JP5830523B2 - 結合化学量論の決定方法 - Google Patents
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- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
Description
a)所定の初期活性濃度の第1の分子種と第2の分子種を含む溶液を調製する段階であって、第2の分子種の初期活性濃度が、第1の分子種に対する第2の分子種の結合の飽和を生じさせるのに十分であるように選択される段階と、
b)第2の分子種の遊離活性濃度を決定する段階と、
c)(第2の分子種の初期活性濃度と遊離活性濃度との差)/(第1の分子種の初期活性濃度)の比又はその逆数を決定する段階と、
d)上記比から、相互作用の結合化学量論を決定する
段階を含む。
a)それぞれ所定の初期活性濃度を有する第1の分子種及び第2の分子種の溶液を調製する段階と、
b)第1の分子種の遊離活性濃度を決定する段階と、
c)第2の分子種の遊離活性濃度を決定する段階と、
d)(第2の分子種の初期活性濃度と遊離活性濃度との差)/(第1の分子種の初期活性濃度と遊離活性濃度との差)の比又はその逆数を決定する段階と、
e)上記比から、相互作用の結合化学量論を決定する段階と
を含む。
1)変動初期活性濃度の他の結合パートナー(Btot)で滴定される一定初期活性濃度の1つの結合パートナー(Atot)を有する溶液中での分子AとBのインキュベーション、
2)各混合物中の遊離結合パートナーB(Bfree)の活性濃度の決定、
3)(Btot−Bfree)対Btotのプロットから(Btot−Bfree)についての飽和値(複数も含む)の識別、ここで、(Btot−Bfree)の定義はAとの複合体におけるB分子の濃度である、
4)(Btot−Bfree)飽和/Atotの式からBに対するAの結合部位の数の決定。
dR/dt=kt×(活性濃度) (2)
ktは、定数×Mw×D2/3(ここで、Mwはタンパクの分子量であり、Dはその拡散係数である)と書き換えることができ、次式に示す通りとなる。
拡散係数Dは、分子のサイズ及び形状の関数及び問題になっている溶媒の粘度により与えられる摩擦抵抗である。球形分子に関して、拡散係数は半径に反比例するので、分子量の立方根に比例する。しかし、タンパク等の非常に大きな溶質分子に関して、拡散係数は比較的分子量に関係がない。
Bの全濃度:1.00E−09
親和性:1.00E−06
1)センサチップCM5を挿入し、システムに緩衝液を入れる。
2)フローセル2中で分子Aを固定化し、フローセル4中で分子Bを固定化する。
25〜100RU/kDaの間で固定化することを目標にする(すなわち、分子Aが50kDaの分子量を有する場合、1250〜5000RUの間で固定化する)。
3)固定化リガンドAに分子Bを注入し、5μl/分の流速で少なくとも0.3RU/秒の初期結合速度を与える希釈を使用する。60秒の注入時間を使用する。
4)また60秒間、100μl/分の流速で同じ希釈の分子Bを注入する。
5)段階3及び4と同様の方法で、5及び100μ/分で固定化リガンドBに分子Aを注入する。
6)T100評価ソフトウェアを開き、濃度分析/検量線を必要としない分析ツールを用いて分子A及びBの濃度を決定する。
分子A及びBの活性濃度を知ることができれば、結合化学量論を決定できる。
1)一定濃度「2a」の分子Aを使用し、その100μl溶液を96ウェルプレートの10以上のウェルにピペットで取る。
2)濃度100×2a(又はそれ以上)の分子Bの200μl溶液を調製し、10(又はそれ以上)の連続3倍希釈のBを調製する。
これらの溶液は、遊離濃度のBの決定及び分子Aとのインキュベーションのための標準曲線に使用する。
3)100μlの各々のBの溶液を、分子Aの初期濃度「a」を与える濃度「2a」で分子Aが既に存在しているウェルに移す。
4)固定化リガンドAに標準濃度のBを注入する。
5)固定化リガンドAに変動濃度のBとインキュベートしたAの溶液を注入する。
段階4及び5において、典型的な注入時間は3分であり、典型的な流速は10μl/分である。反応値として注入停止後に記録点のセットとして10秒を使用する。
6)T100評価ソフトウェアを開き、既知濃度のBに対して注入から得られた反応値をプロットすることによってBについての標準曲線を調製する。
7)各々の混合物中のBの遊離濃度を決定する。
8)(Btot−Bfree)対Btotをプロットし、飽和におけるデータ点(図1を参照のこと)を使用して、化学量論=(Btot−Bfree)飽和/Atotの式から化学量論を計算する。
Claims (6)
- 第1の分子種と第2の分子種との複合体形成相互作用の結合化学量論を求める方法であって、当該方法が、
a1)所定の初期活性濃度の第1の分子種と第2の分子種を含む溶液を調製する段階であって、第2の分子種の初期活性濃度が、第1の分子種に対する第2の分子種の結合の飽和を生じさせるのに十分であるように選択される段階と、
a2)第2の分子種の遊離活性濃度を決定する段階と、
a3)(第2の分子種の初期活性濃度と遊離活性濃度との差)/(第1の分子種の初期活性濃度)の比を決定する段階と、
a4)上記比から、相互作用の結合化学量論を決定する段階、
又は
b1)それぞれ所定の初期活性濃度を有する第1の分子種及び第2の分子種の溶液を調製する段階と、
b2)第1の分子種の遊離活性濃度を決定する段階と、
b3)第2の分子種の遊離活性濃度を決定する段階と、
b4)(第2の分子種の初期活性濃度と遊離活性濃度との差)/(第1の分子種の初期活性濃度と遊離活性濃度との差)の比を決定する段階と、
b5)上記比から、相互作用の結合化学量論を決定する段階と
を含んでおり、分子種の活性濃度が、活性濃度を決定すべき分子種に対する特異的結合パートナーを担持するセンサ表面を含む相互作用分析センサを用いて決定され、活性濃度の決定が、決定すべき分子を含有する溶液を、少なくとも部分的に物質移動が制限された条件下で異なる流速でセンサ表面と接触させることを含んでいるとともに、校正基準を使用せずに実施される、方法。 - 段階a1)〜a3)が、各溶液が一定所定濃度の第1の分子種と濃度を変化させた第2の分子種を含む複数の溶液を調製し、各溶液で第2の分子種の遊離活性濃度を決定し、第2の分子種の初期活性濃度と遊離活性濃度との差を各溶液について計算し、各々の差をそれぞれの初期活性濃度と関連付けて、その差での飽和レベルを求め、段階a4)で用いることを含む、請求項1記載の方法。
- 相互作用分析センサがバイオセンサである、請求項1又は請求項2記載の方法。
- バイオセンサが質量検知バイオセンサである、請求項3記載の方法。
- バイオセンサがエバネセント波検知に基づくバイオセンサである、請求項4記載の方法。
- バイオセンサが表面プラズモン共鳴(SPR)に基づくバイオセンサである、請求項4記載の方法。
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