FR2892723A1

FR2892723A1 - Nouveaux monomeres electropolymerisables, solubles en solution aqueuse, comportant une metalloporphyrine.

Info

Publication number: FR2892723A1
Application number: FR0511187A
Authority: FR
Inventors: Frederic Canonne; Youssoufi Hafsa Korri; Jean Pierre Mahy; Bernard Mandrand; Fauvet Martine Perree
Original assignee: Biomerieux SA; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Paris Sud Paris 11
Current assignee: Biomerieux SA; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Paris Sud Paris 11
Priority date: 2005-11-03
Filing date: 2005-11-03
Publication date: 2007-05-04
Anticipated expiration: 2025-11-03
Also published as: EP1943505A1; WO2007051947A1; FR2892723B1; JP2009515002A; US20090314660A1; US8092661B2

Abstract

La présente invention a pour objet de nouveaux monomères électropolymérisables, destinés à être polymérisés en solution aqueuse, comportant un motif électropolymérisable et une métallo-porphyrine, caractérisés en ce que la métallo-porphyrine est substituée par au moins deux entités ionisées ou ionisables en solution aqueuse.L'invention est également relative au procédé de polymérisation de tels monomères, à la sonde électroactive susceptible d'être obtenue par polymérisation de tels monomères et au procédé de détection d'un ligand cible dans un échantillon biologique mettant en oeuvre une telle sonde électroactive.

Description

La présente invention concerne le domaine technique de

l'électropolymérisation. En particulier, l'invention a pour objet un nouveau monomère électropolymérisable, soluble en solution aqueuse, comportant une métalloporphyrine. L'invention est également relative au procédé de polymérisation d'un tel monomère, à la sonde électroactive susceptible d'être obtenue par polymérisation d'un tel monomère et au procédé de détection d'un ligand cible dans un échantillon biologique mettant en oeuvre une telle sonde électroactive. La détection de biomolécules, telles que les protéines ou les séquences d'acides nucléiques font l'objet d'évolutions technologiques rapides ces dernières années notamment dans le domaine médical. En effet, il est par exemple possible de détecter de très faibles quantités d'ADN, grâce à la mise au point de méthode d'amplification de l'ADN présent, comme la PCR (polymerase chain reaction). L'ADN de l'agent infectieux ou des cellules étudiées est d'abord isolé, puis amplifié par une technique de type PCR et enfin, la présence ou non d'ADN est détectée et quantifiée.

L'élaboration de nouveaux dispositifs pour la détection de biomolécules, basés sur une lecture en temps réel de la détection avec une meilleure sensibilité, une meilleure spécificité et à des coûts moindres est en plein développement. Actuellement, les transducteurs généralement utilisés pour la détection sont des détecteurs fluorescents. Cette méthode est basée sur une lecture optique, à savoir la mesure de lumière absorbée ou émise suite à une réaction chimique ou biochimique. Il s'agit donc d'une méthode indirecte. De nombreux composés possèdent des propriétés de fluorescence, notamment les metallo-porphyrines qui sont largement utilisées dans ce contexte. Le document US 6 623 973 décrit une méthode de détection de composés organiques volatiles par modification de la fluorescence du film de porphyrines.

Wandrekar et al. décrivent les interactions du composé meso-tri(N-méthyl-4-pyridinium)porphyrinyl-p-phénylene-5'-O-thymidine avec une molécule d'ADN (J.Hterocyclic Chem., 1996, 33, 1775-1783). Le document US 6 004 530 décrit un procédé de préparation d'un dérivé metallo-porphyrine couplé à des biomolécules permettant la détection par fluorescence de protéines ou oligonucléotides.

Les inconvénients majeurs de ces méthodes indirectes, sont leur faible sensibilité et spécificité. Des techniques de détection directe ont été développées, telles que la détection électrochimique. Cette dernière offre une détection rapide et spécifique des biomolécules.

La sensibilité élevée des transducteurs électrochimiques, leur compatibilité avec la microfabrication et la technologie de miniaturisation, leur bas prix et leur entretien minimum, rendent ces dispositifs importants pour le diagnostic. De plus, l'électrochimie offre le seul chemin pour le contrôle électrique d'hybridation de l'ADN de divers processus de dénaturation, et d'une manière plus générale, pour sonder l'interaction spécifique de l'ADN avec diverses molécules afin de produire un signal électrique. Il existe plusieurs modes de détection électrochimique tels que la détection coulométrique et potentiométrique ou la détection par mesure d'impédance. Des capteurs électrochimiques, basés sur l'utilisation d'intercalants électroactifs, ont été largement décrits dans la littérature (Millan et al., Anal. Chem., 1993, 65, 2317 ; Bard et al. Anal. Chem., 1990, 62, 2658). Le duplex sonde-cible formé après hybridation est exposé à une solution d'intercalant. L'augmentation de la réponse électrochimique due à l'association d'intercalant avec la surface du duplex sert de signal d'hybridation. La plupart de ces biocapteurs utilisent des complexes de cation métallique comme le Co(phen)33+, Co(bpy) 33+ ou encore la daunomycine. La faible spécificité de ces intercalants vis-à-vis de l'hybridation rende la sélectivité de cette méthode très limitée. D'autres capteurs électrochimiques utilisent un groupe electrodonneur tel que le ferrocène comme sonde électrochimique. Le document WO 01/81446 décrit un polymère électroactif dont l'unité pyrrole porte un polynucléotide lié au ferrocène. Bedioui et al., quant à eux, décrivent un film de poly(pyrrole manganèse porphyrine) utilisé dans un système catalytique (Journal of Molecular Catalysis, 1989, 56, 267-275). Dans ces structures, les monomères mis en oeuvre sont hydrophobes et l'électropolymérisation est généralement réalisée en solvant organique. Or, des manipulations en milieu organique ne sont pas compatibles avec l'utilisation de biomolécules. Ces dernières ne sont pas solubles dans de tels milieux et/ou, bien souvent, s'y dénaturent et leurs propriétés sont altérées. Dans le cas des protéines, on constate le plus souvent une perte de la conformation active. De ce constat, deux stratégies ont, jusqu'à présent, émergé : la première consiste à réaliser, sur une puce à électrodes, plusieurs couches de polymères conducteurs avec, en partant de l'électrode, une couche polypyrrole (déposée en solvant organique), une couche de copolymère pyrrole / pyrrole-groupe electrodonneur (déposée en solvant organique) et enfin une couche de copolymère pyrrole / pyrrole lié covalemment à une biomolécule (déposée en milieu aqueux). Cette stratégie nommée multi-couches est par exemple décrite dans FR 2849038. Des polymères pouvant être utilisés dans cette stratégie sont, par exemple, décrits dans WO 95/29199 et dans WO 01/81446. Cette stratégie multicouches ne donne pas entière satisfaction, car elle est fastidieuse du fait de la mise en oeuvre de plusieurs transitions solvant organique-milieu aqueux avec à chaque fois la nécessité de rincer la puce plusieurs fois.

L'autre stratégie est nommée post-fonctionnalisation : elle consiste en la fixation covalente post-polymérisation de biomolécules, en milieu aqueux, grâce à des fonctions réactives situées sur la couche de polymère. On pourra notamment se référer à Synthetic Metals 1999, 89-94 et à Biomacromolecules 2001, 2, 58-64. Cette stratégie de postfonctionnalisation ne permet pas, quant à elle, l'adressage de biomolécules. De plus, elle présente un manque de reproductibilité plot à plot, lié à la variabilité de l'efficacité de couplage de la biomolécule sur le polymère. On est ainsi toujours dans l'attente de l'élaboration de polymères possédant de meilleures propriétés électroactives compatibles avec une réaction d'électropolymérisation en solution aqueuse.

Pour remédier aux inconvénients de l'état de la technique, la présente invention propose un monomère destiné à être polymérisé en solution aqueuse qui comporte un motif électropolymérisable et une métalloporphyrine substituée par au moins deux entités ionisées ou ionisables en solution aqueuse. De façon avantageuse, le monomère électropolymérisable tel que défini ci-dessus présente l'une quelconque des caractéristiques ci-dessous ou plusieurs caractéristiques ci- après, lorsqu'elles ne s'excluent pas l'une l'autre : - la métalloporphyrine est substituée par trois entités ionisées ou ionisables en solution aqueuse, -le monomère est soluble dans l'eau distillée, au moins jusqu'à une concentration de 10mM, de préférence au moins jusqu'à une concentration de 30mM, - la métallo-porphyrine est substituée par au moins deux entités ionisées ou ionisables en solution aqueuse, situées en position méso de la métallo-porphyrine, - les entités ionisées ou ionisables comprennent une fonction ionisée, ou ionisable dans une solution aqueuse qui présente un pH compris entre 3 et 8, choisie parmi les fonctions : ammonium, amine, polyamine, acide carboxylique, acide phosphonique, acide sulfonique et phosphate, deux des entités ionisées ou ionisables substituant la métallo-porphyrine comprennent un groupement N-méthylpyridinium sous forme de sel ou une fonction ûCOOH, deux des entités ionisées ou ionisables substituant la métallo-porphyrine sont identiques, la métalloporphyrine est substituée par au moins deux entités ionisées ou ionisables en solution aqueuse, différentes, - la métalloporphyrine, et en particulier l'une de ses positions méso, est substituée par un ligand biologique, avantageusement choisi parmi les polynucléotides et notamment les oligonucléotides, les polypeptides, les protéines, les antigènes, les anticorps, les haptènes, les oligosaccharides et la biotine, les polynucléotides étant préférés, - le motif électropolymérisable est choisi parmi l'acétylène, les pyrroles, les thiophènes, les indoles, les anilines, les azines, les p-phénylènevinylènes, les p-phénylènes, les pyrènes, les furanes, les sélénophènes, les pyrridazines, les carbazoles, les acrylates, les méthacrylates et leurs dérivés, la liaison entre le motif électropolymérisable et la métallo-porphyrine se fait en position méso de la métallo-porphyrine, le motif électropolymérisable est un pyrrole ; de préférence, la liaison entre le pyrrole et la métallo-porphyrine est assurée en position 3 du pyrrole, - la métallo-porphyrine est également substituée par un ou plusieurs groupes donneurs ou attracteurs d'électrons, de préférence choisi(s) parmi : les atomes d'halogène, les groupes cyano, nitro, (C1-C4)alkyle, (C1-C4)alcényle, (C1-C4)alcynyle et (CI- C4)alcoxy. - le métal de la métallo-porphyrine est un métal de transition (défini dans le tableau de Mendeleïev dans sa version de juillet 2005), ou Mg, Al, Sn ou Ge, et est de préférence choisi parmi : Co, Ni, Mg, Fe, Zn, Mn, Pd, Cu, Pt, V, Mo, Al, Sn et Ge, et préférentiellement parmi : Co, Zn et Mn ; - le monomère ne comporte pas de ligand biologique. Les monomères selon l'invention, de part la présence d'au moins deux entités ionisées ou ionisables en solution aqueuse, vont être solubles en solution aqueuse, autorisant ainsi leur polymérisation dans de tels milieux aqueux. Avant de décrire plus en détails l'invention, certains termes employés dans la description et les revendications sont définis ci-après. Par monomère électropolymérisable , on entend un monomère comportant un motif électropolymérisable, ledit monomère étant susceptible de réagir par polymérisation électrochimique avec d'autres monomères pour former un polymère. Un motif électropolymérisable présente une alternance de liaisons simples et de doubles liaisons. A titre d'exemple de motif électropolymérisable, on peut citer le pyrrole, l'acetylène, le thiophène, l'azine, le p-phénylène, le p-phénylène vinylène, le pyrène, le furane, le sélénophène, la pyridazine, le carbazole, l'aniline, l'indole, l'acrylate, les méthacrylates et leurs dérivés.

Par entité ou groupe ionisable en solution aqueuse , on entend un groupe chimique hydrophile susceptible de former un cation ou un anion en solution aqueuse. La forme ionisée en solution aqueuse est obtenue sans mise en oeuvre d'une réaction chimique, de type hydrolyse ou dégradation. La forme ionisée est, par exemple, obtenue par échange d'un proton ou sous la forme d'une paire d'ions en solution à partir d'un sel. De telles entités ionisées ou ionisables, comportent notamment un groupe ammonium, amine (-NHR" avec R" qui représente un atome d'hydrogène ou un groupe (C1-C4)alkyle), polyamine, acide carboxylique (-COOH), acide phosphonique (-OP(OH)2), acide sulfonique (-SO3H), phosphate (-O-P(0)2(OR") avec R" qui représente un atome d'hydrogène ou un groupe (C,-C4)alkyle). Une entité ionisable se trouve sous forme ionique lorsqu'elle est mise dans une solution aqueuse qui présente un pH compris entre 3 et 8, de préférence entre 5 et 8. De façon avantageuse, l'entité ionisable se trouve sous forme ionisée dans l'eau distillée.

Dans le cadre de l'invention, on entend par alkyle , un groupe hydrocarboné linéaire ou ramifié, ayant de 1 à 15 atomes de carbone et, de préférence, de 1 à 10 atomes de carbone. Un groupe (C1-C4)alkyle désigne un groupe alkyle comprenant de 1 à 4 atomes de carbone.. Des exemples de groupes (CI-C4)alkyle sont les groupes méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, t-butyle.

Par alcényle , on entend un groupe hydrocarboné, linéaire ou ramifié, comprenant une ou plusieurs doubles liaisons, de préférence, 1 ou 2 doubles liaisons.

Par alcynyle , on entend un groupe hydrocarboné, linéaire ou ramifié,

comprenant une ou plusieurs triples liaisons, de préférence, 1 ou 2 triples liaisons.

Par alcoxy , on entend un groupe ûO-alkyle, alkyle étant tel que défini ci-dessus. Par groupe ammonium, on entend, une amine quaternaire sous forme de sels comme le N-méthylpyridinium. Le groupe N-méthylpyridinium correspond, de préférence, à : ù\ + //NùCH3 Par atomes d'halogène , on entend, un atome de chlore, brome, fluor ou iode. Par monomère soluble en solution aqueuse , on entend un monomère soluble en solution aqueuse dans les conditions de polymérisation, à savoir dans les conditions de température, pH et force ionique utilisées lors de sa mise en oeuvre dans une réaction de polymérisation par voie électrochimique. L'électropolymérisation sera en général, réalisée dans une solution aqueuse dont le pH est compris entre 3 et 8 et à une température de l'ordre de 20 à 30 C. De préférence, la solubilité d'un monomère selon l'invention sera telle que l'introduction dudit monomère dans l'eau distillée à une température de 25 C, au moins jusqu'à une concentration de 1mM, de préférence au moins jusqu'à une concentration de 10mM, et préférentiellement au moins jusqu'à une concentration de 30mM, conduise à une solution homogène et transparente à l'oeil nu, sans précipitation. On entend par polymérisation une réaction par voie chimique ou électrochimique d'unités de même nature chimique permettant l'assemblage d'un certain nombre de monomères pour former un polymère (r x M ' (M)r avec r supérieur ou égal à 2). Le terme polymérisation englobe la copolymérisation et l'homopolymérisation. Il s'agit avantageusement dans le cadre de l'invention de la condensation de motifs pyrrole pour former un polypyrrole. On entend par copolymérisation la polymérisation simultanée d'unités différentes. Les termes electropolymérisation , électrocopolymérisation , copolymérisation électrochimique et polymérisation électrochimique désignent une polymérisation par voie électrochimique. L'étape d'électropolymérisation/électrocopolymérisation est réalisée en utilisant des techniques bien connues de l'homme du métier. Par exemple, elle peut être conduite en soumettant les monomères à des balayages de potentiel électrique suffisants pour provoquer la polymérisation par une oxydation ou bien par polymérisation à courant imposé (chronopotentiométrie) ou à potentiel imposé(chronoampérométrie). Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la polymérisation sera effectuée par un dépôt par chronoampérométrie ou dépôt à potentiel contrôlé. Cette méthode consiste à imposer un saut de potentiel à partir du potentiel d'équilibre (courant nul) jusqu'à une valeur fixe à laquelle s'effectue la réaction à l'électrode et à mesurer le courant en fonction du temps.

Les conditions de polymérisation désignent le pH, la température et la force ionique de la solution aqueuse utilisée lors de la polymérisation. Dans le cas du pyrrole, l'électropolymérisation s'effectue par le mécanisme de Diaz (Sadki et al., Chem.Soc.Rev., 29 : 283-293, 2000) qui conduit à la formation du polypyrrole. Cette polymérisation s'effectue au niveau des positions 2 et 5 des monomères pyrrole. Un pyrrole substitué en position 3 ou 4 du noyau pyrrole est donc susceptible de polymériser ou de copolymériser avec d'autres pyrroles au niveau des positions 2 et 5. Les motifs pyrroles substitués en position 3 sont préférés.

On entend par polymère conducteur , un polymère dont les électrons sont fortement délocalisés, le plus souvent le long d'un enchaînement de liaisons simples et doubles (liaisons conjuguées), ce qui le conduit à se comporter comme un semi-conducteur ou un conducteur. Par ligand biologique, on entend un composé qui possède au moins un site de reconnaissance lui permettant de réagir avec une molécule cible d'intérêt biologique. Un couple ligand/anti-ligand susceptible d'interagir spécifiquement pour former un conjugué est également nommé, dans la présente invention, ligand sonde/ligand cible. A titre d'exemple, on peut citer, comme ligands biologiques, les polynucléotides et notamment oligonucléotides, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines, les haptènes, les oligosaccharides et la biotine ... Il apparaît donc que la plupart de ces ligands biologiques comporte une fonction ionisable en solution aqueuse. Au sens de l'invention, le terme ligands biologiques et les termes polynucléotides , oligonucléotides , antigènes, anticorps , polypeptides , protéines , haptènes , oligosaccharides et biotine peuvent inclure une charnière ou bras de liaison lié au ligand biologique en question et assurant sa liaison avec la métallo-porphyrine. Ces bras de liaisons pourront, notamment, inclure un enchaînement ûNH-CO-ou -CO-NH- résultant du couplage d'une fonction amine ou acide, éventuellement sous forme activée, portée par la métalloporphyrine, avec une fonction réactive portée par le ligand biologique.

Le terme polynucléotide désigne un enchaînement d'au moins 2 nucléotides (désoxyribonucléotides ou ribonucléotides), naturels ou modifiés, susceptibles de s'hybrider, dans des conditions appropriées d'hybridation, avec un oligonucléotide au moins partiellement complémentaire. Par nucléotides modifiés, on entend par exemple, un nucléotide comportant une base modifiée et/ou comportant une modification au niveau de la liaison internucléotidique et/ou au niveau du squelette. A titre d'exemple de bases modifiées, on peut citer l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la diamino-2,6-purine et la bromo-5-désoxyuridine. Pour illustrer une liaison internucléotidique modifiée, on peut mentionner les liaisons phosphorothioate, H- phophonate et alkyl-phosphonate. Les alpha-oligonucléotides tels que ceux décrits dans FR-A62 607 507 et les PNA qui font l'objet de l'article de M. Eghom et al., J. Am. Chem. Soc (1992) 114, 1895-1897, sont des exemples de polynucléotides constitués de nucléotides dont le squelette est modifié. Chacune de ces modifications peut être prise en combinaison. Le polynucléotide peut être un oligonucléotide, un acide nucléique naturel ou son fragment comme un ADN, un ARN ribosomique, un ARN messager, un ARN de transfert, un acide nucléique obtenu par une technique d'amplification enzymatique. Le terme polypeptide signifie notamment tout enchaînement d'au moins deux acides aminés. Par acides aminés, on entend les acides aminés primaires qui codent pour les protéines, les acides aminés dérivés après action enzymatique comme la trans-4 hydroxyproline et les acides aminés naturels mais non présents dans les protéines comme la norvaline, la N-methyl-L leucine, la staline (voir Hunt S. dans Chemistry and Biochemistry of the amino acids, Barett G.C., ed., Chapman and Hall, London, 1985), les acides aminés protégés par des fonctions chimiques utilisables en synthèse sur support solide ou en phase liquide et les acides aminés non naturels. Le terme "protéine" inclut les holoprotéines et les hétéroprotéines comme les nucléoprotéines, les lipoprotéines, les phosphoprotéines, les métalloprotéines et les glycoprotéines aussi bien fibreuses que globulaires sous leur forme conformationnelle caractéristique. Le terme haptène désigne des composés non immunogènes, c'est-à-dire incapables par eux mêmes de promouvoir une réaction immunitaire par production d'anticorps, mais capables d'être reconnues par des anticorps obtenus par immunisation d'animaux dans des conditions connues, en particulier par immunisation avec un conjugué haptène-protéine. Ces composés ont généralement une masse moléculaire inférieure à 3000 Da, et le plus souvent inférieure à 2000 Da et peuvent être par exemple des peptides glycosylés, des métabolites, des vitamines, des hormones, des prostaglandines, des toxines, des antibiotiques ou divers médicaments, les nucléosides et nucléotides. Le terme anticorps inclut les anticorps polyclonaux ou monoclonaux, les anticorps obtenus par recombinaison génétique, et des fragments d'anticorps tels que des fragments Fab ou F(ab')2 ou Fc, ainsi que tout anticorps obtenu par modification ou recombinaison génétique. Le terme "antigène" désigne un composé susceptible d'être reconnu par un anticorps dont il a induit la synthèse par une réponse immune. Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet les monomères de formule (I) comportant un motif pyrrole et une métalloporphyrine : (1) R dans laquelle : - les groupes R1, R2 et R3 représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un groupe ionisé ou ionisable en solution aqueuse, ou un ligand biologique, étant entendu qu'au moins deux des groupes R1, R2 et R3, identiques ou différents, représentent un groupe ionisé ou ionisable, - A1, A2 et A3 représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un bras espaceur, notamment choisi parmi les enchaînements suivants : o -(CH2)ä1- avec nl qui représente un entier compris dans la gamme allant de Oà5, o -(CH2-CH2-O)ä2- avec n2 qui représente un entier compris dans la gamme allant de 1 à 5, Où(CH2)n3 o o avec n3 qui représente un entier compris dans la gamme allant de 1 à 5, o - les groupes Ra, Rb, Re, Rd, Re, R ou Rf, Rg et Rh représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un groupe donneur d'électrons ou un groupe attracteur d'électrons, - X représente un bras espaceur, notamment choisi parmi les enchaînements suivants : 0 -(CH2),,,1- avec ml qui représente un entier compris dans la gamme allant de 1 à 6, 0ù(CH2)m2 NR'--(CH2)ms O o avec m2 et m3 qui représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un entier compris dans la gamme allant de 1 à 3 et R' qui représente un atome d'hydrogène ou un groupe (C I -C4)alkyle, o -(CH2-CH2-O),,,4- avec m4 qui représente un entier compris dans la gamme allant de 1 à 3, o une chaîne polypeptide comportant de 1 à 3 acides aminés, o -(CH=CH)m5- avec m5 qui représente un entier compris dans la gamme 15 allant delà 3, - M est un métal de transition, ou Mg, Al, Sn ou Ge, et - R représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, éthyle ou méthoxy. De façon avantageuse, les monomères de formule (I) présentent une ou plusieurs des caractéristiquement ci-dessous, lorsqu'elle ne s'excluent pas l'une l'autre : 20 - au moins deux des groupes R,, R2 et R3 chacun indépendamment comprennent ou représentent, une fonction ionisée, ou ionisable dans une solution aqueuse qui présente un pH compris entre 5 et 8, choisie parmi les fonctions : ammonium, amine, polyamine, acide carboxylique, acide phosphonique, acide sulfonique et phosphate, un seul des groupes RI, R2 ou R3, de préférence R3, représente un ligand biologique 25 choisi parmi les polynucléotides et notamment les oligonucléotides, les polypeptides, les protéines, les antigènes, les anticorps, les haptènes, les oligosaccharides et la biotine, - au moins un des groupements RI, R2 et R3 est un N-méthylpyridinium sous forme de sel ou ûCOOH, 30 - -A1-R1 = -A2-R2 et de préférence -A1-R1 _ -A2-R2= N-méthylpyridinium sous forme de sel ou: COOH 11 - -A1-R1 = -A2-R2 = -A3-R3 et, de préférence, -A1-Ri = -A2-R2= -A3-R3 = N-méthylpyridinium sous forme de sel, la liaison entre le pyrrole et la métallo-porphyrine est assurée en position 3 du pyrrole, R représente un atome d'hydrogène, Ra=Rb=Re=Rd=Re=Rf=Rg=Rh=H, au moins un des groupes Ra, Rb, Re, Rd, Re, Rf, Rg et Rh représente un groupe donneur ou attracteur d'électrons choisi parmi : les atomes d'halogène, les groupes cyano, nitro, (CI-C4)alkyle, (Cu-C4)alcényle, (Ci-C4)alcynyle et (C1-C4)alcoxy, - le métal de la métallo-porphyrine est choisi parmi Co, Ni, Mg, Fe, Zn, Mn, Pd, Cu, Pt, V, Mo, Al, Sn et Ge et, de préférence, parmi : Co, Zn et Mn. - le monomère ne comporte pas de ligand biologique. Les entités ionisables présentes sur la métalloporphyrine permettent d'obtenir un monomère soluble en solution aqueuse, malgré le caractère hydrophobe de la métalloporphyrine. Ces entités ionisables n'altèrent en rien les propriétés du monomère électropolymérisable présent, la polymérisation pouvant être effectuée en phase aqueuse pour former des couches polymères qui seront, de préférence, conductrices. De plus, en choisissant la nature du métal complexant, il est possible d'obtenir une très large gamme de potentiels de détection suivant le métal choisi en fonction du domaine d'électro-activité désiré. Les polymères ainsi obtenus présentent une forte électroactivité et une large gamme de potentiel de détection. Cette latitude pour le choix de la nature chimique du métal complexant après la synthèse du monomère, et donc du domaine d'activité électrochimique, permettra par la suite d'utiliser ces systèmes de détection en multiplexages.

Cette gamme de potentiel peut être élargie en faisant varier également la nature électronique du substituant (donneur ou attracteur) sur le cycle de la porphyrine. Ainsi, il est possible de substituer les groupements phényle ou pyrrole de la porphyrine selon l'invention par un ou plusieurs groupements donneurs ou attracteurs qui permettent de modifier le potentiel redox, avantageusement choisi parmi l'halogène, les groupes cyano, nitro, (CI-C4)alkyle et (C1-C4)alcoxy, (CI-C4)alcènyle, (C1-C4)alcynyle.

A titre d'exemples, sont détaillées ci-après les synthèses d'une porphyrine tri-cationique fonctionnalisée avec un pyrrole, d'une porphyrine di-anionique fonctionnalisée avec un pyrrole et d'une porphyrine fonctionnalisée sur les quatre positions méso, l'une par un groupe pyrrole pour la polymérisation électrochimique, une autre par un groupe ester activé pour le greffage d'un oligonucléotide sonde, et sur les deux autres positions par deux groupements pyridinium pour assurer une solubilité en milieux aqueux. L'homme du métier sera à même d'adapter ces synthèse pour la préparation des autres composés selon l'invention. La synthèse des porphyrines portant des groupes ûSO3H en position meso pourra mettre en oeuvre la méthode publiée par Fleisher, E.B et al. (J. Am. Chem. Soc, 1971, 93, 3162-3167) qui consiste à traiter une porphyrine substituée en position méso par des phényles par l'acide sulfurique concentré. Une méthode douce a également été publiée par la suite par Bao-Hui Ye et al. (Tetrahedron 2003, 59, 3593-3601) qui consiste à synthétiser une porphyrine portant des groupes triméthylsilylphényl porphyrines, à mener une sulfonation en présence de C1SO3 SiMe3 par reflux dans CC14 pendant 4 h, puis à hydrolyser en présence de NaOH. La synthèse des porphyrines substituées par des groupes ûOP(OH)2 pourra être réalisée selon la méthode décrite par A.M. Massari et al. (Polyhedron, 2003, 22, 3065-3072) qui consiste à synthétiser le 4 formyl phényl phosphonate et le condenser sur le dipyrométhane désiré comme décrit précédemment et puis hydrolyser en présence de pyridine. La synthèse de porpphyrines substituées par des groupes attracteurs est, par exemple, décrite dans le cas du bore, par R. Kachadourian et al. (J. Inorganic. Biochemistry, 2003, 95, 240-248), qui utilise la réaction du dibrome liquide dans du chloroforme sur la porphyrine désirée. L'homme de métier sera à même d'adapter ces méthodes pour aboutir aux porphyrines souhaitées. 1) Synthèse d'une porphyrinetri-cationique fonctionnalisée avec un pyrrole La première étape consiste en la synthèse de benzaldéhyde substitué par un groupement amine protégé sous forme d'un groupement phtalimide. Cette réaction est quantitative. Elle est, par exemple, effectuée par alkylation du 3-hydroxy-benzaldéhyde avec le 3-bromopropyl-phtalamide en présence de carbonate de potassium selon le SCHÉMA 1 suivant : SCHÉMA 1 OH K2CO3 DMF La synthèse de la porphyrine peut être réalisée à partir du benzaldéhyde substitué par 5 le groupement phtalimide synthétisé précédemment, du 4-pyridine-carboxaldéhyde et du pyrrole dans l'acide propanoïque suivant la méthode d'Adler et al. [1 R. G Little, J. A. Anton, P. A. Loach, J. A. Ibers, J. Heterocyclic. Chem., 1975, 343 ; Journal of Organic Chemistry, 1967 (32), p 476] comme illustré sur le SCHÉMA 2 ci-dessous. SCHÉMA 2 H 3 éq. 4 éq. + 10 acide propanoique5 Un mélange de six porphyrines est obtenu. Elles sont séparées par chromatographie sur gel de silice. La fonction amine peut alors être obtenue par déprotection avec de l'hydrazine dans un mélange dichlorométhane /éthanol, selon le SCHÉMA 3 suivant : SCHÉMA 3 NH2NH2 CH2Cl2 - EtOH O -- NH2 10 Le couplage peptidique entre la porphyrine-amine et le pyrrole acétique acide peut alors être effectué. Plusieurs voies de synthèse ont été réalisées, et la voie préférée, selon le SCHÉMA 4 ci-dessous, consiste en la réaction de couplage en présence d'agents de couplage classiques, le N-hydroxysuccinimide en présence de dicyclohexyl-carbodiimide. Cette réaction de couplage a été mise au point en utilisant le pyrrole acétique acide non 15 protégé sur l'azote (VOIE A) ou (VOIE B) celui protégé sur l'azote par un groupement toluène sulfonate (Tos).

SCHÉMA 4 i N NHP ou NHS DCC ONH2 TosO + H La métallation de la porphyrine est aisée et quantitative. Elle est réalisée généralement en présence du chlorure du métal sélectionné au deuxième degré d'oxydation 10 dans le diméthylformamide selon le SCHÉMA 5 suivant : SCHÉMA 5 M2+ 2CI- DMF La dernière étape de la voie de synthèse est la méthylation des groupements pyridyle de la porphyrine pour la rendre tri-cationique. Cette réaction est quantitative et s'effectue, par exemple, en présence d'un large excès d'iodure de méthyle dans le DMF (diméthylformamide) selon le SCHÉMA 6 suivant : SCHÉMA 6 1) Mel - DMF 2) Dowex Cl 5 Le passage sur une colonne de Dowex-Cl avec l'eau comme éluant permet d'échanger les contre-anions et d'effectuer une purification finale.

2) Synthèse d'une porphyrine di-anionique fonctionnalisée avec un pyrrole La porphyrine souhaitée est substituée en position méso par trois types de groupements différents. Dans ce cas, la méthode d'Adler pour sa synthèse est moins bien adaptée, étant donné qu'il serait nécessaire de séparer vingt-et-une porphyrines. Dans le cas où deux substituants différents sont positionnés en trans, la synthèse peut se 10 décomposer en deux étapes : la synthèse d'un dipyrrométhane (B. J. Littler, S. Lindsey, Journal of Organic Chemistry, 1999 (64), p 1391 ; J. K. Laha, S. Lindsey, Organic Process Research Developpement, 2003 (7), p 799), puis la construction du cycle porphyrinique (D. T. Gryko, M. Tasior, Tetrahedron Letters, 2003 (44), p 3317). La synthèse du dipyrrométhane peut être réalisée selon le SCHÉMA 7 ci-dessous, 15 par réaction de l'aldéhyde correspondant avec le pyrrole utilisé comme solvant et en présence de TFA comme acide de Lewis.

SCHÉMA 7 CN NH H Le cycle porphyrinique peut alors être construit selon le SCHÉMA 8 suivant par réaction en présence d'acide trifluoro-acétique (TFA) de deux équivalents de dipyrrométhane avec un équivalent de chacun des deux aldéhydes nécessaires. La conjugaison du cycle est, par exemple, obtenue par oxydation avec le 2,6-dichloro-3,5-dicyanobenzoquinone (DDQ). En théorie, en fin de synthèse, le mélange doit être composé de trois porphyrines différentes. SCHÉMA 8 CN OMe 1éq 1éq NC o Les trois porphyrines synthétisées peuvent alors être séparées par chromatographie sur colonne de silice, notamment.

Ensuite, la fonction amine peut être obtenue par déprotection avec de l'hydrazine selon le SCHÉMA 9 ci-dessous : SCHÉMA 9 OMe NH2NH2 NC ONH2 OMe NC cN Le couplage peptidique de la porphyrine-amine avec le pyrrole-acide est réalisé en présence de DCC (1,3-dicyclohexylcarbodiimide) et de NHS (N-hydroxysuccinimide) selon le SCHÉMA 10 ci-dessous : SCHÉMA 10 OMe O NH2 NC NC CN OMe HO H Pour obtenir la porphyrine porteuse de deux groupements -COOH, les groupements nitrile sont alors hydrolysés en milieu basique et la porphyrine métallée avec le métal désiré selon le SCHÉMA 11 ci-dessous :15 SCHÉMA I l OMe OMe NC N H 3) Synthèse d'une porphyrine fonctionnalisée par un groupe pyrrole et par un groupe 5 ester activé. A C B N H La description qui suit est relative à la préparation d'ne porphyrine fonctionnalisée sur ces quatre positions méso, l'une par un groupe pyrrole pour la polymérisation électrochimique, une autre par un groupe ester activé pour le greffage de l'oligonucléotide 10 sonde, et les deux autres par deux groupements pyridinium sur les deux autres positions méso pour assurer une solubilité en milieux aqueux. Une étude par modélisation moléculaire a montré qu'il était préférable de substituer les deux groupements fonctionnels pyrrole et ester activé en position para sur la porphyrine pour éviter les gènes stériques lors des réactions de couplage. La préparation d'une telle porphyrine peut être réalisée, tout d'abord en synthétisant les deux moitiés de porphyrine (dipyrrométhanes) portant les groupements fonctionnels A (dipyrrométhane comportant un phényle substitué en para par une fonction ester) et B (dipyrrométhane comportant un phényle substitué en para par un bras portant une fonction capable de réagir sur un pyrrole), et par la suite en effectuant une réaction de cyclisation en présence du troisième groupement C (pyridinecarboxaldéhyde). Cette synthèse est effectuée suivant la méthode décrite par Lindsey et al. [D. T. Gryko, M. Tasior, Tetrahedron Letters, 2003, 44, 3317; J. Littler, S. Lindsey, J. Org. Chem., 1999, 64, 1391; J. K. Laha, S. Lindsey, Org. Process Res. Develop., 2003, 7, 799.] La synthèse des deux dipyrrométhanes peut être réalisée à partir de l'aldéhyde correspondant avec le pyrrole comme solvant et de l'acide trifluoro-acétique (TFA) comme acide de Lewis. Dans le cas du dipyrrométhane avec le bras "nitrile", on peut opérer selon le SCHÉMA 12 ci-dessous. SCHÉMA 12 N H ON N H Dans le cas du dipyrrométhane avec le bras "phtalimide", la réaction s'effectue selon le SCHÉMA 13 ci-dessous. SCHÉMA 13 H H25 Le cycle porphyrinique est construit à partir des deux dipyrrométhanes et de la pyridine-carboxaldéhyde, en présence de TFA. La conjugaison du cycle peut être obtenue par oxydation avec la 2,6-dichloro-3,5-dicyanobenzoquinone (DDQ) (SCHÉMA 14). En fin de synthèse, le mélange réactionnel est théoriquement composé de trois porphyrines différentes qui peuvent être séparées par chromatographie sur gel de silice. SCHÉMA 14 H //o H N + Au cours de la synthèse, certaines fonctions, et notamment la fonction amine du pyrrole pourront être protégées, puis déprotégées. Les groupes protecteurs des alcools, amines et acides carboxyliques sont bien connus de l'homme du métier. On pourra notamment se référer à Protective Groups in Organic Synthesis , 2nde édition, Greene T.W. et Wuts P.G.M., ed John Wiley et Sons, 1991. A titre de groupe protecteur des amines, on peut citer, à titre d'exemple, les groupes trifluoroacétyle, tert-butoxycarbonyle et 9-fluorénylméthoxycarbonyle. Sur un monomère selon l'invention porteur d'au moins une fonction ionisée ou ionisable réactive, par exemple, du type amine ou ùCOOH, il est possible de réaliser un couplage sur cette fonction avec un ligand biologique, selon des techniques bien connues de l'homme de l'art. Les monomères obtenus selon un tel couplage font partie intégrante de l'invention. Les ligands biologiques pourront, également, être introduits selon toutes techniques appropriées, en formant intermédiairement des métalloporphyrines, porteuses d'autres fonctions réactives, du type aldéhyde, hydroxy ...

Comme dit précédemment, la mise en oeuvre des monomères selon l'invention permet de préparer des polymères qui peuvent notamment servir à l'adressage de biomolécules sur un plot d'une électrode. Un tel adressage peut alors être réalisé en une seule étape. Les monomères selon l'invention présentent l'avantage de pourvoir être polymérisés en solution aqueuse.

La présente invention a également pour objet un procédé d'électropolymérisation réalisé en solution aqueuse, mettant en oeuvre au moins un des monomères conformes à l'invention, et en particulier au moins un monomère porteur d'un ligand biologique. L'électropolymérisation pourra être menée dans une solution tampon ou non, comprenant, avantageusement, un électrolyte support, par exemple NaCl, LiC1O4. Le pH de la solution sera, avantageusement, compris entre 3 et 8. Cette électropolymérisation peut être une homopolymérisation. En particulier, une homopolymérisation avec un monomère soluble conforme à l'invention porteur d'un ligand biologique. Une homopolymérisation à partir d'un monomère soluble conforme à l'invention porteur d'une fonction réactive amine, hydroxyle ou acide carboxylique, éventuellement sous forme protégée, peut également être mise en oeuvre. Cette homopolymérisation pourra alors être suivie d'un couplage de ladite fonction réactive avec un ligand biologique. De façon préférée, l'électropolymérisation sera une copolymérisation réalisée entre au moins deux monomères différents dont au moins un est conforme à l'invention. De préférence, l'un au moins, et de préférence un seul, des monomères est porteur d'un ligand biologique. Bien entendu, le ou les monomères mis en oeuvre, autres que ceux conformes à l'invention seront solubles en solution aqueuse. la copolymérisation met en oeuvre au moins deux monomères selon l'une des revendications 1 à 31 dans lesquels le métal est différent.

Selon une variante préférée, la réaction de polymérisation est réalisée de façon à obtenir un polymère porteur d'au moins deux ligands biologiques différents. Il sera également avantageux, que tous les monomères mis en jeu comprennent un pyrrole comme motif électropolymérisable. Une copolymérisation pourra être réalisée, par exemple, entre un monomère selon l'invention porteur d'un ligand biologique et un pyrrole non substitué ou un pyrrole-3-alcanol, ou encore entre un monomère selon l'invention ne portant pas de ligand biologique, un pyrrole non substitué ou un pyrrole-3-alcanol et un pyrrole porteur en position 3 d'un ligand biologique. A titre de pyrrole-3-alcanol, on peut citer le 3-(hydroxyéthyl)pyrrole. Il est également possible de réaliser une copolymérisation d'au moins un monomère soluble conforme à l'invention porteur d'une fonction réactive amine, hydroxyle ou acide carboxylique, éventuellement sous forme protégée. Cette réaction de copolymérisation en phase aqueuse sera, avantageusement, suivie d'un couplage de ladite fonction réactive avec un ligand biologique. La présente invention a également pour objet les polymères susceptibles d'être obtenus par de telles réactions de polymérisation, éventuellement suivies d'un couplage avec un ligand biologique. Aussi, un autre objectif de l'invention est de proposer des sondes électroactives correspondant à un polymère selon l'invention porteur d'au moins un ligand biologique et des électrodes au moins partiellement recouvertes d'une telle sonde, qui soient plus simples à réaliser, et qui permettent une mesure plus directe de l'interaction ligand sonde/ligand cible. On entend par sonde électroactive , une sonde dont la réponse électrochimique est modifiée lorsqu'un ligand cible interagit de manière spécifique avec un ligand sonde porté par la sonde. Ainsi, on observe une modification du signal électrochimique suite à l'interaction spécifique avec l'analyte.

On entend par ligand cible , toute molécule susceptible d'interagir spécifiquement avec un ligand sonde fixé à une unité monomérique du polymère selon l'invention obtenu à partir d'au moins un monomère selon l'invention et donc susceptible d'être détecté avec ce polymère. Ce ligand cible peut être une biomolécule, telle que par exemple, un nucléotide, un polynucléotide, un acide nucléique, un oligonucléotide, un polypeptide, une protéine, un anticorps, un antigène, un peptide, un lipide, un stéroïde, ou encore un sucre. Le ligand sonde porté par le polymère est spécifique du ligand cible à détecter. La présente invention a donc également pour objet des sondes électroactives sous la forme d'un homopolymère conducteur, susceptibles d'être obtenues par électropolymérisation d'un monomère soluble conforme à l'invention porteur d'un ligand biologique. Même si elles ne sont pas préférées, les sondes électroactives sous la forme d'un homopolymère conducteur susceptibles d'être obtenues par électropolymérisation d'un monomère soluble conforme à l'invention porteur d'une fonction réactive amine, hydroxyle ou acide carboxylique, éventuellement sous forme protégée, suivie d'un couplage de ladite fonction réactive avec un ligand biologique, font partie intégrante de l'invention.

De façon préférée, la présente invention a pour objet des sondes électroactives sous la forme d'un copolymère conducteur susceptible d'être obtenues par copolymérisation d'au moins deux monomères différents dont au moins un est conforme à l'invention. L'un au moins, et de préférence un seul, des monomères étant porteur d'un ligand biologique. On obtient ainsi, un espacement des ligands biologiques sondes ce qui permet d'améliorer la sensibilité. En particulier, on utilisera un monomère soluble conforme à l'invention porteur d'un ligand biologique et un monomère 3-(hydroxyéthyl)pyrrole. Un autre copolymère préféré pourra être obtenu par copolymérisation d'un monomère soluble conforme à l'invention ne portant pas de ligand biologique, d'un monomère porteur d'un ligand biologique de préférence porté en position 3 du pyrrole, et d'un monomère 3- (hydroxyéthyl)pyrrole. Là encore, même si elles ne sont pas préférées, les sondes électroactives sous la forme d'un copolymère conducteur susceptibles d'être obtenues par électropolymérisation d'au moins un monomère soluble conforme à l'invention porteur d'une fonction réactive amine, hydroxyle ou acide carboxylique, éventuellement sous forme protégée, suivie d'un couplage de ladite fonction réactive avec un ligand biologique, font partie intégrante de l'invention. Selon un autre de ses aspects, la présente invention a également pour objet des électrodes comprenant un support conducteur dont tout ou partie de la surface est revêtue d'une sonde électroactive telle que définie ci-dessus.

La présente invention a également pour objet, un procédé de détection d'un ligand cible dans un échantillon biologique, dans lequel on met en contact l'échantillon avec une sonde électroactive telle que définie précédemment, porteuse d'un ligand sonde, dans des conditions appropriées pour l'interaction ligand sonde/ligand cible et on met en évidence et éventuellement, on quantifie, la différence de potentiel ou de courant émis par la sonde avant et après mise en contact avec l'échantillon. Les polymères obtenus à partir des monomères selon l'invention peuvent être utilisés notamment dans toutes les applications dans lesquelles des ligands biologiques sont adressés et immobilisés sur un support solide.

Plus particulièrement, ces polymères peuvent être obtenus sous forme de films auto-supportés ou sous forme de film sur électrode. L'électrode permet en effet de contrôler, par mesure du courant délivré au cours de la réaction, l'évolution de la réaction de polymérisation. L'électrode permet également de mesurer les réponses électrochimiques ultérieures du polymère. La présente invention se rapporte donc également à une électrode comprenant un support conducteur revêtu en surface d'au moins un polymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des ligands biologiques selon l'invention, c'est-à-dire une sonde électroactive selon l'invention. On connaît de l'état de la technique les supports conducteurs pour électrodes, on citera notamment les substrats en métal ou en dérivés de carbone. Pour la fabrication d'une électrode selon l'invention, le polymère est généralement déposé sur le support conducteur. La polymérisation électrochimique est effectuée avantageusement en surface de l'électrode pour obtenir une électrode comprenant un support conducteur revêtu en surface d'un polymère selon l'invention. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'électrode est obtenue en déposant une couche de polymère à la surface d'un support en or ou en platine. Etant donné qu'il est possible de limiter et de contrôler les réactions de polymérisations électrochimiques au niveau d'une électrode, les monomères selon la présente invention permettent l'immobilisation et l'adressage de ligands biologiques sur de petites surfaces. Cette électrocopolymérisation adressée permet de réaliser une matrice de points miniaturisés et ordonnés, chacun des points portant un ligand biologique défini. Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention se rapporte donc également à une matrice d'électrodes. L'invention concerne donc également une matrice d'électrodes comprenant au moins une électrode selon l'invention. De telles matrices d'électrodes peuvent se présenter sous la forme de carte ou puce d'analyse comportant une série de puits, chaque puits correspondant à une électrode. Dans un mode de réalisation avantageux, les différentes électrodes de la matrice portent des ligands biologiques différents. Selon un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une pluralité d'électrodes ou de microélectrodes fixées sur un support solide, ces électrodes sont revêtues d'un copolymère selon l'invention et portent avantageusement des ligands biologiques différents. De telles matrices d'électrodes peuvent avantageusement être obtenues par électropolymérisation adressée de monomères selon l'invention, et en particulier par copolymérisation d'un monomère porteur d'un ligand biologique et d'un monomère non fonctionnalisé avec un ligand. Les électrodes et les matrices d'électrodes selon l'invention sont notamment utilisables pour la détection d'analytes susceptibles d'être présents dans un échantillon et susceptibles de réagir spécifiquement avec les ligands biologiques portés par le polymère. La présente invention permet de détecter un ligand cible dans tout type d'échantillon. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'échantillon est un échantillon biologique. Avantageusement, cet échantillon peut avoir été prélevé sur un patient à des fins de diagnostic. L'échantillon peut être, par exemple, l'urine, le sang, le sérum, le plasma, des extraits cellulaires ou un fluide corporel. La sonde étant électroactive, sa réponse électrochimique sera modifiée lorsqu'un ligand cible interagit de manière spécifique avec le ligand sonde porté par le polymère. Le polymère conducteur électroactif selon l'invention traduit donc l'interaction avec le ligand cible en un signal électrochimique. L'interaction spécifique d'un ligand cible avec le ligand sonde porté par le polymère engendre une modification de la réponse électrochimique du polymère étudié par rapport à celle obtenue avant introduction du ligand cible. Avantageusement, la détection du ligand cible s'effectue donc par une mesure électrique. On entend par mesure électrique , la mesure d'une variation de type potentiométrique comme la variation du potentiel d'oxydation du polymère ou la mesure d'une variation de type ampérométrique par variation du courant d'oxydation observé à un potentiel donné. Ces variations sont mesurées de manière rapide, sensible et quantitative selon des méthodes bien connues de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la mesure électrique consiste en la mesure d'une variation de potentiel ou d'une variation de courant. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, on utilise la voltamétrie cyclique. Il s'agit d'une méthode électroanalytique qui consiste à balayer une gamme de potentiel dans un sens puis dans l'autre, à vitesse constante. Le voltampérogramme obtenu donne la réponse en courant du système électrochimique étudié et permet sa caractérisation. Les méthodes de détection par une mesure électrique sont préférées avec les polymères selon l'invention. Cependant d'autres méthodes traditionnelles de détection connues de l'homme du métier peuvent également être utilisées. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la détection de l'interaction spécifique entre le ligand cible et le ligand sonde porté par le polymère peut se faire avec l'électrode qui a servi à l'électropolymérisation du polymère. Par exemple, l'hybridation d'un acide nucléique complémentaire à des oligonucléotides portés par le polymère peut être détectée par mesure électrique sur l'électrode qui supporte le polymère selon l'invention.

L'hybridation d'oligonucléotides peut être suivie directement en mesurant la variation du signal électrochimique détecté ou bien par l'intermédiaire d'une réaction enzymatique. Dans ce cas, l'oligonucléotide cible est par exemple porteur d'une biotine. Après introduction de streptavidine-peroxidase et du substrat de l'enzyme, la détection peut se faire soit au niveau du substrat, soit au niveau du signal électrochimique.

De la même façon, il est possible de suivre, grâce aux variations du signal électrochimique les interactions protéine/protéine du type anticorps/antigène et anticorps/protéine notamment. Il est également possible d'utiliser les polymères susceptibles d'être obtenus avec les monomères selon l'invention, pour le dosage des ions phosphates, dans le cadre du suivi d'une PCR par exemple ; pour étudier l'activité d'une enzyme ; dans des applications en électronique moléculaire comme décrit par exemple dans Science, 2004, 306, 2048-2074. Dans un mode particulier de l'invention, le polymère électroactif comporte des biomolécules sondes différentes. Les métallo-porphyrines sont alors complexées par différents métaux permettant la détection de plusieurs types de molécules cibles.

Les exemples de préparation de monomères et la caractérisation électrochimique des polymères obtenus qui vont suivre, sont donnés à titre illustratif.

A. Exemples de préparation de monomères : I) Synthèses de pyrroles substitués par des groupes acide et alcool Acide (1H-pyrrol-3-yl)acétique (1) HO 30 3,37 g (11,5 mmol) de [1-(toluène-4-sulfonyl)-1H-pyrrol-3-yl] acétate de méthyle sont dissous dans 35 mL de méthanol et 35 mL d'une solution de soude 5N. Le milieu réactionnel est chauffé à reflux pendant 4 heures, concentré à sec et repris par de l'eau. La phase aqueuse est lavée avec de l'éther diéthylique, puis acidifiée lentement dans un bain25 de glace avec une solution d'acide chlorhydrique 6N jusqu'à obtenir un pH de 3 environ. La phase aqueuse est extraite avec de l'éther diéthylique. La phase éthérée est lavée avec une solution saturée de NaCl, séchée sur Na2SO4 et concentrée à sec. On obtient 949 mg de composé (1) sous forme de cristaux blancs, avec un rendement de 66 %.

Remarque : Le composé (1) doit être conservé en solution dans l'éther diéthylique. Avant de l'utiliser, la solution doit être filtrée sur verre fritté et concentrée à sec. M (g.mor1) : 125,13 CCM : CH2C12/EtOH 95/5: d= 0,16 RMN'H:CDC13,8(ppm):8,17(1H);6,78(2H;s);6,21(1H;s);3,58(2H;s) 10 2-(1H-pyrrol-3-yl)éthanol (2) HO 15 Une solution de 5,0 g (17 mmol ; 1 éq.) de [1-(toluène-4-sulfonyl)-1H-pyrrol-3-yl]acétate de méthyle dans un minimum de THF anhydre est ajoutée goutte à goutte, sous argon, dans un mélange de 60 mL de THF (distillé sur sodium) et 12 mL (24 mmol ; 1,4 éq.) d'une solution de (BH3)S(CH3)2 2M dans du THF. Le milieu réactionnel est chauffé à reflux pendant 4 heures, puis versé doucement sur 100 mL d'une solution de soude 6N 20 placée dans un bain de glace. La phase aqueuse est extraite avec du dichlorométhane. La phase organique est ensuite lavée avec une solution saturée de NaCl, séchée sur Na2SO4 et concentrée à sec. Le mélange est purifié par chromatographie sur un gel de silice avec un mélange de AcOEt/éther de pétrole 4/6 (v/v). Le produit brut est dissous dans 60 mL de méthanol et 60 mL de soude 5N. Le 25 milieu réactionnel est chauffé à reflux pendant 3 heures, puis concentré à sec et repris par de l'acétate d'éthyle et de l'eau. Les deux phases sont séparées. La phase aqueuse est extraite avec de l'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée avec de l'eau et avec une solution saturée de NaCl, séchée sur Na2SO4 et concentrée à sec. Le produit obtenu est solubilisé dans l'eau et filtré sur célite. On obtient 720 mg de composé (2), avec un 30 rendement de 38 %. M (g.mol-l) : 111,14 RMN'H : CD3OD, 8 (ppm) : 6,61 (1H ; s) ; 6,54 (1H ; s) ; 5,96 (1H ; s) ; 3,65 (2H ; t ; 7,5 Hz) ; 2,66 (2H ; t ; 7,5 Hz)

II- Synthèse d'une porphyrine substituée par un pyrrole et trois pyridinium 5 II-1 4-[ 1-propoxy-3-(N-phtalimide)]benzaldéhyde (3) Sous argon, 3,66 g (30 mmol ; 1 éq.) de 4-hydroxybenzaldéhyde sont dissous dans 10 20 mL de DMF et 8,3 g (60 mmol ; 2 éq.) de K2CO3 sont ajoutés. Après 1 heure d'agitation à 70 C, le milieu rosit. Avec une ampoule d'addition, une solution de 9,65 g (36 mmol ; 1,2 éq.) de N-(3-bromopropyl)phtalimide dans 20 mL de DMF est ajoutée lentement. Le milieu réactionnel est agité 1 heure à 70 C, puis 2 heures à 90 C. Après refroidissement, le milieu est filtré sur verre fritté. Le filtrat est dilué avec du 15 dichlorométhane jusqu'à précipitation, puis filtré à nouveau sur verre fritté. Le nouveau filtrat est concentré à sec, puis repris par du dichlorométhane. La phase organique est lavée deux fois à l'eau puis avec une solution saturée de NaCl, séchée sur Na2SO4 et concentrée à sec. On obtient 10,03 g de composé (3) utilisé sans purification supplémentaire. 20 M (g.mol-') : 309,32 CCM : CH2C12/MeOH 95/5 : rf = 0,74 RMN'H : CDC13, 8 (ppm) : 9,80 (1H ; s) ; 7,77 (2H ; dd ; 5,5 Hz ; 3,1 Hz) ; 7,73 (2H ; d ; 8,8 Hz) ; 7,67 (2H ; dd ; 5,5 Hz ; 3,1 Hz) ; 6,83 (2H ; d ; 8,8 Hz) ; 4,07 (2H ; t ; 6,4 Hz) ; 3,87 (2H ; t ; 6,4 Hz) ; 2,17 (2H ; qi ; 6,4 Hz) 25 II-2 [5-[4-(3-(N-phtalimide)- 1 -propoxy)phényl]- 10,15 ,20-tri-pyridin-4-yl]porphyrine (4) Dans 225 mL d'acide propanoïque, 4,30 mL (45 mmol ; 3 éq.) de 4-pyridinecarboxaldéhyde et 4,64 g (15 mmol ; 1 éq.) de composé (3) sont dissous. Après ajout de pierre ponce, le milieu réactionnel est chauffé au reflux à l'aide d'un chauffe-ballon pendant 10 min. Avec une ampoule d'addition, une solution de 4,19 mL (60 mmol ; 4 éq.) de pyrrole (distillé) dans 20 mL d'acide propanoïque est ajoutée lentement. Le milieu vire au noir dès les premières gouttes. Le milieu réactionnel est chauffé à reflux pendant 1h30. Une demi- spatule de chloranil est additionnée, puis le milieu est maintenu à reflux pendant 30 min. L'acide propanoïque est évaporé totalement. Après une première filtration sur silice avec un mélange CH2C12/EtOH 9/1 (v/v), le mélange est purifié par chromatographie sur un gel de silice de 600 g avec un mélange de CH2C12 contenant des proportions croissantes de EtOH (de 1 % à 5 %). Le produit est précipité, après dissolution dans un minimum de CH2C12, par de l'hexane. On obtient847 mg de composé (4), avec un rendement de 6,9 %. M (g.mol"') : 820,92 CCM : CH2C12/EtOH 95/5: dù 0,17 (5ème porphyrine /6) RMN 'H : CDC13, b (ppm) : 9,04 (6H ; dd ; 4,4 Hz ; 1,5 Hz) ; 8,95 (2H ; d ; 4,9 Hz) ; 8,85 (4H ; s) ; 8,82 (2H ; d ; 4,9 Hz) ; 8,16 (6H ; d ; 4,4 Hz) ; 8,09 (2H ; d ; 8,3 Hz) ; 7,89 (2H ; dd ; 5,4 Hz ; 2,9 Hz) ; 7,72 (2H ; dd ; 5,4 Hz ; 2,9 Hz) ; 7,20 (2H ; d ; 8,3 Hz) ; 4,33 (2H ; t ; 6,4 Hz) ; 4,07 (2H ; t ; 6,4 Hz) ; 2,38 (2H ; qi ; 6,4 Hz) ; -2,89 (2H, s) MS : électrospray, ionisation positive : [M+H]+ = 821

II-3 [5-(4-(3-amino- 1 -propoxy)phényl- 10,15 ,20-tri-pyridin-4-yl]porphyrine (5)25 Dans 30 mL d'un mélange de CH2C12/EtOH 1/2 (v/v), 800 mg (0,97 mmol ; 1 éq.) de composé (4) et 0,5 mL (9,75 mmol ; 10 éq.) d'une solution d'hydrazine à 64 % dans l'eau sont dissous. Le milieu réactionnel est chauffé à reflux pendant 24 heures, puis agité à température ambiante (TA) pendant 24 heures. Une solution d'acide chlorhydrique à 10 % est additionnée. Le milieu est filtré sur verre fritté et le filtrat est neutralisé avec une solution de soude à 10 %, jusqu'à ce que la solution passe du vert au rouge. La phase aqueuse est extraite, en continu sur 24 heures, à l'aide d'une solution de CH2C12/EtOH 95/5 (v/v). Les phases organiques sont lavées avec une solution saturée de NaCl, séchées sur Na2SO4 et concentrées à sec. On obtient 462 mg du composé (5), avec un rendement de 69%.

M (g.mor') : 690,81 CCM : CH2C12/EtOH 9/1 : d= 0 RMN 1H : CDC13, 8 (ppm) : 9,05 (6H ; dd ; 4,4 Hz ; 1,9 Hz) ; 8,97 (2H ; d ; 4,9 Hz) ; 8,86 (4H ; s) ; 8,82 (2H ; d ; 4,9 Hz) ; 8,16 (6H ; d ; 4,4 Hz) ; 8,10 (2H ; d ; 8,8 Hz) ; 7,30 (2H ; d ; 8,8 Hz) ; 4,37 (2H ; t ; 6,4 Hz) ; 3,14 (2H ; t ; 6,4 Hz) ; 2,17 (2H ; qi ; 6,4 Hz) ; - 2,86 (2H ; s) MS : électrospray, ionisation positive : [M+H]+ = 691 ; [M+2H]2+/2 = 346

II-4 [5-(4-(3-(2-1 H-pyrrol-3-yl-acéthylamino)- 1 -propoxy)phényl)-10,15,20-tri-pyridin-4-yl]porphyrine (6) Sous argon, 48 mg (0,38 mmol ; 1,2 éq.) de composé (1), 78 mg (0,38 mmol ; 1,2 éq.) de dicyclohexyl-carbodiimide (DCC), séché à la pompe à palettes, et 44 mg (0,38 mmol ; 1,2 éq.) de N-hydroxysuccinimide (NHS) sont dissous dans 2 mL de CH2C12. Le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant 1 heure, pour obtenir Pester activé. Une solution de 221 mg (0,32 mmol ; 1 éq.) de composé (5) dans 2 mL de CH2Cl2, avec quelques gouttes de triéthylamine, est additionnée lentement. Le milieu est agité pendant 3 heures, puis filtré sur verre fritté et concentré à sec. Le mélange obtenu est purifié par chromatographie flash sur 50 g de silice et avec pour éluant un mélange CH2C12/EtOH 95/5 (v/v). On obtient 252 mg de composé (6). M (g.mol-') : 797,93 CCM : CH2C12/MeOH 85/15: rf = 0,64 RMN'H 400 MHz: CD3OD, 8 (ppm) : 8,99 (m) ; 8,91 (m) ; 8,29 (m) ; 8,10 (d ; 7,7 Hz) ; 15 7,98 (m) ; 7,38 (d ; 7,7 Hz) UV-VIS : DMF (200-775 nm), (nm) : 235 ; 421 (Soret) ; 516, 550, 591, 650 (bandes Q) Masse électrospray, ionisation positive : (M + 2NH4+)=830

II-5 Métallation du composé (6) 20 Pour M = Co Dans 1 mL de DMF, 50 mg (63 mol ; 1 éq.) de composé (6) et 80 mg (616 mol ; 10 éq.) de CoC12 (séché à la pompe à palettes) sont dissous. Le milieu réactionnel est chauffé à 80 C pendant 2 heures, puis concentré à sec. Le mélange est repris dans de l'éthanol et filtré sur verre fritté. Le solide est récupéré avec un mélange MeOH/CH2Cl2. On obtient 50 mg de composé (7) avec M= Co (nommé (7-Co)), soit 93 % de rendement. M (g.mol-1) : 854,84 UV-VIS : pyridine (200-775 nm), (nm) : 255 ; 341 ; 440 (Soret) ; 559 (bandes Q) 10 II-6 Méthylation du composé (7) Pour M = Co En atmosphère fermée, 43 mg (0,05 mmol ; 1 éq.) de composé (7-Co) sont dissous dans 5 mL de DMF et 0, 6 mL (10 mmol ; 200 éq.) d'iodure de méthyle sont additionnés. Le milieu réactionnel est agité à 40 C pendant 3 heures, puis concentré à sec et repris par de l'eau. Le mélange est passé sur colonne échangeuse d'ions : 2 g de Dowex-Cl, puis lyophilisé. On obtient 38 mg de composé (8) avec M=Co, soit 75 % de rendement. L'analyse par la masse montre la présence du produit méthylé sur toutes les amines présentes dans la molécule. M (g.mol-l) : 1034,36 MS : électrospray, ionisation positive : [M-3Cl]3+ = 927 MALDI : [M-3C1+3H] = 930 UV-VIS : eau (200-775 nm), 2 (nm) : 255 ; 341 ; 440 (Soret) ; 559 (bandes Q)

II-7 Méthylation du composé (6) 100 mg (0,125 mmol ; 1 éq.) de composé (6) sont dissous dans 5 mL de DMF et 1,6 mL (25 mmol ; 200 éq.) d'iodure de méthyle sont additionnés. Le milieu réactionnel est agité à TA pendant 18 heures, puis concentré à sec et repris par de l'eau. Le mélange 20 est passé sur colonne échangeuse d'ions : 10 g de Dowex-Cl, puis lyophilisé. On obtient 100 mg du composé (9), soit 84 % de rendement. L'analyse par la masse montre la méthylation uniquement sur les pyridiniums. M (g.mol-l) : 949,3915 RMN ~H : CD3OD à 318 K, 8 (ppm) : 9,99(6H) ; 9,73, 9,61(8H) ; 9,54 (6H); 8,63(2H) ; 7,89 (2H); 7,4 (1H); 7, 1 (1H); 6,6 (1H); 5,43(9H); 4,86 (2H) ; 4,09(2H); (3,1); 2,70(2H). UV-VIS : eau (200-800 nm), 2 (nm) : 242 ; 426 (Soret) ; 522 ...(bandes Q) Masse électrospray M/Z (M - 1C1/2)= 877 II-8 Métallation du composé (9) 10 Pour M = Mn Dans 20 mL d'eau, 50 mg (53 mol ; 1 éq.) de composé (9) et 85 mg (527 'mol ; 10 éq.) de MnC12.2H2O sont dissous. Le milieu réactionnel est chauffé à reflux pendant 5 heures, puis concentré à sec. Le mélange est dissous dans un minimum de méthanol, précipité avec de l'acétonitrile et filtré sur verre fritté. Le solide est récupéré avec un 15 mélange MeOH/H2O. M (g.mol-l) : 1002,31 UV-VIS : eau (200-800 nm), ~, (nm) : 250 ; 438 (Soret) ; 550 (bandes Q)

III- Synthèse de la porphyrine substituée par 3 groupements différents 20 III-1 4-(4-formylphénoxy)butyronitrile (11)5 oN Sous argon, 2,44 g (20 mmol ; 1 éq.) de 4-hydroxybenzaldéhyde sont dissous dans 20 mL de DMF et 5,53 g (40 mmol ; 2 éq.) de K2CO3 sont ajoutés. Après 1 heure d'agitation à 70 C, le milieu rosit. Avec une ampoule d'addition, une solution de 2,4 mL (24 mmol ; 1,2 éq.) de 4-bromobutyronitrile dans 6 mL de DMF est ajoutée lentement. Le milieu réactionnel est agité 1 heure à 70 C, puis 2 heures à 90 C. Après refroidissement, le milieu est filtré sur verre fritté. Le filtrat est dilué avec du dichlorométhane jusqu'à précipitation, puis filtré à nouveau sur verre fritté. Le nouveau filtrat est concentré à sec, puis repris par du dichlorométhane. La phase organique est lavée deux fois à l'eau puis avec une solution saturée de NaCl, séchée sur Na2SO4 et concentrée à sec. On obtient 4,15 g de composé (11) utilisé sans purification supplémentaire (rendement quantitatif). M (g.mol-1) : 189,22 CCM : CH2Cl2/MeOH 9/1 : d= 0,55 RMN 1H : CDC13, 8 (ppm) : 9,82 (1H) ; 7,77 (2H ; d ; 8,8 Hz) ; 6,94 (2H ; d ; 8,8 Hz) ; 4,11 (2H ; t ; 6,3 Hz) ; 2,56 (2H ; t ; 6,3 Hz) ; 2,12 (2H ; qi ; 6,3 Hz)

III-2 4-[4-(bis-(1H-pyrrol-2-yl)méthyl)phénoxy]butyronitrile (12) Sous argon, dans 14 mL (195,5 mmol ; 25 éq.) de pyrrole (distillé), 1,48 g (7,8 mmol ; 1 éq.) de composé (11) sont dissous. 60 L (0,8 mmol ; 0,1 éq.) de TFA sont additionnés. Le milieu réactionnel est agité à TA pendant 10 min. 10 mL (1 mmol) d'une 25 solution de soude 0,1N sont ajoutées. Après dilution de la solution avec de l'eau, la phase aqueuse est extraite à l'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée à l'eau et avec une20 solution saturée de NaCl, séchée sur Na2SO4 et concentrée à sec. Le mélange obtenu est purifié par chromatographie sur 100 g de silice et avec pour éluant un mélange CH2C12/MeOH 95/5 (v/v). On obtient environ 1 g de composé (12), soit environ 42 % de rendement.

M (g.mo1"') : 305,38 CCM : CH2C12/MeOH 99/1 : rf = 0,57 RMN 1H : CDC13, (ppm) : 8,00 (2H) ; 7,21 (2H ; d ; 8,8 Hz) ; 6,94 (2H ; d ; 8,8 Hz) ; 6,69 (2H ; m) ; 6,25 (2H ; m) ; 5,97 (2H ; m) ; 5,41 (1H ; s) ; 4,07 (2H ; t ; 6,3 Hz) ; 2,56 (2H ; t ; 6,3 Hz) ; 2,12 (2H ; qi ; 6,3 Hz) III-3 2-[3-[4-(bis-(1H-pyrrol-2-yl)méthyl)phénoxy]propyl]isoindole-1,3-dione NH H Sous argon, dans 35 mL (500 mmol ; 25 éq.) de pyrrole (distillé), 6,19 g (20 mmol ; 1 éq.) de composé (3) sont dissous. 150 L (2 mmol ; 0,1 éq.) de TFA sont additionnés. Le milieu réactionnel est agité à TA pendant 5 min. 2,4 g (60 mmol ; 3 éq.) de soude en poudre sont additionnés. Le milieu réactionnel est agité à TA pendant 30 min, filtré sur verre fritté, lavé avec de l'hexane et concentré à sec. Le mélange obtenu est purifié par chromatographie sur 400 g de silice et avec pour éluant un mélange

CH2C12/MeOH 995/5 (v/v). On obtient environ 1,52 g de composé (13), soit environ 18 % de rendement.

M (g.mor') : 425,49

CCM : CH2C12/MeOH 99/1: rf = 0,6

RMN 1H : CDC13, 8 (ppm) : 8,21 (2H) ; 7,85 (2H ; m) ; 7,75 (2H ; m) ; 7,11 (2H ; d ; 8,3 25 Hz) ; 6,76 (2H ; d ; 8,3 Hz) ; 6,70 (2H ; m) ; 6,20 (2H ; m) ; 5,94 (2H ; m) ; 5,40 (1H ; s) ; 4,02 (2H ; t ; 6,1 Hz) ; 3,92 (2H ; t ; 6,1 Hz) ; 2,21 (2H ; qi ; 6,1 Hz) III-4 [5 -[4-(3-(N-phtalimide)- 1 -propoxy)phényl]- 15- [4-(3-cyano- 1 -propoxy)phényl]-10,20-tri-pyridin-4-yl]porphyrine (14) (13) Dans 500 mL de CH2C12, 1,00 g (3,27 mmol ; 1 éq.) de composé (12), 1,39 g (3,27 mmol ; 1 éq.) de composé (13) et 0,6 mL (6,55 mmol ; 2 éq.) de 4-pyridinecarboxaldéhyde sont dissous. 2 mL (26,2 mmol ; 8 éq.) de TFA sont additionnés. Le milieu réactionnel est agité à TA pendant 30 min. 250 mL de THF, 3,6 mL (26,2 mmol ; 8 éq.) de triéthylamine, puis une solution de 2,22 g (9,82 mmol ; 3 éq.) de DDQ dans du THF sont additionnés. Le milieu réactionnel est agité à TA pendant 3 heures, puis concentré à sec. Après reprise avec du dichlorométhane, du TFA est additionné jusqu'à neutralisation. Après concentration à sec et une première filtration sur silice avec un mélange CH2C12/EtOH 97/3, le mélange est purifié par chromatographie sur une colonne de 350 g de silice avec un mélange de CH2C12 contenant des proportions croissantes de EtOH (de 0,3 % à 0,5 %). La fraction obtenue est analysée par RMN du proton et montre la présence du bon produit. M (g.mor') : 903,02 RMN 'H : CDC13, (ppm) : 8,85 (8H ; s) ; 8,12 (2H ; d ; 8,8 Hz) ; 8,06 (2H ; d ; 8,8 Hz) ; 7,91 (2H ; dd ; 2,9 Hz ; 5,4 Hz) ; 7,74 (2H ; dd ; 2,9 Hz ; 5,4 Hz) ; 7,26 (2H ; d ; 8,8 Hz) ; 7,18 (2H ; d ; 8,8 Hz) ; 4,39 (2H ; t ; 6,2 Hz) ; 4,33 (2H ; t ; 6,5Hz);4,08(2H;t; 6,5 Hz) ; 2,78 (2H ; t ; 6,2 Hz) ; 2,36 (4H ; m)

B. Caractérisations électrochimiques : On se référera aux Figures 1 à 7 annexées.

Figure 1 Voltamogram mes des méso-tétraméthyl-pyridiniumyl-porphyrines complexées avec différents métaux en milieux aqueux, en présence de 0,5M NaCl. Vitesse de balayage 100mV/s. Figure 2 Voltamogramme d'un film de polypyrrole fonctionnalisé par une porphyrine tri- cationique de zinc. Figure 3 Voltamogramme d'un film de polypyrrole fonctionnalisé par une porphyrine tri-cationique de zinc après 12h en solution tampon. Figure 4 Voltamogramme d'un film de polypyrrole fonctionnalisé par une porphyrine tri-cationique cobalt.

Figure 5 Voltamogramme d'un film de polypyrrole fonctionnalisé par une porphyrine tri-cationique cobalt après 12h en solution tampon. Figure 6 Voltamogramme d'un film de polypyrrole fonctionnalisé par une porphyrine tri-cationique de manganèse. Figure 7 Copolymérisation avec la porphyrine de cobalt à 0,7 V.

I- Porphyrines substituées sur les quatre positions méso par des groupements pyridinium et complexées par divers métaux. Cette analyse électrochimique est effectuée en milieu aqueux en présence de 0,5M NaCl et la Figure 1 montre les voltamogrammes obtenus. Il apparait que suivant la nature chimique du métal le potentiel redox varie fortement sur une large gamme de potentiels qui s'étend de -0,9 V/ECS à + 0,9 V/ECS. On peut ainsi moduler l'électroactivité de la porphyrine, en fonction du métal utilisé, dans un large domaine de potentiels qui correspond à environ 2V, étant donné que suivant le métal complexant choisi, les potentiels redox sont extrêmement différents.

II- Analyses électrochimiques de porphyrines tri-cationiques supportées. Les analyses électrochimiques sont d'abord réalisées sur des macro-électrodes de Platine, de 1 cm de diamètre. Différents essais de polymérisation à potentiel fixe de 0,9V sont réalisés avec les porphyrines de zinc, cobalt et manganèse de formule (10) : en solution aqueuse de 0, 5M de chlorure de sodium. Les films déposés sont analysés par voltamétrie cyclique dans une solution aqueuse 0,5M de chlorure de sodium. II-1 Porphyrine de zinc A une solution aqueuse 0,5M de chlorure de sodium de 3mM de monomèremétalloporphyrine de zinc de formule (10) est appliqué un potentiel de 0,9V pendant 30min. La charge déposée est de 20mC. Le film déposé est analysé par voltamétrie cyclique dans une solution aqueuse 0, 5M de chlorure de sodium (Figure 2). L'analyse du film montre un couple rédox réversible dont le potentiel d'oxydation est de +0,05V et le potentiel de réduction de -0,12V. Par la suite, le film est laissé tremper 12 heures en solution aqueuse pour tester sa stabilité, puis analysé par voltamétrie cyclique dans une solution aqueuse 0,5M de chlorure de sodium (Figure 3). L'analyse du film montre la présence du système rédox relatif au polypyrrole aux mêmes potentiels que précédemment, soit à un potentiel d'oxydation de +0,08V et un potentiel de réduction de -0,13V. Un deuxième couple rédox réversible est observé avec un potentiel d'oxydation est de +0,45V et un potentiel de réduction de +0,40V. II-2 Porphyrine de cobalt A une solution aqueuse 0,5M de chlorure de sodium de 12mM de monomère-métalloporphyrine de cobalt de formule (10) est appliqué un potentiel de 0,9V pendant 30min. La charge déposée est de 325mC. Le film déposé est analysé par voltamétrie cyclique dans une solution aqueuse 0, 5M de chlorure de sodium (Figure 4). L'analyse du film montre un couple rédox réversible dont le potentiel d'oxydation est de +0,05V et le potentiel de réduction de -0,12V, qui correspond au système du polypyrrole. Par la suite, le film est laissé tremper 12 heures en solution aqueuse pour tester sa stabilité, puis analysé par voltamétrie cyclique dans une solution aqueuse 0,5M de chlorure de sodium (Figure 5). L'analyse du film montre le couple rédox réversible du polypyrrole dont le potentiel d'oxydation est de +0,01V et le potentiel de réduction de 0,13V, avec une meilleure électroactivité après hydratation. L'analyse du film montre également le signal électrochimique de la porphyrine de cobalt dont le potentiel d'oxydation est de +0,42V et le potentiel de réduction de +0,35V. On peut également deviner les deux systèmes Co(I)/Co(II) et Co(II)/Co(III) sous la vague d'oxydation à +0,42V. II-3 Porphyrine de manganèse A une solution aqueuse 0,5M de chlorure de sodium de 4mM de monomère- métalloporphyrine de manganèse de formule (10)est appliqué un potentiel de 0,9V pendant 30min. La charge déposée est de 40mC. Le film déposé est analysé par voltamétrie cyclique dans une solution aqueuse 0, 5M de chlorure de sodium (Figure 6). L'analyse du film montre le signal électrochimique du polypyrrole dont le potentiel d'oxydation est de +0,07. L'analyse du film montre également le couple rédox réversible de la porphyrine de manganèse dont le potentiel d'oxydation est de -0,22V et le potentiel de réduction de -0,29V. II-4 Etude sur puces La porphyrine de cobalt de formule (10), en solution à 50mM, est copolymérisée à un potentiel fixe de 0,7V en présence de 3-(hydroxyéthyl)pyrrole, en solution à 50mM (Figure 7). Les tests de polymérisation et d'analyses sont effectués sur des puces à électrodes de carbone constituées de huit plots, avec une solution à 400mM de chlorure de sodium et à 100mM perchlorate de lithium. On observe plusieurs vagues de polymérisation. La courbe de polymérisation présentée Figure 7montre que le copolymère se dépose sur l'électrode.30

Claims

REVENDICATIONS

: 1 - Monomère électropolymérisable, destiné à être polymérisé en solution aqueuse, comportant un motif électropolymérisable et une métallo-porphyrine, caractérisé en ce que la métallo-porphyrine est substituée par au moins deux entités ionisées ou ionisables en solution aqueuse.
2 - Monomère selon la revendication 1, caractérisé en ce que la métalloporphyrine est substituée par trois entités ionisées ou ionisables en solution aqueuse.
3 - Monomère selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est soluble dans l'eau distillée, au moins jusqu'à une concentration de 10mM, de préférence au moins jusqu'à une concentration de 30mM.
4 - Monomère selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la métallo-porphyrine est substituée par au moins deux entités ionisées ou ionisables en solution aqueuse, situées en position méso de la métallo-porphyrine.
5 - Monomère selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les entités ionisées ou ionisables comprennent une fonction ionisée, ou ionisable dans une solution aqueuse qui présente un pH compris entre 3 et 8, choisie parmi les fonctions : ammonium, polyamine, acide carboxylique, acide phosphonique, acide sulfonique et phosphate.
6 - Monomère selon la revendication 5, caractérisé en ce que deux des entités ionisées ou ionisables substituant la métallo-porphyrine comprennent un groupement N-méthylpyridinium sous forme de sel ou une fonction -COOH.
7 - Monomère selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que deux des entités ionisées ou ionisables substituant la métallo-porphyrine sont identiques.
8 - Monomère selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que la métallo-porphyrine est substituée par au moins deux entités ionisées ou ionisables en solution aqueuse différentes.
9 - Monomère selon la revendication 8, caractérisé en ce que la métalloporphyrine, et en particulier l'une de ses positions méso, est substituée par un ligand biologique avantageusement choisi parmi les polynucléotides et, notamment, les oligonucléotides, les polypeptides, les protéines, les antigènes, les anticorps, les haptènes, les oligosaccharides et la biotine, les polynucléotides étant préférés.
10 - Monomère selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le motif électropolymérisable est choisi parmi l'acétylène, les pyrroles, les thiophènes, lesindoles, les anilines, les azines, les p-phénylènevinylènes, les p-phénylènes, les pyrènes, les furanes, les sélénophènes, les pyrridazines, les carbazoles, les acrylates, les méthacrylates et leurs dérivés. 1l - Monomère selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la liaison entre le motif électropolymérisable et la métallo-porphyrine se fait en position mélo de la métallo-porphyrine. 12 - Monomère selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le motif électropolymérisable est un pyrrole. 13 - Monomère selon la revendication 12, caractérisé en ce que la liaison entre le pyrrole et la métallo-porphyrine est assurée en position 3 du pyrrole. 14 - Monomère selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la métallo-porphyrine est également substituée par un ou plusieurs groupes donneurs ou attracteurs d'électrons. - Monomère selon la revendication 14, caractérisé en ce que le(s) groupe(s) 15 donneur(s) ou attracteur(s) d'électrons est (sont) choisi(s) parmi : les atomes d'halogène, les groupes cyano, nitro, (CI-C4)alkyle (Ci-C4)alcényle, (Ci-C4)alcynyle et (C1-C4)alcoxy. 16 - Monomère selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que le métal de la métallo-porphyrine est un métal de transition, ou Mg, Al, Sn ou Ge. 17 -Monomère selon la revendication 16, caractérisé en ce que le métal est choisi parmi : Co, Ni, Mg, Fe, Zn, Mn, Pd, Cu, Pt, V, Mo, Al, Sn et Ge, Co, Zn et Mn étant préférés. 18 - Monomère selon l'une des revendications 1 à 8 ou 10 à 17, caractérisé en ce qu'il ne comporte pas de ligand biologique. 19 - Monomère de formule (I) :(I) dans laquelle : - les groupes RI, R2 et R3 représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un groupe ionisé ou ionisable en solution aqueuse, ou un ligand biologique, étant entendu qu'au moins deux des groupes RI, R2 et R3, identiques ou différents, représentent un groupe ionisé ou ionisable, - AI, A2 et A3 représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un bras espaceur, notamment choisi parmi les enchaînements suivants : o -(CH2)ä1- avec nl qui représente un entier compris dans la gamme allant de o à 5, o -(CH2-CH2-O)ä2- avec n2 qui représente un entier compris dans la gamme allant de 1 à 5, Où(CH2)ns o 15 0avec n3 qui représente un entier compris dans la gamme allant de 1 à 5, o- les groupes Ra, Rh, Re, Rd, Re, R ou R1-, Rg et Rh représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un groupe donneur d'électrons ou un groupe attracteur d'électrons, - X représente un bras espaceur, notamment choisi parmi les enchaînements suivants : 0 -(CH2),n1- avec ml qui représente un entier compris dans la gamme allant de 1 à 6, Où(CH2)m2 NR'--(CH2)ms O o avec m2 et m3 qui représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un entier compris dans la gamme allant de 1 à 3 et R' qui représente un atome d'hydrogène ou un groupe (C1-C4)alkyle, o -(CH2-CH2-O)m4- avec m4 qui représente un entier compris dans la gamme allant de 1 à 3, o une chaîne polypeptide comportant de 1 à 3 acides aminés, o -(CH=CH),,,5- avec m5 qui représente un entier compris dans la gamme 15 allant de 1 à 3, - M est un métal de transition, ou Mg, Al, Sn ou Ge, et - R représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, éthyle ou méthoxy. 20 - Monomère de formule (I) selon la revendication 19 caractérisé en ce qu'au moins deux des groupes R1, R2 et R3 chacun indépendamment, comprennent ou 20 représentent, une fonction ionisée ou ionisable dans une solution aqueuse qui présente un pH compris entre 3 et 8, choisie parmi les fonctions : ammonium, amine, polyamine, acide carboxylique, acide phosphonique, acide sulfonique et phosphate. 21 -Monomère de formule (I) selon la revendication 19 ou 20, caractérisé en ce qu'un seul des groupes R1, R2 ou R3, de préférence R3, représente un ligand biologique 25 choisi parmi les polynucléotides et notamment les oligonucléotides, les polypeptides, les protéines, les antigènes, les anticorps, les haptènes et la biotine. 22 - Monomère de formule (I) selon l'une des revendications 19 à 21, caractérisé en ce qu'au moins un des groupements R1, R2 et R3 est un N-méthylpyridinium sous forme de sel ou -COOH. 30 23 - Monomère de formule (I) selon l'une des revendications 19 à 22, caractérisé en ce que -A1-R1 = -A2-R2.24 - Monomère de formule (I) selon la revendication 23, caractérisé en ce que A,-R1 = -A2-R2= N-méthylpyridinium sous forme de sel ou : COOH 25 - Monomère de formule (I) selon l'une des revendications 19, 20 ou 22 à 24, caractérisé en ce que -A1-R1 = -A2-R2 = -A3-R3. 26 - Monomère de formule (I) selon la revendication 25, caractérisé en ce que -A1-R1 = -A2-R2= -A3-R3 = N-méthylpyridinium sous forme de sel. 27 - Monomère de formule (I) selon la revendication 19 ou 20, caractérisé en ce qu'au moins deux des groupes R,, R2 et R3, chacun indépendamment, représentent une fonction amine ou acide carboxylique. 28 - Monomère susceptible d'être obtenu à partir d'un monomère selon la revendication 27, par couplage sur une fonction amine ou acide carboxylique présente sur la métalloporphyrine, d'un ligand biologique choisi parmi les polynucléotides et, notamment, les oligonucléotides, les polypeptides, les protéines, les antigènes, les anticorps, les haptènes et la biotine. 29 - Monomère de formule (I) selon l'une des revendications 19 à 28, caractérisé en ce que la liaison entre le pyrrole et la métallo-porphyrine est assurée en position 3 du pyrrole. 30 - Monomère de formule (I) selon l'une des revendications 19 à 29, caractérisé en ce que R représente un atome d'hydrogène. 31 - Monomère selon l'une des revendications 19 à 30, caractérisé en ce que Ra=Rb=Re=RdRe=Rf=Rg=Rh=H. 32 - Monomère de formule (I) selon l'une des revendications 19 à 30, caractérisé en ce qu'au moins un des groupes Ra, Rb, Re, Rd, Re, Rf, Rg et Rh représente un groupe donneur ou attracteur d'électrons choisi parmi : les atomes d'halogène, les groupes cyano, nitro, (C1-C4)alkyle, (C1-C4)alcényle, (C1-C4)alcynyle et (CIC4)alcoxy. 33 - Monomère de formule (I) selon l'une des revendications 19 à 32, caractérisé en ce que le métal de la métallo-porphyrine est choisi parmi Co, Ni, Mg, Fe, Zn, Mn, Pd, Cu, Pt, V, Mo, Al, Sn et Ge. 2892723. 48 34 -Monomère de formule (I) selon la revendication 33, caractérisé en ce que M est choisi parmi : Co, Zn et Mn. - Monomère de formule (I) selon l'une des revendications 19, 20 ou 22 à 27 ou 29 à 34, caractérisé en ce qu'il ne comporte pas de ligand biologique. 5 36 - Utilisation d'au moins un monomère selon l'une des revendications 1 à 35, pour la fabrication d'une sonde électrochimique par électropolymérisation. 37 - Utilisation selon la revendication 36, caractérisée en ce que l'électropolymérisation est réalisée avec un monomère selon l'une des revendications 2 à 19 ou 19 à 34 porteur d'un ligand biologique. 10 38 - Sonde électroactive sous la forme d'un homopolymère conducteur susceptible d'être obtenue par électropolymérisation d'un monomère porteur d'un ligand biologique selon l'une des revendications 1 à 17 ou 19 à 34. 39 - Sonde électroactive sous la forme d'un copolymère conducteur susceptible d'être obtenue par copolymérisation entre au moins deux monomères différents, l'un 15 au moins des monomères étant porteur d'un ligand biologique, caractérisé en ce que l'un au moins des monomères mis en oeuvre est tel que défini à l'une des revendications 1 à 35. - Sonde électroactive selon la revendication 39, caractérisée en ce que la copolymérisation met en oeuvre un monomère porteur d'un ligand biologique selon 20 l'une des revendications 1 à 17 ou 19 à 34 et un autre monomère selon la revendication 18 ou 35. 41 - Sonde électroactive selon l'une des revendications 38 à 40, caractérisée en ce que la copolymérisation met en oeuvre au moins deux monomères selon l'une des revendications 1 à 34 dans lesquels le métal est différent. 25 42 - Sonde électroactive selon l'une des revendications 38 à 41, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins deux ligands biologiques différents. . 43 - Sonde électroactive selon l'une des revendications 38 à 42, caractérisée en ce que tous les monomères mis en jeu ont un pyrrole comme motif électropolymérisable. 30 44 - Sonde électroactive selon la revendication 43, caractérisée en ce que la copolymérisation est réalisée entre un monomère porteur d'un ligand biologique selon l'une des revendications 1 à 17 ou 19 à 34 et un pyrrole non substitué ou un pyrrole-3-alcanol. 45 - Sonde électroactive selon la revendication 44, caractérisée en ce que la copolymérisation est réalisée entre un monomère selon l'une des revendications 18 ou 35, un pyrrole non substitué ou un pyrrole-3-alcanol et un pyrrole porteur en position 3 d'un ligand biologique. 46 - Procédé de détection d'au moins un ligand cible dans un échantillon biologique, dans lequel on met en contact l'échantillon avec une sonde électroactive selon l'une des revendications 38 à 45 porteuse d'au moins un ligand sonde, dans des conditions appropriées pour l'interaction ligand sonde/ligand cible et on met en évidence et, éventuellement, on quantifie, la différence de potentiel ou de courant émis par la sonde avant et après mise en contact avec l'échantillon. 47 - Electrode comprenant un support conducteur dont tout ou partie de la surface est revêtue d'une sonde selon l'une quelconque des revendications 38 à 45. 48 - Procédé de polymérisation, caractérisé en ce que la polymérisation est réalisée par électropolymérisation en phase aqueuse à partir d'au moins un monomère selon l'une des revendications 1 à 35. 49 - Procédé de polymérisation selon la revendication 48, caractérisé en ce que la polymérisation est une copolymérisation qui met en oeuvre au moins deux monomères selon l'une des revendications 1 à 35 dans lesquels le métal est différent. 50 - Polymère susceptible d'être obtenu selon le procédé de polymérisation défini à la revendication 48 ou 49.