JP5683606B2 - 相互作用の分析のための方法及びシステム - Google Patents

Description

本発明は、検知表面において分子結合の相互作用を分析する方法に関し、より具体的には、分析物とリガンドとの相互作用についての１以上の相互作用パラメータを、バイオセンサーを用いて求める方法に関する。

生体分子のような分子の間の相互作用をリアルタイムで観測できる分析センサーシステムに対し、興味が高まっている。これらのシステムは、光バイオセンサーに基づくことが多く、通常、相互作用分析センサー又は生体特異的相互作用分析センサーと呼ばれる。代表的なそのようなバイオセンサーシステムは、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ）から市販されているＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）装置であり、この装置は、試料中の分子と、検知表面上に固定された分子構造との相互作用を検出するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いる。試料がセンサー表面を通過する際、結合の進行は、相互作用の起こる速度を直接反映する。試料の注入に続いて緩衝液が流れ、この間、検出器の応答は、表面上の錯体の解離の速度を反映する。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムからの典型的な出力は、時間に対する分子の相互作用の進行を表現するグラフ又は曲線であり、これは会合段階の部分と解離段階の部分とを含む。この結合曲線は通常コンピュータ画面に表示され、「センサグラム」と呼ばれることが多い。

こうして、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システム（及び類似のセンサーシステム）により、標識を行うことなく、かつ多くの場合、関係する物質の精製を行うことなく、試料中の特定の分子（分析物）の存在及び濃度に加えて、分子の相互作用における結合（会合）及び解離の反応速度定数ならびに表面相互作用に対するアフィニティを含む、追加の相互作用パラメータも、リアルタイムで求めることができる。会合速度定数（ｋ_ａ）及び解離速度定数（ｋ_ｄ）は、複数の異なる試料の分析物の濃度に対して得られた反応速度データを、微分方程式の形式の、相互作用モデルの数学的な表現にフィッティングすることで、得ることができる。（アフィニティ定数Ｋ_Ａ又は解離定数Ｋ_Ｄとして表される）アフィニティは、会合速度定数又は解離速度定数から計算されうる。しかし、多くの場合、明確な反応速度データを得ることは難しいことがあるので、通常、平衡結合分析によりアフィニティを測定することがより確実であり、平衡結合分析は、一連の分析物の濃度について、結合の相互作用の会合段階の終わり又は終わり近くで達したと推測される平衡状態すなわち定常状態での、結合のレベルを求めることを含む。結合曲線の会合段階が、実際に定常状態に達していそうであるということを確実にするために、通常は、アフィニティの測定に用いられる予定である条件下で、結合される分析物が平衡に達するのに必要な、試料注入の時間の長さ（すなわち、センサーチップの表面との試料の接触時間）を事前に求める。平衡に達するのにかかる時間と、分析物が解離するのにかかる時間の両方が、主に解離速度定数により決まるので、おおよその注入時間も、その解離定数から推定することができる。

米国特許第６０９３５３６号

本発明の目的は、分析物とリガンドとの相互作用についての１以上の相互作用パラメータを、バイオセンサーを用いて求めるための新しい方法及びバイオセンサーシステムを提供することであり、この方法及びバイオセンサーシステムは、従来技術の１以上の欠点を克服する。このことは、独立請求項で定義されるような方法及びバイオセンサーシステムにより実現される。

本発明の方法の１つの利点は、アフィニティの低い分析物に対する相互作用パラメータの決定を改善し、より信頼性を高めることができることである。

以下の詳細な説明及び図面を参照することで、本発明及び本発明のさらなる特徴及び利点が、より完全に理解されるであろう。

ＳＰＲに基づくバイオセンサーシステムの概略的な側面図である。 結合曲線が目に見える会合段階及び解離段階を有する、代表的なセンサグラムである。 「通常」のアフィニティの、分析物のカーブフィッティングの例を示す図である。 図３のデータ点の下側範囲に基づく、「低い」アフィニティの、分析物のカーブフィッティングの例を示す図である。 本発明の一実施形態による方法の概略的なブロック図を示す図である。 図４の対応するフィッティングを示す図である。 様々なレベルの方法ノイズを有する、シミュレーションされたデータセットのフィッティングを示す図である。 様々なレベルの方法ノイズを有する、シミュレーションされたデータセットのフィッティングを示す図である。 様々なレベルの方法ノイズを有する、シミュレーションされたデータセットのフィッティングを示す図である。 アフィニティが非常に低い第２の（非特異的な）結合について、シミュレーションされたデータへのフィッティングを示す図である。 アフィニティが非常に低い第２の（非特異的な）結合について、シミュレーションされたデータへのフィッティングを示す図である。 注入後にベースラインが上がった、応答曲線の例を示す図である。 注入の間に増大する応答を示す、応答曲線の例を示す図である。

上述の通り、本発明は、第１の種類の分子と第２の種類の分子の間の分子結合の相互作用に対する定常状態の結合データを評価して、相互作用のアフィニティを求めることに関し、第１の種類の分子と第３の種類の対照分子との間の結合の相互作用に対する定常状態の結合データが、第１の種類の分子と第２の種類の分子の間の相互作用に対する最大の応答Ｒ_ｍａｘを推定するために用いられる。通常、実験的な結合データはセンサーに基づく技術により得られ、そのような技術は、分子の相互作用を詳しく調べ、相互作用が進行するに従いリアルタイムで結果を提示する。しかし、本発明をさらに詳細に説明する前に、本発明が用いられることになる全般的な状況が説明される。

別段定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的な用語及び科学的な用語は、本発明に関する当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。また、単数形で記載したものであっても、別途記載しない限り、複数形を含む。

本明細書で引用した刊行物、特許出願、特許その他の文献の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。

上述の通り、本発明は、分子結合の相互作用についての複数のデータセットから、分子結合の相互作用に対する定常状態の結合データを評価して、相互作用についての１以上の相互作用パラメータを求めることに関し、定常状態の結合データ以外の、データセットからの他の相互作用のデータが、データセットの定常状態の結合データの信頼性を推測するのに用いられる。通常、実験的な結合データは、センサーに基づく技術により得られ、そのような技術は、分子の相互作用を詳しく調べ、相互作用が進行するに従いリアルタイムで結果を提示する。しかし、本発明をさらに詳細に説明する前に、本発明が用いられることになる全般的な状況が説明される。

化学センサー又はバイオセンサーは通常、標識を伴わない技術に基づき、例えば、固定された層の質量、屈折率、又は厚さのような、センサー表面の特性の変化を検出するが、ある種の標識を用いるセンサーも存在する。典型的なセンサー検出技術は、限定はされないが、光学的な、熱光学的な、圧電性の、又は音波による方法（例えば、表面音波（ＳＡＷ）及び水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）による方法を含む）のような、質量検出の方法と、電位差測定、電気伝導度測定、電流測定、及び容量／インピーダンスによる方法のような、電気化学的な方法とを含む。光学的な検出方法については、代表的な方法には、反射光学的な方法のような、表面の質量濃度を検出する方法が含まれ、反射光学的な方法は、外部反射の方法と内部反射の方法の両方を含み、これらは角度、波長、偏光、又は位相を分解するものであり、例えば、エバネッセント波による偏光解析法及びエバネッセント波による分光法（ＥＷＳ、又は内部反射分光法）である。これらの偏光解析法と分光法の両方が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を介したエバネッセント場の増強、ブリュースター角屈折率測定、臨界角屈折率測定、漏れ全反射（ＦＴＲ）、散乱内部全反射（ＳＴＩＲ）（散乱増強標識を含みうる）、導光体センサーを含んでもよく、臨界角分解イメージング、ブリュースター角分解イメージング、ＳＰＲ角度分解イメージングなどのような、外部反射イメージング、エバネッセント波に基づくイメージングを含んでもよい。さらに、例えば表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）、エバネッセント波蛍光（ＴＩＲＦ）及びリン光に基づく、光度測定及びイメージング／顕微鏡による方法が、「それ自体」で、又は反射による方法と組み合わせて、導波路干渉計、導波路漏洩モード分光法、反射干渉分光法（ＲＩｆＳ）、伝送干渉計、ホログラフィック分光法、及び原子間力顕微鏡（ＡＦＲ）とともに、言及されうる。

一般に利用可能なバイオセンサーには、スウェーデン・ウプサラのＢｉａｃｏｒｅ ＡＢにより製造され販売される、前述のＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システム装置が含まれ、これは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づき、結合するリガンドと対象の分析物との間の表面の結合の相互作用を、リアルタイムで観測することを可能にする。この文脈において、「リガンド」とは、所与の分析物に対して既知又は未知のアフィニティを有する分子であり、表面上に固定された、任意の捕捉する又は捕獲する物質を含み、「分析物」は、リガンドへの任意の特定の結合対象物を含む。

以下の詳細な説明及び例では、本発明はＳＰＲ分光法に関して、より具体的にはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムに関して例示されるが、本発明はこの検出方法に限定されないことを理解されたい。むしろ、検知表面上に固定されたリガンドへの分析物の結合を定量的に示す、検出表面における変化が測定されうる限り、分析物が検知表面上に固定されたリガンドに結合する、アフィニティに基づくあらゆる検出方法を用いることができる。

ＳＰＲの現象はよく知られており、ある条件下で、光が屈折率の異なる２つの媒体の間の境界で反射すると、ＳＰＲが発生する、と言えば十分であろう。その境界は、通常銀又は金の金属膜で被覆されている。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）装置では、媒体は試料及びセンサーチップのガラスであり、センサーチップのガラスは微小流体の流動システムにより試料と接触している。金属膜は、チップ表面上の薄い金の層である。ＳＰＲにより、特定の反射角で反射される光の強度が、低減する。反射される光の強度が最小になるこの角度は、反射された光とは反対側、すなわちＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システム及び試料側の表面の近くの屈折率とともに変化する。

ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムの概略的な図が、図１に示されている。センサーチップ１は、流路５を通る、例えば抗原のような分析物４を有する試料の流れに曝される、例えば抗体のような捕捉分子（リガンド）３を支持する金属膜２を有する。光源７（ＬＥＤ）からの単色のｐ偏光した光６は、プリズム８によりガラス／金属境界９に結合され、その境界９で光が全反射する。反射された光線１０の強度は、光検出ユニット１１（光検出アレイ）により検出される。

ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）装置の技術的な側面及びＳＰＲの現象についての詳細な議論は、米国特許第５３１３２６４号で見出すことができる。バイオセンサーの検知表面の基質の被覆についてのより詳細な情報は、例えば、米国特許第５２４２８２８号及び５４３６１６１号で与えられる。加えて、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）装置とともに用いられるバイオセンサーチップの技術的な側面についての詳細な議論を、米国特許第５４９２８４０号で見出すことができる。

試料中の分子が、センサーチップ表面上の捕捉分子に結合すると、表面の濃度と、したがって屈折率とが変化し、ＳＰＲの反応が検出される。相互作用の進行中、時間に対して応答をプロットすることで、相互作用の進行の度合が定量的に得られる。そのようなプロット、又は反応速度若しくは結合の曲線（結合等温線）は、通常センサグラムと呼ばれ、当技術分野では「アフィニティ軌跡」又は「アフィノグラム」と呼ばれることもある。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムでは、ＳＰＲの応答の値は、レゾナンスユニット（ＲＵ）で表現される。１ＲＵは、反射光の強度が最小になる角度の０．０００１°の変化を表し、ほとんどのタンパク質及び他の生体分子では、センサー表面上での約１ｐｇ／ｍｍ^２の濃度の変化に相当する。分析物を含む試料がセンサー表面に接触すると、センサー表面に結合した捕捉分子（リガンド）が、「会合」と呼ばれる段階で分析物と相互作用する。この段階は、試料が最初にセンサー表面と接触させられるに従って、ＲＵの増大によりセンサグラム上で示される。逆に、「解離」は通常、試料の流れが例えば緩衝液の流れで置き換えられると、発生する。この段階は、分析物が表面に結合したリガンドから解離するに従って、時間とともに生じるＲＵの低下により、センサグラム上で示される。

センサーチップ表面での可逆的な相互作用の代表的なセンサグラム（結合曲線）が図２に提示され、固定された捕捉分子すなわちリガンド、例えば抗体を有する検知表面が、試料中の結合の対象、すなわち分析物と相互作用する。上で言及された他の検出の原理に基づくバイオセンサーシステムにより生成される結合曲線は、外観が類似する。垂直軸（ｙ軸）は（ここではレゾナンスユニット、ＲＵで）応答を示し、水平軸（ｘ軸）は（ここでは秒で）時間を示す。最初は、緩衝液が検知表面を通過し、センサグラム中のベースライン応答Ａを与える。試料を注入する間、分析物との結合による信号の増大が観測される。結合曲線のこの部分Ｂは、通常「会合段階」と呼ばれる。最終的に、会合段階の終わり又は終わり近くで定常状態の条件に達し、共鳴信号がＣで安定する（しかし、この状態に常に到達しなくてもよい）。本明細書において、用語「定常状態」は、用語「平衡」と同義に用いられることに留意されたい（実際には、システムが平衡ではなくても、結合は長時間一定でありうるので、他の文脈では、用語「平衡」は、理想的な相互作用モデルを表現するために取っておかれることがある）。試料注入の終わりで、試料は緩衝液の継続的な流れに置き換えられ、信号の低下は、表面からの分析物の解離又は放出を反映したものである。結合曲線のこの部分Ｄは、通常、「解離段階」と呼ばれる。分析は再生段階で終了し、再生段階において、結合した分析物を表面から除去できる溶液がセンサー表面に注入されるとともに、（理想的には）リガンドの活性を保つ。これは、センサグラムの部分Ｅにより示される。緩衝液の注入によりベースラインＡが回復し、表面は新しい分析の準備ができている。

会合段階Ｂ及び解離段階Ｄの外形からそれぞれ、結合反応速度及び解離反応速度に関する情報が得られ、Ｃにおける共鳴信号の大きさは、アフィニティを表す（応答は、表面の質量濃度の変化に関連する相互作用の結果である）。ここで、このことが以下でより詳細に説明される。

表面結合速度
拡散又は質量の移動が制限されず擬一次速度式に従う、分析物Ａと表面に結合した（固定された）捕捉分子、すなわちリガンドＢとの間の可逆反応を仮定する。

Ａ＋Ｂ⇔ＡＢ
この相互作用モデル（通常ラングミュア型と呼ばれる）は、分析物（Ａ）が一価かつ均質であり、リガンド（Ｂ）が均質であり、全ての結合事象が独立であるということを仮定し、実際に、大部分の場合に適用可能である。

分析物の注入中の、分析物Ａの表面濃度の変化速度（＝形成された錯体ＡＢの濃度の変化速度）は、分析物Ａの流入速度と流出速度の合計である。

ここで［Ａ］は分析物Ａの濃度、［Ｂ］はリガンドＢの濃度、［ＡＢ］は反応錯体ＡＢの濃度、ｋ_ａは会合速度定数、ｋ_ｄは解離速度定数である。

時間ｔ後、表面における結合していないリガンドＢの濃度は［Ｂ_Ｔ］−［ＡＢ］であり、［Ｂ_Ｔ］はリガンドＢの全体又は最大の濃度である。式（１）に代入すると、

が得られる。

検出器の応答ユニット（ＡＢが検出される）については、これは以下のように表すことができる。

ここで、Ｒは時間ｔでのレゾナンスユニット（ＲＵ）での応答であり、Ｃは溶液中の結合していない分析物（Ａ）の初期の、すなわち体積濃度であり、Ｒ_ｍａｘは分析物（Ａ）が表面上のリガンド（Ｂ）に全て結合した場合に得られる（ＲＵ単位の）応答であり、飽和応答とも呼ばれる。式（３）を並べ替えると、

が得られ、Ｒはレゾナンスユニット（ＲＵ）での応答である。積分された形では、式は

である。

ｋ _ａ 及びｋ _ｄ の計算
ここで、式（４）に従って、ｄＲ／ｄｔが結合した分析物の濃度Ｒに対してプロットされると、傾きは−（ｋ_ａＣ＋ｋ_ｄ）であり、縦軸の切片はｋ_ａＣＲ_ｍａｘである。体積濃度Ｃが既知であり、飽和応答Ｒ_ｍａｘが求められている（例えば、大量の過剰な分析物で表面を飽和させることで）場合、会合速度定数ｋ_ａ及び解離速度定数ｋ_ｄを計算することができる。しかし、より便利な方法は、好ましくはコンピュータプログラムによる、積分された関数（５）のフィッティング、又は微分方程式（４）の数値計算及びフィッティングである。

ｋ_ｄは、以下のように求めることもできる。解離の速度は、

のように表すことができ、積分された形では、

であり、Ｒ_０は、解離段階の開始時（緩衝液による表面の洗浄が始まる時）の応答である。

式（６）は、

のように線形化することができ、ｔに対してｌｎ［Ｒ／Ｒ_０］をプロットすると、傾き＝−ｋ_ｄの直線が得られる。しかし、より便利には、解離速度定数ｋ_ｄは、指数関数の速度式（７）をフィッティングすることで求められる。

信頼性のある反応速度定数を得るために、通常、上で説明された分析が、複数の異なる分析物濃度と、適宜、センサー表面における１以上の他のリガンド濃度とに対しても、繰り返される。

アフィニティの計算
アフィニティは、会合定数Ｋ_Ａ＝ｋ_ａ／ｋ_ｄにより、又は、解離定数（平衡定数とも呼ばれる）Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｄ／ｋ_ａにより表現される。

あるいは、会合定数Ｋ_Ａは式（３）から求めることができ、ここで平衡状態ではｄＲ／ｄｔ＝０であり、
ｋ_ｄＲ_ｅｑ＝ｋ_ａＣ（Ｒ_ｍａｘ−Ｒ_ｅｑ） （９）
が得られ、Ｒ_ｅｑは平衡状態における検出器の応答である。ｋ_ａ／ｋ_ｄ＝Ｋ_Ａなので、式（９）に代入して整理すると、

が得られる。

複数の濃度において結合反応が行われる場合、Ｋ_Ａは、データの非線形なカーブフィッティングにより得ることができる。あるいは、例えば、反応速度データに信頼性がない場合、又は会合若しくは解離が正確に測定するには速すぎる場合、Ｒ_ｅｑ／ＣをＲ_ｅｑに対してプロットしてもよく、これにより傾き＝−Ｋ_Ａが得られる（スキャッチャードプロット）。

式（１０）を整理すると、

が得られる。

式（１１）にＫ_Ａ＝１／Ｋ_Ｄを代入すると、

が得られる。

通常、式（１２）は、

に変更され、「オフセット」は、屈折率の系統的誤差による、ベースラインの平行移動を補償する要素である。

式（１１）及び（１２）は、平均でいくつの結合部位が１つの分析物分子によりブロックされるかを規定する、立体障害係数ｎを導入することによって、以下のように変更することができる。

ソフトウェア支援分析
反応速度及びアフィニティのデータを分析するためのソフトウェアは、市販されている。したがって、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）装置により生成された、反応速度及びアフィニティのデータは、通常、（スウェーデン・ウプサラのＢｉａｃｏｒｅ ＡＢにより提供される）専用のＢＩＡ評価ソフトウェアにより評価される。このソフトウェアは、数値積分を用いて、微分形の速度方程式を計算し、非線形回帰を用いて、フィッティングが最もよく合う変数の値を見つけることによって反応速度及びアフィニティのパラメータをフィッティングして、残差平方和を最小にする。

測定された定常状態の結合レベルから、ＢＩＡ評価ソフトウェアによりアフィニティの定数を求めることは、以下の段階を含む。

（ｉ）曲線の定常状態の領域で、センサグラム上の報告点から、定常状態の結合レベル（Ｒ_ｅｑ）を得る。

（ｉｉ）Ｃに対してＲ_ｅｑのプロットを作成する。

（ｉｉｉ）このプロットを、一般的な「定常状態のアフィニティ」フィッティングモデル（例えば、式（１３）又は式（１４））にフィッティングして、Ｋ_Ａ／Ｋ_Ｄ及びＲ_ｍａｘを得る。

本発明
上述の通り、アフィニティ、ならびに、会合定数及び解離定数のような相互作用パラメータが、Ｂｉａｃｏｒｅ装置のようなバイオセンサーによる定常状態分析により求められ、一連の濃度の分析物が固定されたリガンドに注入され、異なる濃度における相互作用の定常状態での応答を記録する。その後、応答は所定の相互作用モデルにフィッティングされ、相互作用パラメータを求める。信頼性のある結果を得るために、分析物の濃度は、相互作用曲線に対してかなり広い範囲にわたらなければならない。従来技術では、１つの推奨される方法は、濃度が例えば２Ｋ_Ｄから例えば０．１Ｋ_Ｄに連続して希釈される分析物を用い、曲線全体を確実にカバーして、フィッティングされるパラメータの不確実性を最小限にすることである。図３は、「通常の」アフィニティの分析物の曲線フィッティングの例を示し、データ点は、分析物濃度が０．０３Ｋ_Ｄ〜１６Ｋ_Ｄでの応答を表すとともに、飽和応答Ｒ_ｍａｘの全体のフィッティングを示し、結果はＫ_Ｄ＝０．５１１ｍＭ、Ｒ_ｍａｘ＝５７．４ＲＵである。

しかし、例えば分析物の溶解度などの制限のために、そのような広範囲にわたって分析物の濃度を提供することは、常には実現可能ではない。この問題は、フラグメントベースの薬品設計を行う際には一般的な、低いアフィニティを求める際には、目立つようになる。分析物の濃度を高くすることで、評価をさらに複雑にする、表面との二次的な（非特異的な）相互作用の可能性も高まる。こうした状況では、低い濃度（＜Ｋ_Ｄ）のみを用いることが可能であり、実現しうる最大の応答がＲ_ｍａｘよりもはるかに低くなり、結果として記録される応答曲線が、プロット中で非常に小さな曲率しか示さず、これらの両方が、フィッティングされるパラメータ、すなわちＫ_Ｄ及びＲ_ｍａｘに不確実性をもたらす。図４は、図３のデータ点の下側領域に基づく、「低い」アフィニティの分析物の曲線フィッティングの例を示し、データセットの最も低い５個のデータ点のみを用いる。この例では、フィッティングによりＫ_Ｄ＝０．１０９ｍＭ、Ｒ_ｍａｘ＝３０．９ＲＵが得られ、アフィニティＫ_Ｄと飽和応答Ｒ_ｍａｘの両方の値が、全ての点が用いられた場合の上記の値から大きくずれる（図３との比較）。

飽和応答Ｒ_ｍａｘは、分析物ではなく、表面すなわち固定された反応体に関するパラメータであるので、そのような分析物に対する飽和応答Ｒ_ｍａｘＡは、別の実験で適切な第２の分析物（対照分析物）を用いて求められうる、ということが分かっている。対照分析物と試料分析物との間の相対的な応答（又は分子量）の違いを調整した後で、Ｒ_ｍａｘＣと呼ばれる対照分析物の飽和応答値が、次いで、（アフィニティＫ_Ｄに対して）濃度が低い分析物による実験を評価する際に、定数として使用できる。

図５に概略的に示される本発明の一実施形態によれば、分析物とリガンドとの相互作用についての１以上の相互作用パラメータを、バイオセンサーを用いて求める方法が提供され、その方法は、
Ａ：リガンドを固定させたセンサー表面を準備する段階（図５、参照番号１０）と、
Ｂ：センサー表面を対照分析物と接触させる段階（図５、参照番号２０）と、
Ｃ：リガンドの結合部位への対照分析物の結合からのセンサー応答を記録する段階（図５、参照番号３０）と、
Ｄ：対照分析物とリガンドとの相互作用について対照飽和応答（Ｒ_ｍａｘＣ）を求める段階（図５、参照番号４０）と、
Ｅ：分析物及び対照分析物の相対モル感度の寄与を用いて、対照飽和応答（Ｒ_ｍａｘＣ）を分析物飽和応答（Ｒ_ｍａｘＡ）に変換する段階（図５、参照番号５０）と、
Ｆ：センサー表面を、異なる濃度の分析物を含む１種以上の試料と接触させる段階（図５、参照番号６０）と、
Ｇ：結合部位への分析物の結合からのセンサー応答を記録する段階（図５、参照番号７０）と、
Ｈ：分析物飽和応答（Ｒ_ｍａｘＡ）を用いて、記録されたセンサー応答を所定の相互作用モデルにフィッティングし、相互作用パラメータを求める段階（図５、参照番号８０）とを含む。

上述の通り、相互作用パラメータは、アフィニティ（例えばＫ_Ａ又はＫ_Ｄ）、反応速度定数（例えばｋ_ａ又はｋ_ｄ）のような、リガンドと分析物との相互作用を特徴付ける、任意のパラメータであってよい。この方法は、上で例示されたような任意の適切なバイオセンサーを用いて実行することができ、相互作用パラメータの指標、例えば、Ｋ_Ａ、Ｋ_Ｄ、ｋ_ａ又はｋ_ｄは、バイオセンサーの分野に応じて異なっていてもよい。

リガンドを固定させたセンサー表面を準備する段階Ａは、使用される特定のバイオセンサーのセンサー表面に、リガンドを固定する任意の適切な方法を含む。固定されたリガンドは、対照分析物及び調査されることになる分析物に対する結合部位を与える。段階Ｂでは、適切な対照分析物が、センサー表面と接触させられる。上の記述によれば、対照分析物は、対照分析物とリガンドとの相互作用に対する対照飽和応答（Ｒ_ｍａｘＣ）が容易に求められうるように、選択されるべきである。例えば、対照分析物は、調査されることになる分析物と比較して、アフィニティＫ_Ｄに関して、溶解度がより高くなければならない。一実施形態によれば、対照分析物は、センサー表面上のリガンドの全ての結合部位を占有して、１つの相互作用の事象から対照飽和応答（Ｒ_ｍａｘＣ）を直接求められるような、濃度で準備される。あるいは、対照分析物は、対照分析物とリガンドとの非定常状態相互作用から対照飽和応答（Ｒ_ｍａｘＣ）を求められる濃度領域で準備される。

対照飽和応答（Ｒ_ｍａｘＣ）を分析物飽和応答（Ｒ_ｍａｘＡ）に変換する段階Ｅでは、各分析物の飽和応答（Ｒ_ｍａｘ）は全ての結合部位が占有される時の応答を表す、という事実が、変換のために用いられる。２つの異なる分析物、例えばそれぞれ分析物Ｓ及びＴの飽和応答（Ｒ_ｍａｘ）を求めるために同じセンサー表面を用いることで、理想的には、飽和応答（Ｒ_ｍａｘＳ）及び（Ｒ_ｍａｘＴ）はそれぞれ、センサー表面に結合した同じ数の分子による応答を表す。したがって、同じセンサー表面を用いて記録された飽和応答（Ｒ_ｍａｘＳ）及び（Ｒ_ｍａｘＴ）は、２つの分析物の相対モル感度の寄与を与える。したがって、２つの分析物の相対モル感度の寄与が既知又は推定されうるとすると、１つの分析物の飽和応答（Ｒ_ｍａｘ）は、別の分析物の飽和応答（Ｒ_ｍａｘ）から計算（推定）されうる。本発明によれば、この関係を用いて、対照飽和応答（Ｒ_ｍａｘＣ）を分析物飽和応答（Ｒ_ｍａｘＡ）に変換する。

上述の通り、複数の異なる検出技術に基づく、複数のバイオセンサーが利用可能なので、２つの異なる分析物の相対モル感度は用いられるバイオセンサーにより決まるが、それでも原理は有効である。一実施形態によれば、段階Ｅにおける分析物と対照分析物の相対モル感度の寄与は、分析物と対照分析物とのモル質量の比により近似される。この手法は、センサー表面に結合される分子の質量を直接又は間接的に記録する任意のバイオセンサー技術に対して、有効であり、又は少なくとも良好な近似法である。

一実施形態によれば、対照分析物の解離速度は、センサー表面に結合できる分析物を含まない試料、例えば緩衝液で、対照分析物を置き換えた後の、適当な期間内に完全な解離に達するのに、十分に速い。あるいは、再生の段階が、分析物間で全ての結合部位を解放するのに必要でありうる。一実施形態では、各々の分析物に対して計算される飽和応答（Ｒ_ｍａｘＡ）に基づいて複数の分析物の各々に対して１以上の相互作用パラメータを求めるために、段階Ｅ〜Ｈが、複数の分析物について繰り返され、これは図５で参照番号９０により示される。長時間にわたりセンサー表面の可能性のある変性を検出及び／又は修正するために、段階Ｅ〜Ｈを所定の数の分析物に対して実行した後に、段階Ｂ〜Ｄを繰り返すことができ、これは図５で参照番号１００により示される。

一実施形態によれば、分子結合の相互作用を検出するための分析システムが提供され、その分析システムは、
（ｉ）１以上の検知表面と、１以上の検知表面において分子結合の相互作用を検出するための検出手段と、結合曲線を表す検出データを生成するための手段とを含む、バイオセンサーであって、各曲線が、時間に対する結合の相互作用の進行を表す、バイオセンサーと、
（ｉｉ）上記の方法の段階Ａ〜Ｈを実行するための、データ処理手段とを含む。

本発明は、本発明の方法を実行に移すようになされたコンピュータプログラム、特に、担体上又は担体中のコンピュータプログラムにも、拡張される。担体は、プログラムを担持できる任意のエンティティ又はデバイスであってよい。例えば、担体は、ＲＯＭ、ＣＤ ＲＯＭ、ＤＶＤ又は半導体ＲＯＭのような記録媒体、又は磁気記憶媒体、例えばフロッピー（登録商標）ディスク又はハードディスクを含みうる。担体は、電気ケーブル若しくは光ケーブルを介して、又は無線若しくは他の手段により搬送されうる、電気信号又は光信号のような、伝送可能な担体であってもよい。あるいは、担体は、プログラムが組み込まれる集積回路であってもよい。コンピュータシステムとともに用いるのに適切な情報を格納できる、任意の既知の又は開発された媒体を、用いることができる。

図６は、図４のような、対応するフィッティングを示す。図４と同じデータ点であるが、対照分析物を用いて別の実験で求められた６０ＲＵの定数Ｒ_ｍａｘを使ってフィッティングされており、これによりＫ_Ｄ＝０．５２ｍＭである。図４と６はともに、間隔が離れたいくつかの点へのフィッティングにより、誤解を招く良好なフィッティング（図４）が得られ、パラメータが誤って求められるという場合を例示する。本発明に従って、所定の対照飽和応答（Ｒ_ｍａｘＣ）を用いることで、このことを避けることができ、正しいアフィニティが求められる（図６）。

これは、低いアフィニティ、例えば最低でＫ_Ｄ＝０．５ｍＭ又はそれ未満のアフィニティを正確に求めるのに、強力な手法であることが示された。評価に用いられるデータ点が少ない場合に、この方法の相対的な利点が大きくなるということも、示された。

図７ａ〜７ｃは、１〜６ＲＵという様々なレベルの方法ノイズを有する、７個、６個、又は５個のデータ点を用いた、シミュレーションされたデータセットのフィッティングを示す。斜線が引かれた棒グラフは、変化するＲ_ｍａｘについてのフィッティングから得られるＫ_Ｄを表し、白い棒グラフは、Ｒ_ｍａｘがシミュレーション値である６０ＲＵに設定されたフィッティングから得られるＫ_Ｄを表す。シミュレーションされたアフイニティは、Ｋ_Ｄ＝５×１０^−４Ｍである。誤差の棒グラフは、３回実験した場合の±１標準偏差を表す。

この手法は、以下の式による、二次的な相互作用についてのデータセットのフィッティングに使用できることが、さらに分かっている。

所定のＲ_ｍａｘ１を定数として設定すると、適切な相互作用に対するアフィニティ（Ｋ_Ｄ１）は、容易に求めることができる。図８ａ及び８ｂは、アフィニティが非常に小さな（非特異的な）二次的な結合についての、シミュレーションされたデータセットへのフィッティングを示す。シミュレーションされた仕様Ｋ_Ｄ＝１ｍＭは、対応するシミュレーションされたＲ_ｍａｘが定数として設定された場合に、計算されうる（Ｋ_Ｄ＝１．７ｍＭ±０．４５、ｎ＝７）。シミュレーションされた方法ノイズは、比較的高い、２ＲＵすなわちＲ_ｍａｘの２０％である。

結合挙動の評価
本発明の一実施形態によれば、記録されたセンサー応答の、所定の１：１の結合の相互作用モデルへのフィッティングの品質を評価して、相互作用パラメータを求める方法が提供され、この方法は、
Ｉ．各分析物に対してＲ_ｍａｘを求める方法を選択する段階であって、可能な選択肢は、例えば、分析物の異なる濃度において記録されたセンサー応答からの、Ｒ_ｍａｘの全般的決定、及び、対照分析物及び関連するＲ_ｍａｘＣを用いた上記の方法によるＲ_ｍａｘＡの決定であってよい、段階と、
Ｊ．１以上の結合の挙動の基準により、分析物とリガンドの相互作用の結合の挙動を評価する段階であって、その基準が、
ａ）記録されたＲが大きいこと
ｂ）注入後にベースラインが上がること
ｃ）注入中に応答が増大すること
ｄ）Ｒ_{ｍａｘＧｌｏｂａｌ}とＲ_ｍａｘＡの比
からなる群から選択される、段階と、
Ｋ．段階Ｊでの評価に基づいて、各分析物の相互作用パラメータの計算に用いられるべき、結合モデルを提案する段階とを含む。

一実施形態によれば、結合の挙動の基準ａ）は、記録された最大の応答が、分析物の相互作用に対する所定の値「ｈｉｇｈ Ｒ」を超えるかどうかの基準である。この基準は、応答が、分析物の相互作用に対する計算された又は測定された飽和応答の値を超えるかどうかに、関連する。（化学量論的に１：１の）Ｒｍａｘ（又はＲｍａｘＡ）は、分析物の記録された最大の応答と比較される。１以上の分析物濃度について記録された応答ＲがＲ_ｍａｘ＋ｘＲＵを超え、ｘが調査される特定の相互作用に基づいて選択された値である場合、分析物の濃度、センサー表面上のリガンドの濃度など。相互作用に応じて、値は例えば、１０、５０、１００、２００又は４００のような、１〜５００の間の任意の適切な値であってよく、分析物は、「Ｈｉｇｈ ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ Ｒ」として分類され、これは、代替の化学量論的な相互作用又は追加の集合的な相互作用を示すものとして用いられ、それにより複数部位のモデルがより良好なフィッティングを実現できる。

一実施形態によれば、結合の挙動の基準ｂ）は、分析物がセンサー表面と接触した後で、記録された応答が所定の値を超えるかどうかの基準である。図９は、注入の後にベースラインが上がる、この種類の基準を満たす応答の例を示す。所定の値は、調査される相互作用により決まる、１ＲＵ〜５００ＲＵ又はその間の任意の値のような、ＲＵ単位の全体で固定された値でありうる。あるいは、所定の値は、特定の分析物の記録された応答又は様々な分析物の平均に基づいて決定される、値であってよい。一実施形態によれば、所定の値は３ＲＵであってよい。注入後にベースラインが上がることは、（特定のフラグメントに対する）強固で非特異的な結合又は集団を示すことができ、それにより複数部位のモデルがより良好なフィッティングを実現する。

一実施形態によれば、結合の挙動の基準ｃ）は、分析物の接触時間の間に、記録された応答が、所定の率、例えば０．１ＲＵ／ｓ〜１５０ＲＵ／ｓ又はその間の任意の値を超える率で、増大することである。図１０は、注入の間に増大する応答を表示する応答曲線の例であり、使用できる所定の率の基準の一例は、例えば、「０．２ＲＵ／ｓより大きい」である。そのような挙動は、調査される相互作用に加えて起こる、二次的な相互作用を表すことがあり、それにより複数部位のモデルがより良好なフィッティングを実現できる。

一実施形態によれば、飽和応答の値Ｒ_ｍａｘは、分析物の異なる濃度における記録されたセンサー応答からの全体的な決定（Ｒ_{ｍａｘＧｌｏｂａｌ}）、また、対照分析物及び関連するＲ_ｍａｘＣを用いる上記の方法によるＲ_ｍａｘＡの決定の両方によって計算され、段階１でどちらの方法が選択されたかには関係がない。その後、２つの結果が、関係ｎ＝Ｒ_{ｍａｘＧｌｏｂａｌ}／Ｒ_ｍａｘＡを計算することによって、結合の挙動の基準ｄ）として比較され、ｎは、１以上の所定の制限に関する、結合の挙動を示すものとして評価される。一実施形態では、制限は、
ｎ＜１．５ −１：１の結合を示す
ｎ＞１．５ −複数部位での結合を示す
として選択される。

上述の通り、いくつかの状況では、例えば、分析物の異なる濃度において記録されたセンサー応答の少数の点が急峻な傾きを示すために、最も大きな記録された応答Ｒが適度に高い場合でも、Ｒ_{ｍａｘＧｌｏｂａｌ}を計算すると非常に大きな値になることがある。そのような状況では、相互作用そのものは１：１の結合でありうるとしても、得られるＲ_{ｍａｘＧｌｏｂａｌ}の値は、Ｒ_ｍａｘＡと比べて非常に大きくなることがある。したがって、比率ｎの第２の制限基準は、例えば、
ｎ＞１０かつＲ＜Ｒ_ｍａｘＡ −高いＲを示し１：１の結合が除外され得ない
として選択されうる。

明らかに、上記の基準で言及された制限値は、本発明から逸脱することなく、所望の効果を実現するために変えることができる。

本発明の一実施形態によれば、段階Ｋは、複数部位モデルのような代替の結合モデルを提案するための、合計の基準を含んでもよく、満たされる結合の挙動の基準の数が数えられ、合計が所定の値を超えると、代替の結合モデルが提案される。本発明の一実施形態によれば、段階Ｋの合計の基準は、結合の挙動の基準の加重和を含んでもよく、基準ａ〜ｄは関連する重み付け係数を与えられる。一実施形態によれば、結合の挙動の基準ａ及びｄは重み２を与えられ、基準ｂ〜ｃは重み１を与えられ、合計の基準は２に設定される。

したがって、適切な濃度を用いることを可能にする分析物により、準備された表面のＲ_ｍａｘＣを求めることによって、アフィニティが非常に低い分析物の分析において、信頼性を実現することができる。

本発明は、上で説明された本発明の特定の実施形態には限定されず、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により確立されることを、理解されたい。

１ センサーチップ
２ 金属膜
３ リガンド
４ 分析物
５ 流路
６ 単色のｐ偏光した光
７ 光源
８ プリズム
９ 境界
１０ 反射された光線
１１ 光検出ユニット

Claims (9)

1. 分析物とリガンドとの相互作用についての１以上の相互作用パラメータを、バイオセンサーを用いて求める方法であって、
   Ａ：リガンドを固定させたセンサー表面を準備する段階と、
   Ｂ：センサー表面を対照分析物と接触させる段階と、
   Ｃ：リガンドの結合部位への対照分析物の結合からのセンサー応答を記録する段階と、
   Ｄ：対照分析物とリガンドとの相互作用について対照飽和応答（Ｒ_maxC）を求める段階と、
   Ｅ：分析物及び対照分析物の相対モル感度の寄与を用いて、対照飽和応答（Ｒ_maxC）を分析物飽和応答（Ｒ_maxA）に変換する段階と、
   Ｆ：センサー表面を、異なる濃度の分析物を含む１種以上の試料と接触させる段階と、
   Ｇ：結合部位への分析物の結合からのセンサー応答を記録する段階と、
   Ｈ：分析物飽和応答（Ｒ_maxA）を用いて、記録されたセンサー応答を所定の相互作用モデルにフィッティングし、相互作用パラメータを求める段階と
   を含む方法。
2. 対照分析物が、全ての結合部位を占有して、１つの相互作用の事象から対照飽和応答（Ｒ_maxC）を直接求められる濃度で準備される、請求項１記載の方法。
3. 対照飽和応答（Ｒ_maxC）が、対照分析物とリガンドとの非定常状態相互作用から求められる、請求項１記載の方法。
4. 段階Ｅにおける分析物と対照分析物の相対モル感度の寄与が、分析物と対照分析物とのモル質量の比により近似される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
5. 段階Ｅ〜Ｈを複数の分析物に対して繰り返す、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
6. 段階Ｅ〜Ｈを所定の数の分析物に対して実行した後で、段階Ｂ〜Ｄを繰り返す、請求項５記載の方法。
7. Ｉ．分析物の異なる濃度において記録されたセンサー応答からの、Ｒ_maxGlobalの全般的決定、及び、対照分析物及び関連するＲ_maxCを用いたＲ_maxAの決定から、各分析物に対してＲ_maxを求める方法を選択する段階と、
   Ｊ．１以上の結合の挙動の基準により、分析物とリガンドの相互作用の結合の挙動を評価する段階であって、基準が、
   ａ）記録されたセンサー応答（Ｒ）が大きいこと
   ｂ）試料注入後にベースラインが上がること
   ｃ）試料注入中に応答が増大すること
   ｄ）Ｒ_maxGlobalとＲ_maxAの比
   からなる群から選択される、段階と、
   Ｋ．段階Ｊでの評価に基づいて、各分析物の相互作用パラメータの計算に用いられるべき、相互作用モデルを提案する段階と
   を含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
8. 分子結合の相互作用を検出するための分析システムであって、
   （ｉ）１以上の検知表面と、１以上の検知表面において分子結合の相互作用を検出するための検出手段と、結合曲線を表す検出データを生成するための手段とを含む、バイオセンサーであって、各曲線が、時間に対する結合の相互作用の進行を表す、バイオセンサーと、
   （ｉｉ）請求項１乃至請求項７のいずれか１項で定義される請求項１記載の段階Ａ〜Ｈを実行するためのデータ処理手段と
   を含む分析システム。
9. プログラムコード手段を含むコンピュータプログラムであって、プログラムがコンピュータ上で実行されると、プログラムコード手段が、請求項１乃至請求項７のいずれか１項に従って、分析物とリガンドとの相互作用についての１以上の相互作用パラメータを求める、コンピュータプログラム。
   

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