JP4755871B2

JP4755871B2 - バイオチップ用基板及びバイオチップの製造方法

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Publication number: JP4755871B2
Application number: JP2005270252A
Authority: JP
Inventors: 康博五所尾; 孝朗黒岩; 尚弘石川; 太輔小原; 信介山崎
Original assignee: Azbil Corp
Current assignee: Azbil Corp
Priority date: 2005-09-16
Filing date: 2005-09-16
Publication date: 2011-08-24
Anticipated expiration: 2025-09-16
Also published as: CN101263390B; CN101263390A; JP2007078631A

Description

本発明は生体分子検出技術に関し、特にバイオチップ用基板及びバイオチップの製造方法に関する。

バイオチップとは、被検対象であるターゲット生体分子と特異的に結合するプローブ生体分子を基板表面の特定位置に固定した素子の総称である。バイオチップの代表例であるDNAチップは、血液や細胞の抽出液に含まれるターゲットDNAの種類と量を検出するために使用されている。DNAチップにおいては、例えばスライドガラス板等の基板上に、それぞれ既知の配列を有する1本鎖DNAであるプローブDNAが、数千〜数万種類、アレイ状に配列されている。DNAチップに蛍光標識させたターゲットDNAを含む被験液を供給すると、配列がプローブDNAと相補関係にあるターゲットDNAのみがプローブDNAと水素結合で結合して相補的2本鎖を形成する。そのため、ターゲットDNAが固定された部分が蛍光発色するので、基板上の蛍光発色位置とその発色強度を測定することにより、ターゲットDNAの種類と量を知ることができる。したがってDNAチップを製造する際には、基板表面の特定位置のみに所定配列のプローブDNAを固定することが必要である（例えば、特許文献1参照。）。しかし、特定位置のみにプローブDNAを固定するのは困難であることから、特定位置以外に結合したプローブDNAに反応したターゲットDNAが検出工程の際にバックグランドノイズとなり、DNAチップの検査精度を低下させる要因となっていた。
特表２００２−５３７８６９号公報

本発明は、検出工程の際にバックグランドノイズの無いバイオチップ用基板、バイオチップ、バイオチップ用基板の製造方法、及びバイオチップの製造方法を提供する。

本発明の第1の態様によれば、表面に複数の水酸基を導入可能な基体と、基体上に配置され、基体に達する複数のウェルが設けられた金属系膜と、金属系膜上に配置された架橋性の高分子膜と、を備え、それぞれ高分子膜及び金属系膜を貫通し、基体表面を露出させる複数のウェルが設けられており、高分子膜は、エポキシ樹脂からなり、高分子膜は、生体分子が基体に導入される間、金属系膜の表面を保護し、また、高分子膜は、生体分子が基体に導入された後、アルカリ溶液に浸されることにより、金属系膜の表面から剥がされる、バイオチップ用基板が提供される。

本発明の第2の態様によれば、基体を準備するステップと、基体上に金属系膜を形成するステップと、金属系膜上にエポキシ樹脂からなる高分子膜を形成するステップと、高分子膜の一部を選択的に除去するステップと、一部が選択的に除去された高分子膜をエッチマスクとして用いて、それぞれ高分子膜及び金属系膜を貫通し、基体表面を露出させる複数のウェルを形成するステップと、複数のウェルから表出する基体の表面に複数の水酸基を導入するステップと、複数の水酸基に複数のプローブ生体分子を各々結合させるステップと、金属系膜及び高分子膜をアルカリ溶液に浸し、高分子膜を金属系膜から剥離させるステップと、を含むバイオチップの製造方法が提供される。

本発明の第3の態様によれば、基体、基体上に配置された金属系膜、及び金属系膜上に配置されたエポキシ樹脂からなる高分子膜を備えるバイオチップ用基板であって、それぞれ高分子膜及び金属系膜を貫通し、基体表面を露出させる複数のウェルが設けられており、複数のウェルから表出する基体の表面に導入された複数の水酸基を更に備えるバイオチップ用基板を準備するステップと、複数の水酸基に複数のプローブ生体分子を各々結合させるステップと、金属系膜及び高分子膜をアルカリ溶液に浸し、高分子膜を金属系膜から剥離させるステップと、を含むバイオチップの製造方法が提供される。

本発明によれば、検出工程の際にバックグランドノイズの無いバイオチップ用基板、バイオチップ、バイオチップ用基板の製造方法、及びバイオチップの製造方法を提供可能である。

以下に本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。但し、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。

（第1の実施の形態）
本発明の第1の実施の形態に係るバイオチップ用基板は、図1及びA-A方向から見た断面図である図2に示すように、表面に複数の水酸(-OH)基を導入可能な基体15、及び基体15上に配置され、基体15に達する複数のウェル41a, 41b, 41c, 41d, 41e, 41f, 41g, 41h, 41i, 42a, 42b, 42c, 42d, 42e, 42f, 42g, 42h, 42i, 43a, 43b, 43c, 43d, 43e, 43f, 43g, 43h, 43i, 44a, 44b, 44c, 44d, 44e, 44f, 44g, 44h, 44i, 45a, 45b, 45c, 45d, 45e, 45f, 45g, 45h, 45i, 46a, 46b, 46c, 46d, 46e, 46f, 46g, 46h, 46i, 47a, 47b, 47c, 47d, 47e, 47f, 47g, 47h, 47i, 48a, 48b, 48c, 48d, 48e, 48f, 48g, 48h, 48i, 49a, 49b, 49c, 49d, 49e, 49f, 49g, 49h, 49iが設けられた金属系膜13を備える。基体15の膜厚は例えば550μmであり、基体15の材料としては合成石英(SiO₂)及び表面に自然酸化膜が形成されたシリコン基板等が使用可能である。金属系膜13の膜厚は例えば10nm〜10μmであり50nmが好適である。金属系膜13の材料としてはチタン(Ti)、白金(Pt)、クロム(Cr)、ニオブ(Nb)、タンタル(Ta)、及びタングステン(W)等の遷移金属、或いはアルミニウム(Al)及び金(Au)等の金属が使用可能であり、特にTiが好適である。金属系膜13の材料としては、他に、一酸化チタン(TiO)或いは二酸化チタン(TiO₂)等の遷移金属酸化物、窒化チタン(TiN)等の遷移金属窒化物、及び炭化チタン(TiC)等の遷移金属炭化物等が使用可能である。また金属系膜13の材料として酸化インジウム錫ITO(Indium Tin Oxide) 等も使用可能である。

さらに第1の実施の形態に係るバイオチップ用基板は、金属系膜13上に配置された架橋性の高分子膜11を備える。高分子膜11はフッ酸(HF)、硝酸(HNO₃)、及び水(H₂O)の混合液等の酸性溶液に対して不溶性であり、例えば膜厚は20μmである。高分子膜11の材料としては紫外線に対して感光性のエポキシ樹脂が使用可能であり、化薬マイクロケム社のエスユー8(SU-8)3000シリーズ等が好適である。高分子膜11は、図3に示すように、それぞれ架橋された複数のエポキシ樹脂111a, 111b, 111c, 111dからなる。

以上、図1乃至図3に示したバイオチップ用基板を用いてバイオチップを作成すると、後に図26を用いて詳述するように、複数のウェル41a〜41i, 42a〜42i, 43a〜43i, 44a〜44i, 45a〜45i, 46a〜46i, 47a〜47i, 48a〜48i, 49a〜49iから表出する基体15表面にプローブ生体分子を導入した後、プローブ生体分子に含まれるアミノ基をアルカリ溶液で脱保護する際に、高分子膜11を金属系膜13から容易に剥離することが可能となる。特に高分子膜11の材料にSU-8を用いると、金属系膜13からの剥離がより容易となる。プローブ生体分子を導入後に高分子膜11は金属系膜13から容易に剥離可能となるので、金属系膜13の表面にプローブ生体分子が導入されることを防ぐことが可能となる。したがって、複数のウェル41a〜41i, 42a〜42i, 43a〜43i, 44a〜44i, 45a〜45i, 46a〜46i, 47a〜47i, 48a〜48i, 49a〜49iから表出する基体15表面にのみプローブ生体分子が導入され、金属系膜13の表面にはプローブ生体分子が付着しないことから、ターゲット生体分子の検出工程においてバックグランドノイズを無くすことが可能となる。プローブ生体分子を導入後の容易な剥離は、高分子膜11と金属系膜13との組み合わせで観察される現象である。そのため、第1の実施の形態に係るバイオチップ用基板においては、基体15上に金属膜13が配置され、さらに金属膜13上に高分子膜11が配置されている。

次に、図4乃至図6を用いて、第1の実施の形態に係るバイオチップ用基板の製造方法について説明する。

(a) 図4に示すように、SiO₂等からなる基体15を用意し、基体15上にTi等からなる金属系膜13をスパッタリング法又は化学的気相堆積法(CVD)法等を用いて形成する。金属系膜13形成後、表面を酸素(O₂)プラズマで5分間処理する。次に図5に示すように、金属系膜13上にSU-8-3000等の感光性のエポキシ樹脂含有溶液をスピン塗布し高分子膜11を形成する。スピン塗布の条件としては、例えば、5秒かけて毎分300回転まで加速し、10秒間毎分300回転を維持する。さらに5秒かけて毎分500回転まで加速し、15秒間毎分500回転を維持する。その後5秒かけて毎分4500回転まで加速し、30秒間毎分4500回転を維持する。最後に5秒かけてスピンを停止させる。

(b) 高分子膜11を形成後、高分子膜11を予備硬化（プリベーク）処理する。まず基体15を65℃に設定されたホットプレートにのせ、2分経過後、ホットプレートを80℃に設定する。20分経過後、ホットプレートを95℃に設定し、15分間放置する。15分経過後、ホットプレートの電源を切り、1時間放置する。その後、図1に示した複数のウェル41a〜41i, 42a〜42i, 43a〜43i, 44a〜44i, 45a〜45i, 46a〜46i, 47a〜47i, 48a〜48i, 49a〜49iのそれぞれの形状に対応するマスクパターンを有するフォトマスクを用いて、紫外線で高分子膜11の一部を選択的に露光する。露光後、高分子膜11を露光後ベーク(PEB)処理する。具体的には、基体15を65℃に設定されたホットプレートにのせ、2分経過後、ホットプレートを95℃に設定し、6分間放置する。6分経過後、ホットプレートの電源を切り、1時間放置する。その後SU-8現像液等を用いて高分子膜11を現像すると、高分子膜11は感光性を有するため、図6に示すように、高分子膜11の一部が選択的に除去される。

(c) 一部が選択的に除去された高分子膜11をエッチングマスクとして用いて、金属系膜13の一部を等方性のウェットエッチングにより選択的に除去する。エッチング溶液としてはフッ酸(HF)、硝酸(HNO₃)、及び水(H₂O)の混合液等が使用可能である。選択的除去により、図2に示した複数のウェル41a〜41i, 42a〜42i, 43a〜43i, 44a〜44i, 45a〜45i, 46a〜46i, 47a〜47i, 48a〜48i, 49a〜49iのそれぞれが形成され、第1の実施の形態に係るバイオチップ用基板の製造方法を終了する。

以上示した第1の実施の形態に係るバイオチップ用基板の製造方法によれば、SU-8-3000等からなる架橋性の高分子膜11はエッチング溶液に対して強い耐溶剤性を有するため、ウェットエッチング後に高分子膜11を除去し、新しい保護膜を金属系膜13上に形成する必要がなくなる。そのため、高分子膜11を複数のウェル41a〜41i, 42a〜42i, 43a〜43i, 44a〜44i, 45a〜45i, 46a〜46i, 47a〜47i, 48a〜48i, 49a〜49iのそれぞれを形成する際のエッチマスクとして用い、さらにエッチング工程の後も金属系膜13の保護膜として活用することが可能となる。なお、金属系膜13形成後のO₂プラズマ処理は省略可能である。

（第2の実施の形態）
本発明の第2の実施の形態に係るバイオチップは、図7及びA-A方向から見た断面図である図8に示すように、基体15、及び基体15上に配置され、基体15に達する複数のウェル41a, 41b, 41c, 41d, 41e, 41f, 41g, 41h, 41i, 42a, 42b, 42c, 42d, 42e, 42f, 42g, 42h, 42i, 43a, 43b, 43c, 43d, 43e, 43f, 43g, 43h, 43i, 44a, 44b, 44c, 44d, 44e, 44f, 44g, 44h, 44i, 45a, 45b, 45c, 45d, 45e, 45f, 45g, 45h, 45i, 46a, 46b, 46c, 46d, 46e, 46f, 46g, 46h, 46i, 47a, 47b, 47c, 47d, 47e, 47f, 47g, 47h, 47i, 48a, 48b, 48c, 48d, 48e, 48f, 48g, 48h, 48i, 49a, 49b, 49c, 49d, 49e, 49f, 49g, 49h, 49iが設けられた金属系膜13を備える。基体15及び金属系膜13のそれぞれの膜厚と材料は図1に示すバイオチップ用基板と同様であるので説明は省略する。

さらに第2の実施の形態に係るバイオチップは、図8に示すように、複数のウェル41a〜41iのそれぞれを介して表出する基体15の表面に配置された複数の生体物質層91a, 91b, 91c, 91d, 91e, 91f, 91g, 91h, 91iを備える。複数の生体物質層91a〜91iのそれぞれにおいては、複数のデオキシリボ核酸(DNA)、複数のリボ核酸(RNA)、複数のペプチド核酸(PNA)、あるいは複数のタンパク質等の複数のプローブ生体分子のそれぞれの官能基が、図9に示すように基体15表面の水酸(-OH)基と共有結合している。プローブ生体分子がDNA、RNA、あるいはPNAである場合は、それぞれの配列はターゲット生体分子と相補的となるよう設計される。

なお、基体15表面に直接生体物質層91a〜91iのそれぞれを配置することに第2の実施の形態は限定されない。図10に示す例では、基体15の複数のウェル41a〜41iのそれぞれを介して表出する部分の表面上に、シランカップリング層81a, 81b, 81c, 81d, 81e, 81f, 81g, 81h, 81iが配置されている。シランカップリング層81a〜81iのそれぞれにおいては、図11に示すように、複数のシランカップリング剤のそれぞれのメチル基(-CH₃)あるいはエチル基(-C₂H₅)が基体15表面の水酸(-OH)基と酸塩基反応で化学結合している。

複数のシランカップリング剤のそれぞれには、3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、3-グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、3-グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、N-2（アミノエチル）3-アミノプロピルメチルジメトキシシラン、N-2（アミノエチル）3-アミノプロピルトリメトキシシラン、N-2（アミノエチル）3-アミノプロピルトリエトキシシラン、3-アミノプロピルトリメトキシシラン、及び3-アミノプロピルトリエトキシシラン等が使用可能である。

シランカップリング層81a〜81iのそれぞれの上には、生体物質層91a, 91b, 91c, 91d, 91e, 91f, 91g, 91h, 91iが配置されている。生体物質層91a〜91iのそれぞれにおいては、複数のプローブ生体分子のそれぞれに導入されたリン酸アミダイト誘導体がシランカップリング層81a〜81iのシランカップリング剤のエポキシ基と加水分解反応により共有結合している。

あるいは、シランカップリング剤とプローブ生体分子は架橋剤を介して結合してもよい。例えば、受容体、リガンド、アンタゴニスト、抗体、抗原等のタンパク質に含まれるリジン(Lys)のアミノ(-NH₂)基、アスパラギン酸(Asp)及びグルタミン酸(Glu)のカルボキシル(-COOH)基、チロシン(Tyr)のフェノール(-C₆H₄(OH))基、ヒスチジン(His)のイミダゾール(-C₃H₃N₂)基、システイン(Cys)のチオール(-SH)基等の官能基と、シランカップリング剤のアミノ基やエポキシ基とを架橋剤で結合してもよい。図12に示す例においては、シランカップリング剤のアミノ(-NH₂)基と抗体95a, 95b, 95cのアミノ(-NH₂)基とを、両端でアミノ(-NH₂)基と反応する架橋剤であるジスクシンイミジルスベレート(Disuccinimidyl suberate : DSS)で結合している。

架橋剤としては、他に、両端でアミノ基と反応するビスサルフォスクシンイミジルスベレート(Bis [Sulfosuccinimidyl] suberate : BS³)、ジメチルスベルイミデート(Dimethyl suberimidate・HCl : DMS)、ジスクシンイミジルグルタレート(Disuccinimidyl glutarate : DSG)、ローマン試薬(Loman's Reagent)、 3, 3' - ジチオビスサルフォスクシンイミジルプロピオネート(3, 3' - Dithiobis [sulfosuccinimidyl propionate] : DTSSP)、エチレングリコールビススクシンイミジルスクシネート(Ethylene glycol bis [succinimidylsuccinate] : EGS)、アミノ基とカルボキシル基と反応する1-エチル - 3 - [3 - ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドヒドロクロライド(1 - Ethyl - 3 - [3 - Dimethylaminopropyl] carbodiimide Hydrochloride : EDC)等が使用可能である。

またさらに架橋剤としては、アミノ基とチオール基と反応するm-マレイミドベンジル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(m - Maleimidobenzyl - N - hydroxysuccinimide ester : MBS)、スクシンイミジル4 - [N - マレイミドメチル] - シクロヘキサン - 1 - カルボキシレート(Succinimidyl 4 - [N - maleimidomethyl] - cyclohexane - 1 - carboxylate : SMCC)、スクシンイミジル 4 - [p - マレイミドフェニル] - ブチレート(Succinimidyl 4 - [p - maleimidophenyl] - buthrate : SMPB)、 N-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(N - Succinimidyl 3 - [2 - pyridyldithio] propionate : SPDP)、N-(γ-マレイミドブチリルオキシ)サルフォスクシンイミドエステル(N - [γ - Maleimidobutyloxy] sulfosuccinimide ester : Sulfo - GMBS)、サルフォスクシンイミジル6 - [3' (2 - ピリジルジチオ) - プロピオンアミド] ヘキサノエート(Sulfosuccinimidyl 6 - [3' (2 - pyridyldithio) - propionamide] hexanoate : Sulfo - LC - SPDP)、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシサルフォスクシンイミドエステル(m - Maleimidebenzoyl - N - hydoroxysulfo - succinimide ester : Sulfo - MBS)、サルフォスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(Sulfosuccinimidyl 4 [N - maleimidomethyl] - cyclohexane - 1 - carboxylate : Sulfo - SMCC)、サルフォスクシンイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート(Sulfosuccinimidy 4 - [p - maleimidophenyl] - butyrate : Sulfo - SMPB)等が使用可能である。なお、図7に示す他の複数のウェル42a〜42i, 43a〜43i, 44a〜44i, 45a〜45i, 46a〜46i, 47a〜47i, 48a〜48i, 49a〜49iのそれぞれの断面図も、図8乃至図12と同様であるので説明は省略する。

次に、図13乃至図27を用いて、第2の実施の形態に係るバイオチップの製造方法について説明する。

(a) まず図1及び図2に示したバイオチップ用基板を用意する。次にバイオチップ用基板を撹拌された水酸化ナトリウム(NaOH)溶液中に室温で2時間放置する。ここでNaOH溶液とは、98gのNaOH、294mlの蒸留水、及び392mlのエタノールを混合した溶液である。NaOH溶液中に放置することにより、図13に示すように、ウェル41a〜41iのそれぞれから表出する基体15の表面に複数の水酸(-OH)基が導入される。なお、水酸(-OH)基の導入はUVオゾンクリーナ等で行ってもよい。

(b) 3-グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、3-グリシドキシプロピルトリエトキシシラン等の官能基にエポキシ基を有するシランカップリング剤、あるいはN-2（アミノエチル）3-アミノプロピルトリエトキシシラン、3-アミノプロピルトリメトキシシラン、3-アミノプロピルトリエトキシシラン等の官能基にアミンを有するシランカップリン剤等を図2に示すウェル41a〜41iのそれぞれから表出する基体15の表面上に滴下し、図14に示すシランカップリング層81a, 81b, 81c, 81d, 81e, 81f, 81g, 81h, 81iのそれぞれを形成させる。例えば、エポキシ基を有するシランカップリング剤を15℃の環境下で滴下した場合、図15に示すように、基体15表面に複数のエポキシ基が導入される。なお、図14に示す金属系膜13が不透明であれば、シランカップリング剤を滴下する時に、ウェル41a〜41iの位置の判別が容易となる。

(c) 基体15表面に残った未反応の水酸(-OH)基を、例えば、無水酢酸と1-メチルイミダゾール（テトラヒドロフラン溶液）で処理してアセチル化し、キャッピングする。次に図16に示すように、基体15表面に導入されたシランカップリング剤のエポキシ基を加水分解し、シランカップリング層81a〜81iのそれぞれに水酸(-OH)基を導入する。

(d) 図17に示すように、5’末端がジメトキシトリチル(DMTr)基で保護され、3'末端の水酸基が三価のリン酸アミダイト誘導体にされた1塩基目のヌクレオシドを準備する。なお図18に示すように、ヌクレオシドに含まれるアデニン(A)及びシトシン(C)のアミノ基はベンゾイル基で保護されており、グアニン(G)のアミノ基はイソブチル基で保護されている。次に1塩基目のヌクレオシドを、図14に示すシランカップリング層81a〜81iのそれぞれに滴下する。滴下によって、図19に示すようにシランカップリング剤の水酸(-OH)基に1塩基目のヌクレオシドのリン酸シアノエチルアミダイト誘導体を塩基触媒等を用いて結合させる。

(e) シランカップリング剤の未反応の水酸(-OH)基は無水酢酸と1-メチルイミダゾール（テトラヒドロフラン溶液）で処理してアセチル化し、2塩基目以降のヌクレオシドとの結合を阻害する。次に、1塩基目のヌクレオシドのジメトキシトリチル(DMTr)基を3%トリクロロ酢酸/ジクロロメタン酸性溶剤で脱保護し、図20に示すように5’水酸(-OH)基を1塩基目のヌクレオシドに導入する。

(f) 3'末端の水酸基が三価のリン酸アミダイト誘導体にされた2塩基目のヌクレオシドをシランカップリング層81a〜81iに滴下し、図21に示すように、1塩基目のヌクレオシドの5’水酸(-OH)基に2塩基目のヌクレオシドのリン酸シアノエチルアミダイト誘導体を塩基触媒等を用いて縮合反応で結合させる。なお、1塩基目のヌクレオシドの未反応の5’水酸(-OH)基は無水酢酸とテトラヒドロフラン溶液で処理してアセチル化し、キャッピングする。

(g) 縮合反応で生じた亜リン酸トリエステル結合は、ヨウ素と水（ピリジン含有テトラヒドロフラン溶液）で酸化し、図22に示すように、より安定なリン酸トリエステル結合に変換させる。その後、2塩基目のジメトキシトリチル(DMTr)基を除去し、図23に示すように目的のDNA鎖長になるまでヌクレオシドホスホロアミダイトとの縮合反応を繰り返し、図10に示した生体物質層91a〜91iを形成する。

(h) DNA伸長後、高分子膜11が浸るように基体15を55℃でアンモニア(NH₄OH)水等のアルカリ溶液に30分間沈めるアルカリ溶液処理を行う。なお、NH₄OH水の重量パーセント濃度は調整時で40%である。アルカリ溶液処理により、図24に示すように、リン酸基に結合したシアノエチル保護基が脱離する。またアデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)等の塩基が図25に示すように脱保護される。さらにアルカリ溶液処理により、金属系膜13と高分子膜11の密着力が低下する。その後、基体15をNH₄OH水から取り出し、図26に示す高分子膜11の側面115にエアガン等で空気等の気体を吹き付け、高分子膜11を金属系膜13から剥離させる。最後に末端のジメトキシトリチル(DMTr)基を図27に示すように脱保護し、第2の実施の形態に係るバイオチップの製造方法を終了する。

従来のバイオチップの製造方法においては、生体物質層を形成中は複数のウェルが設けられた膜を高分子膜等で保護し、その後高分子膜を複数のウェルが設けられた膜から簡易に剥離する技術がなかった。そのため、複数のウェルが設けられた膜を保護しないで生体物質層を形成すると、複数のウェルが設けられた膜の表面にシランカップリング剤が結合し、シランカップリング剤にプローブ生体分子が結合していた。ゆえに、複数のウェルが設けられた膜上にも蛍光標識されたターゲット生体分子が結合し、検出工程の際にバックグランドノイズになるという問題があった。特に微量検定においては、複数のウェルのそれぞれから表出する基板表面のみにターゲット生体分子がトラップされ、複数のウェルが設けられた膜上にはターゲット生体分子がトラップされないようにして、蛍光検定のコントラスト向上を可能にする技術がのぞまれていた。

これに対し、第2の実施の形態に係るバイオチップの製造方法によれば、図13乃至図27に示したように、生体物質層91a〜91i形成中は金属系膜13が高分子膜11で保護されており、生体物質層91a〜91i形成後は、高分子膜11が金属系膜13から剥離される。そのため、金属系膜13上にプローブ生体分子が導入されず、結果として金属系膜13上にターゲット生体分子が結合しない。したがって、第2の実施の形態に係るバイオチップを用いれば、ターゲット生体分子の検出工程においてバックグランドノイズが生じないため、高い精度でターゲット生体分子の種類及び濃度等を検出することが可能となる。さらに図17乃至図25に示したDNA合成過程において、高分子膜11が金属系膜13上に配置されているため、複数のウェル42a〜49iのそれぞれの深さを確保することも可能となる。そのため、DNA合成に充分な合成試薬を複数のウェル42a〜49iのそれぞれに滴下することも可能となる。また高分子膜11は、シアノエチル保護基の脱離や、アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)等の脱保護に使用されるNH₄OH水に浸すことで、金属系膜13から簡単に剥離することが可能である。そのため、高分子膜11を剥離するための特別な剥離用溶液を調整する必要はなく、また高分子膜11を特別な剥離用溶液に浸す必要も無いことから、生体物質層91a〜91i中のプローブ生体分子が損傷されるおそれも無い。高分子膜11が容易に剥離できる現象は、高分子膜11が金属系膜13上に形成された場合に特異的に見られる現象であり、従来、金属系膜13上に保護膜として高分子膜11を形成するバイオチップの製造方法はなかった。特に高分子膜11がSU-8-3000からなり、金属系膜13がTiからなる場合に、良好な剥離性が示される。なお図13乃至図27においては、複数のウェル42a〜42i, 43a〜43i, 44a〜44i, 45a〜45i, 46a〜46i, 47a〜47i, 48a〜48i, 49a〜49iのそれぞれから供出する基体15上にシランカップリング層81a〜81iを形成した後に生体物質層91a〜91iを形成する方法を説明したが、図13に示した複数の水酸(-OH)基のそれぞれにプローブ生体分子をシランカップリング層81a〜81iを介さずに固定してもかまわないのは勿
論である。

（変形例）
図7に示した複数のウェル41a〜41i, 42a〜42i, 43a〜43i, 44a〜44i, 45a〜45i, 46a〜46i, 47a〜47i, 48a〜48i, 49a〜49iのそれぞれに異なる塩基配列を有するプローブDNAを合成することも可能である。以下、複数のウェル41a〜41i, 42a〜42i, 43a〜43i, 44a〜44i, 45a〜45i, 46a〜46i, 47a〜47i, 48a〜48i, 49a〜49iのそれぞれに異なる塩基配列を有するプローブDNAを合成する方法を説明する。

(a) 図14に示すように、シランカップリング層81a〜81iのそれぞれを形成させた後、シランカップリング層81a〜81iのそれぞれに含まれるシランカップリング剤のエポキシ基を加水分解し、シランカップリング層81a〜81iのそれぞれに水酸(-OH)基を導入する。その後、5塩基のチミン(T)を有するヌクレオシドを順次シランカップリング剤に結合させる。次に、ウェル41d, 41e, 41fに図28に示すように埋め込み樹脂を埋め込み、ブロック層130a, 130b, 130cを形成する。埋め込み樹脂の材料には、ジメチルスルホキシド(DMSO)に平均分子量20,000のポリヒドロキシスチレン(PHS)を重量比5%で溶かしたものが使用可能である。

(b) 埋め込み樹脂が埋め込まれなかったウェル41a, 41b, 41c, 41g, 41h, 41iのそれぞれのヌクレオシドのジメトキシトリチル(DMTr)基を3%トリクロロ酢酸/ジクロロメタン酸性溶剤で脱保護する。その後、溶剤でブロック層130a, 130b, 130cを除去する。次に、3'末端の水酸基が三価のリン酸アミダイト誘導体にされた新たなヌクレオシドをウェル41a〜41iに滴下すると、新たなヌクレオシドはジメトキシトリチル(DMTr)基が脱保護されたウェル41a, 41b, 41c, 41g, 41h, 41iのヌクレオシドの5’水酸(-OH)基のみと反応して結合する。

(c) 図14に示したウェル41a, 41b, 41c, 41g, 41h, 41iに図29に示すように埋め込み樹脂を埋め込み、ブロック層131a, 131b, 131c, 131d, 131e, 131fを形成する。次に埋め込み樹脂が埋め込まれなかったウェル41d, 41e, 41fのそれぞれのヌクレオシドのジメトキシトリチル(DMTr)基を3%トリクロロ酢酸/ジクロロメタン酸性溶剤で脱保護し、溶剤でブロック層131a, 131b, 131c, 131d, 131e, 131fを除去する。その後、3'末端の水酸基が三価のリン酸アミダイト誘導体にされた新たなヌクレオシドをウェル41a〜41iに滴下すると、新たなヌクレオシドはジメトキシトリチル(DMTr)基が脱保護されたウェル41d, 41e, 41fのヌクレオシドの5’水酸(-OH)基のみと反応して結合する。

(d) その後、ウェル41a〜41iのいずれかの内部への埋め込み樹脂の充填、ジメトキシトリチル(DMTr)基の脱保護、埋め込み樹脂の除去、及びヌクレオシドの重合反応を繰り返すことにより、複数のウェル41a〜41i, 42a〜42i, 43a〜43i, 44a〜44i, 45a〜45i, 46a〜46i, 47a〜47i, 48a〜48i, 49a〜49iのそれぞれに異なる塩基配列を有するプローブDNAが合成される。

図28及び図29に示したDNA合成過程において、高分子膜11が金属系膜13上に配置されているため、複数のウェル42a〜49iのそれぞれの深さは充分に確保することが可能である。そのため、埋め込み樹脂の複数のウェル42a〜49iのそれぞれへの埋め込みもより簡易となる。

（第3の実施の形態）
第3の実施の形態に係るバイオチップ用基板は、図30及びA-A方向から見た断面図である図31に示すように、表面に複数の水酸基を導入可能な基体15、及び複数の水酸基のそれぞれにプローブ生体分子を結合させる時に基体15上に配置され、基体15の表面におけるプローブ生体分子の結合領域を規定する複数の貫通孔141a, 141b, 141c, 141d, 141e, 141f, 141g, 141h, 141i, 142a, 142b, 142c, 142d, 142e, 142f, 142g, 142h, 142i, 143a, 143b, 143c, 143d, 143e, 143f, 143g, 143h, 143i, 144a, 144b, 144c, 144d, 144e, 144f, 144g, 144h, 144i, 145a, 145b, 145c, 145d, 145e, 145f, 145g, 145h, 145i, 146a, 146b, 146c, 146d, 146e, 146f, 146g, 146h, 146i, 147a, 147b, 147c, 147d, 147e, 147f, 147g, 147h, 147i, 148a, 148b, 148c, 148d, 148e, 148f, 148g, 148h, 148i, 149a, 149b, 149c, 149d, 149e, 149f, 149g, 149h, 149iを有する保護部材211を備える。

保護部材211は、複数の貫通孔141a〜149iのそれぞれから表出する基体15の表面にプローブ生体分子を導入する間、基体15上に密着して配置される。保護部材211の材料としては、SU-8等の樹脂、シリコン(Si)ゴムやポリジメチルシロキサン(PDMS)等、核酸合成試薬に対して剥離耐性を有する材料が使用可能である。基体15の表面にプローブ生体分子を導入する方法は、図15乃至図25で説明した方法と同様であるので、説明は省略する。複数の貫通孔141a〜149iのそれぞれから表出する基体15の表面にプローブ生体分子が導入された後、保護部材211は基体15上から取り除かれる。保護部材211が基体15から取り除かれた後は、基体15上には複数の貫通孔141a〜149iのそれぞれから表出していた部分のみにプローブ生体分子が導入されており、その他の部分はプローブ生体分子が導入されていない。そのため、基体15表面においてターゲット生体分子は、複数の貫通孔141a〜149iのそれぞれから表出していた部分にのみ結合し、その他の部分には結合しない。したがって、ターゲット生体分子の検出工程において、ターゲット生体分子が基体15表面に非特異的に結合することにより生じるバックグラウンドノイズをなくすことが可能となる。なお、第1及び第2の実施の形態で説明したように、基体15と保護部材211の間に金属系膜を配置してもよいことは勿論である。

（その他の実施の形態）
上記のように、本発明は実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす記述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施の形態及び運用技術が明らかになるはずである。例えば、基体15に透明基板を用い、図7に示す複数のウェル41a〜41i, 42a〜42i, 43a〜43i, 44a〜44i, 45a〜45i, 46a〜46i, 47a〜47i, 48a〜48i, 49a〜49iのそれぞれの直径を少なくとも300μmとし、金属系膜13を遮光性とすることによって、肉眼で容易に発色反応を確認することも可能となる。また図30に示すように、複数のウェル41a〜41i, 42a〜42i, 43a〜43i, 44a〜44i, 45a〜45i, 46a〜46i, 47a〜47i, 48a〜48i, 49a〜49iのそれぞれの間に溝120a, 120b, 120c, 120dを金属系膜13に設けることにより、複数のウェル41a〜41i, 42a〜42i, 43a〜43i, 44a〜44i, 45a〜45i, 46a〜46i, 47a〜47i, 48a〜48i, 49a〜49iのそれぞれの肉眼による存在位置の判別がより容易になる。また溝120a〜120dを金属系膜13に設けると、バイオチップの製造工程において高分子膜11の金属系膜13からの剥離もより容易になる。この様に、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を包含するということを理解すべきである。したがって、本発明はこの開示から妥当な特許請求の範囲の発明特定事項によってのみ限定されるものである。

本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップ用基板の上面図である。本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップ用基板の断面図である。本発明の第１の実施の形態に係る高分子膜の組成を示す化学式である。本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップ用基板の第１の工程断面図である。本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップ用基板の第２の工程断面図である。本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップ用基板の第３の工程断面図である。本発明の第２の実施の形態に係るバイオチップの上面図である。本発明の第２の実施の形態に係るバイオチップの第１の断面図である。本発明の第２の実施の形態に係るバイオチップの第１の拡大断面図である。本発明の第２の実施の形態に係るバイオチップの第２の断面図である。本発明の第２の実施の形態に係るバイオチップの第２の拡大断面図である。本発明の第２の実施の形態に係るバイオチップの第３の拡大断面図である。本発明の第２の実施の形態に係るバイオチップの第１の工程断面図である。本発明の第２の実施の形態に係るバイオチップの第２の工程断面図である。本発明の第２の実施の形態に係るバイオチップの第３の工程断面図である。本発明の第２の実施の形態に係るバイオチップの第４の工程断面図である。本発明の第２の実施の形態に係るヌクレオシドホスホロアミダイトの化学式である。本発明の第２の実施の形態に係るヌクレオシドの塩基の第１の化学式である。本発明の第２の実施の形態に係るバイオチップの第５の工程断面図である。本発明の第２の実施の形態に係るバイオチップの第６の工程断面図である。本発明の第２の実施の形態に係るバイオチップの第７の工程断面図である。本発明の第２の実施の形態に係るバイオチップの第８の工程断面図である。本発明の第２の実施の形態に係るバイオチップの第９の工程断面図である。本発明の第２の実施の形態に係るバイオチップの第１０の工程断面図である。本発明の第２の実施の形態に係るヌクレオシドの塩基の第２の化学式である。本発明の第２の実施の形態に係るバイオチップの第１１の工程断面図である。本発明の第２の実施の形態に係るバイオチップの第１２の工程断面図である。本発明の実施の形態の変形例に係るバイオチップの第１の工程断面図である。本発明の実施の形態の変形例に係るバイオチップの第２の工程断面図である。本発明の第３の実施の形態に係るバイオチップ用基板の上面図である。本発明の第３の実施の形態に係るバイオチップ用基板の断面図である。本発明のその他の実施の形態に係るバイオチップの上面図である。

符号の説明

11…高分子膜
13…金属系膜
15…基体
41a, 41b, 41c, 41d, 41e, 41f, 41g, 41h, 41i, 42a, 42b, 42c, 42d, 42e, 42f, 42g, 42h, 42i, 43a, 43b, 43c, 43d, 43e, 43f, 43g, 43h, 43i, 44a, 44b, 44c, 44d, 44e, 44f, 44g, 44h, 44i, 45a, 45b, 45c, 45d, 45e, 45f, 45g, 45h, 45i, 46a, 46b, 46c, 46d, 46e, 46f, 46g, 46h, 46i, 47a, 47b, 47c, 47d, 47e, 47f, 47g, 47h, 47i, 48a, 48b, 48c, 48d, 48e, 48f, 48g, 48h, 48i, 49a, 49b, 49c, 49d, 49e, 49f, 49g, 49h, 49i…ウェル
81a, 81b, 81c, 81d, 81e, 81f, 81g, 81h, 81i…シランカップリング層
91a, 91b, 91c, 91d, 91e, 91f, 91g, 91h, 91i…生体物質層
95a, 95b, 95c…抗体
111a, 111b, 111c, 111d…エポキシ樹脂
115…側面
120a, 120b, 120c, 120d…溝
130a,130b, 130c…ブロック層
141a, 141b, 141c, 141d, 141e, 141f, 141g, 141h, 141i, 142a, 142b, 142c, 142d, 142e, 142f, 142g, 142h, 142i, 143a, 143b, 143c, 143d, 143e, 143f, 143g, 143h, 143i, 144a, 144b, 144c, 144d, 144e, 144f, 144g, 144h, 144i, 145a, 145b, 145c, 145d, 145e, 145f, 145g, 145h, 145i, 146a, 146b, 146c, 146d, 146e, 146f, 146g, 146h, 146i, 147a, 147b, 147c, 147d, 147e, 147f, 147g, 147h, 147i, 148a, 148b, 148c, 148d, 148e, 148f, 148g, 148h, 148i, 149a, 149b, 149c, 149d, 149e, 149f, 149g, 149h, 149i…貫通孔
211…保護部材

Claims

表面に複数の水酸基を導入可能な基体と、
前記基体上に配置された金属系膜と、
前記金属系膜上に配置された架橋性の高分子膜と、
を備え、
それぞれ前記高分子膜及び前記金属系膜を貫通し、前記基体表面を露出させる複数のウェルが設けられており、
前記高分子膜は、エポキシ樹脂からなり、
前記高分子膜は、生体分子が前記基体に導入される間、前記金属系膜の表面を保護し、また、前記高分子膜は、前記生体分子が前記基体に導入された後、アルカリ溶液に浸されることにより、前記金属系膜の表面から剥がされる、
バイオチップ用基板。
前記基体は、酸化ケイ素からなる、請求項１に記載のバイオチップ用基板。
前記金属系膜は、チタンからなる、請求項１又は２に記載のバイオチップ用基板。
前記金属系膜は、遷移金属酸化物からなる、請求項１又は２に記載のバイオチップ用基板。
前記金属系膜は、遷移金属窒化物からなる、請求項１又は２に記載のバイオチップ用基板。
前記金属系膜は、遷移金属炭化物からなる、請求項１又は２に記載のバイオチップ用基板。
前記高分子膜は酸性溶液に対して不溶性である、請求項１乃至６のいずれか１項に記載のバイオチップ用基板。
前記高分子膜は、感光性を有する、請求項１乃至７のいずれか１項に記載のバイオチップ用基板。
前記高分子膜は、エスユー８からなる、請求項１乃至８のいずれか１項に記載のバイオチップ用基板。
基体を準備するステップと、
前記基体上に金属系膜を形成するステップと、
前記金属系膜上にエポキシ樹脂からなる高分子膜を形成するステップと、
前記高分子膜の一部を選択的に除去するステップと、
前記一部が選択的に除去された高分子膜をエッチマスクとして用いて、それぞれ前記高分子膜及び前記金属系膜を貫通し、前記基体表面を露出させる複数のウェルを形成するステップと、
前記複数のウェルから表出する前記基体の表面に複数の水酸基を導入するステップと、
前記複数の水酸基に複数のプローブ生体分子を各々結合させるステップと、
前記金属系膜及び前記高分子膜をアルカリ溶液に浸し、前記高分子膜を前記金属系膜から剥離させるステップと、
を含む、バイオチップの製造方法。
基体、前記基体上に配置された金属系膜、及び前記金属系膜上に配置されたエポキシ樹脂からなる高分子膜を備えるバイオチップ用基板であって、それぞれ前記高分子膜及び前記金属系膜を貫通し、前記基体表面を露出させる複数のウェルが設けられており、前記複数のウェルから表出する前記基体の表面に導入された複数の水酸基を更に備えるバイオチップ用基板を準備するステップと、
前記複数の水酸基に複数のプローブ生体分子を各々結合させるステップと、
前記金属系膜及び前記高分子膜をアルカリ溶液に浸し、前記高分子膜を前記金属系膜から剥離させるステップと、
を含む、バイオチップの製造方法。
前記基体は、酸化ケイ素からなる、請求項１０又は１１に記載のバイオチップの製造方法。
前記金属系膜は、チタンからなる、請求項１０乃至１２のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
前記金属系膜は、遷移金属酸化物からなる、請求項１０乃至１２のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
前記金属系膜は、遷移金属窒化物からなる、請求項１０乃至１２のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
前記金属系膜は、遷移金属炭化物からなる、請求項１０乃至１２のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
前記高分子膜は、エスユー８からなる、請求項１０乃至１６のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
前記複数のプローブ生体分子に含まれるアミノ基を前記アルカリ溶液で脱保護するステップを更に含む、請求項１０乃至１７のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
前記高分子膜を前記金属系膜から剥離させるステップは、前記高分子膜の側面に気体を吹き付ける手順を含む、請求項１０乃至１８のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。