌ／分で注入し、５〜２０秒後に流量を１００μｌ／分に増加させることができる。データ分析に際しては、これは使用する評価アルゴリズム中に実際の流量を入力することによって処理される。

本発明の方法は、任意には、変化するリガンド密度を有するセンサー表面又は表面領域（即ち、異なるリガンド密度のアレイ）を使用すると共に、最大初期結合速度及びそれによって活性濃度を決定するための当てはめアルゴリズムを備えた新たに開発される校正不要濃度分析方法と組み合わせることができる。

本願と同日に提出された、“Ｍｅｔｈｏｄｏｆｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇａｃｔｉｖｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ”と称する我々の同時係属特許出願（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）中に記載されているこの方法は、システムの輸送効率によって完全に制限される反応について適用される次の式を使用することに基づいている。

式中、Ｒは検出器応答であり、ｋ_mは物質輸送係数であり、Ｃは試料の検体濃度である。即ち、センサー表面における応答増加ｄＲ／ｄｔ又は結合速度は物質輸送係数及び検体の活性濃度な比例する。式（１４）から、完全な輸送制限時の（初期）結合速度ｄＲ／ｄｔ及びｋ_mを知れば、ｄＲ／ｄｔをｋ_mで割ることで検体濃度Ｃを計算できることがわかる。

さらに詳しくは、その方法では、複数（好ましくは４以上）の異なるリガンド密度レベル（即ち、固定化レベル）で初期結合速度を測定する。各固定化レベルについて、１以上の固定流量を用いて応答を記録する。初期結合速度を固定化レベル又は最大結合容量Ｒ_maxに対してプロットし、通例はそれが可能なアルゴリズムを用いてデータを外挿することて、ｄＲ／ｄｔがその最大値に達した結合速度を決定する。この最大結合速度は物質輸送制限時の結合速度に対応し、これは上記の式（１４）が適用され、したがってｄＲ／ｄｔをｋ_mで割ることで活性濃度Ｃを計算できることを意味する。

このように、かかる組合せ分析は、（本発明の方法に従った）部分的な輸送制限下での分析及び（上記に略述したような）完全な輸送制限への外挿の両方を考慮しており、したがってより頑強になる可能性を有する。

異なるリガンド密度を有する表面又は表面領域への試料の接触は、単一のセンサー表面を有する分析機器において、順次の試料注入及び注入間でのリガンド密度の変化によって実施できる。しかし好ましくは、本方法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００、Ｔ２００又は４０００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウブサラ、スウェーデン）或いはＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲシステム（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州）のようなマルチフローチャンネル機器を用いて、好ましくは並行試料注入によって実施される。

校正不要方式で活性濃度を決定する有利な方法では、複数の異なる試料希釈度に関し、部分的又は完全な輸送制限時に異なる固定化レベル及び異なる流量で（初期）結合速度データを収集する。次いで、複数の代替手段に従って得られた結合速度データを評価する選択の自由がある。即ち、かかる代替手段としては、（ｉ）部分的な輸送制限下での、試料の複数の希釈度に関するデータのグローバルフィッティングによる分析、（ii）完全な輸送制限への外挿、又は（iii）（ｉ）と（ii）との組合せがある。

次に、以下の非限定的な実施例によって本発明をさらに例示する。

実施例１
ＣＦＣＡデータのグローバルフィット
例えば一部変更したＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００システムを用いる本発明の方法によって活性濃度を決定するための手順は、次のようにして実施できる。

ここに記載する実験では、抗体を結合し得る固定化プロテインＡ誘導体に対する抗体結合が実証される。通常のＣＦＣＡ分析を図１に示す。

検体を別々のサイクルにおいて様々な流量で注入した。この場合、検体は原液濃度に対して４００倍に希釈した。ＣＦＣＡ分析は１９．１ｎＭの局所抗体濃度を与え、したがって原液は７．６μＭである。

しかし、多くの場合、試料の複数の希釈度を試験するのが有用であり、分析は長々しくなる。データのグローバルフィットに頼ることで、図２に示すように複数の濃度が同時に分析される。

このグラフは、抗体希釈度１：４００、１：１２００、１：３６００及び１：１０８００のグローバルフィットを示している。各希釈液が２つの流量で注入され、原液に関してグローバルに決定された濃度は７．６μＭである。これは直ちに、濃度分析が希釈度に依存せず、分析を簡略化することを証明している。

本発明は上記の好ましい実施形態に限定されない。様々な代替例、修正例及び同等物を使用し得る。したがって、上記実施形態は添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の技術範囲を限定するものと解すべきでない。

Claims

液体試料中の検体の活性濃度を決定する方法であって、
（ａ）検体と特異的に結合し得るリガンドを支持する固相表面又は表面領域に、試料の層流を２以上の異なる流量及び部分的又は完全な物質輸送制限条件下で接触させる段階、
（ｂ）リガンド支持表面又は表面領域におけるリガンドへの検体の初期結合速度ｄＲ／ｄｔを決定する段階、及び
（ｃ）段階（ｂ）で得られた初期結合速度データを、物質輸送に関する項を含む速度論的相互作用モデルに当てはめて活性検体濃度を得る段階
を含んでなり、
段階（ａ）及び（ｂ）は液体試料の複数の異なる希釈度で実施され、
段階（ｃ）では、液体試料の複数の希釈度の少なくともいくつかが速度論的相互作用モデルに対する初期結合速度データのグローバルフィット中に含まれる、方法。
当該方法が２つの実質的に異なる流量で実施される、請求項１記載の方法。
異なる流量が、単一の接触サイクル中に流量を変化させることによって得られる、請求項１又は請求項２記載の方法。
３以上、好ましくは５以上の異なる試料希釈度が使用される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
さらに、それぞれに異なるリガンド密度を有する複数の固体表面又は表面領域に試料の層流を接触させる段階、初期結合速度から表面又は表面領域における輸送制限相互作用に対応する初期結合速度を決定する段階、及びその結合速度から活性検体濃度を決定する段階を含む、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
相互作用分析センサー、好ましくはバイオセンサーが使用される、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
相互作用分析センサーが質量検知、好ましくはエバネッセント波検知、特に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づいている、請求項６記載の方法。
コンピューターで実行される、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法段階をコンピューターに実施させるための命令を含むコンピュータープログラム。