WO2007051947A1 - Nouveaux monomeres electropolymerisables, solubles en solution aqueuse, comportant une metalloporphyrine - Google Patents

Nouveaux monomeres electropolymerisables, solubles en solution aqueuse, comportant une metalloporphyrine Download PDF

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WO2007051947A1
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monomer
metalloporphyrin
pyrrole
formula
ligand
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PCT/FR2006/051131
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Frédéric CANONNE
Hafsa Korri-Youssoufi
Jean-Pierre Mahy
Bernard Mandrand
Martine Perree-Fauvet
Original Assignee
Biomerieux
Centre National De La Recherche Scientifique
Universite Paris Sud
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G61/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carbon-to-carbon link in the main chain of the macromolecule
    • C08G61/12—Macromolecular compounds containing atoms other than carbon in the main chain of the macromolecule
    • C08G61/122—Macromolecular compounds containing atoms other than carbon in the main chain of the macromolecule derived from five- or six-membered heterocyclic compounds, other than imides
    • C08G61/123—Macromolecular compounds containing atoms other than carbon in the main chain of the macromolecule derived from five- or six-membered heterocyclic compounds, other than imides derived from five-membered heterocyclic compounds
    • C08G61/124—Macromolecular compounds containing atoms other than carbon in the main chain of the macromolecule derived from five- or six-membered heterocyclic compounds, other than imides derived from five-membered heterocyclic compounds with a five-membered ring containing one nitrogen atom in the ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/22—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/48—Systems using polarography, i.e. measuring changes in current under a slowly-varying voltage

Definitions

  • the present invention relates to the technical field of electropolymerization.
  • the subject of the invention is a novel electropolymerizable monomer, soluble in aqueous solution, comprising a metalloporphyrin.
  • the invention also relates to the process for the polymerization of such a monomer, to the electroactive probe that can be obtained by polymerization of such a monomer and to the method for the detection of a target ligand in a biological sample implementing a such electroactive probe.
  • the detection of biomolecules, such as proteins or nucleic acid sequences has been subject to rapid technological developments in recent years, particularly in the medical field.
  • DNA of the infectious agent or cells studied is first isolated and then amplified by a PCR type technique and finally, the presence or absence of DNA is detected and quantified.
  • the transducers generally used for detection are fluorescent detectors. This method is based on an optical reading, namely the measurement of light absorbed or emitted following a chemical or biochemical reaction. It is therefore an indirect method. Many compounds possess fluorescent properties, especially metallo-porphyrins which are widely used in this context.
  • US 6,623,973 discloses a method for detecting volatile organic compounds by modifying the fluorescence of the porphyrin film. Wandrekar et al.
  • electrochemical detection there are several modes of electrochemical detection such as coulometric and potentiometric detection or detection by impedance measurement.
  • Electrochemical sensors based on the use of electroactive intercalants, have been widely described in the literature (Millan et al., Anal Chem, 1993, 65, 2317, Bard et al., Chem., 1990, 62, 2658).
  • the probe-target duplex formed after hybridization is exposed to an intercalator solution.
  • the increase in the electrochemical response due to the intercalator association with the duplex surface serves as a hybridization signal.
  • Most of these biosensors use metal cation complexes such as Co (phen) 3 3+ , Co (bpy) 3 3+ or daunomycin.
  • the low specificity of these intercalants with respect to hybridization makes the selectivity of this method very limited.
  • electrochemical sensors use an electron-donating group such as ferrocene as an electrochemical probe.
  • WO 01/81446 discloses an electroactive polymer whose pyrrole unit carries a polynucleotide bound to ferrocene. Bedioui et al, in turn, describe a poly (pyrrole manganese porphyrin) film used in a catalytic system (Journal of Molecular Catalysis, 1989, 56, 267-275). In these structures, the monomers used are hydrophobic and the electropolymerization is generally carried out in organic solvent. However, manipulations in organic medium are not compatible with the use of biomolecules. The latter are not soluble in such media and / or, very often, are denatured and their properties are altered.
  • post-functionalization it consists in the covalent post-polymerization fixation of biomolecules, in aqueous medium, thanks to reactive functions located on the polymer layer.
  • This post-functionalization strategy does not, in turn, allow the addressing of biomolecules.
  • it has a lack of reproducibility pad plot, related to the variability of the coupling efficiency of the biomolecule on the polymer.
  • the present invention proposes a monomer intended to be polymerized in aqueous solution which comprises: an electropolymerizable unit chosen from acetylene, pyrroles, thiophenes, indoles, anilines, azines, p-phenylenevinylenes, p-phenylenes, pyrenes, furans, selenophenes, pyrridazines, carbazoles, acrylates, methacrylates and their derivatives, and a metalloporphyrin substituted with at least two ionized or ionizable entities in solution aqueous.
  • an electropolymerizable unit chosen from acetylene, pyrroles, thiophenes, indoles, anilines, azines, p-phenylenevinylenes, p-phenylenes, pyrenes, furans, selenophenes, pyrridazines, carbazoles, acrylates, methacrylates
  • the electropolymerizable monomer as defined above has any of the following characteristics or the following characteristics, when they do not exclude each other: the metalloporphyrin is substituted by three ionized or ionizable entities in aqueous solution, the monomer is soluble in distilled water, at least up to a concentration of
  • the metalloporphyrin is substituted by at least two ionized or ionizable entities in aqueous solution, located in the meso position of the metalloporphyrin, the ionized or ionizable entities comprise an ionized or ionizable function in an aqueous solution which has a pH of between 3 and 8, chosen from the following functions: ammonium, amine, polyamine, carboxylic acid, phosphonic acid, sulphonic acid and phosphate; two of the ionized or ionizable substituting metallo-po ⁇ hyrin moieties comprise a N-methylpyridinium salt moiety or a -COOH moiety, two of the metalloporphyrin-substituted ionizable or ionizable moieties are identical, the metalloporphyrin is substituted by at least two moieties ionized or io
  • the metalloporphyrin and in particular one of its meso positions, is substituted by a biological ligand, advantageously chosen from polynucleotides and in particular oligonucleotides, polypeptides, proteins, antigens, antibodies, haptens, oligosaccharides and biotin, the polynucleotides being preferred, the bond between the electropolymerizable unit and the metalloporphyrin is in the meso position of the metalloporphyrin, the bond between the electropolymerizable unit and the metalloporphyrin is via the intermediary of a spacer arm,
  • the electropolymerizable pattern is a pyrrole; preferably, the bond between the pyrrole and the metalloporphyrin is ensured in position 3 of the pyrrole, the metalloporphyrin is also substituted by one or more electron donor or attractor groups, preferably chosen from: the atoms halogen, cyano groups, nitro, (Cj-C 4) alkyl, (Ci-C 4) alkenyl, (C 1 -C 4) alkynyl and (C 1 - C 4) alkoxy.
  • the metal of the metalloporphyrin is a transition metal (defined in the Mendeleyev table in its July 2005 version), or Mg, Al, Sn or Ge, and is preferably chosen from: Co, Ni, Mg, Fe, Zn, Mn, Pd, Cu, Pt, V, Mo, Al, Sn and Ge, and preferentially among: Co, Zn and Mn; the monomer does not contain a biological ligand.
  • the monomers according to the invention because of the presence of at least two ionized or ionizable entities in aqueous solution, will be soluble in aqueous solution, thus allowing their polymerization in such aqueous media.
  • electropolymerizable monomer a monomer having an electropolymerizable unit, said monomer being capable of reacting by electrochemical polymerization with other monomers to form a polymer.
  • An electropolymerizable pattern has alternating single bonds and double bonds.
  • pyrrole, acetylene, thiophene, azine, p-phenylene, p-phenylene vinylene, pyrene and furan will be used as the electropolymerizable unit.
  • the ionized form in aqueous solution is obtained without carrying out a chemical reaction, hydrolysis or degradation type.
  • the ionized form is, for example, obtained by exchange of a proton or in the form of a pair of ions in solution from a salt.
  • Such ionized or ionizable entities include in particular an ammonium group, amine (-NHR “with R” which represents a hydrogen atom or a (C 1 -C 4 ) alkyl), polyamine, carboxylic acid (-COOH), phosphonic acid (-OP (OH) 2 ), sulfonic acid (-SO 3 H), phosphate (-O-P (O) 2 (OR ”) with R” which represents a hydrogen atom or a group (C 1 -C 4 ) alkyl).
  • An ionizable entity is in ionic form when it is placed in an aqueous solution which has a pH of between 3 and 8, preferably between 5 and 8.
  • the ionizable entity is in ionized form in the distilled water.
  • alkyl means a linear or branched hydrocarbon group having from 1 to 15 carbon atoms and preferably from 1 to 10 carbon atoms.
  • a (C 1 -C 4 ) alkyl group denotes an alkyl group comprising from 1 to 4 carbon atoms.
  • groups (Ci-C 4) alkyl are methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, t-butyl.
  • alkenyl is meant a hydrocarbon group, linear or branched, having from 1 to 15 carbon atoms and preferably from 1 to 10 carbon atoms and comprising one or more double bonds, preferably 1 or 2 double bonds. links.
  • alkynyl is meant a hydrocarbon group, linear or branched, having 1 to 15 carbon atoms and preferably 1 to 10 carbon atoms and comprising one or more triple bonds, preferably 1 or 2 triples links.
  • alkoxy is meant an -O-alkyl group, alkyl being as defined above.
  • ammonium group is meant a quaternary amine in the form of salts such as N-methylpyridinium.
  • the N-methylpyridinium group preferably corresponds to:
  • halogen atom is meant an atom of chlorine, bromine, fluorine or iodine. When it is indicated that an integer is in the range from 1 to 3, for example, it means that this integer can be 1, 2 or 3.
  • soluble monomer in aqueous solution is meant a soluble monomer in aqueous solution under the polymerization conditions, namely under the conditions of temperature, pH and ionic strength used during its implementation in an electrochemical polymerization reaction. .
  • the electropolymerization will generally be carried out in an aqueous solution whose pH is between 3 and 8 and at a temperature of the order of 20 to 30 ° C.
  • the solubility of a monomer according to the invention will be such that the introduction of said monomer in distilled water at a temperature of 25 ° C, at least up to a concentration of 1 mM, preferably at least up to at a concentration of 10 mM, and preferably at least up to a concentration of 30 mM, lead to a homogeneous solution and transparent to the naked eye, without precipitation.
  • Polymerization is understood to mean a reaction by chemical or electrochemical means of units of the same chemical nature permitting the assembly of a certain number of monomers to form a polymer (r ⁇ M ⁇ (M) 1 - with r greater than or equal to 2).
  • the term “polymerization” embraces copolymerization and homopolymerization. It is advantageously in the context of the invention of the condensation of pyrrole units to form a polypyrrole. By copolymerization is meant the simultaneous polymerization of different units.
  • electrochemical polymerization denote an electrochemical polymerization.
  • the electropolymerization / electrocopolymerization step is carried out using techniques well known to those skilled in the art. For example, it can be conducted by subjecting the monomers to electrical potential sweeps sufficient to cause the polymerization by oxidation or by forced-current (time-domain) or pressure-imposed polymerization (chronoamperometry). In a particular embodiment of the invention, the polymerization will be carried out by chronoamperometry deposition or controlled potential deposition. This method consists of imposing a potential jump from the equilibrium potential (zero current) to a fixed value at which the reaction to the electrode takes place and the current is measured as a function of time.
  • Polymerization conditions refer to the pH, temperature, and ionic strength of the aqueous solution used in the polymerization.
  • the electropolymerization is carried out by the Diaz mechanism (Sadki et al., Chem.Soc.Rev., 29: 283-293, 2000) which leads to the formation of polypyrrole.
  • This polymerization takes place at the 2 and 5 positions of the pyrrole monomers.
  • a pyrrole substituted at the 3 or 4 position of the pyrrole ring is therefore capable of polymerizing or copolymerizing with other pyrroles at the 2 and 5 positions.
  • the 3-substituted pyrrole units are preferred.
  • conductive polymer is meant a polymer whose electrons are highly delocalised, most often along a sequence of single and double bonds (conjugate bonds), which leads it to behave as a semiconductor or a conductor.
  • biological ligand is meant a compound which has at least one recognition site allowing it to react with a target molecule of biological interest.
  • a ligand / anti-ligand pair capable of interacting specifically to form a conjugate is also named, in the present invention, target probe / ligand ligand.
  • biological ligands of polynucleotides and in particular oligonucleotides, antigens, antibodies, polypeptides, proteins, haptens, oligosaccharides and biotin. It therefore appears that most of these biological ligands have an ionizable function in aqueous solution.
  • biotin may include a hinge or connecting arm bonded to the biological ligand in question and ensuring its binding with the metalloporphyrin.
  • linking arms may, in particular, include a sequence -NH-CO- or -CO-NH- resulting from the coupling of an amine or acid function, possibly under activated form, carried by the metalloporphyrin, with a reactive function carried by the biological ligand.
  • polynucleotide refers to a sequence of at least 2 nucleotides (deoxyribonucleotides or ribonucleotides), natural or modified, capable of hybridizing, under appropriate hybridization conditions, with an at least partially complementary oligonucleotide.
  • modified nucleotides is meant, for example, a nucleotide having a modified base and / or having a modification at the level of the internucleotide link and / or at the level of the backbone.
  • modified bases By way of example of modified bases, mention may be made of inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino-5-deoxyuridine, diamino-2,6-purine and bromo-5-deoxyuridine.
  • modified internucleotide linkage there may be mentioned phosphorothioate, H-phophonate and alkyl phosphonate linkages.
  • Alpha-oligonucleotides such as those described in FR-A62 607 507 and the PNAs which are the subject of the article by M. Eghom et al., J. Am. Chem.
  • polypeptide means especially any sequence of at least two amino acids.
  • amino acids we mean the primary amino acids that code for proteins, amino acids derived after enzymatic action such as trans-4-hydroxyproline and natural amino acids but not present in proteins such as norvaline, N-methyl-L leucine, Stalin (see Hunt S. in Chemistry and Biochemistry of the amino acids, Barett GC, ed., Chapman and Hall, London, 1985), the amino acids protected by chemical functions usable in synthesis on solid support or in phase liquid and unnatural amino acids.
  • protein includes holoproteins and heteroproteins such as nucleoproteins, lipoproteins, phosphoproteins, metalloproteins and both fibrous and globular glycoproteins in their characteristic conformational form.
  • hapten refers to non-immunogenic compounds, i.e. incapable by themselves to promote an immune reaction by antibody production, but capable of being recognized by antibodies obtained by immunizing animals in animals. known conditions, in particular by immunization with a conjugate hapten-protein.
  • These compounds generally have a molecular mass of less than 3000 Da, and most often less than 2000 Da and may be, for example, glycosylated peptides, metabolites, vitamins, hormones, prostaglandins, toxins, antibiotics or various medicaments, nucleosides and nucleotides.
  • antibodies includes polyclonal or monoclonal antibodies, antibodies obtained by genetic recombination, and antibody fragments such as Fab or F (ab ') 2 or Fc fragments, as well as any antibodies obtained by genetic modification or recombination.
  • antigen refers to a compound capable of being recognized by an antibody for which it has induced synthesis by an immune response.
  • the subject of the present invention is the monomers of formula (I) comprising a pyrrole unit and a metalloporphyrin:
  • Ai, A 2 and A 3 represent, each independently of one another, a spacer arm, in particular chosen from the following sequences: o ⁇ (CH 2 ) n i- with ni which represents an integer included in the range ranging from 0 to 5, o - (CH 2 -CH 2 -O) 112 - with n 2 which represents an integer in the range from 1 to 5,
  • n3 representing an integer in the range of 1 to 5
  • R a , Rb, Rc, Rd, Re, R or Rf, R g and Rh represent, each independently of one another, a hydrogen atom, an electron donor group or an attractor group; of electrons, X represents a spacer arm, chosen in particular from the following sequences: o - (CH 2 ) ml - with ml which represents an integer in the range from 1 to 6,
  • M is a transition metal, or Mg, Al, Sn or Ge, and
  • - R represents a hydrogen atom or a methyl, ethyl or methoxy group.
  • the monomers of formula (I) have one or more of the following characteristics, when they do not exclude each other: - at least two of R 1, R 2 and R 3 each independently comprise or represent an ionized function or ionizable in an aqueous solution having a pH between 5 and 8, chosen from the following functions: ammonium, amine, polyamine , a carboxylic acid, phosphonic acid, sulfonic acid and phosphate, - only one of the groups R 1, R 2 or R 3 , preferably R 3 , represents a biological ligand chosen from polynucleotides and in particular oligonucleotides, polypeptides, proteins, proteins, antigens, antibodies, haptens, oligosaccharides and biotin, at least one of R 1 , R 2 and R 3 is 7V-methylpyridinium in salt form or -COOH,
  • At least one of the groups R a , Rb, R 0 , Rd, Re, Rf, Rg and Rh represents a donor or electron withdrawing group chosen from: halogen atoms, cyano groups, nitro groups, C 4 ) alkyl, (C 1 -C 4 ) alkenyl, (C 1 -C 4 ) alkynyl and (C 1 -C 4 ) alkoxy
  • the metal of the metalloporphyrin is selected from Co, Ni, Mg, Fe, Zn, Mn , Pd, Cu, Pt, V, Mo, Al, Sn and Ge and, preferably, among: Co, Zn and Mn.
  • X represents a group: V // ° ⁇ (CH2) 3 ⁇ Î1 - ⁇ "CHr ⁇ o
  • the ionizable entities present on the metalloporphyrin make it possible to obtain a soluble monomer in aqueous solution, despite the hydrophobic character of the metalloporphyrin. These ionizable entities in no way alter the properties of the electropolymerizable monomer present, the polymerization can be carried out in the aqueous phase to form polymer layers which will preferably be conductive.
  • This range of potential can be broadened by also varying the electronic nature of the substituent (donor or attractor) on the porphyrin cycle.
  • porphyrins carrying -SO 3 H groups in the meso position may implement the method published by Fleisher, EB et al. (J. Am Chem Soc, 1971, 93, 3162-3167) which consists in treating a porphyrin substituted in the meso position by phenyls with concentrated sulfuric acid.
  • a gentle method has also been published by following by Bao-Hui Ye et al.
  • the first step consists of the synthesis of benzaldehyde substituted with a protected amino group in the form of a phthalimide group. This reaction is quantitative. It is, for example, carried out by alkylation of 3-hydroxy-benzaldehyde with 3-bromopropyl phthalamide in the presence of potassium carbonate according to the following Scheme 1:
  • FIGURE 1 A first figure.
  • porphyrin The synthesis of porphyrin can be carried out from benzaldehyde substituted with the previously synthesized phthalimide group, 4-pyridine-carboxaldehyde and pyrrole in propanoic acid according to the method of Adler et al. [R. G Little, JA Anton, Loach PA, JA Ibers, J. Heterocyclic. Chem., 1975, 343; Journal of Organic Chemistry, 1967 (32), p 476] as shown in FIGURE 2 below.
  • a mixture of six porphyrins is obtained. They are separated by chromatography on silica gel.
  • the peptide coupling between the porphyrin-amine and the acetic acid pyrrole can then be carried out.
  • Several synthetic routes have been made, and the preferred route, according to Scheme 4 below, is the coupling reaction in the presence of conventional coupling agents, N-hydroxysuccinimide in the presence of dicyclohexylcarbodiimide.
  • This coupling reaction was developed by using acidic pyrrole acid not protected on nitrogen (PATH A) or (PATH B) that protected on nitrogen by a toluene sulfonate group (Tos).
  • the last step of the synthesis route is the methylation of the pyridyl groups of the porphyrin to make it tri-cationic.
  • This reaction is quantitative and is carried out, for example, in the presence of a large excess of methyl iodide in DMF (dimethylformamide) according to the following Scheme 6: FIGURE 6
  • the desired porphyrin is substituted in the meso position by three different types of groups.
  • the Adler method for its synthesis is less well suited, since it would be necessary to separate twenty-one porphyrins.
  • the synthesis can be broken down into two stages: the synthesis of a dipyrromethane (BJ Littler, S. Lindsey,
  • the dipyrromethane synthesis can be carried out according to Scheme 7 below, by reaction of the corresponding aldehyde with the pyrrole used as a solvent and in the presence of TFA as Lewis acid.
  • the porphyrinic ring can then be constructed as described by Rao PD, Dhanalekshmi S., Littler BJ and Lindsey JS, Journal of Organic Chemistry, 2000, 65, p. 7323-7344, according to the following DIAGRAM 8 by reaction in the presence of trifluoroacetic acid (TFA) of two equivalents of dipyrromethane with one equivalent of each of the two necessary aldehydes.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the conjugation of the ring is, for example, obtained by oxidation with 2,6-dichloro-3,5-dicyanobenzoquinone (DDQ).
  • DDQ 2,6-dichloro-3,5-dicyanobenzoquinone
  • the mixture must be composed of three different porphyrins.
  • FIGURE 11 To obtain the porphyrin carrying two -COOH groups, the nitrile groups are then hydrolyzed in a basic medium and the porphyrin metallated with the desired metal according to FIGURE 11 below: FIGURE 11
  • the description which follows relates to the preparation of porphyrin functionalized on these four meso positions, one by a pyrrole group for the electrochemical polymerization, another by an activated ester group for the grafting of the probe oligonucleotide, and the two others by two pyridinium groups on the other two meso positions to ensure solubility in aqueous media.
  • a study by modeling molecular showed that it was preferable to substitute the two functional groups pyrrole and para-activated ester on the porphyrin to avoid steric genes during coupling reactions.
  • the preparation of such a porphyrin can be carried out, firstly by synthesizing the two halves of porphyrin (dipyrromethanes) carrying the functional groups A (dipyrromethane comprising a phenyl substituted para by an ester function) and B (dipyrromethane containing a phenyl para substituted by an arm bearing a function capable of reacting on a pyrrole), and thereafter by carrying out a cyclization reaction in the presence of the third group C (pyridine-carboxaldehyde).
  • This synthesis is carried out according to the method described by Lindsey et al. [DT Gryko, M. Tasior, Tetrahedron Letters, 2003, 44, 3317; J. Littler, S. Lindsey, J. Org. Chem., 1999, 64, 1391; JK Laha, S. Lindsey, Org. Process Res. Develop., 2003, 7, 799.]
  • the synthesis of the two dipyrromethanes can be carried out from the corresponding aldehyde with pyrrole as a solvent and trifluoroacetic acid (TFA) as the Lewis acid.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the porphyrinic cycle is constructed from both dipyrromethanes and pyridine carboxaldehyde in the presence of TFA. Conjugation of the ring can be achieved by oxidation with 2,6-dichloro-3,5-dicyanobenzoquinone (DDQ) (FIGURE 14). At the end of the synthesis, the reaction mixture is theoretically composed of three different porphyrins which can be separated by chromatography on silica gel.
  • amine function of pyrrole can be protected and deprotected.
  • the protecting groups of alcohols, amines and carboxylic acids are well known to those skilled in the art. May in particular refer to "Protective Groups in Organic Synthesis", 2 nd edition, Greene TW and Wuts PGM, ed John Wiley and Sons, 1991.
  • amino protecting group include, for example, trifluoroacetyl, tert-butoxycarbonyl and 9-fluorenylmethoxycarbonyl groups.
  • a mode of preparation of the di-cationic monomer (26) is shown in Scheme 15 below. Since the porphyrinic ring is substituted by three different types of groups, but is centered around a trans axis, the (2 + 2) method described above is used for its synthesis. As previously, the terminal amine of the alkoxy chain substituting porphyrin is protected in the form of a phthalimide, during the construction of the porphyrinic ring. The first step is the synthesis of dipyrromethane pyridyl (21). After construction of the porphyrinic cycle and deprotection of the amine (23), it is coupled with the pyrrole derivative (1). Finally, the metallation and permethylation reactions make it possible to obtain the desired di-cationic monomer (26). SCHEME 15
  • a monomer according to the invention carrying at least one ionized or reactive ionizable function, for example of the amine or -COOH type, it is possible to carry out a coupling on this function with a biological ligand, according to techniques well known to those skilled in the art.
  • the monomers obtained according to such a coupling form an integral part of the invention.
  • the biological ligands may also be introduced by any appropriate technique, forming intermediately metalloporphyrins, carrying other reactive functions, of the aldehyde, hydroxy ...
  • the use of the monomers according to the invention makes it possible to prepare polymers which can in particular be used for the addressing of biomolecules on a pad of an electrode. Such addressing can then be done in a single step.
  • the monomers according to the invention have the advantage of being able to be polymerized in aqueous solution.
  • the present invention also relates to an electropolymerization process carried out in aqueous solution, implementing at least one of the monomers according to the invention, and in particular at least one monomer carrying a biological ligand.
  • the electropolymerization may be carried out in a buffer solution or not, comprising, advantageously, a carrier electrolyte, for example NaCl, LiClO 4 .
  • the pH of the solution will advantageously be between 3 and 8.
  • This electropolymerization may be a homopolymerization.
  • a homopolymerization with a soluble monomer according to the invention carrying a biological ligand may also be used.
  • This homopolymerization can then be followed by coupling of said reactive function with a biological ligand.
  • the electropolymerization will be a copolymerization carried out between at least two different monomers of which at least one is in accordance with the invention.
  • at least one, and preferably only one, monomer carries a biological ligand.
  • the monomer (s) used other than those in accordance with the invention, will be soluble in aqueous solution.
  • the copolymerization uses at least two monomers according to one of claims 1 to 37 in which the metal is different.
  • the polymerization reaction is carried out so as to obtain a polymer carrying at least two different biological ligands.
  • a copolymerization may be carried out, for example, between a monomer according to the invention carrying a biological ligand and an unsubstituted pyrrole or a pyrrole-3-alkanol, or between a monomer according to the invention not carrying a biological ligand. , an unsubstituted pyrrole or a pyrrole-3-alkanol and a pyrrole bearing in position 3 a biological ligand.
  • pyrrole-3-alkanol mention may be made of 3- (hydroxyethyl) pyrrole.
  • the subject of the present invention is also the polymers that can be obtained by such polymerization reactions, optionally followed by coupling with a biological ligand.
  • another object of the invention is to provide electroactive probes corresponding to a polymer according to the invention carrying at least one biological ligand and electrodes at least partially covered with such a probe, which are simpler to produce. , and which allow a more direct measurement of the probe ligand / target ligand interaction.
  • electroactive probe a probe whose electrochemical response is modified when a target ligand interacts specifically with a probe ligand carried by the probe. Thus, a modification of the electrochemical signal is observed following the specific interaction with the analyte.
  • target ligand means any molecule capable of interacting specifically with a probe ligand attached to a monomeric unit of the polymer according to the invention obtained from at least one monomer according to the invention and therefore capable of being detected. with this polymer.
  • This target ligand may be a biomolecule, such as, for example, a nucleotide, a polynucleotide, a nucleic acid, an oligonucleotide, a polypeptide, a protein, an antibody, an antigen, a peptide, a lipid, a steroid, or another sugar.
  • the probe ligand carried by the polymer is specific for the target ligand to be detected.
  • the present invention therefore also relates to electroactive probes in the form of a conductive homopolymer, obtainable by electropolymerization of a soluble monomer according to the invention carrying a biological ligand.
  • the electroactive probes in the form of a conducting homopolymer that can be obtained by electropolymerization of a soluble monomer according to the invention carrying an amine, hydroxyl or carboxylic acid reactive function, optionally in protected form, followed by coupling of said reactive function with a biological ligand, form an integral part of the invention.
  • the present invention relates to electroactive probes in the form of a conductive copolymer capable of being obtained by copolymerization of at least two different monomers of which at least one is in accordance with the invention. At least one, and preferably only one, of the monomers carrying a biological ligand.
  • the electroactive probes in the form of a conductive copolymer that can be obtained by electropolymerization of at least one soluble monomer according to the invention carrying an amine reactive function, hydroxyl or carboxylic acid, optionally in protected form, followed by coupling of said reactive function with a biological ligand, form an integral part of the invention.
  • the present invention also relates to electrodes comprising a conductive support of which all or part of the surface is coated with an electroactive probe as defined above.
  • the subject of the present invention is also a method for detecting a target ligand in a biological sample, in which the sample is brought into contact with an electroactive probe as defined above, carrying a probe ligand, under conditions appropriate for the probe ligand / target ligand interaction and the potential or current difference emitted by the probe before and after contact with the sample is demonstrated and possibly quantified.
  • the polymers obtained from the monomers according to the invention can be used in particular in all applications in which biological ligands are addressed and immobilized on a solid support. More particularly, these polymers can be obtained in the form of self-supported films or in the form of an electrode film.
  • the electrode makes it possible to control, by measuring the current delivered during the reaction, the evolution of the polymerization reaction.
  • the electrode also makes it possible to measure the subsequent electrochemical responses of the polymer.
  • the present invention therefore also relates to an electrode comprising a conductive support coated on the surface with at least one electroactive conductive polymer functionalized with biological ligands according to the invention, that is to say an electroactive probe according to the invention.
  • the state of the art is known of conductive supports for electrodes, in particular substrates made of metal or of carbon derivatives.
  • the polymer is generally deposited on the conductive support.
  • the electrochemical polymerization is advantageously carried out at the surface of the electrode to obtain an electrode comprising a conductive support coated on the surface of a polymer according to the invention.
  • the electrode is obtained by depositing a layer of polymer on the surface of a support in gold or platinum.
  • the monomers according to the present invention allow the immobilization and addressing of biological ligands on small surfaces.
  • This electrocopolymerization addressed makes it possible to produce a matrix of miniaturized and ordered points, each of the points carrying a defined biological ligand.
  • the invention therefore also relates to an electrode matrix.
  • the invention therefore also relates to an electrode matrix comprising at least one electrode according to the invention.
  • Such electrode matrices may be in the form of a card or analysis chip comprising a series of wells, each well corresponding to an electrode.
  • the different electrodes of the matrix carry different biological ligands.
  • the invention relates to a plurality of electrodes or microelectrodes fixed on a solid support, these electrodes are coated with a copolymer according to the invention and advantageously carry different biological ligands.
  • Such electrode matrices may advantageously be obtained by electropolymerization of monomers according to the invention, and in particular by copolymerization of a monomer carrying a biological ligand and a non-functionalized monomer with a ligand.
  • the electrodes and the matrices of electrodes according to the invention are particularly useful for the detection of analytes likely to be present in a sample and likely to react specifically with the biological ligands carried by the polymer.
  • the present invention makes it possible to detect a target ligand in any type of sample.
  • the sample is a biological sample.
  • this sample may have been taken from a patient for diagnostic purposes.
  • the sample may be, for example, urine, blood, serum, plasma, cell extracts or body fluid.
  • the electroactive conductive polymer according to the invention therefore translates the interaction with the target ligand into an electrochemical signal.
  • the specific interaction of a target ligand with the probe ligand carried by the polymer causes a modification of the electrochemical response of the polymer studied relative to that obtained before introduction of the target ligand.
  • the detection of the target ligand is therefore performed by an electrical measurement.
  • electrical measurement is meant the measurement of a potentiometric type variation such as the variation of the oxidation potential of the polymer or the measurement of an amperometric type variation by variation of the oxidation current observed at a given potential. These variations are measured quickly, sensitively and quantitatively according to methods well known to those skilled in the art.
  • the electrical measurement consists of measuring a potential variation or a current variation.
  • cyclic voltammetry is used. It is an electroanalytical method that consists in sweeping a range of potential in one direction then in the other, at constant speed. The voltammogram obtained gives the current response of the electrochemical system studied and allows its characterization.
  • the methods of detection by an electrical measurement are preferred with the polymers according to the invention. However, other traditional detection methods known to those skilled in the art can also be used.
  • the detection of the specific interaction between the target ligand and the probe ligand carried by the polymer can be done with the electrode which was used for the electropolymerization of the polymer.
  • the hybridization of a nucleic acid complementary to oligonucleotides carried by the polymer can be detected by electrical measurement on the electrode which supports the polymer according to the invention.
  • Hybridization of oligonucleotides can be directly monitored by measuring the variation of the detected electrochemical signal or via an enzymatic reaction.
  • the target oligonucleotide is, for example, carrying a biotin.
  • the detection can be done either at the level of the substrate or at the level of the electrochemical signal.
  • the electroactive polymer comprises different probe biomolecules.
  • the metallo-porphyrins are then complexed by different metals allowing the detection of several types of target molecules.
  • the organic phase is then washed with saturated NaCl solution, dried over Na 2 SO 4 and concentrated to dryness.
  • the mixture is purified by chromatography on silica gel with a mixture of AcOEt / petroleum ether 4/6 (v / v).
  • the crude product is dissolved in 60 mL of methanol and 60 mL of 5N sodium hydroxide.
  • the reaction medium is refluxed for 3 hours, then concentrated to dryness and taken up in ethyl acetate and water.
  • the two phases are separated.
  • the aqueous phase is extracted with ethyl acetate.
  • the organic phase is washed with water and with saturated NaCl solution, dried over Na 2 SO 4 and concentrated to dryness.
  • the product obtained is solubilized in water and filtered on celite.
  • the medium is stirred for 3 hours, then filtered on sintered glass and concentrated to dryness.
  • the mixture obtained is purified by flash chromatography on 50 g of silica and eluting with a mixture CH 2 Cl 2 / EtOH 95/5 (v / v). 252 mg of compound (6) are obtained.
  • the amine function is obtained by deprotection with hydrazine in various changes with respect to the operating conditions used with previous porphyrins: a large excess of hydrazine is used (100 equivalents) and the reaction mixture is heated at 60 0 C for 24 hours.
  • Porphyrin (16) (917 mg, 1.02 mmol, 1 eq) is dissolved in 20 mL of CH 2 Cl 2 and 40 mL of MeOH. 5 mL of 64% NH 2 NH 2 (102 mmol, 100 eq) is added.
  • the reaction mixture is stirred at 60 0 C for 24 hours.
  • a solution of 10% HCl is added until the mixture becomes green.
  • the solution is then filtered. Water is added until neutralization, The solution becomes violet.
  • CH 2 Cl 2 and MeOH are evaporated.
  • the solution is extracted several times with CH 2 Cl 2 .
  • the organic phase is washed several times with water, dried and then concentrated to dryness.
  • FTIR Fourier Transform Infra Red Spectrometry
  • the purification is carried out on a neutral alumina gel, to prevent a possible polymerization of the compound (18), which would occur on silica gel, and to avoid the addition of triethylamine to the eluent (as above).
  • the porphyrin was characterized by NMR spectrometry, for purity, and by MALDI mass spectrometry, by the presence of an unmarked majority peak at 907.0 and peaks corresponding to [M] + and [M + H] ] + 875.1 (65%) and 876.1 (50%) respectively.
  • Porphyrin (18) reacts with the desired metal salt acetate in DMF to give the desired metal salt acetate in DMF to give the desired metal salt acetate in DMF to give the desired metal salt acetate in DMF to give the desired metal salt acetate in DMF to give the desired metal salt acetate in DMF to give the desired metal salt acetate in DMF to give the desired metal salt acetate in DMF to give the desired metal salt acetate in DMF.
  • the cobalt porphyrin has a majority peak corresponding to [M + H] + at 932.3 and that of manganese a majority peak corresponding to [M] + at 927.3.
  • UV-Vis DMF (350-750 nm). ⁇ (nm): 414 (Soret); 574; 622; 649
  • hydrolysis reactions of the nitrile groups to carboxylic acids are generally carried out in an acid medium, as for example in the work of S. Gobbi et al [Gobbi S., Rampa A., Bisi A., Belluti F., Valenti P. , Caputo A., Zampiron
  • the infrared spectrometric analysis shows a total disappearance of the band at
  • the compound (19) -Co (355 mg, 0.4 mmol, 1 eq) is dissolved in a solution of KOH (IN) in methanol (20 mL). The reaction mixture is heated at 50 ° C. for 24 hours and then concentrated to dryness. The product is dissolved in water and ethyl acetate is added. A solution of HCl (IN) is added until neutralization.
  • the pH is controlled, to avoid polymerizing the pyrrole.
  • the synthesis of 5- (4-pyridyl) dipyrromethane can be carried out by different methods.
  • the operating conditions used by J.-W. Ka and C-H. Lee [Ka J. -W. and Lee C-H., "Optimizing the synthesis of 5,10-disubstituted tripyrromethanes", Tetrahedron Letters, 2000, 41, p. 4609-4613] are stirring at room temperature for 5 minutes, with a pyrrole / aldehyde ratio of 5/1 and using 0.1 equivalent of TFA.
  • the low yield of 35% they obtained comes from the protonation of the nitrogen heterocycle, which decreases the amount of acid catalyst in the medium and gives many byproducts.
  • porphyrinic cycle was carried out according to the same operating conditions, previously described by DT Gryko and M. Tasior (5-pyridyldipyrromethane with 5 equivalents of TFA for 30 minutes at room temperature). ambient), using the two different aldehydes: compound (6) and 4-methoxybenzaldehyde according to Scheme 18.
  • porphyrin (22) is then isolated from the mixture of three porphyrins by chromatography on silica. Porphyrin has been characterized by NMR spectrometry. V-3 Deprotection of the amino function
  • porphyrin (23) was characterized by NMR and MALDI mass spectrometry, with the presence of a majority peak corresponding to [M + H] + at 720.3.
  • the metallation and permethylation reactions can be carried out without order of preference, but it is still preferable to first methylate if it is desired to use different metals. It was therefore chosen to operate the permethylation reaction, then to separate different batches for different metals and finally to metallize the water-soluble porphyrin.
  • the di-iodinated compound is passed over a column
  • the metallation of the porphyrin is carried out with a very large excess of the desired metal salt acetate in DMF at 40 ° C. (FIG. 22).
  • the separation of the remaining metal salts of the water-soluble metalloporphyrin is carried out by precipitation.
  • an excess of anions hexafluorophosphates is added, resulting in the precipitation of porphyrin.
  • passage through a Dowex-Cl column is used to recover a soluble metalloporphyrin with against anions chlorides.
  • iodides against anions are sufficient to make the insoluble porphyrin in aqueous solution.
  • FIG. 1 Voltamograms of meso-tetramethyl-pyridiniumyl-porphyrins complexed with various metals in aqueous media, in the presence of 0.5M NaCl. Scan speed lOOmV / s.
  • FIG. 2 Voltamogram of a polypyrrole film functionalized with a tri-cationic porphyrin of zinc.
  • FIG. 3 Voltamogram of a polypyrrole film functionalized with a tri-cationic porphyrin of zinc after 12 hours in buffer solution.
  • FIG. 4 Voltamogram of a polypyrrole film functionalized with a cobalt tri-cationic porphyrin.
  • FIG. 5 Voltamogram of a polypyrrole film functionalized with a cobalt triphosphine porphyrin after 12 hours in buffer solution.
  • Figure 6 Voltamogram of a polypyrrole film functionalized with a tri-cationic porphyrin of manganese.
  • FIG. 8 Polymerization of the Functionalized Pyrrole Monomer with the Zinc Diacid Porphyrin at 900mV / ECS
  • I- Porphyrins substituted on the four meso positions by pyridinium groups and complexed by various metals.
  • FIG. 1 shows the voltammograms obtained. It appears that, depending on the chemical nature of the metal, the redox potential varies greatly over a wide range of potentials ranging from -0.9 V / SCE to +0.9 V / SCE. It is thus possible to modulate the electroactivity of porphyrin, depending on the metal used, in a wide range of potentials which corresponds to about 2V, since according to the complexing metal chosen, the redox potentials are extremely different.
  • Electrochemical analyzes of supported tri-cationic porphyrins Electrochemical analyzes are first performed on macro-electrodes of
  • the film is allowed to soak for 12 hours in aqueous solution to test its stability, and then analyzed by cyclic voltammetry in a 0.5M aqueous solution of sodium chloride (FIG. 3).
  • the analysis of the film shows the presence of the polypyrrole-related redox system at the same potentials as before, ie at a potential oxidation of +0.08 V and a reduction potential of -0.13V.
  • a second reversible redox couple is observed with an oxidation potential of + 0.45V and a reduction potential of + 0.4OV.
  • the film is allowed to soak for 12 hours in aqueous solution to test its stability, and then analyzed by cyclic voltammetry in a 0.5M aqueous solution of sodium chloride (FIG. 5).
  • the analysis of the film shows the reversible redox couple of polypyrrole whose oxidation potential is + 0.01V and the reduction potential of -0.13V, with better electroactivity after hydration.
  • the analysis of the film also shows the electrochemical signal of the cobalt porphyrin whose oxidation potential is +0.42 V and the reduction potential of +0.35 V.
  • aqueous solution of pyrrole monomer functionalized with the porphyrin diacid zinc (2O) -Zn is obtained with a concentration of approximately 2 mM.
  • the monomer is electropolymerized by applying a fixed potential of 900 mV / ECS in an aqueous monomer solution, containing 500 mM NaCl and sodium hydroxide, using a 7 mm platinum electrode.
  • the polymerization curve is shown in Figure 8.
  • the final charge deposited on the surface of the platinum electrode is 6 mC.cm -2 .
  • the analysis of this surface (FIG. 9) is then carried out in an aqueous solution without monomer containing 0.5M NaCl (scanning speed).
  • the voltammogram presented in Figure 9 shows two waves at 644 mV / ECS and 257 mV / ECS corresponding to the oxidation-reduction of polypyrrole.

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Abstract

La présente invention a pour objet de nouveaux monomères électropolymérisables, destinés à être polymérisés en solution aqueuse, comportant : - un motif électropolymérisable choisi parmi l'acétylène, les pyrroles, les thiophènes, les indoles, les anilines, les azines, les p-phénylènevinylènes, les p-phénylènes, les pyrènes, les furanes, les sélénophènes, les pyrridazines, les carbazoles, les acrylates, les méthacrylates et leurs dérivés, et - une métallo-porphyrine substituée par au moins deux entités ionisées ou ionisables en solution aqueuse. L'invention est également relative au procédé de polymérisation de tels monomères, à la sonde électroactive susceptible d'être obtenue par polymérisation de tels monomères et au procédé de détection d'un ligand cible dans un échantillon biologique mettant en œuvre une telle sonde électroactive.

Description

NOUVEAUX MONOMERES ELECTROPOLYMERISABLES, SOLUBLES EN SOLUTION AQUEUSE. COMPORTANT UNE METALLOPORPHYRINE
La présente invention concerne le domaine technique de l'électropolymérisation. En particulier, l'invention a pour objet un nouveau monomère électropolymérisable, soluble en solution aqueuse, comportant une métalloporphyrine. L'invention est également relative au procédé de polymérisation d'un tel monomère, à la sonde électroactive susceptible d'être obtenue par polymérisation d'un tel monomère et au procédé de détection d'un ligand cible dans un échantillon biologique mettant en œuvre une telle sonde électroactive. La détection de biomolécules, telles que les protéines ou les séquences d'acides nucléiques font l'objet d'évolutions technologiques rapides ces dernières années notamment dans le domaine médical. En effet, il est par exemple possible de détecter de très faibles quantités d'ADN, grâce à la mise au point de méthode d'amplification de l'ADN présent, comme la PCR (polymerase chain reaction). L'ADN de l'agent infectieux ou des cellules étudiées est d'abord isolé, puis amplifié par une technique de type PCR et enfin, la présence ou non d'ADN est détectée et quantifiée.
L'élaboration de nouveaux dispositifs pour la détection de biomolécules, basés sur une lecture en temps réel de la détection avec une meilleure sensibilité, une meilleure spécificité et à des coûts moindres est en plein développement. Actuellement, les transducteurs généralement utilisés pour la détection sont des détecteurs fluorescents. Cette méthode est basée sur une lecture optique, à savoir la mesure de lumière absorbée ou émise suite à une réaction chimique ou biochimique. Il s'agit donc d'une méthode indirecte. De nombreux composés possèdent des propriétés de fluorescence, notamment les metallo-porphyrines qui sont largement utilisées dans ce contexte. Le document US 6 623 973 décrit une méthode de détection de composés organiques volatiles par modification de la fluorescence du film de porphyrines. Wandrekar et al. décrivent les interactions du composé meso-tri(N-méthyl-4- pyridinium)porphyrinyl-p-phénylene-5'-O-thymidine avec une molécule d'ADN (J.Hterocyclic Chem., 1996, 33, 1775-1783). Le document US 6 004 530 décrit un procédé de préparation d'un dérivé metallo-porphyrine couplé à des biomolécules permettant la détection par fluorescence de protéines ou oligonucléotides.
Les inconvénients majeurs de ces méthodes indirectes, sont leur faible sensibilité et spécificité. Des techniques de détection directe ont été développées, telles que la détection électrochimique. Cette dernière offre une détection rapide et spécifique des biomolécules. La sensibilité élevée des transducteurs électrochimiques, leur compatibilité avec la microfabrication et la technologie de miniaturisation, leur bas prix et leur entretien minimum, rendent ces dispositifs importants pour le diagnostic. De plus, l' électrochimie offre le seul chemin pour le contrôle électrique d'hybridation de l'ADN de divers processus de dénaturation, et d'une manière plus générale, pour sonder l'interaction spécifique de l'ADN avec diverses molécules afin de produire un signal électrique.
Il existe plusieurs modes de détection électrochimique tels que la détection coulométrique et potentiométrique ou la détection par mesure d'impédance.
Des capteurs électrochimiques, basés sur l'utilisation d'intercalants électroactifs, ont été largement décrits dans la littérature (Millan et ah, Anal. Chem., 1993, 65, 2317 ; Bard et al. Anal. Chem., 1990, 62, 2658). Le duplex sonde-cible formé après hybridation est exposé à une solution d'intercalant. L'augmentation de la réponse électrochimique due à l'association d'intercalant avec la surface du duplex sert de signal d'hybridation. La plupart de ces biocapteurs utilisent des complexes de cation métallique comme le Co(phen)3 3+, Co(bpy) 3 3+ ou encore la daunomycine. La faible spécificité de ces intercalants vis-à-vis de l'hybridation rende la sélectivité de cette méthode très limitée.
D'autres capteurs électrochimiques utilisent un groupe electrodonneur tel que le ferrocène comme sonde électrochimique. Le document WO 01/81446 décrit un polymère électroactif dont l'unité pyrrole porte un polynucléotide lié au ferrocène. Bedioui et al, quant à eux, décrivent un film de poly(pyrrole manganèse porphyrine) utilisé dans un système catalytique (Journal of Molecular Catalysis, 1989, 56, 267-275). Dans ces structures, les monomères mis en œuvre sont hydrophobes et rélectropolymérisation est généralement réalisée en solvant organique. Or, des manipulations en milieu organique ne sont pas compatibles avec l'utilisation de biomolécules. Ces dernières ne sont pas solubles dans de tels milieux et/ou, bien souvent, s'y dénaturent et leurs propriétés sont altérées.
Dans le cas des protéines, on constate le plus souvent une perte de la conformation active.
De ce constat, deux stratégies ont, jusqu'à présent, émergé : la première consiste à réaliser, sur une puce à électrodes, plusieurs couches de polymères conducteurs avec, en partant de l'électrode, une couche polypyrrole (déposée en solvant organique), une couche de copolymère pyrrole / pyrrole-groupe electrodonneur (déposée en solvant organique) et enfin une couche de copolymère pyrrole / pyrrole lié covalemment à une biomolécule (déposée en milieu aqueux). Cette stratégie nommée « multi-couches » est par exemple décrite dans FR 2849038. Des polymères pouvant être utilisés dans cette stratégie sont, par exemple, décrits dans WO 95/29199 et dans WO 01/81446. Cette stratégie « multi- couches » ne donne pas entière satisfaction, car elle est fastidieuse du fait de la mise en œuvre de plusieurs transitions solvant organique-milieu aqueux avec à chaque fois la nécessité de rincer la puce plusieurs fois.
L'autre stratégie est nommée post-fonctionnalisation : elle consiste en la fixation covalente post-polymérisation de biomolécules, en milieu aqueux, grâce à des fonctions réactives situées sur la couche de polymère. On pourra notamment se référer à Synthetic Metals 1999, 89-94 et à Biomacromolecules 2001, 2, 58-64. Cette stratégie de post- fonctionnalisation ne permet pas, quant à elle, l'adressage de biomolécules. De plus, elle présente un manque de reproductibilité plot à plot, lié à la variabilité de l'efficacité de couplage de la biomolécule sur le polymère.
On est ainsi toujours dans l'attente de l'élaboration de polymères possédant de meilleures propriétés électroactives compatibles avec une réaction d' électropolymérisation en solution aqueuse.
Pour remédier aux inconvénients de l'état de la technique, la présente invention propose un monomère destiné à être polymérisé en solution aqueuse qui comporte : un motif électropolymérisable choisi parmi l'acétylène, les pyrroles, les thiophènes, les indoles, les anilines, les azines, les p-phénylènevinylènes, les p-phénylènes, les pyrènes, les furanes, les sélénophènes, les pyrridazines, les carbazoles, les acrylates, les méthacrylates et leurs dérivés, et une métalloporphyrine substituée par au moins deux entités ionisées ou ionisables en solution aqueuse. De façon avantageuse, le monomère électropolymérisable tel que défini ci-dessus présente l'une quelconque des caractéristiques ci-dessous ou plusieurs caractéristiques ci- après, lorsqu'elles ne s'excluent pas l'une l'autre : la métalloporphyrine est substituée par trois entités ionisées ou ionisables en solution aqueuse, - le monomère est soluble dans l'eau distillée, au moins jusqu'à une concentration de
1OmM, de préférence au moins jusqu'à une concentration de 3OmM, - la métallo-porphyrine est substituée par au moins deux entités ionisées ou ionisables en solution aqueuse, situées en position méso de la métallo-porphyrine, - les entités ionisées ou ionisables comprennent une fonction ionisée, ou ionisable dans une solution aqueuse qui présente un pH compris entre 3 et 8, choisie parmi les fonctions : ammonium, aminé, polyamine, acide carboxylique, acide phosphonique, acide sulfonique et phosphate, - deux des entités ionisées ou ionisables substituant la métallo-poφhyrine comprennent un groupement iV-méthylpyridinium sous forme de sel ou une fonction -COOH, deux des entités ionisées ou ionisables substituant la métallo-porphyrine sont identiques, la métalloporphyrine est substituée par au moins deux entités ionisées ou ionisables en solution aqueuse, différentes,
- la métalloporphyrine, et en particulier l'une de ses positions méso, est substituée par un ligand biologique, avantageusement choisi parmi les polynucléotides et notamment les oligonucléotides, les polypeptides, les protéines, les antigènes, les anticorps, les haptènes, les oligosaccharides et la biotine, les polynucléotides étant préférés, - la liaison entre le motif électropolymérisable et la métallo-porphyrine se fait en position méso de la métallo-porphyrine, la liaison entre le motif électropolymérisable et la métallo-porphyrine se fait par l'intermédiaire d'un bras espaceur,
- le motif électropolymérisable est un pyrrole ; de préférence, la liaison entre le pyrrole et la métallo-porphyrine est assurée en position 3 du pyrrole, la métallo-porphyrine est également substituée par un ou plusieurs groupes donneurs ou attracteurs d'électrons, de préférence choisi(s) parmi : les atomes d'halogène, les groupes cyano, nitro, (Cj-C4)alkyle, (Ci-C4)alcényle, (C1-C4)alcynyle et (C1- C4)alcoxy. - le métal de la métallo-porphyrine est un métal de transition (défini dans le tableau de Mendeleïev dans sa version de juillet 2005), ou Mg, Al, Sn ou Ge, et est de préférence choisi parmi : Co, Ni, Mg, Fe, Zn, Mn, Pd, Cu, Pt, V, Mo, Al, Sn et Ge, et préférentiellement parmi : Co, Zn et Mn ; le monomère ne comporte pas de ligand biologique. Les monomères selon l'invention, de part la présence d'au moins deux entités ionisées ou ionisables en solution aqueuse, vont être solubles en solution aqueuse, autorisant ainsi leur polymérisation dans de tels milieux aqueux. Avant de décrire plus en détails l'invention, certains termes employés dans la description et les revendications sont définis ci-après.
Par « monomère électropolymérisable », on entend un monomère comportant un motif électropolymérisable, ledit monomère étant susceptible de réagir par polymérisation électrochimique avec d'autres monomères pour former un polymère. Un motif électropolymérisable présente une alternance de liaisons simples et de doubles liaisons. En particulier, dans le cadre de l'invention, on utilisera, en tant que motif électropolymérisable, le pyrrole, l'acétylène, le thiophène, l'azine, le p-phénylène, le p- phénylène vinylène, le pyrène, le furane, le sélénophène, la pyridazine, le carbazole, l'aniline, l'indole, l'acrylate, les méthacrylates et leurs dérivés.
Par « entité » ou « groupe » « ionisable en solution aqueuse », on entend un groupe chimique hydrophile susceptible de former un cation ou un anion en solution aqueuse. La forme ionisée en solution aqueuse est obtenue sans mise en oeuvre d'une réaction chimique, de type hydrolyse ou dégradation. La forme ionisée est, par exemple, obtenue par échange d'un proton ou sous la forme d'une paire d'ions en solution à partir d'un sel. De telles entités ionisées ou ionisables, comportent notamment un groupe ammonium, aminé (-NHR" avec R" qui représente un atome d'hydrogène ou un groupe (C1- C4)alkyle), polyamine, acide carboxylique (-COOH), acide phosphonique (-OP(OH)2), acide sulfonique (-SO3H), phosphate (-0-P(O)2(OR") avec R" qui représente un atome d'hydrogène ou un groupe (C1-C4)alkyle). Une entité ionisable se trouve sous forme ionique lorsqu'elle est mise dans une solution aqueuse qui présente un pH compris entre 3 et 8, de préférence entre 5 et 8. De façon avantageuse, l'entité ionisable se trouve sous forme ionisée dans l'eau distillée.
Dans le cadre de l'invention, on entend par « alkyle », un groupe hydrocarboné linéaire ou ramifié, ayant de 1 à 15 atomes de carbone et, de préférence, de 1 à 10 atomes de carbone. Un groupe (C1-C4)alkyle désigne un groupe alkyle comprenant de 1 à 4 atomes de carbone. Des exemples de groupes (Ci-C4)alkyle sont les groupes méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, t-butyle.
Par « alcényle », on entend un groupe hydrocarboné, linéaire ou ramifié, ayant de 1 à 15 atomes de carbone et, de préférence, de 1 à 10 atomes de carbone et comprenant une ou plusieurs doubles liaisons, de préférence, 1 ou 2 doubles liaisons. Par « alcynyle », on entend un groupe hydrocarboné, linéaire ou ramifié, ayant de 1 à 15 atomes de carbone et, de préférence, de 1 à 10 atomes de carbone et comprenant une ou plusieurs triples liaisons, de préférence, 1 ou 2 triples liaisons.
Par « alcoxy », on entend un groupe -O-alkyle, alkyle étant tel que défini ci-dessus. Par groupe ammonium, on entend, une aminé quaternaire sous forme de sels comme le N-méthylpyridinium. Le groupe iV-méthylpyridinium correspond, de préférence, à :
Figure imgf000007_0001
Par « atome d'halogène », on entend, un atome de chlore, brome, fluor ou iode. Lorsqu'il est indiqué qu'un entier est compris dans la gamme allant de 1 à 3, par exemple, cela signifie que cet entier peut être égal à 1 , 2 ou 3.
Par « monomère soluble en solution aqueuse», on entend un monomère soluble en solution aqueuse dans les conditions de polymérisation, à savoir dans les conditions de température, pH et force ionique utilisées lors de sa mise en œuvre dans une réaction de polymérisation par voie électrochimique. L'électropolymérisation sera en général, réalisée dans une solution aqueuse dont le pH est compris entre 3 et 8 et à une température de l'ordre de 20 à 30°C. De préférence, la solubilité d'un monomère selon l'invention sera telle que l'introduction dudit monomère dans l'eau distillée à une température de 25°C, au moins jusqu'à une concentration de ImM, de préférence au moins jusqu'à une concentration de 1OmM, et préférentiellement au moins jusqu'à une concentration de 3OmM, conduise à une solution homogène et transparente à l'œil nu, sans précipitation.
On entend par « polymérisation » une réaction par voie chimique ou électrochimique d'unités de même nature chimique permettant l'assemblage d'un certain nombre de monomères pour former un polymère (r x M → (M)1- avec r supérieur ou égal à 2). Le terme « polymérisation » englobe la copolymérisation et l'homopolymérisation. Il s'agit avantageusement dans le cadre de l'invention de la condensation de motifs pyrrole pour former un polypyrrole. On entend par copolymérisation la polymérisation simultanée d'unités différentes. Les termes « electropolymérisation », « électrocopolymérisation », « copolymérisation électrochimique » et polymérisation électrochimique » désignent une polymérisation par voie électrochimique. L'étape d' électropolymérisation / électrocopolymérisation est réalisée en utilisant des techniques bien connues de l'homme du métier. Par exemple, elle peut être conduite en soumettant les monomères à des balayages de potentiel électrique suffisants pour provoquer la polymérisation par une oxydation ou bien par polymérisation à courant imposé (chronopotentiométrie) ou à potentiel imposé(chronoampérométrie). Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la polymérisation sera effectuée par un dépôt par chronoampérométrie ou dépôt à potentiel contrôlé. Cette méthode consiste à imposer un saut de potentiel à partir du potentiel d'équilibre (courant nul) jusqu'à une valeur fixe à laquelle s'effectue la réaction à l'électrode et à mesurer le courant en fonction du temps.
Les « conditions de polymérisation » désignent le pH, la température et la force ionique de la solution aqueuse utilisée lors de la polymérisation. Dans le cas du pyrrole, l' électropolymérisation s'effectue par le mécanisme de Diaz (Sadki et al, Chem.Soc.Rev., 29 : 283-293, 2000) qui conduit à la formation du polypyrrole. Cette polymérisation s'effectue au niveau des positions 2 et 5 des monomères pyrrole. Un pyrrole substitué en position 3 ou 4 du noyau pyrrole est donc susceptible de polymériser ou de copolymériser avec d'autres pyrroles au niveau des positions 2 et 5. Les motifs pyrroles substitués en position 3 sont préférés.
On entend par « polymère conducteur », un polymère dont les électrons sont fortement délocalisés, le plus souvent le long d'un enchaînement de liaisons simples et doubles (liaisons conjuguées), ce qui le conduit à se comporter comme un semiconducteur ou un conducteur. Par ligand biologique, on entend un composé qui possède au moins un site de reconnaissance lui permettant de réagir avec une molécule cible d'intérêt biologique. Un couple ligand/anti-ligand susceptible d'interagir spécifiquement pour former un conjugué est également nommé, dans la présente invention, ligand sonde/ligand cible.
A titre d'exemple, on peut citer, comme ligands biologiques, les polynucléotides et notamment oligonucléotides, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines, les haptènes, les oligosaccharides et la biotine ... Il apparaît donc que la plupart de ces ligands biologiques comporte une fonction ionisable en solution aqueuse. Au sens de l'invention, le terme « ligands biologiques » et les termes « polynucléotides », « oligonucléotides », « antigènes, « anticorps », « polypeptides », « protéines », « haptènes », « oligosaccharides » et « biotine » peuvent inclure une charnière ou bras de liaison lié au ligand biologique en question et assurant sa liaison avec la métallo- porphyrine. Ces bras de liaisons pourront, notamment, inclure un enchaînement -NH-CO- ou -CO-NH- résultant du couplage d'une fonction aminé ou acide, éventuellement sous forme activée, portée par la métalloporphyrine, avec une fonction réactive portée par le ligand biologique.
Le terme « polynucléotide » désigne un enchaînement d'au moins 2 nucléotides (désoxyribonucléotides ou ribonucléotides), naturels ou modifiés, susceptibles de s'hybrider, dans des conditions appropriées d'hybridation, avec un oligonucléotide au moins partiellement complémentaire. Par nucléotides modifiés, on entend par exemple, un nucléotide comportant une base modifiée et/ou comportant une modification au niveau de la liaison internucléotidique et/ou au niveau du squelette. A titre d'exemple de bases modifiées, on peut citer l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5- désoxyuridine, la diamino-2,6-purine et la bromo-5-désoxyuridine. Pour illustrer une liaison internucléotidique modifiée, on peut mentionner les liaisons phosphorothioate, H- phophonate et alkyl-phosphonate. Les alpha-oligonucléotides tels que ceux décrits dans FR-A62 607 507 et les PNA qui font l'objet de l'article de M. Eghom et al., J. Am. Chem. Soc (1992) 114, 1895-1897, sont des exemples de polynucléotides constitués de nucléotides dont le squelette est modifié. Chacune de ces modifications peut être prise en combinaison. Le polynucléotide peut être un oligonucléotide, un acide nucléique naturel ou son fragment comme un ADN, un ARN ribosomique, un ARN messager, un ARN de transfert, un acide nucléique obtenu par une technique d'amplification enzymatique.
Le terme « polypeptide » signifie notamment tout enchaînement d'au moins deux acides aminés. Par acides aminés, on entend les acides aminés primaires qui codent pour les protéines, les acides aminés dérivés après action enzymatique comme la trans-4 hydroxyproline et les acides aminés naturels mais non présents dans les protéines comme la norvaline, la N-methyl-L leucine, la Staline (voir Hunt S. dans Chemistry and Biochemistry of the amino acids, Barett G.C., éd., Chapman and Hall, London, 1985), les acides aminés protégés par des fonctions chimiques utilisables en synthèse sur support solide ou en phase liquide et les acides aminés non naturels. Le terme "protéine" inclut les holoprotéines et les hétéroprotéines comme les nucléoprotéines, les lipoprotéines, les phosphoprotéines, les métalloprotéines et les glycoprotéines aussi bien fibreuses que globulaires sous leur forme conformationnelle caractéristique. Le terme « haptène » désigne des composés non immunogènes, c'est-à-dire incapables par eux mêmes de promouvoir une réaction immunitaire par production d'anticorps, mais capables d'être reconnues par des anticorps obtenus par immunisation d'animaux dans des conditions connues, en particulier par immunisation avec un conjugué haptène-protéine. Ces composés ont généralement une masse moléculaire inférieure à 3000 Da, et le plus souvent inférieure à 2000 Da et peuvent être par exemple des peptides glycosylés, des métabolites, des vitamines, des hormones, des prostaglandines, des toxines, des antibiotiques ou divers médicaments, les nucléosides et nucléotides.
Le terme « anticorps » inclut les anticorps polyclonaux ou monoclonaux, les anticorps obtenus par recombinaison génétique, et des fragments d'anticorps tels que des fragments Fab ou F(ab')2 ou Fc, ainsi que tout anticorps obtenu par modification ou recombinaison génétique. Le terme "antigène" désigne un composé susceptible d'être reconnu par un anticorps dont il a induit la synthèse par une réponse immune.
Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet les monomères de formule (I) comportant un motif pyrrole et une métalloporphyrine :
Figure imgf000010_0001
dans laquelle : - les groupes R1, R2 et R3 représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un groupe ionisé ou ionisable en solution aqueuse, ou un ligand biologique, étant entendu qu'au moins deux des groupes R1, R2 et R3, identiques ou différents, représentent un groupe ionisé ou ionisable,
- Ai, A2 et A3 représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un bras espaceur, notamment choisi parmi les enchaînements suivants : o ~(CH2)ni- avec ni qui représente un entier compris dans la gamme allant de 0 à 5, o -(CH2-CH2-O)112- avec n2 qui représente un entier compris dans la gamme allant de 1 à 5,
Figure imgf000011_0001
avec n3 qui représente un entier compris dans la gamme allant de 1 à 5,
Figure imgf000011_0002
- les groupes Ra, Rb, Rc, Rd, Re, R ou Rf, Rg et Rh représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un groupe donneur d'électrons ou un groupe attracteur d'électrons, - X représente un bras espaceur, notamment choisi parmi les enchaînements suivants : o -(CH2)ml- avec ml qui représente un entier compris dans la gamme allant de 1 à 6,
<λ />-O-(CH2)m-NR1-C-(CH2)mT- o avec m2 et m3 qui représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un entier compris dans la gamme allant de 1 à 3 et R' qui représente un atome d'hydrogène ou un groupe (Q-GOalkyle, o -(CH2-CH2-O)1114- avec m.4 qui représente un entier compris dans la gamme allant de 1 à 3, o une chaîne polypeptide comportant de 1 à 3 acides aminés, o -(CH=CH)m5- avec m5 qui représente un entier compris dans la gamme allant de 1 à 3,
- M est un métal de transition, ou Mg, Al, Sn ou Ge, et
- R représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, éthyle ou méthoxy.
De façon avantageuse, les monomères de formule (I) présentent une ou plusieurs des caractéristiques ci-dessous, lorsqu'elles ne s'excluent pas l'une l'autre : - au moins deux des groupes R1, R2 et R3 chacun indépendamment comprennent ou représentent, une fonction ionisée, ou ionisable dans une solution aqueuse qui présente un pH compris entre 5 et 8, choisie parmi les fonctions : ammonium, aminé, polyamine, acide carboxylique, acide phosphonique, acide sulfonique et phosphate, - un seul des groupes Ri, R2 ou R3, de préférence R3, représente un ligand biologique choisi parmi les polynucléotides et notamment les oligonucléotides, les polypeptides, les protéines, les antigènes, les anticorps, les haptènes, les oligosaccharides et la biotine, au moins un des groupements R1, R2 et R3 est un 7V-méthylpyridinium sous forme de sel ou -COOH,
- -Ai-Ri = -A2-R2 et de préférence -Ai-Ri = -A2-R2= JV-méthylpyridinium sous forme de sel ou :
Figure imgf000012_0001
-A3-R3 représente un groupe :
Figure imgf000012_0002
- -Ai-Ri = -A2-R2 = -A3-R3 et, de préférence, -Ai-Rj = -A2-R2= -A3-R3 = JV- méthylpyridinium sous forme de sel, la liaison entre le pyrrole et la métallo-porphyrine est assurée en position 3 du pyrrole,
- R représente un atome d'hydrogène, - Ra = Rb = Rc = Rd = Re = Rf = Rg = Rh = H,
- au moins un des groupes Ra, Rb, R0, Rd, Re, Rf, Rg et Rh représente un groupe donneur ou attracteur d'électrons choisi parmi : les atomes d'halogène, les groupes cyano, nitro, (Ci-C4)alkyle, (Ci-C4)alcényle, (Ci-C4)alcynyle et (Ci-C4)alcoxy, le métal de la métallo-porphyrine est choisi parmi Co, Ni, Mg, Fe, Zn, Mn, Pd, Cu, Pt, V, Mo, Al, Sn et Ge et, de préférence, parmi : Co, Zn et Mn.
- le monomère ne comporte pas de ligand biologique, X représente un groupe : V // °~(CH2)3~Î1 — π"CHr~ o
Les entités ionisables présentes sur la métalloporphyrine permettent d'obtenir un monomère soluble en solution aqueuse, malgré le caractère hydrophobe de la métalloporphyrine. Ces entités ionisables n'altèrent en rien les propriétés du monomère électropolymérisable présent, la polymérisation pouvant être effectuée en phase aqueuse pour former des couches polymères qui seront, de préférence, conductrices.
De plus, en choisissant la nature du métal complexant, il est possible d'obtenir une très large gamme de potentiels de détection suivant le métal choisi en fonction du domaine d' électro-activité désiré. Les polymères ainsi obtenus présentent une forte électroactivité et une large gamme de potentiel de détection. Cette latitude pour le choix de la nature chimique du métal complexant après la synthèse du monomère, et donc du domaine d'activité électrochimique, permettra par la suite d'utiliser ces systèmes de détection en multiplexages.
Cette gamme de potentiel peut être élargie en faisant varier également la nature électronique du substituant (donneur ou attracteur) sur le cycle de la porphyrine. Ainsi, il est possible de substituer les groupements phényle ou pyrrole de la porphyrine selon l'invention par un ou plusieurs groupements donneurs ou attracteurs qui permettent de modifier le potentiel redox, avantageusement choisi parmi l'halogène, les groupes cyano, nitro, (Ci-C4)alkyle et (Ci-Q)alcoxy, (Ci-C4)alcènyle, (Ci-C4)alcynyle. A titre d'exemples, sont détaillées ci-après les synthèses d'une porphyrine tri- cationique fonctionnalisée avec un pyrrole, d'une porphyrine di-anionique fonctionnalisée avec un pyrrole et d'une porphyrine fonctionnalisée sur les quatre positions méso, l'une par un groupe pyrrole pour la polymérisation électrochimique, une autre par un groupe ester activé pour le greffage d'un oligonucléotide sonde, et sur les deux autres positions par deux groupements pyridinium pour assurer une solubilité en milieux aqueux. L'homme du métier sera à même d'adapter ces synthèse pour la préparation des autres composés selon l'invention.
La synthèse des porphyrines portant des groupes -SO3H en position meso pourra mettre en œuvre la méthode publiée par Fleisher, E.B et al. (J. Am. Chem. Soc, 1971, 93, 3162-3167) qui consiste à traiter une porphyrine substituée en position méso par des phényles par l'acide sulfurique concentré. Une méthode douce a également été publiée par la suite par Bao-Hui Ye et al. (Tetrahedron 2003, 59, 3593-3601) qui consiste à synthétiser une porphyrine portant des groupes triméthylsilylphényl porphyrines, à mener une sulfonation en présence de ClSO3 SiMe3 par reflux dans CCl4 pendant 4 h, puis à hydrolyser en présence de NaOH. La synthèse des porphyrines substituées par des groupes -OP(OH)2 pourra être réalisée selon la méthode décrite par A.M. Massari et al. (Polyhedron, 2003, 22, 3065- 3072) qui consiste à synthétiser le 4 formyl phényl phosphonate et le condenser sur le dipyrométhane désiré comme décrit précédemment et puis hydrolyser en présence de pyridine. La synthèse de porpphyrines substituées par des groupes attracteurs est, par exemple, décrite dans le cas du bore, par R. Kachadourian et al. (J. Inorganic. Biochemistry, 2003, 95, 240-248), qui utilise la réaction du dibrome liquide dans du chloroforme sur la porphyrine désirée.
L'homme de métier sera à même d'adapter ces méthodes pour aboutir aux porphyrines souhaitées.
1) Synthèse d'une porphyrine tri-cationique fonctionnalisée avec un pyrrole La première étape consiste en la synthèse de benzaldéhyde substitué par un groupement aminé protégé sous forme d'un groupement phtalimide. Cette réaction est quantitative. Elle est, par exemple, effectuée par alkylation du 3-hydroxy-benzaldéhyde avec le 3-bromopropyl-phtalamide en présence de carbonate de potassium selon le SCHÉMA 1 suivant :
SCHÉMA 1
Figure imgf000014_0001
La synthèse de la porphyrine peut être réalisée à partir du benzaldéhyde substitué par le groupement phtalimide synthétisé précédemment, du 4-pyridine-carboxaldéhyde et du pyrrole dans l'acide propanoïque suivant la méthode d'Adler et al. [ R. G Little, J. A. Anton, P. A. Loach, J. A. Ibers, J. Heterocyclic. Chem., 1975, 343 ; Journal of Organic Chemistry, 1967 (32), p 476] comme illustré sur le SCHÉMA 2 ci-dessous.
SCHEMA 2
Figure imgf000015_0001
Un mélange de six porphyrines est obtenu. Elles sont séparées par chromatographie sur gel de silice.
La fonction aminé peut alors être obtenue par déprotection avec de l'hydrazine dans un mélange dichlorométhane /éthanol, selon le SCHÉMA 3 suivant : SCHÉMA 3
Figure imgf000016_0001
(4) (5)
Le couplage peptidique entre la porphyrine-amine et le pyrrole acétique acide peut alors être effectué. Plusieurs voies de synthèse ont été réalisées, et la voie préférée, selon le SCHÉMA 4 ci-dessous, consiste en la réaction de couplage en présence d'agents de couplage classiques, le N-hydroxysuccinimide en présence de dicyclohexyl-carbodiimide. Cette réaction de couplage a été mise au point en utilisant le pyrrole acétique acide non protégé sur l'azote (VOIE A) ou (VOIE B) celui protégé sur l'azote par un groupement toluène sulfonate (Tos).
SCHEMA 4
Figure imgf000016_0002
Figure imgf000017_0001
La métallation de la porphyrine est aisée et quantitative. Elle est réalisée généralement en présence du chlorure du métal sélectionné au deuxième degré d'oxydation dans le diméthylformamide selon le SCHÉMA 5 suivant :
SCHEMA 5
Figure imgf000017_0002
La dernière étape de la voie de synthèse est la méthylation des groupements pyridyle de la porphyrine pour la rendre tri-cationique. Cette réaction est quantitative et s'effectue, par exemple, en présence d'un large excès d'iodure de méthyle dans le DMF (diméthylformamide) selon le SCHÉMA 6 suivant : SCHÉMA 6
Figure imgf000018_0001
Le passage sur une colonne de Dowex-Cl avec l'eau comme éluant permet d'échanger les contre-anions et d'effectuer une purification finale.
2) Synthèse d'une porphyrine di-anionique fonctionnalisée avec un pyrrole
Figure imgf000018_0002
La porphyrine souhaitée est substituée en position méso par trois types de groupements différents. Dans ce cas, la méthode d'Adler pour sa synthèse est moins bien adaptée, étant donné qu'il serait nécessaire de séparer vingt-et-une porphyrines. Dans le cas où deux substituants différents sont positionnés en trans, la synthèse peut se décomposer en deux étapes : la synthèse d'un dipyrrométhane (B. J. Littler, S. Lindsey,
Journal of Organic Chemistry, 1999 (64), p 1391 ; J. K. Laha, S. Lindsey, Organic
Process Research Développement, 2003 (7), p 799), puis la construction du cycle porphyrinique (D. T. Gryko, M. Tasior, Tetrahedron Letters, 2003 (44), p 3317). On pourra également suivre le protocole décrit par Rao P. D., Dhanalekshmi S., Littler B. J. and Lindsey J. S., Journal of Organic Chemistry, 2000, 65, p. 7323-7344.
La synthèse du dipyrrométhane peut être réalisée selon le SCHÉMA 7 ci-dessous, par réaction de l'aldéhyde correspondant avec le pyrrole utilisé comme solvant et en présence de TFA comme acide de Lewis.
SCHÉMA 7
Figure imgf000019_0001
Le cycle porphyrinique peut alors être construit comme décrit par Rao P. D., Dhanalekshmi S., Littler B. J. and Lindsey J. S., Journal of Organic Chemistry, 2000, 65, p. 7323-7344, selon le SCHÉMA 8 suivant par réaction en présence d'acide trifluoro- acétique (TFA) de deux équivalents de dipyrrométhane avec un équivalent de chacun des deux aldéhydes nécessaires. La conjugaison du cycle est, par exemple, obtenue par oxydation avec le 2,6-dichloro-3,5-dicyanobenzoquinone (DDQ). En théorie, en fin de synthèse, le mélange doit être composé de trois porphyrines différentes. SCHEMA 8
Figure imgf000020_0001
Les trois porphyrines synthétisées peuvent alors être séparées par chromatographie sur colonne de silice, notamment.
Ensuite, la fonction aminé peut être obtenue par déprotection avec de l'hydrazine selon le SCHÉMA 9 ci-dessous : SCHEMA 9
Figure imgf000021_0001
Le couplage peptidique de la porphyrine-amine avec le pyrrole-acide est réalisé en présence de DCC (1,3-dicyclohexylcarbodiimide) et de NHS (iV-hydroxysuccinimide) selon le SCHÉMA 10 ci-dessous :
SCHÉMA 10
Figure imgf000021_0002
Pour obtenir la porphyrine porteuse de deux groupements -COOH, les groupements nitrile sont alors hydrolyses en milieu basique et la porphyrine métallée avec le métal désiré selon le SCHÉMA 11 ci-dessous : SCHÉMA 11
Figure imgf000022_0001
3) Synthèse d'une porphyrine fonctionnalisée par un groupe pyrrole et par un groupe ester activé.
Figure imgf000022_0002
La description qui suit est relative à la préparation d'ne porphyrine fonctionnalisée sur ces quatre positions méso, l'une par un groupe pyrrole pour la polymérisation électrochimique, une autre par un groupe ester activé pour le greffage de l'oligonucléotide sonde, et les deux autres par deux groupements pyridinium sur les deux autres positions méso pour assurer une solubilité en milieux aqueux. Une étude par modélisation moléculaire a montré qu'il était préférable de substituer les deux groupements fonctionnels pyrrole et ester activé en position para sur la porphyrine pour éviter les gènes stériques lors des réactions de couplage. La préparation d'une telle porphyrine peut être réalisée, tout d'abord en synthétisant les deux moitiés de porphyrine (dipyrrométhanes) portant les groupements fonctionnels A (dipyrrométhane comportant un phényle substitué en para par une fonction ester) et B (dipyrrométhane comportant un phényle substitué en para par un bras portant une fonction capable de réagir sur un pyrrole), et par la suite en effectuant une réaction de cyclisation en présence du troisième groupement C (pyridine- carboxaldéhyde). Cette synthèse est effectuée suivant la méthode décrite par Lindsey et al. [D. T. Gryko, M. Tasior, Tetrahedron Letters, 2003, 44, 3317; J. Littler, S. Lindsey, J. Org. Chem., 1999, 64, 1391; J. K. Laha, S. Lindsey, Org. Process Res. Develop., 2003, 7, 799.]
La synthèse des deux dipyrrométhanes peut être réalisée à partir de l'aldéhyde correspondant avec le pyrrole comme solvant et de l'acide trifluoro-acétique (TFA) comme acide de Lewis. Dans le cas du dipyrrométhane avec le bras "nitrile", on peut opérer selon le SCHÉMA 12 ci-dessous.
SCHÉMA 12
Figure imgf000023_0001
Dans le cas du dipyrrométhane avec le bras "phtalimide", la réaction s'effectue selon le SCHÉMA 13 ci-dessous.
SCHÉMA 13
Figure imgf000023_0002
Le cycle porphyrinique est construit à partir des deux dipyrrométhanes et de la pyridine-carboxaldéhyde, en présence de TFA. La conjugaison du cycle peut être obtenue par oxydation avec la 2,6-dichloro-3,5-dicyanobenzoquinone (DDQ) (SCHÉMA 14). En fin de synthèse, le mélange réactionnel est théoriquement composé de trois porphyrines différentes qui peuvent être séparées par chromatographie sur gel de silice.
SCHÉMA 14
Figure imgf000024_0001
Au cours de la synthèse, certaines fonctions, et notamment la fonction aminé du pyrrole pourront être protégées, puis déprotégées. Les groupes protecteurs des alcools, aminés et acides carboxyliques sont bien connus de l'homme du métier. On pourra notamment se référer à « Protective Groups in Organic Synthesis », 2nde édition, Greene T.W. et Wuts P.G.M., ed John Wiley et Sons, 1991. A titre de groupe protecteur des aminés, on peut citer, à titre d'exemple, les groupes trifluoroacétyle, tert-butoxycarbonyle et 9-fluorénylméthoxycarbonyle.
4) Synthèse d'une porphyrine di-cationique fonctionnalisée avec un pyrrole (26) De la même manière que pour la porphyrine à caractère di-anionique, cette porphyrine di-cationique est axée autour d'un axe trans et possède une fonction méthoxy, mimant le futur bras accueillant l'ODN-sonde.
Figure imgf000025_0001
Un mode de préparation du monomère di-cationique (26) est présenté dans le SCHÉMA 15 ci-après. Puisque le cycle porphyrinique est substitué par trois types de groupements différents, mais est axé autour d'un axe trans, la méthode (2+2) précédemment décrite est utilisée pour sa synthèse. Comme précédemment, l'aminé terminale de la chaîne alcoxy substituant la porphyrine est protégée sous forme d'un phtalimide, lors de la construction du cycle porphyrinique. La première étape consiste en la synthèse du dipyrrométhane pyridyle (21). Après construction du cycle porphyrinique et déprotection de l'aminé (23), celle-ci est couplée avec le dérivé pyrrolique (1). Enfin, les réactions de métallation et perméthylation permettent d'obtenir le monomère di- cationique (26) souhaité. SCHEMA 15
Figure imgf000026_0001
Sur un monomère selon l'invention porteur d'au moins une fonction ionisée ou ionisable réactive, par exemple, du type aminé ou -COOH, il est possible de réaliser un couplage sur cette fonction avec un ligand biologique, selon des techniques bien connues de l'homme de l'art. Les monomères obtenus selon un tel couplage font partie intégrante de l'invention.
Les ligands biologiques pourront, également, être introduits selon toutes techniques appropriées, en formant intermédiairement des métalloporphyrines, porteuses d'autres fonctions réactives, du type aldéhyde, hydroxy ...
Comme dit précédemment, la mise en oeuvre des monomères selon l'invention permet de préparer des polymères qui peuvent notamment servir à l'adressage de biomolécules sur un plot d'une électrode. Un tel adressage peut alors être réalisé en une seule étape.
Les monomères selon l'invention présentent l'avantage de pourvoir être polymérisés en solution aqueuse.
La présente invention a également pour objet un procédé d'électropolymérisation réalisé en solution aqueuse, mettant en œuvre au moins un des monomères conformes à l'invention, et en particulier au moins un monomère porteur d'un ligand biologique. L'électropolymérisation pourra être menée dans une solution tampon ou non, comprenant, avantageusement, un électrolyte support, par exemple NaCl, LiClO4. Le pH de la solution sera, avantageusement, compris entre 3 et 8.
Cette électropolymérisation peut être une homopolymérisation. En particulier, une homopolymérisation avec un monomère soluble conforme à l'invention porteur d'un ligand biologique. Une homopolymérisation à partir d'un monomère soluble conforme à l'invention porteur d'une fonction réactive aminé, hydroxyle ou acide carboxylique, éventuellement sous forme protégée, peut également être mise en oeuvre. Cette homopolymérisation pourra alors être suivie d'un couplage de ladite fonction réactive avec un ligand biologique.
De façon préférée, l'électropolymérisation sera une copolymérisation réalisée entre au moins deux monomères différents dont au moins un est conforme à l'invention. De préférence, l'un au moins, et de préférence un seul, des monomères est porteur d'un ligand biologique. Bien entendu, le ou les monomères mis en œuvre, autres que ceux conformes à l'invention seront solubles en solution aqueuse. La copolymérisation met en œuvre au moins deux monomères selon l'une des revendications 1 à 37 dans lesquels le métal est différent. Selon une variante préférée, la réaction de polymérisation est réalisée de façon à obtenir un polymère porteur d'au moins deux ligands biologiques différents.
Il sera également avantageux, que tous les monomères mis en jeu comprennent un pyrrole comme motif électropolymérisable. Une copolymérisation pourra être réalisée, par exemple, entre un monomère selon l'invention porteur d'un ligand biologique et un pyrrole non substitué ou un pyrrole-3- alcanol, ou encore entre un monomère selon l'invention ne portant pas de ligand biologique, un pyrrole non substitué ou un pyrrole-3-alcanol et un pyrrole porteur en position 3 d'un ligand biologique. A titre de pyrrole-3-alcanol, on peut citer le 3- (hydroxyéthyl)pyrrole.
Il est également possible de réaliser une copolymérisation d'au moins un monomère soluble conforme à l'invention porteur d'une fonction réactive aminé, hydroxyle ou acide carboxylique, éventuellement sous forme protégée. Cette réaction de copolymérisation en phase aqueuse sera, avantageusement, suivie d'un couplage de ladite fonction réactive avec un ligand biologique.
La présente invention a également pour objet les polymères susceptibles d'être obtenus par de telles réactions de polymérisation, éventuellement suivies d'un couplage avec un ligand biologique.
Aussi, un autre objectif de l'invention est de proposer des sondes électroactives correspondant à un polymère selon l'invention porteur d'au moins un ligand biologique et des électrodes au moins partiellement recouvertes d'une telle sonde, qui soient plus simples à réaliser, et qui permettent une mesure plus directe de l'interaction ligand sonde/ligand cible.
On entend par « sonde électroactive », une sonde dont la réponse électrochimique est modifiée lorsqu'un ligand cible interagit de manière spécifique avec un ligand sonde porté par la sonde. Ainsi, on observe une modification du signal électrochimique suite à l'interaction spécifique avec l'analyte.
On entend par « ligand cible », toute molécule susceptible d'interagir spécifiquement avec un ligand sonde fixé à une unité monomérique du polymère selon l'invention obtenu à partir d'au moins un monomère selon l'invention et donc susceptible d'être détecté avec ce polymère. Ce ligand cible peut être une biomolécule, telle que par exemple, un nucléotide, un polynucléotide, un acide nucléique, un oligonucléotide, un polypeptide, une protéine, un anticorps, un antigène, un peptide, un lipide, un stéroïde, ou encore un sucre. Le ligand sonde porté par le polymère est spécifique du ligand cible à détecter.
La présente invention a donc également pour objet des sondes électroactives sous la forme d'un homopolymère conducteur, susceptibles d'être obtenues par électropolymérisation d'un monomère soluble conforme à l'invention porteur d'un ligand biologique.
Même si elles ne sont pas préférées, les sondes électroactives sous la forme d'un homopolymère conducteur susceptibles d'être obtenues par électropolymérisation d'un monomère soluble conforme à l'invention porteur d'une fonction réactive aminé, hydroxyle ou acide carboxylique, éventuellement sous forme protégée, suivie d'un couplage de ladite fonction réactive avec un ligand biologique, font partie intégrante de l'invention.
De façon préférée, la présente invention a pour objet des sondes électroactives sous la forme d'un copolymère conducteur susceptible d'être obtenues par copolymérisation d'au moins deux monomères différents dont au moins un est conforme à l'invention. L'un au moins, et de préférence un seul, des monomères étant porteur d'un ligand biologique.
On obtient ainsi, un espacement des ligands biologiques sondes ce qui permet d'améliorer la sensibilité. En particulier, on utilisera un monomère soluble conforme à l'invention porteur d'un ligand biologique et un monomère 3-(hydroxyéthyl)pyrrole. Un autre copolymère préféré pourra être obtenu par copolymérisation d'un monomère soluble conforme à l'invention ne portant pas de ligand biologique, d'un monomère porteur d'un ligand biologique de préférence porté en position 3 du pyrrole, et d'un monomère 3-
(hydroxyéthyl)pyrrole .
Là encore, même si elles ne sont pas préférées, les sondes électroactives sous la forme d'un copolymère conducteur susceptibles d'être obtenues par électropolymérisation d'au moins un monomère soluble conforme à l'invention porteur d'une fonction réactive aminé, hydroxyle ou acide carboxylique, éventuellement sous forme protégée, suivie d'un couplage de ladite fonction réactive avec un ligand biologique, font partie intégrante de l'invention. Selon un autre de ses aspects, la présente invention a également pour objet des électrodes comprenant un support conducteur dont tout ou partie de la surface est revêtue d'une sonde électroactive telle que définie ci-dessus. La présente invention a également pour objet, un procédé de détection d'un ligand cible dans un échantillon biologique, dans lequel on met en contact l'échantillon avec une sonde électroactive telle que définie précédemment, porteuse d'un ligand sonde, dans des conditions appropriées pour l'interaction ligand sonde/ligand cible et on met en évidence et éventuellement, on quantifie, la différence de potentiel ou de courant émis par la sonde avant et après mise en contact avec l'échantillon.
Les polymères obtenus à partir des monomères selon l'invention peuvent être utilisés notamment dans toutes les applications dans lesquelles des ligands biologiques sont adressés et immobilisés sur un support solide. Plus particulièrement, ces polymères peuvent être obtenus sous forme de films auto- supportés ou sous forme de film sur électrode. L'électrode permet en effet de contrôler, par mesure du courant délivré au cours de la réaction, l'évolution de la réaction de polymérisation. L'électrode permet également de mesurer les réponses électrochimiques ultérieures du polymère. La présente invention se rapporte donc également à une électrode comprenant un support conducteur revêtu en surface d'au moins un polymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des ligands biologiques selon l'invention, c'est-à-dire une sonde électroactive selon l'invention.
On connaît de l'état de la technique les supports conducteurs pour électrodes, on citera notamment les substrats en métal ou en dérivés de carbone. Pour la fabrication d'une électrode selon l'invention, le polymère est généralement déposé sur le support conducteur. La polymérisation électrochimique est effectuée avantageusement en surface de l'électrode pour obtenir une électrode comprenant un support conducteur revêtu en surface d'un polymère selon l'invention. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'électrode est obtenue en déposant une couche de polymère à la surface d'un support en or ou en platine.
Etant donné qu'il est possible de limiter et de contrôler les réactions de polymérisations électrochimiques au niveau d'une électrode, les monomères selon la présente invention permettent l'immobilisation et l'adressage de ligands biologiques sur de petites surfaces. Cette électrocopolymérisation adressée permet de réaliser une matrice de points miniaturisés et ordonnés, chacun des points portant un ligand biologique défini. Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention se rapporte donc également à une matrice d'électrodes. L'invention concerne donc également une matrice d'électrodes comprenant au moins une électrode selon l'invention. De telles matrices d'électrodes peuvent se présenter sous la forme de carte ou puce d'analyse comportant une série de puits, chaque puits correspondant à une électrode. Dans un mode de réalisation avantageux, les différentes électrodes de la matrice portent des ligands biologiques différents. Selon un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une pluralité d'électrodes ou de microélectrodes fixées sur un support solide, ces électrodes sont revêtues d'un copolymère selon l'invention et portent avantageusement des ligands biologiques différents. De telles matrices d'électrodes peuvent avantageusement être obtenues par électropolymérisation adressée de monomères selon l'invention, et en particulier par copolymérisation d'un monomère porteur d'un ligand biologique et d'un monomère non fonctionnalisé avec un ligand.
Les électrodes et les matrices d'électrodes selon l'invention sont notamment utilisables pour la détection d'analytes susceptibles d'être présents dans un échantillon et susceptibles de réagir spécifiquement avec les ligands biologiques portés par le polymère.
La présente invention permet de détecter un ligand cible dans tout type d'échantillon. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'échantillon est un échantillon biologique. Avantageusement, cet échantillon peut avoir été prélevé sur un patient à des fins de diagnostic. L'échantillon peut être, par exemple, l'urine, le sang, le sérum, le plasma, des extraits cellulaires ou un fluide corporel. La sonde étant électroactive, sa réponse électrochimique sera modifiée lorsqu'un ligand cible interagit de manière spécifique avec le ligand sonde porté par le polymère. Le polymère conducteur électroactif selon l'invention traduit donc l'interaction avec le ligand cible en un signal électrochimique. L'interaction spécifique d'un ligand cible avec le ligand sonde porté par le polymère engendre une modification de la réponse électrochimique du polymère étudié par rapport à celle obtenue avant introduction du ligand cible. Avantageusement, la détection du ligand cible s'effectue donc par une mesure électrique. On entend par « mesure électrique », la mesure d'une variation de type potentiométrique comme la variation du potentiel d'oxydation du polymère ou la mesure d'une variation de type ampérométrique par variation du courant d'oxydation observé à un potentiel donné. Ces variations sont mesurées de manière rapide, sensible et quantitative selon des méthodes bien connues de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la mesure électrique consiste en la mesure d'une variation de potentiel ou d'une variation de courant. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, on utilise la voltamétrie cyclique. Il s'agit d'une méthode électroanalytique qui consiste à balayer une gamme de potentiel dans un sens puis dans l'autre, à vitesse constante. Le voltampérogramme obtenu donne la réponse en courant du système électrochimique étudié et permet sa caractérisation.
Les méthodes de détection par une mesure électrique sont préférées avec les polymères selon l'invention. Cependant d'autres méthodes traditionnelles de détection connues de l'homme du métier peuvent également être utilisées. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la détection de l'interaction spécifique entre le ligand cible et le ligand sonde porté par le polymère peut se faire avec l'électrode qui a servi à l' électropolymérisation du polymère. Par exemple, l'hybridation d'un acide nucléique complémentaire à des oligonucléotides portés par le polymère peut être détectée par mesure électrique sur l'électrode qui supporte le polymère selon l 'invention.
L'hybridation d' oligonucléotides peut être suivie directement en mesurant la variation du signal électrochimique détecté ou bien par l'intermédiaire d'une réaction enzymatique. Dans ce cas, l'oligonucléotide cible est par exemple porteur d'une biotine.
Après introduction de streptavidine-peroxidase et du substrat de l'enzyme, la détection peut se faire soit au niveau du substrat, soit au niveau du signal électrochimique.
De la même façon, il est possible de suivre, grâce aux variations du signal électrochimique les interactions protéine/protéine du type anticorps/antigène et anticorps/protéine notamment.
Il est également possible d'utiliser les polymères susceptibles d'être obtenus avec les monomères selon l'invention, pour le dosage des ions phosphates, dans le cadre du suivi d'une PCR par exemple ; pour étudier l'activité d'une enzyme ; dans des applications en électronique moléculaire comme décrit par exemple dans Science, 2004, 306, 2048-2074.
Dans un mode particulier de l'invention, le polymère électroactif comporte des biomolécules sondes différentes. Les métallo-porphyrines sont alors complexées par différents métaux permettant la détection de plusieurs types de molécules cibles.
Les exemples de préparation de monomères et la caractérisation électrochimique des polymères obtenus qui vont suivre, sont donnés à titre illustratif. A. Exemples de préparation de monomères :
I) Synthèses de pyrroles substitués par des groupes acide et alcool Acide ClH-pyrrol-3-yl)acétique (1)
Figure imgf000033_0001
3,37 g (11,5 mmol) de [l-(toluène-4-sulfonyl)-l//-pyrrol-3-yl] acétate de méthyle sont dissous dans 35 mL de méthanol et 35 mL d'une solution de soude 5N. Le milieu réactionnel est chauffé à reflux pendant 4 heures, concentré à sec et repris par de l'eau. La phase aqueuse est lavée avec de l'éther diéthylique, puis acidifiée lentement dans un bain de glace avec une solution d'acide chlorhydrique 6N jusqu'à obtenir un pH de 3 environ. La phase aqueuse est extraite avec de l'éther diéthylique. La phase éthérée est lavée avec une solution saturée de NaCl, séchée sur Na2SO4 et concentrée à sec. On obtient 949 mg de composé (1) sous forme de cristaux blancs, avec un rendement de 66 %. Remarque : Le composé (1) doit être conservé en solution dans l'éther diéthylique. Avant de l'utiliser, la solution doit être filtrée sur verre fritte et concentrée à sec. M Cg.moF1) : 125,13 CCM : CH2Cl2/Et0H 95/5 : rf = 0,16 RMN 1H : CDCl3, δ (ppm ) : 8,17 (IH) ; 6,78 (2H ; s) ; 6,21 (IH ; s) ; 3,58 (2H ; s)
2-πH-Pyrrol-3-yl)éthanol (2)
Figure imgf000033_0002
Une solution de 5,0 g (17 mmol ; 1 éq.) de [l-(toluène-4-sulfonyl)-lH-pyrrol-3- yl] acétate de méthyle dans un minimum de THF anhydre est ajoutée goutte à goutte, sous argon, dans un mélange de 60 mL de THF (distillé sur sodium) et 12 mL (24 mmol ; 1,4 éq.) d'une solution de (BH3)S(CH3 )2 2M dans du THF. Le milieu réactionnel est chauffé à reflux pendant 4 heures, puis versé doucement sur 100 mL d'une solution de soude 6N placée dans un bain de glace. La phase aqueuse est extraite avec du dichlorométhane. La phase organique est ensuite lavée avec une solution saturée de NaCl, séchée sur Na2SO4 et concentrée à sec. Le mélange est purifié par chromatographie sur un gel de silice avec un mélange de AcOEt/éther de pétrole 4/6 (v/v). Le produit brut est dissous dans 60 mL de méthanol et 60 mL de soude 5N. Le milieu réactionnel est chauffé à reflux pendant 3 heures, puis concentré à sec et repris par de l'acétate d'éthyle et de l'eau. Les deux phases sont séparées. La phase aqueuse est extraite avec de l'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée avec de l'eau et avec une solution saturée de NaCl, séchée sur Na2SO4 et concentrée à sec. Le produit obtenu est solubilisé dans l'eau et filtré sur célite. On obtient 720 mg de composé (2), avec un rendement de 38 %. M (g.mol'1) : 111,14 RMN 1H : CD3OD, δ (ppm ) : 6,61 (IH ; s) ; 6,54 (IH ; s) ; 5,96 (IH ; s) ; 3,65 (2H ; t ; 7,5 Hz) ; 2,66 (2H ; t ; 7,5 Hz)
II- Synthèse d'une porphyrine substituée par un pyrrole et trois pyridinium II- 1 4-[l-propoxy-3-(JV-phtalimide)]benzaldéhyde (3)
Figure imgf000034_0001
Sous argon, 3,66 g (30 mmol ; 1 éq.) de 4-hydroxybenzaldéhyde sont dissous dans
20 mL de DMF et 8,3 g (60 mmol ; 2 éq.) de K2CO3 sont ajoutés. Après 1 heure d'agitation à 70 °C, le milieu rosit. Avec une ampoule d'addition, une solution de 9,65 g (36 mmol ; 1,2 éq.) de iV-(3-bromopropyl)phtalimide dans 20 mL de DMF est ajoutée lentement. Le milieu réactionnel est agité 1 heure à 70 0C, puis 2 heures à 90 0C. Après refroidissement, le milieu est filtré sur verre fritte. Le filtrat est dilué avec du dichlorométhane jusqu'à précipitation, puis filtré à nouveau sur verre fritte. Le nouveau filtrat est concentré à sec, puis repris par du dichlorométhane. La phase organique est lavée deux fois à l'eau puis avec une solution saturée de NaCl, séchée sur Na2SO4 et concentrée à sec. On obtient 10,03 g de composé (3) utilisé sans purification supplémentaire.
M (g.mol"1) : 309,32
CCM : CH2Cl2MeOH 95/5 : rf = 0,74
RMN 1H : CDCl3, δ (ppm) : 9,80 (IH ; s) ; 7,77 (2H ; dd ; 5,5 Hz ; 3,1 Hz) ; 7,73 (2H ; d ;
8,8 Hz) ; 7,67 (2H ; dd ; 5,5 Hz ; 3,1 Hz) ; 6,83 (2H ; d ; 8,8 Hz) ; 4,07 (2H ; t ; 6,4 Hz) ; 3,87 (2H ; t ; 6,4 Hz) ; 2,17 (2H ; qi ; 6,4 Hz) II-2 [5-[4-(3-(7V-phtalimide)-l-propoxy)phényl]-10,15,20-tri-pyridin-4-yl]porphyrine (4)
Figure imgf000035_0001
Dans 225 mL d'acide propanoïque, 4,30 mL (45 mmol ; 3 éq.) de 4-pyridine- carboxaldéhyde et 4,64 g (15 mmol ; 1 éq.) de composé (3) sont dissous. Après ajout de pierre ponce, le milieu réactionnel est chauffé au reflux à l'aide d'un chauffe-ballon pendant 10 min.
Avec une ampoule d'addition, une solution de 4,19 mL (60 mmol ; 4 éq.) de pyrrole (distillé) dans 20 mL d'acide propanoïque est ajoutée lentement. Le milieu vire au noir dès les premières gouttes. Le milieu réactionnel est chauffé à reflux pendant lh30. Une demi- spatule de chloranil est additionnée, puis le milieu est maintenu à reflux pendant 30 min. L'acide propanoïque est évaporé totalement. Après une première filtration sur silice avec un mélange CH2Cl2/EtOH 9/1 (v/v), le mélange est purifié par chromatographie sur un gel de silice de 600 g avec un mélange de CH2Cl2 contenant des proportions croissantes de EtOH (de 1 % à 5 %). Le produit est précipité, après dissolution dans un minimum de CH2Cl2, par de l'hexane. On obtient 847 mg de composé (4), avec un rendement de 6,9 %. M (g.mol"1) : 820,92
CCM : CH2Cl2/EtOH 95/5 : rf = 0,17 (5ème porphyrine 16) RMN 1H : CDCl3, δ (ppm ) : 9,04 (6H ; dd ; 4,4 Hz ; 1,5 Hz) ; 8,95 (2H ; d ; 4,9 Hz) ; 8,85 (4H ; s) ; 8,82 (2H ; d ; 4,9 Hz) ; 8,16 (6H ; d ; 4,4 Hz) ; 8,09 (2H ; d ; 8,3 Hz) ; 7,89 (2H ; dd ; 5,4 Hz ; 2,9 Hz) ; 7,72 (2H ; dd ; 5,4 Hz ; 2,9 Hz) ; 7,20 (2H ; d ; 8,3 Hz) ; 4,33 (2H ; t ; 6,4 Hz) ; 4,07 (2H ; t ; 6,4 Hz) ; 2,38 (2H ; qi ; 6,4 Hz) ; -2,89 (2H, s) MS : électrospray, ionisation positive : [M+H]+ = 821 II-3 [5-(4-(3-amino-l-propoxy)phényl-10,15,20-tri-pyridin-4-yl]porphyrine (5)
Figure imgf000036_0001
Dans 30 mL d'un mélange de CH2Cl2/Et0H 1/2 (v/v), 800 mg (0,97 mmol ; 1 éq.) de composé (4) et 0,5 mL (9,75 mmol ; 10 éq.) d'une solution d'hydrazine à 64 % dans l'eau sont dissous. Le milieu réactionnel est chauffé à reflux pendant 24 heures, puis agité à température ambiante (TA) pendant 24 heures. Une solution d'acide chlorhydrique à 10
% est additionnée. Le milieu est filtré sur verre fritte et le filtrat est neutralisé avec une solution de soude à 10 %, jusqu'à ce que la solution passe du vert au rouge. La phase aqueuse est extraite, en continu sur 24 heures, à l'aide d'une solution de CH2Cl2/Et0H 95/5
(v/v). Les phases organiques sont lavées avec une solution saturée de NaCl, séchées sur
Na2SO4 et concentrées à sec. On obtient 462 mg du composé (5), avec un rendement de
69 % .
M (g.mol"1) : 690,81
CCM : CH2Cl2/Et0H 9/1 : rf = 0
RMN 1H : CDCl3, δ (ppm ) : 9,05 (6H ; dd ; 4,4 Hz ; 1,9 Hz) ; 8,97 (2H ; d ; 4,9 Hz) ;
8,86 (4H ; s) ; 8,82 (2H ; d ; 4,9 Hz) ; 8,16 (6H ; d ; 4,4 Hz) ; 8,10 (2H ; d ; 8,8 Hz) ; 7,30
(2H ; d ; 8,8 Hz) ; 4,37 (2H ; t ; 6,4 Hz) ; 3,14 (2H ; t ; 6,4 Hz) ; 2,17 (2H ; qi ; 6,4 Hz) ; - 2,86 (2H ; s)
MS : électrospray, ionisation positive : [M+H]+ = 691 ; [M+2H]2+/2 = 346 II-4 [5-(4-(3-(2-lH-pyrrol-3-yl-acéthylamino)-l-propoxy)phényl)-10,15,20-tri-pyridin- 4-yl]porphyrine (6)
Figure imgf000037_0001
Sous argon, 48 mg (0,38 mmol ; 1,2 éq.) de composé (1), 78 mg (0,38 mmol ; 1,2 éq.) de dicyclohexyl-carbodiimide (DCC), séché à la pompe à palettes, et 44 mg (0,38 mmol ; 1,2 éq.) de JV-hydroxysuccinimide (NHS) sont dissous dans 2 mL de CH2Cl2. Le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant 1 heure, pour obtenir l'ester activé. Une solution de 221 mg (0,32 mmol ; 1 éq.) de composé (5) dans 2 mL de CH2Cl2, avec quelques gouttes de triéthylamine, est additionnée lentement. Le milieu est agité pendant 3 heures, puis filtré sur verre fritte et concentré à sec. Le mélange obtenu est purifié par chromatographie flash sur 50 g de silice et avec pour éluant un mélange CH2Cl2/EtOH 95/5 (v/v). On obtient 252 mg de composé (6).
M (g.mol"1) : 797,93
CCM : CH2Cl2MeOH 85/15 : rf = 0,64
RMN 1H 400 MHz: CD3OD, δ (ppm ) : 8,99 (m) ; 8,91 (m) ; 8,29 (m) ; 8,10 (d ; 7,7 Hz) ;
7,98 (m) ; 7,38 (d ; 7,7 Hz)
UV-VIS : DMF (200-775 nm), λ (mn) : 235 ; 421 (Soret) ; 516, 550, 591, 650 (bandes Q) Masse électrospray, ionisation positive : (M + 2NH4 +)=830 II-5 Métallation du composé (6)
Figure imgf000038_0001
Pour M = Co
Dans 1 mL de DMF, 50 mg (63 μmol ; 1 éq.) de composé (6) et 80 mg (616 μmol ; 10 éq.) de CoCl2 (séché à la pompe à palettes) sont dissous. Le milieu réactionnel est chauffé à 80 °C pendant 2 heures, puis concentré à sec. Le mélange est repris dans de l'éthanol et filtré sur verre fritte. Le solide est récupéré avec un mélange MeOH/CH2Cl2. On obtient 50 mg de composé (7) avec M= Co (nommé (7-Co)), soit 93 % de rendement. M (g.mor1) : 854,84 UV-VIS : pyridine (200-775 nm), λ (nm) : 255 ; 341 ; 440 (Soret) ; 559 (bandes Q)
II-6 Méthylation du composé (7)
Figure imgf000038_0002
Pour M = Co
En atmosphère fermée, 43 mg (0,05 mmol ; 1 éq.) de composé (7-Co) sont dissous dans 5 mL de DMF et 0,6 mL (10 mmol ; 200 éq.) d'iodure de méthyle sont additionnés. Le milieu réactionnel est agité à 40 0C pendant 3 heures, puis concentré à sec et repris par de l'eau. Le mélange est passé sur colonne échangeuse d'ions : 2 g de Dowex-Cl, puis lyophilisé. On obtient 38 mg de composé (8) avec M=Co, soit 75 % de rendement. L'analyse par la masse montre la présence du produit méthylé sur toutes les aminés présentes dans la molécule. M (^mOl"1) : 1034,36 MS : électrospray, ionisation positive : [M-3C1]3+ = 927
MALDI : [M-3C1+3H] = 930 UV-VIS : eau (200-775 nm), λ (irai) : 255 ; 341 ; 440 (Soret) ; 559 (bandes Q)
II-7 Méthylation du composé (6)
Figure imgf000039_0001
100 mg (0,125 mmol ; 1 éq.) de composé (6) sont dissous dans 5 mL de DMF et
1,6 mL (25 mmol ; 200 éq.) d'iodure de méthyle sont additionnés. Le milieu réactionnel est agité à TA pendant 18 heures, puis concentré à sec et repris par de l'eau. Le mélange est passé sur colonne échangeuse d'ions : 10 g de Dowex-Cl, puis lyophilisé. On obtient 100 mg du composé (9), soit 84 % de rendement. L'analyse par la masse montre la méthylation uniquement sur les pyridiniums. M (g.mol 1) : 949,39
RMN 1H : CD3OD à 318 K, δ (ppm ) : 9,99(6H) ; 9,73, 9,61(8H) ; 9,54 (6H); 8,63(2H) ; 7,89 (2H); 7,4 (IH); 7,1 (IH); 6,6 (IH); 5,43(9H); 4,86 (2H) ; 4,09(2H); (3,1); 2,70(2H). UV-VIS : eau (200-800 nm), λ (nm) : 242 ; 426 (Soret) ; 522 ...(bandes Q) Masse électrospray M/Z (M - lCl/2)= 877
II- 8 Métallation du composé (9)
Figure imgf000040_0001
Pour M = Mn
Dans 20 mL d'eau, 50 mg (53 μmol ; 1 éq.) de composé (9) et 85 mg (527 μmol ; 10 éq.) de MnCl2'2H2O sont dissous. Le milieu réactionnel est chauffé à reflux pendant 5 heures, puis concentré à sec. Le mélange est dissous dans un minimum de méthanol, précipité avec de l'acétonitrile et filtré sur verre fritte. Le solide est récupéré avec un mélange MeOH/H2O. MKg.mol'1) : 1002,31 UV-VIS : eau (200-800 nm), λ (nm) : 250 ; 438 (Soret) ; 550 (bandes Q)
III- Synthèse de la porphyrine substituée par 3 groupements différents III- 1 4-(4-formylphénoxy)butyronitrile (11)
Figure imgf000040_0002
Sous argon, 2,44 g (20 mmol ; 1 éq.) de 4-hydroxybenzaldéhyde sont dissous dans
2O mL de DMF et 5,53 g (40 mmol ; 2 éq.) de K2CO3 sont ajoutés. Après 1 heure d'agitation à 70 °C, le milieu rosit. Avec une ampoule d'addition, une solution de 2,4 mL (24 mmol ; 1,2 éq.) de 4-bromobutyronitrile dans 6 mL de DMF est ajoutée lentement. Le milieu réactionnel est agité 1 heure à 70 0C, puis 2 heures à 90 °C. Après refroidissement, le milieu est filtré sur verre fritte. Le filtrat est dilué avec du dichlorométhane jusqu'à précipitation, puis filtré à nouveau sur verre fritte. Le nouveau filtrat est concentré à sec, puis repris par du dichlorométhane. La phase organique est lavée deux fois à l'eau puis avec une solution saturée de NaCl, séchée sur Na2SO4 et concentrée à sec. On obtient 4,15 g de composé (11) utilisé sans purification supplémentaire (rendement quantitatif). MKg.mor1) : 189,22 CCM : CH2Cl2/Me0H 9/1 : rf = 0,55
RMN 1H : CDCl3, δ (ppm) : 9,82 (IH) ; 7,77 (2H ; d ; 8,8 Hz) ; 6,94 (2H ; d ; 8,8 Hz) ; 4,11 (2H ; t ; 6,3 Hz) ; 2,56 (2H ; t ; 6,3 Hz) ; 2,12 (2H ; qi ; 6,3 Hz)
III-2 4-[4-(bis-(lH-pyrrol-2-yl)méthyl)phénoxy]butyronitrile (12)
Figure imgf000041_0001
Sous argon, dans 14 mL (195,5 mmol ; 25 éq.) de pyrrole (distillé), 1,48 g (7,8 mmol ; 1 éq.) de composé (11) sont dissous. 60 μL (0,8 mmol ; 0,1 éq.) de TFA sont additionnés. Le milieu réactionnel est agité à TA pendant 10 min. 10 mL (1 mmol) d'une solution de soude 0,1N sont ajoutées. Après dilution de la solution avec de l'eau, la phase aqueuse est extraite à l'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée à l'eau et avec une solution saturée de NaCl, séchée sur Na2SO4 et concentrée à sec. Le mélange obtenu est purifié par chromatographie sur 100 g de silice et avec pour éluant un mélange CH2Cl2MeOH 95/5 (v/v). On obtient environ 1 g de composé (12), soit environ 42 % de rendement. M (g.mol 1) : 305,38
CCM : CH2Cl2MeOH 99/1 : rf = 0,57
RMN 1H : CDCl3, δ (ppm) : 8,00 (2H) ; 7,21 (2H ; d ; 8,8 Hz) ; 6,94 (2H ; d ; 8,8 Hz) ; 6,69 (2H ; m) ; 6,25 (2H ; m) ; 5,97 (2H ; m) ; 5,41 (IH ; s) ; 4,07 (2H ; t ; 6,3 Hz) ; 2,56 (2H ; t ; 6,3 Hz) ; 2,12 (2H ; qi ; 6,3 Hz) III-3 2-[3-[4-(bis-(li/-pyrrol-2-yl)méthyl)phénoxy]propyl]isoindole-l,3-dione
Figure imgf000042_0001
Sous argon, dans 35 mL (500 mmol ; 25 éq.) de pyrrole (distillé), 6,19 g (20 mmol ; 1 éq.) de composé (3) sont dissous. 150 μL (2 mmol ; 0,1 éq.) de TFA sont additionnés. Le milieu réactionnel est agité à TA pendant 5 min. 2,4 g (60 mmol ; 3 éq.) de soude en poudre sont additionnés. Le milieu réactionnel est agité à TA pendant 30 min, filtré sur verre fritte, lavé avec de l'hexane et concentré à sec. Le mélange obtenu est purifié par chromatographie sur 400 g de silice et avec pour éluant un mélange CH2Cl2MeOH 995/5 (v/v). On obtient environ 1,52 g de composé (13), soit environ 18 % de rendement. M (g.mol"1) : 425,49 CCM : CH2Cl2/MeOH 99/1 : rf = 0,6
RMN 1H : CDCl3, δ (ppm) : 8,21 (2H) ; 7,85 (2H ; m) ; 7,75 (2H ; m) ; 7,11 (2H ; d ; 8,3 Hz) ; 6,76 (2H ; d ; 8,3 Hz) ; 6,70 (2H ; m) ; 6,20 (2H ; m) ; 5,94 (2H ; m) ; 5,40 (IH ; s) ; 4,02 (2H ; t ; 6,1 Hz) ; 3,92 (2H ; t ; 6,1 Hz) ; 2,21 (2H ; qi ; 6,1 Hz)
III-4 [5-[4-(3-(N-phtalimide)-l-propoxy)phényl]-15-[4-(3-cyano-l-propoxy)phényl]- 10,20-tri-pyridm-4-yl]porphyrine (14)
Figure imgf000042_0002
Dans 500 mL de CH2Cl2, 1,00 g (3,27 mmol ; 1 éq.) de composé (12), 1,39 g
(3,27 mmol ; 1 éq.) de composé (13) et 0,6 mL (6,55 mmol ; 2 éq.) de 4-pyridine- carboxaldéhyde sont dissous. 2 mL (26,2 mmol ; 8 éq.) de TFA sont additionnés. Le milieu réactionnel est agité à TA pendant 30 min. 250 mL de THF, 3,6 mL (26,2 mmol ; 8 éq.) de triéthylamine, puis une solution de 2,22 g (9,82 mmol ; 3 éq.) de DDQ dans du THF sont additionnés. Le milieu réactionnel est agité à TA pendant 3 heures, puis concentré à sec. Après reprise avec du dichlorométhane, du TFA est additionné jusqu'à neutralisation. Après concentration à sec et une première fïltration sur silice avec un mélange CH2Cl2ZEtOH 97/3, le mélange est purifié par chromato graphie sur une colonne de 350 g de silice avec un mélange de CH2Cl2 contenant des proportions croissantes de EtOH (de 0,3 % à 0,5 %). La fraction obtenue est analysée par RMN du proton et montre la présence du bon produit. M (g.mol"1) : 903,02
RMN 1H : CDCl3, δ (ppm) : 8,85 (8H ; s) ; 8,12 (2H ; d ; 8,8 Hz) ; 8,06 (2H ; d ; 8,8 Hz) ; 7,91 (2H ; dd ; 2,9 Hz ; 5,4 Hz) ; 7,74 (2H ; dd ; 2,9 Hz ; 5,4 Hz) ; 7,26 (2H ; d ; 8,8 Hz) ; 7,18 (2H ; d ; 8,8 Hz) ; 4,39 (2H ; t ; 6,2 Hz) ; 4,33 (2H ; t ; 6,5 Hz) ; 4,08 (2H ; t ; 6,5 Hz) ; 2,78 (2H ; t ; 6,2 Hz) ; 2,36 (4H ; m)
IV- Synthèse d'une porphyrine di-anionique fonctionnalisée avec un pyrrole
La synthèse est réalisée conformément aux SCHÉMA 7 à 11 précédemment décrits
IV.1- Synthèse du 5-(4-cyanophényl)dipyrrométhane (15)
Figure imgf000043_0001
La synthèse du 5-(4-cyanophényl)dipyrrométhane (15) est réalisée par réaction du 4-cyanobenzaldéhyde pendant 10 minutes à température ambiante, avec un rapport pyrrole/aldéhyde 25/1 et 0,1 équivalent de TFA.
Sous argon, 3,28 g de 4-cyanobenzaldehyde (25 mmol ; 1 eq) sont dissous dans 44mL (630 mmol ; 25 eq) de pyrrole (distillé), 0,2 mL (2,5 mmol ; 0,1 eq) de TFA sont additionnés. Le milieu réactionnel est agité à température ambiante (TA) pendant 10 min. Une solution aqueuse de NaOH (30 mL ; 0,1 M) est ajoutée. Le mélange est dilué dans de l'acétate d'éthyle. La phase organique est séparée par décantation, lavée avec de l'eau jusqu'à neutralisation puis saturée avec une solution de NaCl, séchée sur Na2SO4 et concentrée à sec. Le mélange obtenu (7,83 g) est purifié par chromatographie sur 400g de silice et avec pour éluant du CH2Cl2.
Masse molaire (g.mol"1) : 247,30 (Ci6Hi3N3)
Chromatographie sur Couche Mince (CCM ou TLC) : CH2Cl2 : rf = 0,4
RMN 1H : CDCl3. δ (ppm) : 8,02 (2H ; s) ; 7,60 (2H ; d ; 8 Hz) ; 7,31 (2H ; d ; 8 Hz) ;
6,73 (2H ; d ; 3 Hz) ; 6,16 (2H ; d ; 3 Hz) ; 5,85 (2H ; m) ; 5,53 (IH ; s)
IV- 2-Construction du cycle porphyrinique (16)
Figure imgf000044_0001
Sous argon, 2,47g (lO mmol ; 2 eq) de 5-(4-cyanophényl)dipyrrométhane (15) 4-méthoxybenzaldéhyde (0,68 g ; 5 mmol ;l eq) et 1,55 g de 4-[l-propoxy- 3-(N-phtalimide)]benzaldéhyde (5 mmol ; 1 eq) sont dissous dans CH2Cl2 (1 L). 2,3 mL de TFA (30 mmol ; 6 eq) sont additionnés. Le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant 30 min. 250 mL de THF, 7 mL de Et3N (50 mmol ; 10 eq) puis une solution de DDQ (3,41 g ; 15 mmol ; 3 eq) dans du THF (250 mL) sont additionnés. Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 2 heures, puis concentré à sec. Le mélange (16,8 g) est purifié par filtration sur gel de silice avec un mélange CH2Cl2ZEtOH 99/1. Le produit obtenu (3,53 g) est purifié par chromatographie sur une colonne de 400g de silice avec un mélange de CH2Cl2. Le produit est à nouveau purifié (1,3 g) sur gel de silice (200 g) avec CH2Cl2. La porphyrine (16) (950 mg) est obtenue.
M (g.mol"1) : 898,00 (C58H39N7O4) TLC : CH2Cl2MeOH 99/1 : rf = 0,41
1H RMN : CDCl3. δ (ppm) : 8,94 - 8,97 (4H ; 2d ; 4,5 Hz) ; 8,74 - 8,77 (4H ; 2d ; 4,5 Hz) ; 8,28 (4H ; d ; 8 Hz) ; 8,13 (2H ; d ; 8,5 Hz) ; 8,07 (2H ; d ; 8,5 Hz) ; 7,98 (4H ; d ; 8 Hz) ; 7,78 (2H ; dd ; 5,5 Hz ; 3 Hz) ; 7,58 (2H ; dd ; 5,5 Hz ; 3 Hz) ; 7,29 (2H ; d ; 9 Hz) ; 7,16 (2H ; d ; 9 Hz) ; 4,24 (2H ; t ; 6 Hz) ; 4,07 (3H ; s) ; 4,01 (2H ; t ; 6 Hz) ; 2,33 (2H ; qi ; 6 Hz) ; -2,83 (2H ; s large)
Spectrométrie de Masse (MS) par électrospray à ionisation positive (Positive-ion electrospray ionisation) : 188,0 (100) ; [M]+ = 898,3 (30) ; [M+H]+ = 899,3 (19) Spectoscopie Ultra- Violet - Visible (UV-Vis) : CH2Cl2 (350-750 nm). λ (nm) : 422 (Soret) ; 518 ; 552 ; 592 ; 648
IV-3 -Déprotection de la fonction aminé et préparation de la porphyrine (17)
Figure imgf000045_0001
La fonction aminé est obtenue par déprotection avec de l'hydrazine, en apportant différentes modifications par rapport aux conditions opératoires utilisées avec les porphyrines précédentes : un large excès d'hydrazine est utilisé (100 équivalents) et le milieu réactionnel est chauffé à 60 0C pendant 24 heures. La porphyrine (16) (917 mg ; 1,02 mmol ; 1 eq) est dissous dans 20 mL de CH2Cl2 et 40 mL de MeOH. 5 mL de NH2NH2 à 64 % (102 mmol ; 100 eq) est ajouté. Le mélange réactionnel est agité à 60 0C pendant 24 heures. Une solution de HCl à 10 % est ajoutée jusqu'à ce que le mélange devienne vert. La solution est ensuite filtrée. De l'eau est ajoutée jusqu'à neutralisation, La solution devient violette. CH2Cl2 et MeOH sont évaporés. La solution est extraite plusieurs fois avec CH2Cl2. La phase organique est lavée plusieurs fois avec de l'eau, séchée puis concentrée à sec.
On remarquera qu'avec cette porphyrine di-nitrile (17), il n'est pas nécessaire d'utiliser un montage d'extraction en continu pour la purification par lavage à l'eau. Nous observons, en spectrométrie de RMN, la disparition des deux signaux caractéristiques du groupement phtalimide à 7,9 et 7,7 ppm, et en spectrométrie de masse, un pic majoritaire pour à 711,2, correspondant à la molécule fragmentée au niveau du pont éther de la chaîne propyloxy, et un pic correspondant à [M+H]+ à 768,3 (15 %).
M (g-mol"1) : 767,90 (C50H37N7O2) TLC : CH2Cl2MeOH 95/5 : rf ~ 0
1U NMR : CDCl3. δ (ppm) : 8,93 - 8,94 (4H ; 2d ; 4,5 Hz) ; 8,73 - 8,74 (4H ; 2d ;
4,5 Hz) ; 8,31 (4H ; d ; 7,5 Hz) ; 8,12 (2H ; d ; 8 Hz) ; 8,10 (2H ; d ; 6 Hz) ; 8,04 (4H ; d ;
7,5 Hz) ; 7,30 (2H ; d ; 8 Hz) ; 7,27 (2H ; d ; 6 Hz) ; 4,34 (2H ; t ; 6,5 Hz) ; 4,10 (3H ; s) ;
3,09 (2H ; t ; 6,5 Hz) ; 2,34 (2H ; qi ; 6,5 Hz) ; -2,78 (2H ; s) Spectrométrie de Masse (MS) par technique MALDI-TOF : [(Porρhyrin-O-)+2H]+ = 711,2
(100) ; [M+H]+ = 768,3 (15)
Spectrométrie Infra-Rouge à Transformée de Fourier (FTIR) : υ (cm"1) : 3315 ; 2930 ;
2228 ; 1604 ; 1504 ; 1472 : 1245 ; 1173 ; 982 ; 966 ; 790 ; 734
IV-4-Couplage peptidique entre la porphyrine (17) et le dérivé acide carboxylique du pyrrole, préparation de la porphyrine (18)
Le couplage peptidique de la porphyrine-amme (17) avec le pyrrole-acide non- protégé est réalisé en présence de DCC / NHS selon le SCHÉMA 16. SCHÉMA 16
I) D C C - N HS Z C H2CI- - TA - 4h
Figure imgf000047_0001
Figure imgf000047_0002
TA - 24h
Figure imgf000047_0003
La purification est réalisée sur un gel d'alumine neutre, pour empêcher une éventuelle polymérisation du composé (18), qui se produirait sur gel de silice, et afin d'éviter l'ajout de triéthylamine à l'éluant (comme précédemment). La porphyrine a été caractérisée par spectrométrie de RMN, pour la pureté, et par spectrométrie de masse MALDI, par la présence d'un pic majoritaire à 907,0 non-caractérisé et de pics correspondant à [M]+ et [M+H]+ à 875,1 (65 %) et 876,1 (50 %) respectivement.
IV-5- Réactions de métallation et d'hydrolyse des groupements nitriles du composé (18)
Pour obtenir la porphyrine métallée et di-anionique, les deux réactions : métallation et hydrolyse, peuvent être effectuées sans ordre de préférence. Mais, si l'on désire complexer la porphyrine avec différents métaux, il est plus intéressant de réaliser l'hydrolyse dans un premier temps. Néanmoins, les fonctions carboxylates de la molécule risquent dans ce cas de complexer les sels métalliques et de poser des problèmes de réactivité et de purification. La métallation a donc été réalisée avant l'hydrolyse. IV-5-1 Métallation et préparation des poφhyrines (19)
Figure imgf000048_0001
La porphyrine (18) réagit avec l'acétate du sel métallique désiré dans le DMF à
40 0C pendant 24 heures. Plusieurs métalloporphyrines complexées par le métal désiré : cobalt, fer, manganèse et zinc, ont été synthétisées, avec des rendements de 94 % à 100 % suivant le métal.
L'introduction du métal a été constatée par spectrométrie UV- Vis, en observant la disparition de deux des quatre bandes Q et le déplacement de la bande de Soret : de
422 irai à 419 nm pour le cobalt, à 414 nm pour le fer, à 466 nm pour le manganèse et à 428 nm pour le zinc. En spectrométrie de masse MALDI, la porphyrine de cobalt présente un pic majoritaire correspondant à [M+H]+ à 932,3 et celle de manganèse un pic majoritaire correspondant à [M]+ à 927,3.
Mode opératoire
- Mode opératoire pour M = Co Le composé (18) (350 mg ; 0,4 mmol ; 1 eq) et le Co(acetate)2-4H2O (5 g ; 20 mmol ;
50 eq) sont dissous dans du DMF (20 mL) sous argon. Le mélange réactionnel est chauffé à 50 °C pendant 24 heures, puis concentré à sec. Le produit est dissous dans de l'acétate d'éthyle et la phase organique est lavée plusieurs fois avec de l'eau. Après concentration, le composé (19)-Co (355 mg) est obtenu. M (g-mol"1) : 931 ,93 (C56CoH40N8O3)
TLC : CH2Cl2MeOH 95/5 : rf = 0,35 MS : MALDI-TOF : [M+H]+ = 932,3 (100) ; [M+Na]+ = 954,3 (59) ; [M]+ = 931,3 (52) UV-Vis : DMF (350-750 nm). λ (nm) : 419 (Soret) ; 532 - Pour M = Fe
Le composé (18) (50 mg ; 57 μmol ; 1 eq) et FeCl2-4H2O (568 mg ; 2,9 mmol ; >50 eq) sont dissous dans du DMF (5 mL) sous argon. Le mélange réactionnel est chauffé à 50 0C pendant 48 heures, et concentré à sec. Le produit est dissous dans de l'acétate d'éthyle et la phase organique est lavée plusieurs fois dans de l'eau. Après concentration, le composé (19)-Fe (50 mg) est obtenu. M (g.mol"1) : 928,84 (C56H40FeN8O3) TLC : CH2Cl2MeOH 85/15 : rf = 0,67
MS : MALDI-TOF : 568,1 (100) ; [M+Na]+ = 951,2 (33) ; [M+H]+ = 929,3 (31) ;
[M+35Cl]+ = 963,3 (16)
UV-Vis : DMF (350-750 nm). λ (nm) : 414 (Soret) ; 574 ; 622 ; 649
IV-5-2 Hydrolyse des groupements nitriles et préparation des métalloporphyrines (20)
Figure imgf000049_0001
Les réactions d'hydrolyse des groupements nitriles en acides carboxyliques sont effectuées généralement en milieu acide, comme par exemple dans les travaux de S. Gobbi et al [Gobbi S., Rampa A., Bisi A., Belluti F., Valenti P., Caputo A., Zampiron
A. and Carrara M., "Synthesis and Antitumor Activity of New Derivatives of Xanthen-9- one-4-acetic Acid", Journal of Médicinal Chemistry, 2002, 45, p. 4931 -4939/. Mais, dans le cas de la préparation des composés (20) où un substituant pyrrole, très sensible au milieu acide, est présent sur la molécule, l'hydrolyse est, avantageusement, effectuée en milieu basique [Cignarella G., Barlocco D., Rossi G. and Rossi E., "Spirocyclopropane Carboxylic Acids Derived from 1-Tetralone and 4-Chromanone and their Conversion to the Corresponding Pyridazinones", Synthesis, 1990, p. 160-162 ; Fϋrstner A., Stelzer F., Rumbo A. and Krause H., "Total Synthesis of the Turrianes and Evaluation of Their DNA-Cleaving Properties", Chemistry - A European Journal, 2002, 8, p. 1856-1871]. Tous les protocoles sont semblables : HO" comme base, mélange eau - alcool et chauffage à reflux. La seule différence repose sur la force de cette base déterminée en fonction du contre-cation utilisé (K+, Na+, Li+).
L'analyse par spectrométrie infra-rouge montre une totale disparition de la bande à
2228 cm"1, caractéristique des groupements nitriles.
Mode opératoire pour M = Co
Le composé (19)-Co (355 mg ; 0.4 mmol ; 1 eq) est dissous dans une solution de KOH (IN) dans du méthanol (2O mL). Le mélange réactionnel est chauffé à 50 0C pendant 24 heures, puis concentré à sec. Le produit est dissous dans de l'eau et de l'acétate d'éthyle est ajouté. Une solution de HCl (IN) est ajoutée jusqu'à neutralisation.
Lors de la neutralisation, le pH est contrôlé, pour éviter de polymériser le pyrrole.
Le produit est extrait avec de l'acétate d'éthyle et la phase organique est lavée avec de l'eau. Après concentration, le composé (2O)-Co (237 mg) est obtenu.
M (g.mol"1) : 969.93 (C56CoH42N6O7)
MS : MALDI-TOF : [(PorphyrinCN/COOH)+H+31]+ = 982,2 (100) ; [M+31]+ = 1000,2 (97) ; [M+H+31]+ = 1001,2 (86) ; [(PorphyrinCN/COOH-O-)+H]+ = 785,2 (86) ; [(PorphyrinCN/COOH)+31]+ = 981,2 (25) ; [(Porphyrin-O-)+H]+ = 804,2 (25) ; [M]+ = 969,2 (21) ; [(PoφhyrinCN/COOH)+H]+ = 951,2 (19) ; [M+H]+ = 970,2 (16) UV- Vis : DMF (350-750 m), λ (m) : 420 (Soret) ; 536 FTIR : υ (cm"1) : 3381 ; 2924 ; 1714 ; 1655 ; 1247 ; 1017 ; 952 ; 757 V- Synthèse d'une porphyrine di-cationique fonctionnalisée avec un pyrrole (26)
La voie de synthèse du monomère di-cationique (26) est présentée précédemment
SCHÉMA 15.
V-I Synthèse du 5-(4-pyridyl)dipyrrométhane (21)
La synthèse du 5-(4-pyridyl)dipyrrométhane peut être réalisée suivant différentes méthodes. Les conditions opératoires utilisées par J.-W. Ka et C-H. Lee [Ka J. -W. and Lee C-H., "Optimizing the synthesis of 5,10-disubstituted tripyrromethanes", Tetrahedron Letters, 2000, 41, p. 4609-4613] sont une agitation à température ambiante pendant 5 minutes, avec un rapport pyrrole/aldéhyde de 5/1 et en utilisant 0,1 équivalent de TFA. Le faible rendement de 35 %, qu'ils ont obtenu, provient de la protonation de l'hétérocycle azoté, ce qui diminue la quantité de catalyseur acide dans le milieu et donne de nombreux produits secondaires. D. Gryko et J. S. Lindsey [Gryko D. and Lindsey J. S., "Rational Synthesis of Meso-Substituted Porphyrins Bearing One Nitrogen Heterocyclic Group", Journal of Organic Chemistry, 2000, 65, p. 2249-2252] ont proposé un autre protocole, sans utiliser d'acide de Brônsted. Ils ont réalisé la synthèse du 5-(4-pyridyl)dipyrrométhane avec un rendement de 58 %, par chauffage à 85 °C pendant 15 heures d'un mélange pyrrole/aldéhyde 14/1.
Le 5-(4-pyridyl)dipyrrométhane (21) a été préparé en suivant les conditions opératoires présentées SCHÉMA 17, sans acide à haute température. SCHÉMA 17
Figure imgf000051_0001
V-2 Construction du cycle porphyrinique (22)
La construction du cycle porphyrinique a été réalisée selon les mêmes conditions opératoires, décrites précédemment par D. T. Gryko et M. Tasior (5-pyridyldipyrrométhane avec 5 équivalents de TFA pendant 30 minutes à température ambiante), en utilisant les deux aldéhydes différents : le composé (6) et le 4-méthoxybenzaldéhyde selon le SCHÉMA 18.
SCHÉMA 18
Figure imgf000052_0001
La porphyrine (22) souhaitée est ensuite isolée du mélange de trois porphyrines par chromatographie sur silice. La porphyrine a été caractérisée par spectrométrie de RMN. V-3 Déprotection de la fonction aminé
La fonction aminé de la porphyrine (23) est obtenue par déprotection avec 100 équivalents d'hydrazine (SCHÉMA 19).
SCHÉMA 19
Figure imgf000052_0002
La porphyrine (23) a été caractérisée par spectrométries de RMN et de masse MALDI, avec la présence d'un pic majoritaire correspondant à [M+H]+ à 720,3. V-4 Couplage peptidique entre la porphyrine aminée (23) et le dérivé acide carboxylique du pyrrole (1)
Le couplage peptidique de la porphyrine-amine (23) avec le pyrrole-acide (1) non- protégé est réalisé en présence de DCC / NHS (SCHÉMA 20), dans les mêmes conditions opératoires que pour les monomères précédents. SCHÉMA 20
Figure imgf000053_0001
Le couplage a été contrôlé par spectrométrie de RMN et de masse MALDI, avec la présence d'un pic majoritaire à 850,3 correspondant à [M+Na+H]2+ et d'un pic à 849,3 (87 %) correspondant à [M+Na]+.
V-5 Réactions de métallation et de perméthylation des groupements pyridyles
Comme pour le cas des monomères précédents, les réactions de métallation et de perméthylation peuvent être exécutées sans ordre de préférence, mais il est toujours préférable de méthyler dans un premier temps si l'on souhaite utiliser différents métaux. Il a donc été choisi d'opérer la réaction de perméthylation, puis de séparer différents lots pour différents métaux et enfin de métaller la porphyrine hydrosoluble. V-5-1 Méthylation
La réaction de perméthylation des deux groupements pyridyles est réalisée avec un large excès d'iodure de méthyle à 40 0C (SCHÉMA 21).
SCHÉMA 21
Figure imgf000054_0001
Pour rendre la porphyrine hydrosoluble, le composé di-iodé est passé sur une colonne
Dowex-CI" pour échanger les iodures en contre-anions chlorures. La réaction est quantitative.
Sous atmosphère, le composé (24) (26 mg ; 31 μmol ; 1 eq) est dissous dans du DMF (6 mL) et du iodométhane (0,4 mL ; 6.3 mmol ; 200 eq) est ajouté. Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 48 heures, puis concentré à sec puis dissous dans de l'eau. Le mélange est passé à travers une colonne d'échange d'ions résine Dowex-CI et lyophilisé. 57 mg de composé (25) est isolé.
M (g.mol"1) : 927,94 (C54H48Cl2N8O3) MS : MALDI-TOF : [M(-2C1)+Na]+ = 879,4 (100) ; [(Porphyrin-O-)(-2Cl)+H]+ = 692,3
(10)
UV-Vis : DMF (350-750 m), λ (nm) : 428 (Soret) ; 521 ; 559 ; 599 ; 655 V-5-2 Métallation
La métallation de la porphyrine est réalisée avec un très large excès de l'acétate du sel métallique désiré dans le DMF à 40 0C (SCHÉMA 22).
SCHÉMA 22
Figure imgf000055_0001
L'insertion du métal au sein du macrocycle a été vérifiée par spectrométrie UV- Vis, par un déplacement de la bande de Soret de 428 nm à 468 nm.
La séparation des sels métalliques restant de la métalloporphyrine hydrosoluble est réalisée par précipitation. En solution aqueuse, un excès d'anions hexafluorophosphates est additionné, ce qui entraîne la précipitation de la porphyrine. Après filtration, un passage sur une colonne Dowex-Cl" permet de récupérer une métalloporphyrine soluble avec des contre-anions chlorures. En fait, des contre-anions iodures suffisent à rendre la porphyrine insoluble en solution aqueuse. Ainsi, il peut être intéressant de ne pas passer la molécule (25) sur la colonne Dowex-Q", après la méthylation, pour gagner une étape.
Le composé (25) (47 mg ; 51 μmol ; 1 eq) et du Mn(acetate)2*4H2O séché (750 mg ; 3.1 mmol ; 100 eq) sont dissous dans du DMF (5 mL) sous argon. Le mélange réactionnel est chauffé à 50 0C pendant 48 heures, et concentré à sec. Le mélange est dissous dans de l'eau. Afin de précipiter la porphyrine, du NH4PF6 est ajouté. Après filtration et lavage avec de l'eau, le produit est dissous dans de l'eau. Le mélange passé à travers une colonne d'échangeur d'ions résine Dowex-Cl et lyophilisé. 35 mg de composé (26)-Mn est isolé. M (g.mol"1) : 980,86 (C54H46Cl2MnN8O3)
MS : MALDI-TOF : [M(-2C1)+Na-H]+ = 931,3 (100) ; [M(-2C1)+Na]+ = 932,3 (60) ; [M(no-metaUed)(-2CY)+NΑ]+ = 879,4 (60) ; [(Porphyrin-O-)(-2Cl)+H]+ = 759,3 (25) UV- Vis : DMF (350-750 m), λ (nm) : 429 ; 468 (Soret) ; 524 ; 573 ; 632
B. Caractérisations électrochimiques : On se référera aux Figures 1 à 7 annexées.
Figure 1 Voltamogrammes des méso-tétraméthyl-pyridiniumyl-porphyrines complexées avec différents métaux en milieux aqueux, en présence de 0,5M NaCl. Vitesse de balayage lOOmV/s.
Figure 2 Voltamogramme d'un film de polypyrrole fonctionnalisé par une porphyrine tri- cationique de zinc.
Figure 3 Voltamogramme d'un film de polypyrrole fonctionnalisé par une porphyrine tri- cationique de zinc après 12h en solution tampon. Figure 4 Voltamogramme d'un film de polypyrrole fonctionnalisé par une porphyrine tri- cationique cobalt.
Figure 5 Voltamogramme d'un film de polypyrrole fonctionnalisé par une porphyrine tri- cationique cobalt après 12h en solution tampon.
Figure 6 Voltamogramme d'un film de polypyrrole fonctionnalisé par une porphyrine tri- cationique de manganèse.
Figure 7 Copolymérisation avec la porphyrine de cobalt à 0,7 V.
Figure 8 : Polymérisation du monomère pyrrole fonctionnalisé avec la porphyrine diacide de Zinc à 900mV/ECS
Figure 9 : Voltamogramme d'un film de polypyrrole fonctionnalisé par une porphyrine diacide de Zinc
I- Porphyrines substituées sur les quatre positions méso par des groupements pyridinium et complexées par divers métaux.
Cette analyse électrochimique est effectuée en milieu aqueux en présence de 0,5M NaCl et la Figure 1 montre les voltamogrammes obtenus. Il apparait que suivant la nature chimique du métal le potentiel redox varie fortement sur une large gamme de potentiels qui s'étend de -0,9 V/ECS à + 0,9 V/ECS. On peut ainsi moduler l' électroactivité de la porphyrine, en fonction du métal utilisé, dans un large domaine de potentiels qui correspond à environ 2V, étant donné que suivant le métal complexant choisi, les potentiels redox sont extrêmement différents.
II- Analyses électrochimiques de porphyrines tri-cationiques supportées. Les analyses électrochimiques sont d'abord réalisées sur des macro-électrodes de
Platine, de 1 cm de diamètre. Différents essais de polymérisation à potentiel fixe de 0,9V sont réalisés avec les porphyrines de zinc, cobalt et manganèse de formule (10) :
Figure imgf000057_0001
en solution aqueuse de 0,5M de chlorure de sodium. Les films déposés sont analysés par voltamétrie cyclique dans une solution aqueuse 0,5M de chlorure de sodium. II- 1 Porphyrine de zinc
A une solution aqueuse 0,5M de chlorure de sodium de 3mM de monomère- métalloporphyrine de zinc de formule (10) est appliqué un potentiel de 0,9V pendant 30min. La charge déposée est de 2OmC. Le film déposé est analysé par voltamétrie cyclique dans une solution aqueuse 0,5M de chlorure de sodium (Figure 2). L'analyse du film montre un couple rédox réversible dont le potentiel d'oxydation est de +0,05V et le potentiel de réduction de -0,12V.
Par la suite, le film est laissé tremper 12 heures en solution aqueuse pour tester sa stabilité, puis analysé par voltamétrie cyclique dans une solution aqueuse 0,5M de chlorure de sodium (Figure 3). L'analyse du film montre la présence du système rédox relatif au polypyrrole aux mêmes potentiels que précédemment, soit à un potentiel d'oxydation de +0,08 V et un potentiel de réduction de -0,13V. Un deuxième couple rédox réversible est observé avec un potentiel d'oxydation est de +0,45V et un potentiel de réduction de +0,4OV.
II-2 Porphyrine de cobalt A une solution aqueuse 0,5M de chlorure de sodium de 12mM de monomère- métalloporphyrine de cobalt de formule (10) est appliqué un potentiel de 0,9V pendant 30min. La charge déposée est de 325mC. Le film déposé est analysé par voltamétrie cyclique dans une solution aqueuse 0,5M de chlorure de sodium (Figure 4). L'analyse du film montre un couple rédox réversible dont le potentiel d'oxydation est de +0,05V et le potentiel de réduction de -0,12V, qui correspond au système du polypyπOle.
Par la suite, le film est laissé tremper 12 heures en solution aqueuse pour tester sa stabilité, puis analysé par voltamétrie cyclique dans une solution aqueuse 0,5M de chlorure de sodium (Figure 5). L'analyse du film montre le couple rédox réversible du polypyrrole dont le potentiel d'oxydation est de +0,01V et le potentiel de réduction de - 0,13V, avec une meilleure électroactivité après hydratation. L'analyse du film montre également le signal électrochimique de la porphyrine de cobalt dont le potentiel d'oxydation est de +0,42 V et le potentiel de réduction de +0,35 V. On peut également deviner les deux systèmes Co(I)/Co(II) et Co(II)/Co(III) sous la vague d'oxydation à +0,42V. II-3 Porphyrine de manganèse
A une solution aqueuse 0,5M de chlorure de sodium de 4mM de monomère- métalloporphyrine de manganèse de formule (lθ)est appliqué un potentiel de 0,9V pendant 30min. La charge déposée est de 4OmC. Le film déposé est analysé par voltamétrie cyclique dans une solution aqueuse 0,5M de chlorure de sodium (Figure 6). L'analyse du film montre le signal électrochimique du polypyrrole dont le potentiel d'oxydation est de +0,07. L'analyse du film montre également le couple rédox réversible de la porphyrine de manganèse dont le potentiel d'oxydation est de -0,22V et le potentiel de réduction de -0,29V.
II-4 Etude sur puces La porphyrine de cobalt de formule (10), en solution à 5OmM, est copolymérisée à un potentiel fixe de 0,7V en présence de 3-(hydroxyéthyl)pyrrole, en solution à 5OmM (Figure 7). Les tests de polymérisation et d'analyses sont effectués sur des puces à électrodes de carbone constituées de huit plots, avec une solution à 40OmM de chlorure de sodium et à 10OmM perchlorate de lithium. On observe plusieurs vagues de polymérisation. La courbe de polymérisation présentée Figure 7 montre que le copolymère se dépose sur l'électrode.
II-5 Electropolymérisation d'une porphyrine di-anionique fonctionnalisée avec un pyrrole (2O)-Zn
Une solution aqueuse de monomère pyrrole fonctionnalisé avec la porphyrine diacide de Zinc (2O)-Zn est obtenue avec une concentration approximative de 2 mM. Le monomère est électropolymérisé par application d'un potentiel fixe de 900 mV/ECS dans une solution aqueuse de monomère, contenant 500 mM de NaCl et de la soude, en utilisant une électrode de platine de 7 mm . La courbe de polymérisation est présentée Figure 8.
La charge finale déposée à la surface de l'électrode de platine est de 6 mC.cm"2. L'analyse de cette surface (Figure 9) est ensuite effectuée dans une solution aqueuse sans monomère contenant 0.5M de NaCl (vitesse de balayage lOOmV/s). Le voltamogramme présenté Figure 9 présente deux vagues à 644 mV/ECS et à 257 mV/ECS correspondant à l'oxydo-réduction du polypyrrole.

Claims

REVENDICATIONS :
1 - Monomère électropolymérisable, destiné à être polymérisé en solution aqueuse, comportant :
- un motif électropolymérisable choisi parmi l'acétylène, les pyrroles, les thiophènes, les indoles, les anilines, les azines, les p-phénylènevinylènes, les p-phénylènes, les pyrènes, les furanes, les sélénophènes, les pyrridazines, les carbazoles, les acrylates, les méthacrylates et leurs dérivés, et une métallo-porphyrine substituée par au moins deux entités ionisées ou ionisables en solution aqueuse. 2 - Monomère selon la revendication 1, caractérisé en ce que la métalloporphyrine est substituée par trois entités ionisées ou ionisables en solution aqueuse.
3 - Monomère selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est soluble dans l'eau distillée, au moins jusqu'à une concentration de 1OmM, de préférence au moins jusqu'à une concentration de 3OmM. 4 - Monomère selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la métallo-porphyrine est substituée par au moins deux entités ionisées ou ionisables en solution aqueuse, situées en position méso de la métallo-porphyrine.
5 - Monomère selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les entités ionisées ou ionisables comprennent une fonction ionisée, ou ionisable dans une solution aqueuse qui présente un pH compris entre 3 et 8, choisie parmi les fonctions : ammonium, polyamine, acide carboxylique, acide phosphonique, acide sulfonique et phosphate.
6 - Monomère selon la revendication 5, caractérisé en ce que deux des entités ionisées ou ionisables substituant la métallo-porphyrine comprennent un groupement N-méthylpyridinium sous forme de sel ou une fonction -COOH.
7 - Monomère selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que deux des entités ionisées ou ionisables substituant la métallo-porphyrine sont identiques.
8 - Monomère selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que la métallo-porphyrine est substituée par au moins deux entités ionisées ou ionisables en solution aqueuse différentes. 9 - Monomère selon la revendication 8, caractérisé en ce que la métalloporphyrine, et en particulier l'une de ses positions méso, est substituée par un ligand biologique, de préférence choisi parmi les polynucléotides et, notamment, les oligonucléotides, les polypeptides, les protéines, les antigènes, les anticorps, les haptènes, les oligosaccharides et la biotine, les polynucléotides étant préférés.
10 - Monomère selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la liaison entre le motif électropolymérisable et la métallo-porphyrine se fait par l'intermédiaire d'un bras espaceur.
11 - Monomère selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la liaison entre le motif électropolymérisable et la métallo-porphyrine se fait en position méso de la métallo-porphyrine.
12 - Monomère selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le motif électropolymérisable est un pyrrole.
13 - Monomère selon la revendication 12, caractérisé en ce que la liaison entre le pyrrole et la métallo-porphyrine est assurée en position 3 du pyrrole.
14 - Monomère selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la métallo-porphyrine est également substituée par un ou plusieurs groupes donneurs ou attracteurs d'électrons.
15 - Monomère selon la revendication 14, caractérisé en ce que le(s) groupe(s) donneur(s) ou attracteur(s) d'électrons est (sont) choisi(s) parmi : les atomes d'halogène, les groupes cyano, nitro, (Ci-C4)alkyle (C1-C4)alcényle, (C1-C4)alcynyle et (Ci-C4)alcoxy.
16 - Monomère selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que le métal de la métallo-poφhyrine est un métal de transition, ou Mg, Al, Sn ou Ge. 17 - Monomère selon la revendication 16, caractérisé en ce que le métal est choisi parmi : Co, Ni, Mg, Fe, Zn, Mn, Pd, Cu, Pt, V, Mo, Al, Sn et Ge, Co, Zn et Mn étant préférés.
18 - Monomère selon l'une des revendications I à 8 ou l0 à l7, caractérisé en ce qu'il ne comporte pas de ligand biologique. 19 - Monomère de formule (I)
Figure imgf000062_0001
dans laquelle : - les groupes R1, R2 et R3 représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un groupe ionisé ou ionisable en solution aqueuse, ou un ligand biologique, étant entendu qu'au moins deux des groupes Ri, R2 et R3, identiques ou différents, représentent un groupe ionisé ou ionisable,
- Ai, A2 et A3 représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un bras espaceur, notamment choisi parmi les enchaînements suivants : o -(CH2)ni- avec ni qui représente un entier compris dans la gamme allant de
0 à 5, o -(CH2-CH2-O)112- avec n2 qui représente un entier compris dans la gamme allant de 1 à 5,
Figure imgf000062_0002
avec n3 qui représente un entier compris dans la gamme allant de 1 à 5,
Figure imgf000062_0003
- les groupes Ra, Rb, Rc, Rd, Re, R ou Rf, Rg et Rh représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un groupe donneur d'électrons ou un groupe attracteur d'électrons,
- X représente un bras espaceur, notamment choisi parmi les enchaînements suivants : o -(CH2)mi- avec ml qui représente un entier compris dans la gamme allant de 1 à 6,
Figure imgf000063_0001
représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un entier compris dans la gamme allant de 1 à 3 et R' qui représente un atome d'hydrogène ou un groupe (Cj-C4)alkyle, o -(CH2-CH2-O)m4- avec m4 qui représente un entier compris dans la gamme allant de 1 à 3, o une chaîne polypeptide comportant de 1 à 3 acides aminés, o -(CH=CH)m5- avec m5 qui représente un entier compris dans la gamme allant de 1 à 3,
- M est un métal de transition, ou Mg, Al, Sn ou Ge, et
- R représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, éthyle ou méthoxy.
20 - Monomère de formule (I) selon la revendication 19 caractérisé en ce qu'au moins deux des groupes R1, R2 et R3 chacun indépendamment, comprennent ou représentent, une fonction ionisée ou ionisable dans une solution aqueuse qui présente un pH compris entre 3 et 8, choisie parmi les fonctions : ammonium, aminé, polyamine, acide carboxylique, acide phosphonique, acide sulfonique et phosphate.
21 - Monomère de formule (I) selon la revendication 19 ou 20, caractérisé en ce qu'un seul des groupes R1, R2 ou R3, de préférence R3, représente un ligand biologique choisi parmi les polynucléotides et notamment les oligonucléotides, les polypeptides, les protéines, les antigènes, les anticorps, les haptènes et la biotine.
22 - Monomère de formule (I) selon l'une des revendications 19 à 21, caractérisé en ce qu'au moins un des groupements R1, R2 et R3 est un N- méthylpyridinium sous forme de sel ou -COOH. 23 - Monomère de formule (I) selon l'une des revendications 19 à 22, caractérisé en ce que -Ai-Ri = -A2-R2.
24 - Monomère de formule (I) selon la revendication 23, caractérisé en ce que -Ai-Ri = -A2-R2= JV-méthylpyridinium sous forme de sel ou :
Figure imgf000064_0001
25 - Monomère de formule (I) selon l'une des revendications 19, 20 ou 22 à 24, caractérisé en ce que -A3-R3 représente un groupe :
Figure imgf000064_0002
26 - Monomère de formule (I) selon l'une des revendications 19, 20 ou 22 à 24, caractérisé en ce que -Ai-Ri = -A2-R2 = -A3-R3.
27 - Monomère de formule (I) selon la revendication 26, caractérisé en ce que -Ai-Ri = -A2-R2= -A3-R3 = iV-méthylpyridinium sous forme de sel.
28 - Monomère de formule (I) selon la revendication 19 ou 20, caractérisé en ce qu'au moins deux des groupes Ri, R2 et R3, chacun indépendamment, représentent une fonction aminé ou acide carboxylique.
29 - Monomère susceptible d'être obtenu à partir d'un monomère selon la revendication 28, par couplage sur une fonction aminé ou acide carboxylique présente sur la métalloporphyrine, d'un ligand biologique choisi parmi les polynucléotides et, notamment, les oligonucléotides, les polypeptides, les protéines, les antigènes, les anticorps, les haptènes et la biotine.
30 - Monomère de formule (I) selon l'une des revendications 19 à 29, caractérisé en ce que la liaison entre le pyrrole et la métallo-porphyrine est assurée en position 3 du pyrrole.
31 - Monomère de formule (I) selon l'une des revendications 19 à 30, caractérisé en ce que R représente un atome d'hydrogène.
32 - Monomère selon l'une des revendications 19 à 31, caractérisé en ce que Ra = Rb = R0 = Rd = Re = Rf = Rg = Rh = H.
33 - Monomère de formule (I) selon l'une des revendications 19 à 32, caractérisé en ce qu'au moins un des groupes Ra, Rb, R0, Rd, Re5 Rf, Rg et Rh représente un groupe donneur ou attracteur d'électrons choisi parmi : les atomes d'halogène, les groupes cyano, nitro, (Ci-C4)alkyle, (Ci-C4)alcényle, (Ci-C4)alcynyle et (C1- C4)alcoxy.
34 - Monomère de formule (I) selon l'une des revendications 19 à 33, caractérisé en ce que le métal de la métallo-porphyrine est choisi parmi Co, Ni, Mg, Fe, Zn, Mn, Pd, Cu, Pt, V, Mo, Al, Sn et Ge.
35 - Monomère de formule (I) selon la revendication 34, caractérisé en ce que M est choisi parmi : Co, Zn et Mn.
36 - Monomère de formule (I) selon l'une des revendications 19 à 35 caractérisé en ce que X représente un groupe :
Figure imgf000065_0001
37 - Monomère de formule (I) selon l'une des revendications 19, 20 ou 22 à 28 ou 30 à 36, caractérisé en ce qu'il ne comporte pas de ligand biologique.
38 - Utilisation d'au moins un monomère selon l'une des revendications 1 à 37, pour la fabrication d'une sonde électrochimique par électropolymérisation. 39 - Utilisation selon la revendication 38, caractérisée en ce que l 'électropolymérisation est réalisée avec un monomère selon l'une des revendications I à l7 ou l9 à 36 porteur d'un ligand biologique.
40 - Sonde électroactive sous la forme d'un homopolymère conducteur susceptible d'être obtenue par électropolymérisation d'un monomère porteur d'un ligand biologique selon l'une des revendications I à l7 ou l9 à 36.
41 - Sonde électroactive sous la forme d'un copolymère conducteur susceptible d'être obtenue par copolymérisation entre au moins deux monomères différents, l'un au moins des monomères étant porteur d'un ligand biologique, caractérisé en ce que l'un au moins des monomères mis en œuvre est tel que défini à l'une des revendications 1 à 37.
42 - Sonde électroactive selon la revendication 41, caractérisée en ce que la copolymérisation met en œuvre un monomère porteur d'un ligand biologique selon l'une des revendications 1 à 17 ou 19 à 36 et m autre monomère selon la revendication 18 ou 37. 43 - Sonde électroactive selon l'une des revendications 40 à 42, caractérisée en ce que la copolymérisation met en œuvre au moins deux monomères selon l'une des revendications 1 à 37 dans lesquels le métal est différent.
44 - Sonde électroactive selon l'une des revendications 40 à 43, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins deux ligands biologiques différents.
45 - Sonde électroactive selon l'une des revendications 40 à 44, caractérisée en ce que tous les monomères mis en jeu ont un pyrrole comme motif électropolymérisable.
46 - Sonde électroactive selon la revendication 45, caractérisée en ce que la copolymérisation est réalisée entre un monomère porteur d'un ligand biologique selon l'une des revendications 1 à 17 ou 19 à 36 et un pyrrole non substitué ou un pyrrole-3- alcanol.
47 - Sonde électroactive selon la revendication 46, caractérisée en ce que la copolymérisation est réalisée entre un monomère selon l'une des revendications 18 ou 37, un pyrrole non substitué ou un pyrrole-3-alcanol et un pyrrole porteur en position 3 d'un ligand biologique.
48 - Procédé de détection d'au moins un ligand cible dans un échantillon biologique, dans lequel on met en contact l'échantillon avec une sonde électroactive selon l'une des revendications 40 à 47 porteuse d'au moins un ligand sonde, dans des conditions appropriées pour l'interaction ligand sonde/ligand cible et on met en évidence et, éventuellement, on quantifie, la différence de potentiel ou de courant émis par la sonde avant et après mise en contact avec l'échantillon.
49 - Electrode comprenant un support conducteur dont tout ou partie de la surface est revêtue d'une sonde selon l'une quelconque des revendications 40 à 47. 50 - Procédé de polymérisation, caractérisé en ce que la polymérisation est réalisée par électropolymérisation en phase aqueuse à partir d'au moins un monomère selon l'une des revendications 1 à 37.
51 - Procédé de polymérisation selon la revendication 50, caractérisé en ce que la polymérisation est une copolymérisation qui met en œuvre au moins deux monomères selon l'une des revendications 1 à 37 dans lesquels le métal est différent.
52 - Polymère susceptible d'être obtenu selon le procédé de polymérisation défini à la revendication 50 ou 51.
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