CN102667448B

CN102667448B - 用于相互作用分析的方法和系统

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Publication number: CN102667448B
Application number: CN201080053950.0A
Authority: CN
Inventors: O.卡尔森
Original assignee: GE Healthcare Bio Sciences AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 2009-11-30
Filing date: 2010-11-29
Publication date: 2015-02-04
Anticipated expiration: 2030-11-29
Also published as: EP2507618B1; US10545090B2; EP2507618A4; CN102667448A; US20120244637A1; JP5683606B2; JP2013512457A; WO2011065912A1; DK2507618T3; EP2507618A1

Abstract

一种使用生物传感器来确定分析物与配位体之间的相互作用的一个或多个相互作用参数的方法，方法包括如下步骤：A：提供将配位体与之固定化的传感器表面，B：将传感器表面与控制分析物接触，C：根据控制分析物至配位体的结合位点的结合登记传感器响应，D：确定控制分析物与配位体之间的相互作用的控制饱和响应(R_maxC)，E：使用分析物与控制分析物的相对摩尔响应贡献将控制饱和响应(R_maxC)转换到分析物饱和响应(R_maxA)。F：将传感器表面与包含不同浓度的分析物的一个或多个样本接触，G：根据分析物至结合位点的结合登记传感器响应，以及H：使用分析物饱和响应(R_maxA)将登记的传感器响应拟合到预定相互作用模型以确定相互作用参数。

Description

用于相互作用分析的方法和系统

技术领域

本发明涉及分析感测表面处的分子结合相互作用的方法，并且更具体地说，涉及使用生物传感器来确定分析物与配位体之间的相互作用的一个或多个相互作用参数的方法。

背景技术

能够实时地监视分子(例如，生物分子)之间的相互作用的分析传感器系统正得到渐增的关注。这些系统往往基于光学生物传感器，且常常称为相互作用分析传感器或生物特定相互作用分析传感器。代表性的此类生物传感器系统是Biacore AB(乌普萨拉，瑞典)销售的BIACORE?仪器，其使用表面等离子共振(SPR)来检测样本中的分子与感测表面上固定化的分子结构之间的相互作用。随着样本在传感器表面上方通过，结合的进度直接地反映相互作用发生的速率。在注入样本之后是缓冲液流，在此期间检测器响应反映表面上的复合物离解的速率。来自BIACORE?系统的典型输出是描述分子相互作用随时间的进度、包括缔合阶段部分和离解阶段部分的曲线图或曲线。常常在计算机屏幕上显示的此结合曲线往往称为“传感器谱图(sensorgram)”。

因此，利用BIACORE?系统(和模拟传感器系统)，在未使用标记以及往往没有对所包含的物质进行纯化的情况下，不仅可能实时地确定样本中具体分子(分析物)的存在和浓度，而且可能实时地确定附加相互作用参数，包括分子相互作用中结合(缔合)和离解的动力学速率常数以及表面相互作用的亲和度。缔合速率常数(k_a)和离解速率常数(k_d)可以通过将对多种不同样本分析物浓度得到的结果动力学数据拟合到微分方程形式的相互作用模型的数学描述来获得。可以由缔合速率常数和离解速率常数来计算亲和度(表示为亲和度常数K_A或离解常数K_D)。但是，许多时候，可能难以获得明确的动力学数据，并且因此往往通过平衡结合分析来测量亲和度更为可靠，这包括对一系列分析物浓度确定平衡或稳态处的结合水平，平衡或稳态假定处于或接近结合相互作用的缔合阶段的结束。为了确保结合曲线的缔合阶段确实可能已经达到稳态，往往预先确定在为用于亲和度测量预设的条件下已结合的分析物达到平衡的必要样本注入时间长度(即，与传感器芯片表面的样本接触时间)。因为达到平衡所花的时间和分析物离解所花的时间都主要通过离解速率常数来控制，所以还可以由离解常数估计近似注入时间。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新方法和生物传感器系统，用于使用生物传感器确定分析物与配位体之间的相互作用的一个或多个相互作用参数，该方法和生物传感器系统克服了现有技术的一个或多个缺点。这通过独立权利要求中定义的方法和生物传感器系统来实现。

本发明的方法的一个优点在于，它允许对低亲和度分析物进行改进且更可靠的相互作用参数的确定。

通过参考下文详细描述和附图将获得对本发明及其进一步特征和优点的更全面的理解。

附图说明

图1是基于SPR的生物传感器系统的侧视示意图。

图2是其中结合曲线具有可见的缔合阶段和离解阶段的代表性传感器谱图。

图3示出“正常”亲和度分析物曲线拟合的示例。

图4示出基于图3的数据点的较低范围的、“低”亲和度分析物曲线拟合的示例。

图5示出根据本发明的一个实施例的方法的示意框图。

图6示出如图4中的对应拟合。

图7a-7c示出具有多种水平的方法噪声的模拟数据集的拟合。

图8a-8b示出具有二次非常低亲和度(非特定)结合的模拟数据集的拟合。

图9示出注入之后具有抬高的基线的响应曲线的示例。

图10示出显示注入期间渐增的响应的响应曲线的示例。

具体实施方式

如上文提到的，本发明涉及评估第一物种与第二物种之间的分子结合相互作用的稳态结合数据以确定该相互作用的亲和度，其中使用第一与第三控制物种之间的结合相互作用的稳态结合数据来估计第一物种与第二物种之间的相互作用的最大响应R_max。通常，通过基于传感器的技术获得试验结合数据，该技术研究分子相互作用并实时地将结果呈示为相互作用进度。但是，在更详细地描述本发明之前，将描述预设要使用本发明于其中的一般上下文。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明相关领域中的技术人员所共识的相同的含义。再有，除非另外说明，否则单数形式“一”和“该”意味着包括复数个的引述。

本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考书目通过引用全部并入。

如上文提到的，本发明涉及由分子结合相互作用的多个数据集评估该相互作用的稳态结合数据以确定该相互作用的一个或多个相互作用参数，其中使用来自数据集的稳态结合数据以外的其他相互作用数据来估计该数据集的稳态结合数据的可靠性。通常，通过基于传感器的数据获得试验结合数据，该试验结合数据研究分子相互作用并实时地将结果呈示为相互作用进度。但是，在更详细地描述本发明之前，将描述预设要使用本发明于其中的一般上下文。

化学传感器或生物传感器通常基于非标记技术，检测传感器表面的属性的变化，例如质量、折射率或固定化层的厚度，但是也有传感器依赖于某种类型的标记。典型的传感器检测技术包括但不限于，质量检测方法，如光学，热光和压电或声波方法(包括，例如表面声波(SAW)和石英晶体微天平(QCM)方法)；以及电化学方法，如电位测量、电导测量、电流测量和电容/阻抗方法。就光检测方法来说，代表性的方法包括检测质量表面浓度的那些方法，如反射型光学方法，包括外部和内部反射型方法，它们是角度、波长、偏振或相位分辨的，例如瞬逝波椭圆偏振法和瞬逝波光谱法(EWS或内部反射型光谱法)，二者均可以包括经由表面等离子共振(SPR)的瞬逝场增强、布鲁斯特角折射仪、临界角测折射率法、受抑全反射(FTR)、散射的全内反射(STIR)(其可以包括散射增强标记)、光波导传感器；外部反射成像、基于瞬逝波的成像(如临界角分辨的成像)、布鲁斯特角分辨的成像、SPR角分辨的成像等。再者，可以提到“本身的”或与反射型方法组合的测光和成像/显微镜检查方法，其基于例如，表面增强的拉曼光谱法(SERS)、表面增强的谐振拉曼光谱法(SERRS)、瞬逝波荧光(TIRF)和磷光法，以及波导干涉仪、波导泄漏模光谱法、反射干涉光谱法(RIfS)、透射干涉测量法、全息光谱法和原子力显微镜检查法(AFR)。

可商业购得的生物传感器包括前文提到的Biacore AB(乌普萨拉，瑞典)销售的BIACORE?仪器，其基于表面等离子共振(SPR)并允许实时地监视结合的配位体与关注的分析物之间的表面结合相互作用。在此上下文中，“配位体”是对于给定分析物具有已知或未知亲和度的分子，且包括固定化在表面上的任何捕获或捕捉试剂，而“分析物”包括其任何特定结合的配对物。

虽然下文的详细描述和示例是在SPR光谱法以及更具体为BIACORE?系统的上下文中说明本发明的，但是要理解，本发明并不局限于此检测方法。更确切地，可以采用其中分析物结合到固定化在感测表面上的配位体的任何基于亲和度的检测方法，只要感测表面处的变化能够被测量，该变化是分析物到其上固定化的配位体的结合的量化指示即可。

SPR的现象是众所周知的，足以说当在某些条件下光在不同折射率的两种介质之间的介面反射时出现SPR，并且该介面涂覆以金属膜(通常为银或金)。在BIACORE?仪器中，该介质是样本和通过微流控流系统与样本接触的传感器芯片的玻璃。该金属膜是芯片表面上的薄金层。SPR导致特定反射角处反射的光的强度降低。最小反射光强度的此角度随靠近与反射光相反一侧(在BIACORE?系统中为样本侧)表面的折射率而变化。

图1中示出BIACORE?系统的示意图。传感器芯片1具有金膜2支撑捕获分子(配位体)3，例如抗体，捕获分子(配位体)3暴露于经由流通道5的含有分析物4(例如，抗原)的样本流。来自光源7(LED)的单色p-偏振光6通过棱镜8耦合到玻璃/金属介面9，在玻璃/金属介面9中光被完全反射。由光检测单元11(光检测器阵列)来检测反射光束10的强度。

BIACORE?仪器的技术方面以及SPR现象的详细论述可以参见美国专利号5,313,264。有关生物传感器感测表面的基质涂层的更详细信息在例如美国专利号5,242,828和5,436,161中给出。此外，与BIACORE?仪器结合使用的生物传感器芯片的技术方面的详细论述可以参见美国专利号5,492,840。

当样本中的分子结合到传感器芯片表面上的捕获分子时，表面处的浓度改变，并且由此表面处的折射率改变，并且检测到SPR响应。绘制相互作用过程期间响应对时间的曲线图将提供相互作用的进度的量化测量。此类绘图或动力学或结合曲线(结合等温线)常常称为传感器谱图，有时在本领域中也称为“亲和度轨迹”或“亲和度谱图(affinogram)”。在BIACORE?系统中，以共振单位表示SPR响应值。一个RU表示最小反射光强度的角度中0.0001°的变化，对于大多数蛋白质和其他生物分子，这对应于传感器表面上约1 pg/mm²的浓度变化。当包含分析物的样本接触传感器表面时，在称为“缔合”的步骤中，结合到传感器表面的捕获分子(配位体)与分析物相互作用。此步骤在传感器谱图上由样本最初接触到传感器表面时RU的增加指示。相反，“离解”通常发生在样本流被例如缓冲液流置换时。此步骤在传感器谱图上由分析物从表面结合的配位体离解时随时间推移RU下降来指示。

图2中呈示传感器芯片表面处可逆相互作用的代表性传感器谱图(结合曲线)，该感测表面具有固定化的捕获分子或配位体，例如抗体，其与样本中的结合配对物或分析物相互作用。生物传感器系统基于上文提到的其他检测原理产生的结合曲线将具有相似的外观。垂直轴(y轴)指示响应(此处以共振单位RU计)，而水平轴(x轴)指示时间(此处以秒计)。最初，缓冲液通过感测表面上方，这得到传感器谱图中的基线响应A。在样本注入期间，由于分析物的结合，观察到信号增加。结合曲线的此部分B常常称为“缔合阶段”。最后，处于或接近缔合阶段结束处达到稳态条件，其中共振信号在C处平稳(但是可能不总是达到此状态)。要注意，本文的术语“稳态”与术语“平衡”作为同义词来使用(在其他上下文中，术语“平衡”可能被保留来描述理想相互作用模型，因为实践中结合可以随时间推移而恒定，即使系统未处于平衡中)。在样本注入结束时，以持续的缓冲液流置换样本，信号的下降反映分析物从表面离解或释放。结合曲线的此部分D常常称为“离解阶段”。通过再生步骤结束此分析，在再生步骤中，在传感器表面上注入能够从表面移除结合的分析物的溶液，同时(理想地)保持配位体的活性。这在传感器谱图的部分E中指示。缓冲液的注入恢复基线A，并且现在表面已为新的分析准备就绪。

从缔合阶段B和离解阶段D的外形，分别获得有关结合和离解动力学的信息，并且C处的共振信号的高度表示亲和度(由相互作用得到的响应与表面上质量浓度的变化相关联)。下文将对此作更详细的解释。

表面结合速率

假定分析物A与表面结合(固定化)的捕获分子或配位体B之间的可逆反应，这不是扩散或质量转移受限的，并且遵循准一阶动力学：

此相互作用模型(常常称为Langmuir模型)，假定分析物(A)是单价且均质的，配位体(B)是均质的，并且所有结合事件是独立的，事实上此相互作用模型适用于绝大多数的情况。

分析物注入期间分析物A的表面浓度变化速率(=形成的复合物AB的浓度变化速率)是分析物A闭合和断开的速率之和：

其中[A]是分析物的浓度，[B]是配位体B的浓度，[AB]是反应复合物AB的浓度，k_a是缔合速率常数，以及k_d是离解速率常数。

在时间t之后，表面处未结合的配位体的浓度是[B_T]-[AB]，其中[B_T]是配位体B的总浓度或最大浓度。插入方程(1)得到：

根据检测器响应单位(检测AB)，可以将其表示为

其中R是时间t处以共振单位(RU)计的响应，C是溶液中的自由分析物(A)的初始浓度或总体浓度，而R_max是分析物(A)结合到表面上的所有配位体(B)的情况下得到的响应(以RU计)，也称为饱和响应。重新组织方程(3)得到：

其中R是以共振单位(RU)计的响应。在积分形式中，方程为：

。

k_a和k_d的计算

现在，根据方程(4)，如果将dR/dt对结合的分析物浓度R绘图，则斜率是-(k_aC + k_d)以及垂直截距是k_aCR_max。如果总体浓度C是已知的，且已确定饱和响应R_max(例如通过以过量分析物使表面饱和)，就能够计算缔合速率常数k_a和离解速率常数k_d。但是，更方便的方法是，优选地通过计算机程序拟合积分函数(5)或数值计算以及拟合微分方程(4)。

k_d还能以如下方式来确定。可以将离解的速率表示为：

以及以积分形式表示：

其中R₀是离解阶段开始处(当缓冲液冲洗表面开始时)的响应。

可以将方程(6)线性化为：

以及ln[R/R₀]对t的绘图将得到斜率= -k_d的直线。但是，更方便地，通过拟合指数速率方程(7)确定离解速率常数k_d。

为了获得可靠的动力学常数，常常对多个不同分析物浓度重复上述分析，并且适合的情况下，还对传感器表面处的至少一个其他配位体密度重复上述分析。

亲和度的计算

亲和度由缔合常数K_A = k_a/k_d，或离解常数(也称为平衡常数)K_D = k_d/k_a来表示。

作为备选方式，可以根据方程(3)来确定缔合常数K_A，其中平衡时dR/dt = 0，得到：

其中R_eq是平衡时的检测器响应。因为k_a/k_d = K_A，所以方程(9)中插入并重新组织得到：

。

如果在多个浓度处执行结合反应，则可以通过数据的非线性曲线拟合来获得K_A。作为备选，例如当动力学数据不可靠或缔合和离解太快而无法精确地测量时，可以将R_eq/C对R_eq绘图，这得到斜率 = -K_A(Scatchard图)。

重新组织方程(10)得到：

将K_A = 1/K_D插入到方程(11)得到：

常常，将方程(12)修改成：

其中“Offset”是因系统性折射率误差导致的平行基线移位的补偿系数。

可以通过引入位阻影响系数n来修改方程(11)和(12)，位阻影响系数n指定一个分析物分子平均阻塞多少个结合位点：

。

软件辅助的分析

用于分析动力学和亲和度数据的软件可从市场购得。因此，例如，对BIACORE?仪器产生的动力学和亲和度数据的评估常常利用专用的BIAevaluation软件(由瑞典乌普萨拉的Biacore AB提供)来执行，其使用数值积分来计算微分速率方程和非线性回归以通过找到给出最逼近的拟合的变量的值来拟合动力学和亲和度参数，从而将残差平方和减到最小。

利用BIAevaluation软件根据测得的稳态结合水平确定亲和度常数包括如下步骤：

(i)从传感器谱图上曲线的稳态区域中的报告点获取稳态结合水平(R_eq)；

(ii)创建R_eq对C的绘图，以及

(iii)将此绘图拟合到通用“稳态亲和度”拟合模型(例如，方程(13或14))以获得K_A/K_D和R_max。

本发明

正如上文提到的，当利用生物传感器(如Biacore仪器)通过稳态分析来确定相互作用参数(如亲和度以及缔合和离解常数)时，将一个浓度系列的分析物注入到固定化的配位体上以登记不同浓度下相互作用的稳态响应。此后，将这些响应拟合到预定的相互作用模型以确定相互作用参数。为了实现可靠的结果，分析物浓度应该分布在相对于相互作用曲线的合理宽的范围上。在现有技术中，一种建议是使用稀度序列，例如从2K_D下降到例如0.1K_D的分析物浓度来确保覆盖整个曲线，从而将拟合的参数中的不确定性减到最小。图3示出“正常”亲和度分析物曲线拟合的示例，其中这些数据点表示分析物浓度为0.03K_D - 16K_D的响应，其具有饱和响应R_max:的全局拟合；以及其中得到结果：K_D = 0.511 mM以及R_max = 57.4 RU。

但是，例如由于分析物可溶性等的限制，提供此类宽范围上的分析物浓度并非总是可行的。当确定结合基于片段的药物设计来工作中常见的低亲和度时，问题会加重。使用高分析物浓度还会增加与表面的二次(非特定)相互作用的概率，这将进一步使评估复杂化。在这些情况中，可能仅使用低浓度(<K_D)，使得可达到的最高响应远低于R_max以及最终登记的响应曲线将在绘图中仅显示小的曲率，二者均在拟合的参数，即K_D和R_max中引入不确定性。图4示出基于图3的数据点的较低范围的“低”亲和度分析物曲线拟合的示例，仅使用数据集中5个最低数据点。在本示例中，拟合得到K_D = 0.109 mM，R_max = 30.9 RU，从而当使用所有点时亲和度K_D和饱和响应R_max值均显著地与上述值偏离(与图3比较)。

因为饱和响应R_max是与表面(即，固定化的相互作用物)相关联而不是与分析物相关联的参数，所以已发现可以在单独的试验中使用适合的第二分析物(控制分析物)来确定此类分析物的饱和响应R_maxA。在调整控制分析物与样本分析物之间的相对响应(或分子量)中的差异之后，可以将称为R_maxC的控制分析物饱和响应值随后用作评估低浓度(相对于亲和度K_D)的分析物的试验时的常数。

根据本发明的一个实施例，如图5中示意方式示出的，提供一种使用生物传感器来确定分析物与配位体之间的相互作用的一个或多个相互作用参数的方法，该方法包括如下步骤：

A：提供将配位体与之固定化的传感器表面，图5引用号10，

B：将传感器表面与控制分析物接触，图5引用号20，

C：根据控制分析物至配位体的结合位点的结合登记传感器响应，图5引用号30，

D：确定控制分析物与配位体之间的相互作用的控制饱和响应(R_maxC)，图5引用号40

E：使用分析物与控制分析物的相对摩尔响应贡献将控制饱和响应(R_maxC)转换到分析物饱和响应(R_maxA)，图5引用号50

F：将传感器表面与包含不同浓度的分析物的一个或多个样本接触，图5引用号60，

G：根据分析物至结合位点的结合登记传感器响应，图5引用号70，以及

H：使用分析物饱和响应(R_maxA)将登记的传感器响应拟合到预定相互作用模型以确定相互作用参数，图5引用号80。

正如上文论述的，相互作用参数可以是表征配位体与分析物之间的相互作用的任何参数，如亲和度(例如，K_A或K_D)、动力学常数(例如，k_a或k_d)。可以使用上文举例说明的任何适合的生物传感器来执行该方法，并且相互作用参数指标，例如K_A、K_D、k_a或k_d可以是不同的，取决于生物传感器的领域。

提供具有与之固定化的配位体的传感器表面的步骤A包括将配位体固定化到所使用的具体生物传感器中的传感器表面的任何适合方式。固定化的配位体提供控制分析物和要查询的分析物的结合位点。在步骤B中，将适合的控制分析物与传感器表面接触。根据上文，控制分析物应该选为使得控制分析物与配位体之间的相互作用的控制饱和响应(R_maxC)能够容易地被确定。例如，控制分析物相对于亲和度K_D应该具有比要查询的分析物更高的可溶性。根据一个实施例，以使之能够占据传感器表面上配位体的所有结合位点的浓度提供控制分析物，以根据一个相互作用事件提供控制饱和响应(R_maxC)的直接确定。作为备选，以使得根据控制分析物与配位体之间的非稳态相互作用来确定控制饱和响应(R_maxC)成为可能的浓度范围来提供控制分析物。

在将控制饱和响应(R_maxC)转换到分析物饱和响应(R_maxA)的步骤E中，利用每个分析物的饱和响应(R_maxC)表示所有结合位点被占据时的响应的事实来实现该转换。使用相同的传感器表面来分别确定两种不同分析物(例如分析物S和T)的饱和响应(R_max)，理想情况下，这些饱和响应(R_maxS)和(R_maxT)分别表示相同数量的分子结合到传感器表面所产生的响应。因此，使用相同传感器表面登记的饱和响应(R_maxS)和(R_maxT)给出了这两种分析物的相对摩尔响应贡献。因此，假定两个分析物的相对摩尔响应贡献是已知的或能够估算的，则可以由一个分析物的饱和响应(R_max)计算另一个分析物的饱和响应(R_max)。根据本发明，使用此关系将控制饱和响应(R_maxC)转换到分析物饱和响应(R_maxA)。

正如上文提到的，有多种基于多种不同检测技术可获得的生物传感器，因此两个不同分析物的相对摩尔响应取决于所使用的生物传感器，但是原理仍是有效的。根据一个实施例，通过分析物与控制分析物之间的摩尔量比来逼近步骤E中分析物和控制分析物的相对摩尔响应贡献。对于直接或间接地登记结合到传感器表面的分子质量的任何生物传感器技术，此方法是有效的，或至少完美逼近(god approximation)。

根据一个实施例，控制分析物的离解速率足够高以达到在以无能够结合到传感器表面的分析物的样本(例如，缓冲液)置换控制分析物之后的合理时间框架内完全离解。作为备选，再生的步骤对于在分析物之间释放所有结合位点是必不可少的。根据一个实施例，对多个分析物重复步骤E至H，以便基于为每种分析物计算的饱和响应(R_maxA)确定多个分析物的每种的一个或多个相互作用参数，如图5中引用号90所示。为了检测和/或校正传感器表面随时间推移的可能退化，可以在对预定数量的分析物执行了步骤E至H之后重复步骤B至D，如图5中引用号100所示。

根据一个实施例，提供一种用于检测分子结合相互作用的分析系统，包括：

(i)生物传感器，其包括至少一个感测表面、用于检测至少一个感测表面处分子结合相互作用的检测部件以及用于产生表示结合曲线的检测数据的部件，其中每个曲线表示结合相互作用随时间推移的进度，以及

(ii)用于执行上文方法的步骤A至H的数据处理部件。

本发明还扩展到计算机程序，具体来说调适成用于实践本发明的方法的载体上或载体中的计算机程序。该载体可以是能够承载程序的任何实体或装置。例如，该载体可以包括如ROM、CD ROM、DVD或半导体ROM的存储介质或例如软盘或硬盘的磁记录介质。该载体还可以是可传输的载体，如可经由电缆或光缆或通过无线电或其他方式传送的电信号或光信号。作为备选，该载体可以是将程序嵌入其中的集成电路。能够存储适于与计算机系统一起使用的信息的已知或已开发的任何介质均可以使用。

图6示出图4中的对应拟合。这些数据点与图4中相同，但通过使用控制分析物的单独试验中确定的60 RU的常数R_max来拟合，从而K_D = 0.52 mM。图4和图6一起举例说明远间隔中的几个点的拟合可能给出误导的好拟合(图4)的情况，这导致误确定的参数。利用根据本发明的预先确定的控制饱和响应R_maxC，能够避免此情况，并且确定正确的亲和度(图6)。

其中示出这是用于精确地确定低亲和度，例如低至K_D = 0.5 mM或更低的强大方法。还示出当使用更少的数据点来进行评估时该方法的相对优势更大。

图7a-7c示出具有多种水平的方法噪声(1-6 RU)的模拟数据集的拟合，使用7、6或5个数据点。阴影线条表示与变化的R_max的拟合得到的K_D，以及白条表示与设为60 RU的R_max拟合得到的K_D，这是模拟值。模拟的亲和度是：K_D = 5 x 10^-4M。误差条表示三次重复内的+/- 1准则差。

进一步发现此方法可以用于利用如下方程拟合二次相互作用的数据集：

。

如果将预定的R_max1设为常数，则能够容易地确定适合的相互作用的亲和度(K_D1)。图8a和8b示出具有二次非常低亲和度(非特定)结合的模拟数据集的拟合。当模拟的对应R_max设为常数时，可以计算模拟的特定K_D = 1(K_D = 1.7 mM +/-0.45, n = 7)。模拟的方法噪声是2 RU或R_max的20%，这是相对较高的。

结合行为评估

根据本发明的一个实施例，提供一种评估登记的传感器响应对预定1:1结合相互作用模型的拟合质量以确定相互作用参数的方法，包括如下步骤：

I. 为每种分析物选择确定R_max的方法。可用的选项可以是例如，根据分析物的不同浓度下登记的传感器响应进行R_max的全局确定以及根据上面的方法使用控制分析物和关联的R_maxC进行R_maxA的确定；

J. 通过选自如下集合的一个或多个结合行为准则评估分析物-配位体相互作用的结合行为：

a)高登记的R

b)注入之后抬高的基线

c)注入期间渐增的响应

d)R_maxGlobal与R_maxA之间的比率；

K.基于步骤ii)中的评估，建议用于计算每种分析物的相互作用参数的结合模型。

根据一个实施例，结合行为准则a)是登记的最大响应是否超过分析物相互作用的预定值：“高R”的控制。此准则与响应是否超过为分析物相互作用计算的或测量的饱和响应值相关联。将R_max(或R_maxA)(按计量比1:1)与分析物的登记的最大响应比较。如果一种或多种分析物浓度的登记的响应R超过R_max + xRU，其中x是基于研究的特定相互作用、分析物浓度、传感器表面上的配位体密度等选择的值，根据具体相互作用，该值可以是例如1与500之间的任何适合的值(如10、50、100、200或400)，则将分析物分类为“高登记的R”(用作备选计量比的指示或附加聚合相互作用)，从而多位点模型应该可以提供更好的拟合。

根据一个实施例，结合行为标准准则b)是登记的响应是否超过分析物与传感器表面接触之后的预定值的控制。图9示出满足注入之后具有抬高的基线的这种类型的准则的响应曲线的示例。预定值可以是以RU为单位全局固定的值，如1至500 RU或其之间的任何值，取决于研究的相互作用。作为备选，该预定值可以是基于特定分析物的登记的响应或来自一定范围的分析物的平均值而确定的值。根据一个实施例，该预定值可以是3 RU。注入之后存在抬高的基线可以指示紧密的非典型结合(对于特定片段)或聚合，从而多位点模型应该提供更好的拟合。

根据一个实施例，结合行为准则c)是在分析物接触时间期间，登记的响应以超过预定速率的速率增加，如0.1至150 RU/s或其之间的任何值。图10示出显示注入期间渐增的响应的响应曲线的示例，以及可使用的预定速率的准则的一个示例，例如> 0.2 RU/ s。此类行为可以指示研究的相互作用以外发生的二次相互作用，从而多位点模型可以提供更好的拟合。

根据一个实施例，同时根据分析物的不同浓度下登记的传感器响应进行的全局确定(R_maxGlobal)以及根据上面的方法使用控制分析物和关联的R_maxC进行R_maxA的确定来计算饱和响应值R_max，而无论步骤I中选择哪种方法。此后，例如通过计算如下关系，作为结合行为准则d)，比较两个结果：n= R_maxGlobal / R_maxA以及其中n是作为有关一个或多个预定限制的结合行为的指标来评估的。根据一个实施例，该限制选为：

n < 1.5 - 指示1:1结合

n > 1.5 - 指示多位点结合

正如上文示出的，在一些情况中，即使最高登记的响应R是中等高度，由于例如分析物的不同浓度下登记的传感器响应的几个数据点指示陡峭的斜率，R_maxGlobal的计算可能得到非常高的值。在此类情况中，即使相互作用本身可能是1:1结合，但是R_maxGlobal的结果值与R_maxA相比可能仍变得非常高。因此，比值n的第二准则限制可以选为例如：

n > 10且R < R_maxA - 指示高R且不能违反1:1结合。

上文准则中引述的限制值可以显然改变以达到期望的效果，并且不背离本发明。

根据本发明的一个实施例，步骤K可以包括建议备选结合模型(如多位点模型)的汇总准则，其中统计满足的结合行为准则的数量，且如果总和超过预定值，则建议备选结合模型。根据本发明的一个实施例，步骤K的汇总准则可以包括结合行为准则的加权和，其中对准则a至d赋予关联的权重系数。根据一个实施例，对结合行为准则a和d赋予权重2，对准则b至c赋予权重1，以及汇总准则设为2。

因此，通过对利用允许使用足够浓度的分析物制备的表面确定R_maxC，能够实现对亲和度非常小的分析物的分析的置信。

要理解本发明不限于上文描述的本发明的具体实施例，而本发明的范围将由所附权利要求来建立。

Claims

1.一种使用生物传感器来确定分析物与配位体之间的相互作用的一个或多个相互作用参数的方法，所述方法包括如下步骤：

A：提供将所述配位体与之固定化的传感器表面，

B：将所述传感器表面与控制分析物接触，

C：根据所述控制分析物至所述配位体的结合位点的结合登记所述传感器响应，

D：确定所述控制分析物与所述配位体之间的所述相互作用的控制饱和响应(R_maxC)，

E：使用所述分析物与所述控制分析物的相对摩尔响应贡献将所述控制饱和响应(R_maxC)转换到分析物饱和响应(R_maxA)

F：将所述传感器表面与包含不同浓度的所述分析物的一个或多个样本接触，

G：根据所述分析物至所述结合位点的结合登记所述传感器响应，以及

H：使用所述分析物饱和响应(R_maxA)将所登记的传感器响应拟合到预定相互作用模型以确定所述相互作用参数。

2.如权利要求1所述的方法，其中，以使之能够占据所有结合位点的浓度提供所述控制分析物，从而根据一个相互作用事件提供所述控制饱和响应(R_maxC)的直接确定。

3.如权利要求1所述的方法，其中，根据所述控制分析物与所述配位体之间的非稳态相互作用确定所述控制饱和响应(R_maxC)。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，通过所述分析物与所述控制分析物之间的摩尔量比来逼近步骤E中所述分析物和所述控制分析物的所述相对摩尔响应贡献。

5.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，对多个分析物重复步骤E至H。

6.如权利要求5所述的方法，其中，在对预定数量的分析物执行步骤E至H之后，重复步骤B至D。

7.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其包括如下步骤：

I：从根据所述分析物的不同浓度下登记的传感器响应进行全局确定R_maxGlobal以及使用控制分析物和关联的R_maxC进行确定R_maxA中选择用于确定每个分析物的R_max的方法；

J：通过选自如下集合的一个或多个结合行为准则来评估所述分析物-配位体相互作用的结合行为：

a)高登记的R

b)注入之后抬高的基线

c)注入期间渐增的响应

d)R_maxGlobal与R_maxA之间的比率

K：基于步骤J中的评估，建议用于计算每种分析物的所述相互作用参数的结合模型。

8.一种用于检测分子结合相互作用的分析系统，包括：

(i)生物传感器，其包括至少一个感测表面、用于检测所述至少一个感测表面处分子结合相互作用的检测部件、以及用于产生表示结合曲线的检测数据的部件，其中每个曲线表示结合相互作用随时间推移的进度，以及

(ii)用于按权利要求1至7中任一项中定义的执行如权利要求1所述的步骤A至H的数据处理部件。