DE69531717T2 - Elektrisch leitfähige und elektroaktive kunjugierte und funktionnalisierte polymere und ihre anwendung - Google Patents

Elektrisch leitfähige und elektroaktive kunjugierte und funktionnalisierte polymere und ihre anwendung Download PDF

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Description

  • Konjugierte Polymere, wie Polypyrrole, Polythiophene, Polyaniline, Polyphenylene und deren Derivate sind für ihren elektroaktiven Charakter bekannt, wie dies umfangreich in Zeitschriften wie dem „Handbook of Organic Conducting Polymers" (T. J. Skotheim/Herausgeber, Marcel Dekker, New York, 1986) beschrieben ist. Diese Polymere werden in Form eines Filmes auf einer Elektrode, in Form von selbsttragenden Filmen oder auch in Kompositform erhalten, wenn diese mit einem polykationischen oder polyanionischen Polymer verbunden sind und sich wie organische Elektroden verhalten, die sich nach einem anodischen Oxidationsvorgang durch Einbringung von Ionen des elektrolytischen Mediums beladen. Dieser elektrochemische Prozess ist reversibel, wobei die Reduktion die Abgabe von Tonen dieses konjugierten Polymers oder des elektroaktiven Kompositen bewirkt.
  • Anschließend wurde in der Literatur eine zweite Generation von konjugierten Polymeren beschrieben, die durch kovalentes Pfropfen von funktionellen Gruppen auf die Monomereinheiten der Polymere erhalten werden, die in der Lage sind, diesen elektro aktiven konjugierten Polymeren eine zusätzliche Funktion zu verleihen. Bspw. werden elektrokatalytische metallische Komplexe auf Polypyrrolmonomereinheiten gepfropft, spezifische makrozyklische Komplexbildner werden auf Polypyrrol- oder Polythiophenketten gepfropft, um optisch aktive Anionen zu erkennen. Sämtliche dieser Funktionalisierungswege waren ebenfalls Gegenstand von detaillierten Darstellungen in der Literatur (F. Garnier, Angew. Chemie, 1989, 101, 529; A. Deronzier, J. C. Moutet, Acc. Chem. Res., 1989, 22, 249; J. Roncali, Chem. Rev., 1992, 92, 711).
  • In den letzten Jahren haben sich diese Autoren für die Verwendung von funktionalisierten, leitfähigen Polymeren zur Entwicklung von Analytsensoren interessiert, insbesondere zu diagnostischem Zweck. Allerdings wurde, wie in der Patentanmeldung EP 0 314 009 angegeben, von der Wissenschaftsgemeinschaft allgemein angenommen, dass Pyrrolpolymere, die im Bereich von entweder dem Stickstoffatom oder direkt im Bereich der Kohlenstoffatome des Pyrrolringes, keine guten Kandidaten für die Entwicklung von Analytsensoren seien, insbesondere wegen des Leitfähigkeitsverlustes der Polymere, wenn funktionelle Gruppen in den heteroatomaren Ring eingeführt werden. Um dieses Problem zu lösen, hatten die Autoren dieser Patentanmeldung deshalb beabsichtigt, 2,5-Di(2-thienylpyrrol)-Polymere zu verwenden, auf die in Position 3 des Pyrrolkernes ein reaktiver Teil gepfropft wurde, an das über Kovalenz ein organisches Molekül gebunden werden konnte. Es sollte jedoch festgehalten werden, dass in Anbetracht der Hydrophobizität der Thiophenkerne die beschriebenen Polymere daher in wässrigen Medien nicht leitfähig und elektroaktiv sein können, und deshalb nicht für die Detektion und/oder Charakterisierung eines Analyten in einer biologischen Probe angepasst zu sein scheinen (siehe J. Roncali et al., Chem. Comm., 1986, Seite 783 und G. Tourillon et al., Electronal. Chem, 161, 407, 1984).
  • Es wurde nun völlig überraschend im Gegensatz zu dem, was bislang von Spezialisten angenommen wurde, aufgefunden, dass die Leitfähigkeit und Elektroaktivität der Polypyrrole unter der Bedingung erhalten bleiben, dass das Pfropfen einer funktionellen Gruppe entweder in Position 3 oder 4 auf den Pyrrolring mit Hilfe eines solchen Funktionalisierungsagens durchgeführt wird, das die Beabstandung der Funktion hinsichtlich des Pyrrolkernes ermöglicht. Am freien Ende der funktionellen Gruppe ist mittels Kovalenz ein Antiligand gebunden, ohne dass die oben erwähnten Eigenschaften des Polymers verändert werden. Derartige funktionalisierte Polymere wurden bis zum heutigen Tag nicht beschrieben und es hat sich gezeigt, dass diese als Sensoren für einen biologischen Liganden perfekt geeignet sind. Ferner erweisen sich die Polypyrrole wegen ihrer Biokompatibilität als interessante Polymere. Schließlich ermöglichen es die so funktionalisierten Polypyrrole elektroaktive und leitfähige Polymere von großer Dicke herzustellen (bis zu mehreren Millimetern), was eine hohe Dichte von funktionellen Stellen ermöglicht und gleichermaßen die Empfindlichkeit verbessert.
  • Die Erfindung hat deshalb als ersten Gegenstand ein funktionalisiertes, elektrisch leitfähiges Polymer, das Formel I entspricht:
    Figure 00030001
    in der
    – n eine ganze Zahl ungleich Null, und i eine ganze Zahl, die von 2 bis n-1 variiert, ist, und
    – R1, Ri, Rn, die identisch oder unterschiedlich sind, ein H oder eine funktionelle Gruppe, mit Ausnahme von CH2-COOH, repräsentieren, die über Kovalenz an ein erstes biologisches Molekül oder einen Anti-Liganden binden kann, wobei das Polymer eine Leitfähigkeit und Elektroaktivität von im Wesentlichen der gleichen Größenordnung aufweist, wie das entsprechende konjugierte, nicht-funktionalisierte Polymer, d. h. das der Formel I entsprechende Polymer, bei dem R1, Ri, Rn jeweils einem H entsprechen.
  • Insbesondere wird bzw. werden die funktionelle(n) Gruppe(n) unabhängig ausgewählt aus sämtlichen der folgenden funktionellen Gruppen:
    Yp-C-X, wobei X ein H, OH, ein substituiertes oder nichtsubstituiertes O-Niederalkyl-Radikal, ein Halogen, insbesondere Cl, repräsentiert; Yp-NHZ, wobei Z ein H oder ein Alkyl-Radikal repräsentiert; Yp-NH-CO-CF3; Yp-X, wobei X der obigen Definition entspricht, wobei p eine ganze Zahl von vorzugsweise 0, 1 oder 2 ist; -Si(alkyl)3, -Si(alkoxyl)3, oder eine aktivierte Estergruppe, wie bspw. N-Hydroxysuccinimid.
    Y repräsentiert eine Gruppe, die ausgewählt ist aus den Alkylen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, den Alkoxylen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, den Polyethern, die der allgemeinen Formel (CH2-CH2-O)m-(CH2)m, entsprechen, wobei m eine ganze Zahl, die von 1 bis 3 variiert, und m' eine ganze Zahl von 1 oder 2 repräsentieren.
  • Die Erfindung hat als zweiten Gegenstand ein elektrisch leitfähiges und elektroaktives konjugiertes Polymer, das zumindest eine funktionelle Gruppe aufweist, die über Kovalenz an ein erstes biologisches Molekül oder Antiliganden gebunden ist, das Formel II entspricht:
    Figure 00050001
    in der
    – n eine ganze Zahl ungleich Null, und i eine ganze Zahl, die von 2 bis n-1 variiert, ist, und
    – R'1, R'i, R'n, die identisch oder unterschiedlich sind, jeweils ein H oder eine funktionelle Gruppe repräsentieren, die über Kovelenz an ein erstes biologisches Molekül oder einen Anti-Liganden binden können.
  • Die funktionellen Gruppen, die an ein biologisches Molekül oder einen Liganden gebunden sind, werden vor der Reaktion mit letzteren aus der Gesamtheit der folgenden funktionellen Gruppen ausgewählt:
    Yp-C-X, wobei X ein H, OH, ein substituiertes oder nichtsubstituiertes O-Niederalkyl-Radikal, ein Halogen, insbesondere Cl, repräsentiert; Yp-NHZ, wobei Z ein H oder ein Alkyl-Radikal repräsentiert; Yp-NH-CO-CF3; Yp-X, wobei X der obigen Definition entspricht, p eine ganze Zahl von vorzugsweise 0, 1 oder 2 ist; -Si(alkyl)3, -Si(alkoxyl)3, oder eine aktivierte Estergruppe, wie bspw. N-Hydroxysuccinimid.
  • Insbesondere sind die funktionellen Gruppen, die an ein biologisches Molekül gebunden sind, identisch und bestehen vor der Reaktion mit dem oder den ersten biologischen Molekül(en) aus -(CH2)-COOH, wobei die ersten biologischen Moleküle oder Antiliganden ausgewählt sind aus dem Peptiden oder Peptidderivaten, insbesondere Gly-Phe, Phe-Pro, Phe-HEA-Pro, und aus den Polynukleotiden, wie bspw. dem Oligonukleotid mit der Sequenz CCTAAGAGGGAGTG.
  • Ein dritter Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines wie zuvor gemäß dem zweiten Gegenstand der Erfindung definierten konjugierten Polymer, um ein zweites biologisches Molekül oder einen Liganden in vitro oder in vivo zu detektieren oder zu bestimmen, der sich von dem Antiliganden unterscheidet und spezifisch mit letzterem interagiert, wobei die Detektion und/oder die Bestimmung dieses Liganden durch Erfassung und/oder Messung einer Potenzialdifferenz oder einer Stromveränderung zwischen dem nicht an den Liganden gebundenen konjugierten Polymer und dem an den Liganden gebundenen Polymer erfolgt.
  • Insbesondere werden die Polymere der Erfindung dazu verwendet, um ein Enzym, wie bspw. ein proteolytisches Enzym, insbesondere Carboxypeptidase A, oder ein Polynukleotid zu detektieren und/oder zu bestimmen, oder um ein zweites biologisches Molekül oder einen Liganden in vitro oder in vivo zu extrahieren, der sich von dem Antiliganden unterscheidet und mit letzterem spezifisch interagiert.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist das konjugierte Polymer auf einem leitfähigen Substrat, wie bspw. Metall oder ein Kohlenstoffderivat, oder in Form eines selbsttragenden Films aufgebracht.
  • Schließlich betrifft die Erfindung eine Elektrode und einen selbsttragenden Film, der aus einem leitfähigen Substrat, wie bspw. Metall oder ein Kohlenstoffderivat, und einem wie zuvor gemäß dem zweiten Gegenstand der Erfindung definierten Polymer gebildet ist.
  • In einer Ausführungsform ist der Antiligand spezifisch für den Liganden oder das Zielmolekül. Der Antiligand ist insbesondere ausgesucht, um einen Antiligand/Zielmolekül-Komplex auszubilden. Der Komplex kann bspw. insbesondere durch jedes Paar aus Peptid/Antikörper, Antikörper/Hapten, Hormon/Rezeptor, Polynukleotid/Polynukleotid-, Polynukleotid/Nukleinsäure-Hybride, oder Analoge dargestellt sein.
  • Der Begriff „Polynukleotid", wie dieser in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezeichnet eine Abfolge von zumindest fünf Desoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden, die ggf. zumindest ein modifiziertes Nukleotid aufweist, bspw. ein Nukleotid, das eine modifizierte Base aufweist, wie Inosin, Methyl-5-desoxycitidin, Dimethylamino-5-desoxyuridin, Desoxyuridin, Diamino-2,6-purin, Bromo-5-desoxyuridin oder jede andere modifizierte Base, die die Hybridisierung ermöglicht. Dieses Polynukleotid kann gleichermaßen im Bereich der Internukleotidbindung (wie bspw. Phosphorothioat-, H-Phosphonat-, Alkyl-Phosphonat-Bindungen), im Bereich des Gerüstes, wie bspw. alpha-Oligonukleotide (FR 2 607 507) oder PNA (M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc., (1992), 114, 1895–1897) modifiziert sein. Jede dieser Modifikationen kann in Kombination verwendet werden.
  • Der Begriff „Peptid", wie dieser in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, bezeichnet insbesondere jedes separierte oder im Wesentlichen isolierte oder synthetisierte Peptid von zumindest zwei Aminosäuren, insbesondere Protein oder Proteinfragment, Oligopeptid, Extrakt, insbesondere jene, die durch chemische Synthese oder durch Expression in einem rekombinanten Organismus erhalten wurden; jedes Peptid der Sequenz, bei dem eine oder mehrere Aminosäuren der L-Serie durch eine Aminosäure der D-Serie ersetzt werden, und umgekehrt; jedes Peptid, bei dem zumindest eine der CO-NH-Bindungen und vorteilhafterweise sämtliche der CO-NH-Bindungen der Peptidkette durch eine (mehrere) NH-CO-Bindung(en) ersetzt ist (sind); jedes Peptid, bei dem zumindest eine der CO-NH-Bindungen und vorteilhafterweise sämtliche der CO-NH-Bindungen durch eine oder mehrere NH-CO-Bindungen ersetzt ist bzw. ersetzt sind, wobei die Chiralität eines jeden Aminoacylrestes, der in eine oder mehrere der oben erwähnten CO-NH-Verbindungen verwickelt ist, entweder erhalten bleibt oder hinsichtlich der ein Referenzpeptid bildenden Aminoacylreste invertiert wird, ferner als Immunoretroide bezeichnete Verbindungen, ein Mimotop.
  • Es können zahlreiche Klassen von Peptiden aufgepfropft werden, wie die nachfolgende, nicht erschöpfende Liste zeigt: adrenocorticotrope Hormone und deren Fragmente; Angiotensinanaloge und deren Inhibitoren (Bestandteile des Renin-Angiotensin-Systems, die die renale Hypertension regulieren); natriuretische Peptide, Bradykinin und dessen Peptidderivate; chemotakti sche Peptide; Dynorphin und dessen Derivate; Endorphine oder Analoge; Encephaline und deren Derivate; Enzyminhibitoren (wie Proteasen); Fibronectinfragmente und Derivate; gastrointestinale Peptide; Peptide, die mit der Freisetzung von Wachstumshormonen assoziiert sind; Neurotensine und Analoge; Opioidpeptide; Oxytocin, Vasopressin, Vasotocin und Derivate; Proteinkinasen.
  • Die Peptide oder Polynukleotide weisen eine erhöhte biologische Aktivität auf und sind dafür bekannt, dass diese zahlreiche biologische Funktionen kontrollieren (A. S. Dutta, Advances in Drug Research, B. Testa/Herausgeber, Academic Press, New York, 1991, 21, 145). Die Peptide zeigen bspw. ein sehr bedeutendes therapeutisches Potenzial als Agonist- oder Antagonistrezeptor, als sehr wirksame Inhibitoren, die sehr stark an Enzyme binden, dem Prinzip, auf dem die sog. Affinitäts-Chromatographie basiert. Ferner können Polynukleotide durch selektive Hybridisierungsreaktion mit anderen Nukleotiden oder Zielnukleotidsäurefragmenten zu interessanten Erkennungsphänomenen führen, was insbesondere die Entwicklung von neuen Gensensoren ermöglicht. Folglich wird, um eine Nukleinsäure oder ein Zielnukleinsäurefragment zu detektieren und/oder zu bestimmen, ein zumindest teilweise an ein Antiligandpolynukleotid gebundenes funktionalisiertes Polymer mit einer Probe in Kontakt gebracht, die das Ziel enthalten kann, anschließend wird die Hybridisierungsreaktion detektiert, falls diese stattgefunden hat, entweder direkt durch Messung einer Potenzialdifferenz oder einer Stromveränderung zwischen dem nicht-gebundenen und dem gebundenen Polymer, das mit dem Ziel reagiert hat, oder indirekt durch dieselbe Messung wie zuvor, aber mittels eines zusätzlichen Detektionspolynukleotids, das mit dem Ziel reagieren kann, wobei das zusätzliche Polynukleotid an das Antili gandpolynukleotid angrenzt und mit einem elektroaktiven Molekül markiert ist.
  • Der Begriff „Antikörper", wie dieser in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, bezeichnet jeden monoklonalen oder polyklonalen Antikörper, jedes Fragment eines solchen Antikörpers, wie das Fab-, Fab'2- oder Fc-Fragment, sowie jeden Antikörper, der durch Modifikation oder genetische Rekombination erhalten wird.
  • Die Funktionalisierung des Polypyrrols an Position 3 oder 4 des Pyrrolringes kann entweder auf Monomereinheiten mit einem anschließenden Polymerisierungsschritt erfolgen, oder auf Monomereinheiten eines zuerst synthetisierten Polymers. Es kann jedes geeignete Funktionalisierungsagens unter der Bedingung verwendet werden, dass es zumindest eine reaktive Funktion aufweist, die in der Lage ist, mit den Atomen 3 und/oder 4 des Pyrrolkerns zu reagieren. Das Funktionalisierungsagens kann damit ein unifunktionelles Agens sein, unter der Voraussetzung, dass nach dem Schritt des Pfropfens auf den Pyrrolkern eine neue reaktive Funktion zur nachfolgenden Reaktion mit dem Antiliganden eingeführt wird, oder ein bifunktionelles Agens und insbesondere homo- oder heterobifunktionelle Agenzien. Das Funktionalisierungsagens ist bspw. ausgewählt aus den Alkyl- oder Alkoxyl- oder substituierten oder nicht-substituierten und mit einer solchen Gruppe abschließenden Polyetherketten, die eine reaktive Funktion trägt. Die reaktive Funktion wird insbesondere durch eine funktionelle Gruppe dargestellt, wie bspw. Carboxyl-, Hydrazid-, Amin-, Nitril-, Aldehyd-, Thiol-, Iodoacetyldisulfid-, Ester-, Anhydrid-, Tosyl-, Mesyl-, Trityl-, Silylgruppe oder Analogen.
  • Die Ausbildung eines aus der kovalenten Bindung eines Antiliganden, bspw. eines Polynukleotides, an ein erfindungsgemäßes funktionalisiertes Polypyrrol resultierenden Konjugats kann gemäß bekannter direkter oder indirekter Methoden erfolgen.
  • Bspw. wird im Falle eines Polynukleotids gemäß der direkten Methode ein Polynukleotid mit einer reaktiven Funktion an irgendeiner Seite der Nukleotidkette, wie bspw. dem 5'-Ende oder dem 3'-Ende, oder an einer Base oder einem zwischen den Nukleotiden liegenden Phosphat, oder an 2'-Position eines Zuckers synthetisiert. Das Polynukleotid wird anschließend an das Polymer gekoppelt, das zuvor hergestellt wurde und eine zu der vorherigen komplementäre reaktive Funktion trägt, d. h., welche die Ausbildung einer kovalenten Bindung durch eine Reaktion zwischen den beiden komplementären reaktiven Funktionen ermöglicht, wobei eine von dem Polynukleotid und die andere von dem funktionalisierten Polymer getragen wird. Bspw. können auf bekannte Art und Weise primäre Amine mit einer aktivierten Carboxylsäure oder einem Aldehyd oder auch einer Thiolfunktion mit einem Halogenoalkyl gekoppelt werden. Vorzugsweise ist die reaktive Funktion des Polynukleotids für die Kopplung auf das Polymer an dem 5'- oder 3'-Ende.
  • In der Methode der indirekten Kopplung sind das Polynukleotid und das Polymer jeweils Träger einer reaktiven Funktion, wobei die reaktiven Funktionen identisch oder voneinander unterschiedlich sein können, diese beiden Funktionen sind nicht komplementär, jedoch in der Lage, mit einem dazwischen liegenden Kopplungsagens zu reagieren, das ein bifunktionelles Reagens ist (homobifunktionell, wenn die beiden Funktionen identisch sind, oder heterobifunktionell, wenn die beiden Funktio nen verschieden sind). Von den homobifunktionellen Kopplungsagenzien kann das DITC(Phenylen-1,4-diisothiocyanat), das DSS (Disuccinimidylsuberat) oder Analoge genannt werden. Von den heterobifunktionellen Kopplungsagenzien kann das SMCC(Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat), oder das SMPB(Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat) genannt werden, die in der Lage sind, einerseits mit einem primären Amin und andererseits mit einem Thiol zu reagieren.
  • Die Erfindung wird besser bei der Lektüre der folgenden Beschreibung verstanden, in der auf die beigefügten Figuren Bezug genommen wird, in denen
  • 1 Beispiele von konjugierten Polymeren darstellt, wie 1) Polyacetylen; 2) Polypyrrol; 3) Polythiophen; 4) Polyphenylen; 5) Polyanilin;
  • 2A ein Polypyrrol darstellt, das an Position 3 mit Essigsäure (1) substituiert ist und 2B, 2C, 2D, 2E und 2F Polypyrrole darstellen, die an Position 3 mit verschiedenen Peptiden (jeweils zwei bis sechs) substituiert sind;
  • 3 Voltammogramme von vier funktionalisierten Polymeren, die unten in 0,5 M H2O-NaCl-Medium identifiziert sind, darstellt;
    Poly(pyrrol-Essigsäure) in (1), Poly(pyrrol(Gly-DPhe)) in (2), Poly(pyrrol(Val)) in (3) und Poly(pyrrol(Phe)) in (4);
  • 4 das Voltammogramm von Poly(2) in 0,5 M H2O-NaCl-Medium in Gegenwart von Carboxypeptidase A bei einer jeweiligen Konzentration von 0,0 mg in 5 cm3 Elektrolyt (a), 1,2 mg in 5 cm3 Elektrolyt (b), 2,4 mg in 5 cm3 Elektrolyt (c), und 5,0 mg in 5 cm3 Elektrolyt (d) darstellt;
  • 5 der konduktometrischen Antwort einer Elektrode, Poly (2), in Abhängigkeit der Menge von Enzym, Carboxypeptidase A, in Nanomolen, die in dem Medium vorherrschen, entspricht. Die lineare Relation zwischen dem beobachteten Strom und der Enzymmenge bei einem Potenzial von 0,3 V ist hinsichtlich einer gesättigten Quecksilber(I)-Chloridelektrode angegeben;
  • 6 ein Prinzipschaltbild eines mikroelektrochemischen Feldeffekttransistors ist, um das Vorhandensein einer mittels eines funktionalisierten leitfähigen Polymers erkannten biologischen Spezies zu detektieren (amplifizieren). Die folgenden Abkürzungen bedeuten jeweils: P, Polymer. Sub, Substrat. S, D, Source- bzw. Drain-Elektroden. GE, Gegenelektrode, die die Rolle des Gates G übernimmt. R, Referenzelektrode. Poten., Potentiostat;
  • 7 ein Prinzipschaltbild einer elektrochemischen Zelle mit funktionalisierter Polypyrrolmembran und mit zwei Kompartimenten ist, um biologische Spezies zu extrahieren, die durch einen Substituenten erkannt werden, der auf eine Kette eines elektroaktiven konjugierten Polymers gepfropft ist;
  • 8 das Voltammogramm von Poly[N-hydroxysuccinimid-3-pyrrol] in 0,1 M LiClO4-Acetonitrilmedium mit einer gesättigten Quecksilber(I)-Chloridreferenzelektrode darstellt, die eine Elektroaktivität und eine erhöhte elektrochemische Umsteuerbarkeit zeigt;
  • 9 das Voltammogramm einer Elektrode des Copolymers Poly([pyrrol-ODN][pyrrol-COOH]) mit einem Polynukleotid oder ODN-Oligonukleotid der Sequenz CCTAAGAGGGAGTG darstellt. Nach der Inkubation dieses Polymers mit einer Nicht-Zielsequenz, GGTGATAGRAGTATC wird keine Modifizierung beobachtet; und
  • 10 das Voltammogramm einer Elektrode des Copolymers Poly([pyrrol-ODN][pyrrol-COOH]) mit dem ODN-Oligonukleotid CCTAAGRGGGAGTG darstellt. Diese Elektrode wurde in Gegenwart eines Zieles, CACTCCCTCTTAGG, bei 335 nmol bei 37°C für 2 h inkubiert. Diese Elektrode wurde anschließend gespült und in elektrochemischem Medium analysiert. Hinsichtlich des vorherigen Voltammogrammes wurde eine Potenzialverschiebung beobachtet.
  • Die erfindungsgemäßen Polymere sind insbesondere zur Detektion von aktiven biologischen Spezies verwendbar, die in einer Probe vorhanden sein und mit dem oder den gepfropften Antiliganden reagieren können. Tatsächlich wird beobachtet, wie nachfolgend gezeigt, dass die konjugierten Polymere, die an Position 3 ihrer heterozyklischen Verbindung funktionalisiert sind und auf die ein oder mehrere Antiliganden gepfropft sind, nach der Reaktion mit einem oder mehreren Liganden eine Modifizierung der elektrochemischen Antwort im Vergleich zu einem Referenzpolymer zeigen, das nicht mit dem oder den Liganden eines biologischen Milieus reagiert hat, was durch eine Veränderung des Oxidationspotenzials sichtbar gemacht wird. Diese Veränderung des elektrochemischen Voltammogrammes der Oxidoreduktion des Polymers verleiht eine Sensorfunktion und kann so für eine quantitative Messung der aktiven biologischen Spezies, entweder durch Potenzialänderung bei fixem Strom, oder durch Stromänderung bei fixem Potenzial, oder auch in der Herstellung eines mikroelektrochemischen Feldwirkungstransistors verwendet werden.
  • Ferner sind die Polymere der Erfindung auch für die Extraktion von in Lösung befindlichen aktiven biologischen Spezies verwendbar. In einigen Fällen bindet sich die in Lösung befindliche aktive biologische Spezies auf starke Art und Weise an den auf die Polymerkette gepfropften Antiligand, wie bspw. ein bioaktives Peptid oder ein Polynukleotid, was es also ermöglicht, die aktive biologische Spezies auf selektive Art und Weise aus einem Medium zu extrahieren. Diese Art von Extraktion kann in vitro oder sogar in vivo durchgeführt werden, sofern das Trägerpolymer biokompatibel ist, wie bspw. Polypyrrol.
  • Schließlich können die Polymere der Erfindung eine Quelle zum Aussalzen aktiver biologischer Spezies (Enzyme oder anderen) von einem Medium in ein anderes Medium sein.
  • Die Funktionalisierung der elektroaktiven leitfähigen Polymere der Erfindung, wie bspw. Polypyrrole, durch Gruppen, die eine Erkennung gegenüber Verbindungen von biologischem Interesse zeigen, kann die Erkennung von Nukleinsäuren (NA) umfassen. So ermöglicht das Pfropfen von Polynukleotiden oder Oligonukleotiden, ODN, entlang der konjugierten Polymerkette die Unterscheidung von NA oder entsprechenden NA-Fragmenten innerhalb eines biologischen Mediums. Diese Erkennung wird durch selektive Hybridisierung zwischen dem ODN, das auf das Polymer gepfropft ist, und der in dem externen Medium vorhandenen entsprechenden NA durchgeführt, in das der funktionalisierte Polymerfilm eingetaucht wird, so wie die später beschriebene „Pep tid/Enzym"-Erkennung. Die „ODN-NA"-Komplexierung resultiert in einer Modifizierung der physikochemischen Eigenschaften des konjugierten Polymers, deren Charakterisierung es ermöglichen wird, das Vorhandensein von gesuchter NA zu bestätigen.
  • Der wesentliche Punkt betrifft die Natur der physikochemischen Eigenschaften des Polymers, die dazu bestimmt sind, sich bei der „ODN/NA"-Erkennung zu verändern. In der Tat betrifft das Ziel der vorliegenden Erfindung, um eine schnelle, empfindliche und quantitative Methode zur Messung des Vorhandenseins von NA zu entwickeln, die Erstellung von elektroaktiven Materialien, deren elektrochemische Antwort sich nach der „ODN/AN"-Hybridisierung modifiziert. Die Modifizierung betrifft eine Veränderung vom potentiometrischen Typ, wie die Veränderung des Oxydationspotenzials des Polymers, oder vom konduktometrischen Typ, über die Veränderung des Oxidations-(oder des Reduktions-)Stromes, die bei einem bestimmten Potenzial beobachtet wird. Diese Veränderungen der elektrochemischen Antwort können quantitativ gemessen werden, wobei die funktionalisierten Polymere entweder als elektrochemische Sensoren vom konduktometrischen oder potentiometrischen Typ, oder in einer mikroelektrochemischen Feldwirkungstransistorstruktur verwendet werden, so wie dies zuvor im Falle der enzymatischen Erkennung ausgehend von Peptiden beschrieben wurde, die auf Polypyrrole gepfropft wurden. Das Interesse an diesem Typ von Messungen gilt der Geschwindigkeit, der Empfindlichkeit und der Möglichkeit, einfach Matrizenkarten von 2n Messelementen zu erstellen, die n ODN-Ziele und -Nicht-Ziele aufweisen, die also fähig sind, zwischen dem Vorhandensein oder der Abwesenheit von Genen in einem Medium schnell zu unterscheiden.
  • Ebenso wie im Falle der zuvor beschriebenen enzymatischen Erkennung betrifft ein zweiter wesentlicher Punkt die Tatsache, dass die Funktionalisierung an Position 3 eines heterozyklischen (Pyrrol)Kernes unentbehrlich ist, um eine elektrochemische Antwort auf ein Erkennungsphänomen zu erhalten.
  • Um für diese Polymere eine Antwort vom präzisen elektrochemischen Typ zu gewährleisten, ist es notwendig, dass die Funktionalisierung der konjugierten Ketten mit einer großen Elektroaktivität des funktionalisierten Polymers kompatibel ist. Die Notwendigkeit einer solchen Elektroaktivität erfordert, dass im Falle von hydrophilen Polyheterozyklen, wie bspw. dem Polypyrrol, die Funktionalisierung an Position 3 des Pyrrolringes erfolgt. Die Polymere der Erfindung sind elektroaktive Polymere, in denen entweder sämtliche Monomereinheiten mit einem Antiligand, wie bspw. einem Oligonukleotid funktionalisiert sind, oder nur ein einziger Teil der Monomereinheiten so funktionalisiert ist. Es versteht sich, dass die Monomereinheiten durch identische oder verschiedene Antiliganden funktionalisiert werden können, im letzteren Fall können die Polymere der Erfindung für die Detektion von mehreren Zielliganden in derselben Probe verwendet werden. Die Polymere der Erfindung können durch verschiedene folgende Wege hergestellt werden.
  • a) Vollständig funktionalisierte Polymere
  • Bei diesem Weg wird der erste Schritt die Funktionalisierung des Monomers, wie dem Pyrrol, durch einen Antiliganden, wie ein bestimmtes Oligonukleotid, betreffen. Der zweite Schritt wird die anschließende Polymerisation dieses Monomers betreffen, die zu einem Polymerfilm führt, bei dem sämtliche Monomereinheiten funktionalisiert sind.
  • b) Partiell funktionalisierte Copolymere
  • Im besonderen Fall von Zielnukleinsäuren und in Anbetracht von deren generell großen Größe, ist die Funktionalisierung von sämtlichen Monomereinheiten des Polymers von geringen Größen nicht notwendig, und einer der Wege wird deshalb die Herstellung eines Copolymers betreffen, der einerseits die in a) beschriebenen funktionalisierten Monomere und gleichermaßen die mit dem Antiligand-Oligonukleotid nicht-funktionalisierten Pyrroleinheiten berücksichtigen wird.
  • c) Funktionalisierung eines Precursor-Polymers
  • Die partielle Funktionalisierung eines Polymerfilms kann gleichermaßen ausgehend von einem konjugierten Polymerfilm erfolgen, in den zuvor chemische Gruppen eingebracht wurden, die mit der Pfropfung eines Antiliganden, wie einem Oligonukleotid, kompatibel sind. Bei diesem Weg wird zuerst ein Pfropfsynthon hergestellt, wie das [N-Hydroxysuccinimid-3-pyrrol). Das [N-Hydroxysuccinimod]-Synthon ist dafür bekannt, dass es das spätere Aufpfropfen eines Oligonukleotides ermöglicht. Dieses Monomer wird später polymerisiert oder noch mit einem anderen Pyrrolderivat copolymerisiert. Der erhaltene Polymerfilm wird danach in ein Reaktionsmedium getaucht, das ein Oligonukleotid enthält, und es erfolgt die Reaktion des Aufpfropfens dieses Oligonukleotids auf die Pyrrolmonomere. Das Pfropfen wird tatsächlich nur auf einem Teil der Pyrrolmonomereinheiten erfolgen, die das Polymer bilden.
  • Beispiel 1: Synthese der Monomere
  • In dem nachfolgend beschriebenen Beispiel wurde als Träger für das konjugierte Polymer Polypyrrol (1) wegen seiner Biokompatibilität (H. Naarmann, persönliche Mitteilung) ausgewählt. Ein Acetyl-A-Spacerarm wird zwischen dem Kohlenstoffatom 3 des Pyrrolkerns und dem Peptidsubstituenten gepfropft, um die Leitfähigkeit und Elektroaktivität des entsprechenden funktionalisierten Polypyrrols zu bewahren. Verschiedene Peptide mit deren nicht geschützter oder in Form von einem Methylester geschützten terminalen Carboxylfunktion wurden wegen ihrer biologischen Relevanz ausgewählt und auf ein Pyrrol-Essigsäure-Monomer aufgepfropft, PyA (1). Es wurden mehrere Mono- und Dipeptide gepfropft und haben zu den nachfolgenden Pyrrolderivaten geführt, die in 2 dargestellt sind: Pyrrol-Essigsäure, PyA (1), Pyrrol(Glycin-dPhenylalanin), Py(Gly-DPhe) (2), wegen seiner Kapazität zur Komplexierung mit proteolytischen Enzymen, wie bspw. Carboxypeptidase A (Sigma) und Trypsin (Sigma) (J. R. Uren, Biochim. Acta, 1971, 236, 67), Pyrrol(valin), Py(Val) (3), Pyrrol(phenylalanin), Py(Phe) (4), Pyrrol(phenylalanin-Prolin), Py(Phe-Pro) (5). Sehr voluminöse Dipeptidderivate können ebenfalls gepfropft werden, wie das Phenylalanin-Hydroxyethylamin-Prolin Py(Phe[HEA]Pro) (6), welches dafür bekannt ist, dass dieses ein interessanter potenzieller Inhibitor für die mit dem HIV-1-Aidsvirus assoziierte Protease ist. Diese Monomere wurden gemäß eines beschriebenen chemischen Weges synthetisiert (D. Delabouglise, F. Garnier, Synth. Met., 1990, 39, 117). Diese Monomere wurden gereinigt und mittels NMR, Mikroanalyse und Massenspektrometrie charakterisiert.
  • Beispiel 2: Polymerisation
  • Diese Monomere wurden auf elektrochemischem Wege auf eine Platinelektrode von 0,7 cm2 sowie auf einem Platingate von 10 cm2 Oberfläche in Propylencarbonatmedium mit 0,5 M NaCl bei einem konstanten Potenzial von 0,8 V/SCE polymerisiert. Dicke Polymerfilme werden bis zu einer Dicke von 10 μm erhalten. Wie in 3 gezeigt, wurde die Elektroaktivität dieser Polymere durch zyklische Voltammetrie in 0,5 M NaCl-H2O-Medium bei einem neutralen pH von 7 bestätigt. Die Werte des Oxydationspotenzials in der Größenordnung von 0,30 V/SCE, die nahe bei jenen des nicht-substituierten Polypyrrols liegen, bestätigen die Elektroaktivität dieser mit den Dipeptiden funktionalisierten Polypyrrole.
  • Beispiel 3: Erkennung von Carboxypeptidase A
  • Die spezifischen Komplexierungseigenschaften dieser Polypyrrole gegenüber proteolytischen Enzymen wurden mit Carboxypeptidase A analysiert, bei der (Gly-DPhe) dafür bekannt ist, bei neutralem pH stabile Komplexe auszubilden. Es wurden Lösungen mit zunehmender Carboxypeptidase-A-Konzentration analysiert, die von 1 mg bis 5 mg in 5 cm3 0,5 M NaCl-H2O geht. Wenn in diese Lösung nicht-spezifische Elektroden wie nichtsubstituierte Polypyrrole, oder Poly(3, 4, 5 oder 6) eingetaucht werden, wird ein Voltammogramm beobachtet, das identisch ist mit jenem, das in Beispiel 2 erhalten wurde, ohne irgendeine Modifikation. Wenn jedoch das Poly(pyrrol(Gly-DPhe)), Poly(2), verwendet wird, zeigt das Voltammogramm eine Verschiebung in Richtung erhöhter Potenziale von 0,340 V/SCE für eine Ausgangsmenge von 0 an Carboxypeptidase A bis zu einem Grenzwert von 0,500 mV/SCE für eine Menge von 5 mg Carboxypeptidase A in Lösung. Dieses Ergebnis ist in 4 dargestellt, die die Potenzialverschiebung zeigt, die einem Raumbedarf und einer Versteifung der Polypyrrolkette zuzuschreiben ist, die bei der Komplexierung des Enzyms auf das durch die Polymerkette getragene Dipeptid erzeugt wurde. Die Ausbildung dieses Komplexes zwischen dem Enzym und dem Poly(pyrrol-dipeptid) wurde durch das Aussalzen des Enzymes in saurem Medium bei pH 3 bestätigt, wie dies klassischerweise mittels Affinitätschromatographie erfolgt ist (I. M. Chaiken, M. Wilchek, I. Parikh, Affinity Chromatography and Biological Recognition, Academic Press, New York, 1983). Das ausgesalzte Enzym wurde auf klassische Art und Weise durch den Bradford-Test charakterisiert, indem die enzymatische Aktivität mit Coomassie-Brillant-Blau und mittels Verwendung eines Rinderserumalbuminstandards gemessen wurde. Wenn ein Poly(Gly-DPhe)-Film verwendet wird, der 5 × 10–6 Monomereinheiten enthält, die einer Polymerisationsladung von 1 Coulomb entspricht, wurde nach dem Aussalzen in einem sauren Medium eine signifikante Menge von 400 μg an Carboxypeptidase A erhalten. In Anbetracht der Größe dieses Enzyms von 307 Aminosäureeinheiten zeigt diese Menge an ausgesalztem Enzym, dass ungefähr 1 Enzymmolekül mit 200 Monomereinheiten von (Pyrroldipeptid) komplexiert ist, was in Anbetracht des Größenunterschiedes (ungefähr von einem Faktor 100) vernünftig erscheint. Dieses Ergebnis zeigt auch, dass das Enzym im Inneren des Polymerfilms verteilt werden muss, was dessen Permeabilität gegenüber dem Enzym demonstriert. Vergleichbare Ergebnisse wurden erhalten, wenn als Enzym Trypsin verwendet wurde.
  • Bei einem bestimmten Potenzial der Elektrode, wie in 4 gezeigt, wird eine Stromveränderung in Abhängigkeit der En zymkonzentration beobachtet. Dieses Ergebnis entspricht der konduktometrischen Antwort der Elektrode, und eine der interessanten Eigenschaften dieser Antwort betrifft ihre Linearität mit der Enzymkonzentration, wie in 5 gezeigt. Eine solche lineare Relation ermöglicht es, eine quantitative Bestimmung einer in Lösung befindlichen biologischen Spezies entweder durch die Verwendung eines Sensors vom elektrochemischen Typ, oder durch die Entwicklung eines Feldeffekttransistors vorzuschlagen, der schematisch in 6 dargestellt ist. Das Funktionsprinzip ist Folgendes. Das Polymer wird auf Source- und Drain-Elektroden hergestellt, die auf einem Substrat angeordnet sind. Diese Gesamtheit wird in eine zu analysierende Lösung eingetaucht und eine Gegenelektrode in demselben Medium stellt das Gate des Transistors dar. Wenn diese Gate-Elektrode auf ein Potenzial gesetzt wird, bei dem die Veränderung des Voltammogrammes in Abhängigkeit der Enzymkonzentration maximal ist, gegen 0,2 V im in 4 dargestellten Falle, variiert die Leitfähigkeit des Polymers deutlich mit der Enzymkonzentration. Ein dann zwischen die Source- und Drain-Elektroden angelegtes Potenzial ermöglicht es, ein amplifiziertes Signal zu erhalten, wobei dieser Transistor gemäß des Prinzips eines Feldeffekttransistors funktioniert.
  • Beispiel 4: Kontrolliertes Aussalzen eines Enzymes
  • Eine zusätzliche interessante Eigenschaft dieser Elektroden betrifft die Tatsache, dass in der Literatur gezeigt worden ist, dass das Poly(pyrrol-Essigsäure) oder Poly(1) in dem Elektrolytmedium Protonen aussalzt, wenn dieses einer elektrochemischen Oxidation unterzogen wird (P. Baüerle et al., Adv. Mater., 1990, 2, 490). Bis zu Werten in der Größenordnung von 3 können in einem geringen Elektrolytvolumen größere pH-Veränderungen beobachtet werden. Diese Aussalzung von Protonen wird gleichermaßen beobachtet, wenn die Carboxylfunktion von dem Pyrrolkern entfernt ist, wie dies für eine Aminosäure oder ein auf das Pyrrol gepfropftes, nicht geschütztes Peptid der Fall ist. Es gibt zwei Wege für ein kontrolliertes Aussalzen von Protonen, entweder die Verwendung eines Peptides, dessen terminale Carboxylfunktion nicht geschützt ist, COOH, oder durch die Verwendung eines Copolymers zwischen Pyrrol-Essigsäure und geschütztem Pyrrolpeptid. Es wird ein Beispiel dieses zweiten Weges gegeben. Es wird elektrochemisch ein Copolymer zwischen Py(A), (1) und Py(Gly-DPhe) unter denselben Bedingungen wie zuvor hergestellt. Dieses Copolymer, Poly(1, 2) führt in der Umgebung der Elektrode zu einer großen pH-Veränderung bis zu pH = 4, wenn dieses einer Elektrooxidation bei 0,3 V/SCE unterzogen wird.
  • Ausgehend von diesem Copolymer Poly(1, 2), oder ausgehend von dem Polymer Poly(2), dessen Carboxylfunktion frei ist, können zwei Verfahren zur Extraktion durchgeführt werden, ein diskontinuierliches Verfahren und ein kontinuierliches Verfahren.
  • a) Diskontinuierliches Verfahren
  • Dieses Verfahren besteht in dem Verwenden einer Membran oder Elektrode auf der Basis der oben erwähnten Materialien, dem In-Kontakt-Bringen dieser mit dem Medium, in dem die gesuchte aktive biologische Spezies mit weiteren Spezies koexistiert. Die durch das aufgepfropfte Peptid eingebrachte selektive Affinität gegenüber dieser gesuchten Spezies bewirkt die Komplexierung dieser letzteren auf das Peptid, das auf das Polymer der Elektrode oder der Membran gepfropft wurde. Diese Membran oder Elektrode wird anschließend aus dem Analysemedium herausgezogen und in ein sog. Rückgewinnungsmedium eingebracht. In diesem Rückgewinnungsmedium, das ein Trägersalz vom NaCl-Typ enthält, wird die Elektrode oder Membran einer elektrochemischen Oxidation unterzogen, die die Abgabe von Protonen durch die Carboxylsäuregruppen bis zu einem pH, bewirkt, der ausreichend ist für die Dissoziation und das Aussalzen der gesuchten Spezies.
  • b) Kontinuierliches Verfahren
  • Das Copolymer Poly(1, 2) oder das Polymer Poly(2) mit seiner freien Carboxylfunktion wird in Form einer Membran oder Elektrode hergestellt, ggf. mit der Hilfe eines polykationischen oder polyanionischen Trägerpolymers vom Typ Polystyrol-Sufonat oder auch einer perfluorierten Membran, wie bspw. Nafion. Diese ggf. zusammengesetzte Elektrode oder Membran bildet die Verbindung zwischen den beiden Kompartimenten A und B, wie in 7 schematisiert. Ein Beispiel der Extraktion von Carboxypeptidase A mittels des letzteren kontinuierlichen Verfahrens wird nachfolgend beschrieben.
  • Das bioselektive Element besteht in dem in 7 dargestellten Fall aus einem zuvor beschriebenen Copolymer Poly(1, 2), das in einer NAFION-Membran (Aldrich) polymerisiert ist, erhalten durch Evaporation von 10 μl einer 5%igen Lösung von NAFION in einer Mischung von höheren linearen Alkoholen (Aldrich) auf einem sehr dünnen Platingitter. Der sich daraus ergebende NAFION-Film weist eine Dicke von ungefähr 5 μm auf und dient dann als Träger für die Elektropolymerisation des Copolymers Poly(1, 2), was zu einer elektroaktiven zusammengesetzten Poly(1, 2)-NAFION-Membran führt.
  • In einem ersten Schritt 1 wird eine Menge von 10 g Carboxypeptidase A in einem 0,5 M NaCl-H2O-Medium in das Kompartiment A eingebracht. Auf der zusammengesetzten [Poly(1-2)]-NAFION-Membran erfolgt sofort auf den Peptideinheiten von (2) eine Komplexierung, wie zuvor in Beispiel 3 beschrieben. Im Anschluss folgt mit Hilfe einer Gegenelektrode und einer in das Kompartiment B eingebrachten Referenzelektrode eine Oxidation. In einem zweiten Schritt 2 führt die elektrochemische Oxidation zur Aussalzung von Protonen in diesem Kompartiment B bis zu einem pH in der Größenordnung von 4, und zum unmittelbaren Aussalzen der Carboxypeptidase A. Bei einem Zyklus dieses kontinuierlichen Verfahrens wurde in dem Kompartiment B eine Menge von 1,2 g Carboxypeptidase A wiedergewonnen, wie dies durch Messung der enzymatischen Aktivität bestimmt wurde.
  • Diese Ergebnisse bestätigen folglich das Erkennungsphänomen dieser Elektroden in Bezug auf Enzyme sowie deren Kapazität zur Extraktion dieser Enzyme. Dieses Verhalten ist auf eindeutige Art und Weise mit der chemischen Natur des auf die Polypyrrolkette gepfropften Dipeptides verbunden.
  • Beispiel 5: Synthese eines mit einem Polznukleotid oder Oligonukleotid funktionalisierten Polypyrrols
  • Diese Synthese wird gemäß der drei folgenden Schritte durchgeführt.
  • a) Synthese des Monomers [N-Hydroxysuccinimid-3-pyrrol]
  • In eine Dreihalsflasche werden 0,4 mol Pyrrol-Essigsäure, (I), 30 ml Chloroform und 0,4 mol N-Hydroxysuccinimid, NHS (II), zugegeben. Die Mischung wird geschüttelt, anschließend wird tropfenweise eine Lösung von 0,4 mol Dicyclohexylcarboxiimid, DCC, in 20 ml Chloroform hinzugegeben. Nach dem Schütteln für 2 h bildet sich ein weißer Feststoff, der filtriert und mit Chloroform gewaschen wird. Nach dem Verdampfen und Waschen mit Acetonitril, um nicht notwendige Reaktionsprodukte zu entfernen, wird das Produkt in Chloroform rekristallisiert. Es wird dann die gesuchte Verbindung [N-Hydroxysuccinimid-3-pyrrol], (III), in Form eines weißen Pulvers erhalten.
  • Figure 00260001
  • Schmelzpunkt, TS = 135°C; 1HNMR (ppm): (NH, 1H, 9, s); Pyrrol (2H, 6,7, m): Pyrrol (1H, 6,1, s); CH2 (2H, 3,8, s); Hydroxysuccinimid (4H, 2,8, s).
  • b) Synthese des Polymers durch Elektropolymerisation
  • Die Elektropolymerisationslösung enthält 0,5 M LiClO4, 0,1 M des Monomers (III) in Acetonitril. Die Elektropolymerisa tion erfolgt auf einer Platinelektrode mit einer Oberfläche von 0,7 cm2, bei einem Potenzial von 0,9 V in Bezug auf eine gesättigte Quecksilber(I)-Chloridelektrode, ECS, indem eine Elektropolymerisationsladung von 30 mC verwendet wird. Es erscheint ein schwarzer Film auf der Elektrode, der dem Poly(III) entspricht, dessen Dicke ungefähr 200 nm beträgt.
  • Figure 00270001
  • Die Elektroaktivität dieses Polymers wurde in einem 0,5 M LiClo4-Acetonitrilmedium analysiert, das einen Oxidationspeak bei 0,28 V/ECS und einen Reduktionspeak bei 0,24 V/ECS zeigt, wie in 8 gezeigt. Der geringe Abstand zwischen dem Oxidations- und dem Reduktionspeak, 40 mV, bestätigt die sehr große Elektroaktivität und Reversibilität dieses Polymers.
  • c) Pfropfung eines ODN-Oligonukleotids
  • Die vorherige Elektrode, die den Polymerfilm aufweist, wird in ein Reaktionsmedium eingetaucht, das aus einer Mischung gebildet wird, die besteht aus Dimethylformamid mit 10% von 0,1 M Boratpuffer bei pH 9,3, und 26,2 nmol Oligonukleotid, ODN, von 14 Basen, die die Sequenz CCTAAGAGGGAGTG sowie eine Aminfunktion am 5'-Ende tragen, auf der eine Kopplungsreaktion mit der N-Hydroxysuccinimidgruppe durchgeführt wird, die von den Pyrroleinheiten des Polymers getragen wird. Diese Kopp lungsreaktion erfolgt in 2 h. Das Pfropfen wird in Essigsäure ebenfalls von der Hydrolyse der mit dem Oligonukleotid nichtsubstituierten Succinimid-Gruppen begleitet. Das auf der Elektrode erhaltene Polymer entspricht also einem Poly([pyrrol-ODN][pyrrol-COOH])-Copolymer.
  • Figure 00280001
  • Beispiel 6: Charakterisierung des Erkennungsphänomens
  • Das Erkennungsphänomen wurde durch elektrochemische Charakterisierung des Films des Polymers Poly([pyrrol-ODN][pyrrol-COOH]), der in Beispiel 5 c) erhalten wurde, bestätigt. Die elektrochemische Analyse wurde zuerst direkt auf die Elektrode gerichtet, die nach der Synthese erhalten wurde, anschließend, nachdem diese Elektrode in Gegenwart von Ziel-ODN und von Nicht-Ziel-ODN gebracht wurde. Die Hybridisierungsreaktion des Polymers erfolgte somit in Gegenwart von komplementärer (Ziel-)ODN und nicht-komplementärer (Nicht-Ziel)ODN in einer gepufferten wässrigen Lösung mit PEG. Die Inkubation erfolgte bei 37°C für 2h, entweder in Gegenwart von Ziel-ODN, CACTCCCTCTTAGG, bei einer Konzentration von 335 nmol, oder in Gegenwart von Nicht-Ziel-ODN, GGTGATAGAAGTATC, bei einer Konzentration von 272 nmol. Nach der Reaktion werden die Filme mit dem PEG-Puffer gewaschen und durch zyklische Voltammetrie ana lysiert. Die erhaltenen Voltammogramme sind in den 9 und 10 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen in erster Linie, 9, dass das Polymer nach der Synthese und bevor dieses in Gegenwart der Ziel- oder Nicht-Ziel-Sequenz gebracht wird, einen reversiblen Oxidationspeak, der bei 0,34 V/ECS liegt, was die Elektroaktivität dieses funktionalisierten Polymers bestätigt. Nach der Inkubationsreaktion in Gegenwart der Nicht-Ziel-Sequenz und nach dem Spülen zeigt das Voltammogramm keine Modifikation. Wenn dagegen das Polymer in Gegenwart des Zieles inkubiert wird, ist das erhaltene Voltammogramm, 10, anders, mit einer Zunahme des Oxidationspotenzials auf 0,40 V/ECS, d. h., einer Erhöhung von 60 mV. Diese Zunahme ist bei einer Hybridisierung, die zwischen ODN und dem entsprechenden Ziel stattgefunden hat, ganz und gar signifikant. Diese Erhöhung, das sog. Oxidationspotenzial, wird einem Komplexierungsphänomen des Armes entlang der Länge der Polypyrrolketten zugeschrieben, welches also von einer Energiezunahme begleitet wird, die für die Oxidation dieses Polymers notwendig ist.
  • Dieses Ergebnis bestätigt, dass diese neue Klasse von elektroaktiven Materialien, von konjugierten Polyheterozyklen, die an Position 3 durch ein Oligonukleotid substituiert sind, tatsächlich mit einem Phänomen der Erkennung von komplementärer DNA verbunden sind, und andererseits, dass diese Materialien eine elektrochemische Messung dieser selektiven Hybridisierung ermöglichen. Diese elektrochemische Messung eröffnet den Weg für Gensensoren vom elektrochemischen, konduktometrischen oder potentiometrischen Typ, und andererseits für Gensensoren vom Typ eines mikroelektrochemischen Feldwirkungstransistors, basierend auf einer konduktometrischen Antwort.

Claims (10)

  1. Funktionalisiertes elektrisch leitfähiges und elektroaktives konjugiertes Polymer, dadurch gekennzeichnet, dass es Formel I entspricht:
    Figure 00300001
    in der – n eine ganze Zahl ungleich Null, und i eine ganze Zahl, die von 2 bis n-1 variiert, ist, und – R1, Ri, Rn, die identisch oder unterschiedlich sind, ein H oder eine funktionelle Gruppe, mit Ausnahme von CH2-COOH, repräsentieren, die über Kovalenz an ein erstes biologisches Molekül oder einen Anti-Liganden binden kann, und das zumindest eine – funktionelle Gruppe aufweist, die unabhängig ausgewählt ist aus der Gesamtheit der nachfolgenden funktionellen Gruppen: Yp-C-X, wobei X ein OH, ein substituiertes oder nichtsubstituiertes O-Niederalkyl-Radikal, ein Halogen, insbesondere Cl, repräsentiert; Yp-NHZ, wobei Z ein H oder ein Alkyl-Radikal repräsentiert; Yp-NH-CO-CF3; Yp-X, wobei X der obigen Definition entspricht, -Si(alkyl)3, -Si(alkoxyl)3, oder eine aktivierte Estergruppe, die N-Hydroxysuccinimid enthält, wobei p eine ganze Zahl von vorzugsweise 1 oder 2 ist, in denen Y eine Gruppe repräsentiert, die ausgewählt ist aus den Alkylen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, den Alkoxylen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, den Polyethern, die der allgemeinen Formel (CH2-CH2-O)m-(CH2)m, entsprechen, wobei m eine ganze Zahl, die von 1 bis 3 variiert, und m' eine ganze Zahl von 1 oder 2 repräsentieren.
  2. Elektrisch leitfähiges und elektroaktives konjugiertes Polymer, das zumindest eine funktionelle Gruppe aufweist, die über Kovalenz an ein erstes biologisches Molekül gebunden ist, das ausgewählt ist aus den Polynukleotiden und den Peptiden oder dem Anti-Liganden, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer Formel II entspricht:
    Figure 00310001
    in der: – n eine ganze Zahl ungleich Null, und i eine ganze Zahl, die von 2 bis n-1 variiert, ist, und – R'1, R'i, R'n, die identisch oder unterschiedlich sind, ein H oder eine funktionelle Gruppe repräsentieren, die über Kovalenz an ein erstes biologisches Molekül oder einen Anti-Liganden binden können oder daran gebunden sind, und von denen zumindest eine Gruppe eine funktionelle ist, die über Kovalenz an ein erstes biologisches Molekül oder einen Anti-Liganden gebunden ist, – die eine oder mehreren funktionellen Gruppen, die an ein biologisches Molekül oder einen Liganden gebunden sind, vor der Reaktion mit letzteren aus der Gesamtheit der folgenden funktionellen Gruppen ausgewählt werden: Yp-C-X, wobei X ein OH, ein substituiertes oder nichtsubstituiertes O-Niederalkyl-Radikal, ein Halogen, insbesondere Cl, repräsentiert; Yp-NHZ, wobei Z ein H oder ein Alkyl-Radikal repräsentiert; Yp-NH-CO-CF3; Yp-X, wobei X der obigen Definition entspricht, -Si(alkyl)3, -Si(alkoxyl)3, oder eine aktivierte Estergruppe, die N-Hydroxysuccinimid enthält, wobei p eine ganze Zahl von vorzugsweise 1 oder 2 ist, in denen Y eine Gruppe repräsentiert, die ausgewählt ist aus den Alkylen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, den Alkoxylen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, den Polyethern, die der allgemeinen Formel (CH2-CH2-O)m-(CH2)m, entsprechen, wobei m eine ganze Zahl, die von 1 bis 3 variiert, und m' eine ganze Zahl von 1 oder 2, oder -CH2-COOH repräsentieren; unter der Bedingung, dass die funktionellen Gruppen, die an ein biologisches Molekül gebunden sind, das ausgewählt ist aus den Polynukleotiden und den Peptiden, identisch sind, wenn sie vor der Reaktion mit dem ersten biologischen Molekül aus -(CH2)-COOH bestehen.
  3. Konjugiertes Polymer nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das oder die ersten biologischen Moleküle oder Anti-Liganden ausgewählt sind aus den Peptiden oder Peptidderivaten, insbesondere aus Gly-Phe, Phe-Pro, Phe-Hea-Pro, und aus den Polynukleotiden, wie dem Oligonukleotid mit der Sequenz: CCTAAGAGGGAGTG.
  4. Verwendung eines wie in einem der Ansprüche 2 bis 3 definierten konjugierten Polymers, um ein zweites biologisches Molekül oder einen Liganden in vitro oder in vivo zu detektieren oder zu bestimmen, der sich von dem Anti-Liganden unterscheidet und spezifisch mit diesem interagiert, wobei die Detektion und/oder die Bestimmung dieses Liganden durch Erfassung und/oder Messung einer Potenzialdifferenz oder einer Stromveränderung zwischen dem nicht an den Liganden gebundenen konjugierten Polymer und dem an den Liganden gebundenen Polymer erfolgt.
  5. Verwendung eines in Anspruch 3 definierten Polymers gemäß Anspruch 4, um ein Enzym, wie bspw. ein proteolytisches Enzym, insbesondere Carboxypeptidase A, zu detektieren und/oder zu bestimmen.
  6. Verwendung eines in einem der Ansprüche 2 bis 5 definierten Polymers gemäß Anspruch 4, um ein Polynukleotid, wie bspw. das Oligonukleotid mit der Sequenz CACTCCCTCTTAGG, zu detektieren und/oder zu bestimmen.
  7. Verwendung eines konjugierten Polymers nach Anspruch 2 oder 3, um ein zweites biologisches Molekül oder einen Liganden in vitro oder in vivo zu extrahieren, der sich von dem Anti-Liganden unterscheidet und mit letzterem spezifisch interagiert.
  8. Verwendung eines konjugierten Polymers nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das konjugierte Polymer auf einem leitfähigen Substrat, wie bspw. Metall oder ein Kohlenstoffderivat oder in Form eines selbsttragenden Films, aufgebracht wird.
  9. Elektrode, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einem leitfähigen Substrat, wie bspw. Metall oder ein Kohlenstoffderivat, und einem wie in Anspruch 2 oder 3 definierten Polymer gebildet ist.
  10. Selbsttragender Film aus einem Polymer, dadurch gekennzeichnet, dass er aus einem wie in Anspruch 2 oder 3 definierten Polymer gebildet ist.
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