JP2006518334A - オリゴヌクレオチドで置換されたピロール - Google Patents
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Abstract
-(CH2)n-O-、-(CH2)<SB>P</SB>O-[(CH2)2-O]q-、-(CH2)r;-CO-NR’-(CH2)r-O-、
-(CH2)r-NCH3-(CH2)r-O-、-(CH2)r-CO-NR’-[(CH2)2-O]s-、
-(CH2)r-NCH3-[(CH2)2-O]<SB>S</SB>から選ばれたスペーサーアームであり、R’はH又は
-CH3であり、nは1〜5の整数であり、pは1〜2の整数であり、qは1〜4の整数であり、rは1〜3の整数であり、r’は1〜3の整数であり、sは1〜3の整数であり、n、p、q、r、r’及びsは同一であるか異なるものであり、ピロール環は2-、3-、4-又は5-位で置換されている。
Description
WO-A1-95/29199、Garnier等(Synthetic Metals、100:89-94、1999)、Ho-Hoang等
(Synthetic Metals、62:277-280、1994)、Ho-Hoang等(J. Mater,Chem.,6(7),1107-
1112,1996)及びKorri-Youssoufi等(Materials Science and Engineering,C15,265-
268,2001)に記載されている。更に、種々のアンチリガンド(antiligand)をポリピロールによって担持されている官能基上にグラフトし得る。
Xは-(CH2)n-O-、-(CH2)p-O-[(CH2)2-O]q-、-(CH2)r-CO-NR’-(CH2)r’-O-、
-(CH2)r-NCH3-(CH2)r’-O-、-(CH2)r-CO-NR’-[(CH2)2-O]s-、-(CH2)r-NCH3-[(CH2)2-O]s-
から選ばれたスペーサーアームを表し、
R’は-H又は-CH3を表し、
nは1〜5の整数であり、
pは1〜2の整数であり、
qは1〜4の整数であり、
rは1〜3の整数であり、
r’は1〜3の整数であり、
sは1〜3の整数であり、
n、p、q、r、r’及びsは同一であるか異なるものであり、ピロール環は2-、3-、4-又は5-位で置換されている。
(phosphorylated group)によりスペーサーアームの酸素原子に連結されている。オリゴヌクレオチドは2−70個の、好ましくは、20個のヌクレオチドからなることが有利である。
a) 一般式(II)で表される、本発明に従ったオリゴヌクレオチド置換ピロールから選ばれた少なくとも1種のモノマーを準備する工程、
b) 他のピロールと共重合し得る置換ピロールから選ばれた少なくとも1種のモノマーを準備する工程、
c) 工程a)のモノマーを工程b)のモノマーと電気化学的に共重合させる工程、
からなるオリゴヌクレオチドで官能性化された導電性、電気的活性共重合体の製造方法である。
zation”)、“電気化学的共重合”(“electrochemical copolymerization”)及び“電気化学的重合”(“electrochemical polymerization”)という用語は、電気化学的プロセスによる重合を意味する。電気的重合法は当業者に周知である。例えば、サイクリックボルタンメトリー(cyclic voltammetry)、クロノポテンショメトリー(chronopotentiometry)
(負荷電流)及びクロノアンペロメトリー(chronoamperometry)(負荷電位)の技術が挙げられる。本発明の特定に態様においては、沈着(deposite)はクロノアンペロメトリー又は制御された電位沈着(potential deposition)により行われる。この方法は電位におけるサージ(surge)を平衡電位(ゼロ電流)から、電極で反応の生起する一定の値まで負荷し(impose)、時間の関数としての電流を測定することからなる。
Garnier等(Synthetic Metals、100:89-94、1999)、Ho-Hoang等(Synthetic Metals、62:277-280、1994)、Ho-Hoang等(J. Mater,Chem.,6(7),1107-1112,1996)及びKorri-
Youssoufi等(Materials Science and Engineering,C15,265-268,2001)が挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチド置換ピロールと、オリゴヌクレオチドを担持していない基で置換されているピロールとの共重合により、共重合反応中に立体障害を減少させることができる。
a) 他のピロールと重合し得る置換ピロールから選ばれた少なくとも1種のモノマーを準備する工程、
b) 工程a)のモノマーを電気化学的に重合させて第1の導電性、電気的活性重合体を製造する工程、
c) 一般式(II)のオリゴヌクレオチド置換ピロールから選ばれたモノマーを準備する工程、
d) 他のピロールと重合し得る置換ピロールから選ばれた少なくとも1種のモノマーを準備する工程、
e) 工程c)のモノマーと工程d)のモノマーとを、工程b)で形成された第1の導電性、電気的活性共重合体上で電気化学的に共重合させて、オリゴヌクレオチドで官能性化された導電性、電気的活性共重合体を製造する工程、
からなるオリゴヌクレオチドで官能性化された導電性、電気的活性共重合体の製造方法に関する。
a) 他のピロールと重合し得る置換ピロールから選ばれた少なくとも1種のモノマーを準備する工程、
b) 工程a)のモノマーを電気化学的に重合させて第1の導電性、電気的活性重合体を製造する工程、
c) 一般式(II)のオリゴヌクレオチド置換ピロールから選ばれたモノマーを準備する工程、
d) 工程c)のモノマーを、工程b)で形成された第1の導電性、電気的活性重合体上で電気化学的に重合させて、オリゴヌクレオチドで官能性化された導電性、電気的活性重合体を製造する工程、
からなるオリゴヌクレオチドで官能性化された導電性、電気的活性共重合体の製造方法に関する。
a) 他のピロールと重合し得る置換ピロールから選ばれた少なくとも1種のモノマーを準備する工程、
b) 工程a)のモノマーを電気化学的に重合させて第1の導電性、電気的活性重合体を製造する工程、
c) 一般式(III)のオリゴヌクレオチド置換ピロールを準備する工程、
d) 工程c)の置換ピロールを、工程b)で形成された第1の導電性、電気的活性重合体上で電気化学的にカップルさせて、オリゴヌクレオチドで官能性化された導電性、電気的活性共重合体を製造する工程、
からなるオリゴヌクレオチドで官能性化された導電性、電気的活性共重合体の製造方法に関する。
a) 本発明のオリゴヌクレオチドで官能性化された導電性、電気的活性共重合体又は本発明のオリゴヌクレオチドで官能性化された導電性、電気的活性共重合体で被覆された導電性支持体からなる電極を準備する工程、
b) 工程a)の電気的活性共重合体又は電極と試料とを、検体と上記オリゴヌクレオチドとの特異的な相互作用に適当な条件下で接触させる工程、
c) 上記オリゴヌクレオチドと結合した検体を電気的測定により検出する工程、
からなる、試料中の検体の検出方法である。
(sweep)ことからなる方法である。得られたボルトアンペログラム(voltamperogram)は、検討している電気化学的系の、電流としての応答を与え、その特徴付けを可能にする。
(式中、R2はアミン保護基である)で表される置換ピロールである。種々のアミン保護基を本発明の置換ピロールで使用し得る。これらのアミン保護基は当業者には周知である
(Kocienski P.J.,Thieme Publishing Group,1994;Hanson J.R.,Protecting Groups
in Organic Synthesis,Continuum International Publishing Group)。アミン保護基はモノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トシル、トリイソプロピルシリル、tert-ブトキシカルボニル、9-フルオレニルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル及びアセチルから選ばれることが好ましい。
-(CH2)r-NCH3-(CH2)r’-O-、-(CH2)r-CO-NR’-[(CH2)2-O]s-、-(CH2)r-NCH3-[(CH2)2-O]s-
から選ばれたスペーサーアームを表す;
R’は-H又は-CH3を表す;
nは1〜5の整数である;
pは1〜2の整数である;
qは1〜4の整数である;
rは1〜3の整数である;
r’は1〜3の整数である;
sは1〜3の整数である;
n、p、q、r、r’及びsは同一であるか異なるものである;ピロール環は2-、3-、4-又は5-位で置換されている。
(式中、R2はアミン保護基である)の置換ピロールに関する。R2はモノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トシル、トリイソプロピルシリル、tert-ブトキシカルボニル、9-フルオレニルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル及びアセチルから選ばれることが好ましい。
-(CH2)r-NCH3-(CH2)r’-O-、-(CH2)r-CO-NR’-[(CH2)2-O]s-、-(CH2)r-NCH3-[(CH2)2-O]s-
から選ばれたスペーサーアームを表す;
R’は-H又は-CH3を表す;
nは1〜5の整数である;
pは1〜2の整数である;
qは1〜4の整数である;
rは1〜3の整数である;
r’は1〜3の整数である;
sは1〜3の整数である;
n、p、q、r、r’及びsは同一であるか異なるものである。
(式中、R2は、好ましくは、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トシル、トリイソプロピルシリル、tert-ブトキシカルボニル、9-フルオレニルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル及びアセチルから選ばれたアミン保護基である;
R3は遊離の水酸基と反応し得るリン含有基である。R3はホスホトリエステル、H-ホスホネート又はホスホルアミダイト基から選ばれることが好ましい;
Xは-(CH2)n-O-、-(CH2)p-O-[(CH2)2-O]q-、-(CH2)r-CO-NR’-(CH2)r’-O-、
-(CH2)r-NCH3-(CH2)r’-O-、-(CH2)r-CO-NR’-[(CH2)2-O]s-、-(CH2)r-NCH3-[(CH2)2-O]s-
から選ばれたスペーサーアームを表す;
R’は-H又は-CH3を表す;
nは1〜5の整数である;
pは1〜2の整数である;
qは1〜4の整数である;
rは1〜3の整数である;
r’は1〜3の整数である;
sは1〜3の整数である;
n、p、q、r、r’及びsは同一であるか異なるものである)で表される。。
a) オリゴヌクレオチドを合成するためのサイクルを行う工程、
b) 上記オリゴヌクレオチドを合成するための最終サイクルにおいて、一般式(IV)
(式中、R2、R3及びXは前記の意義を有する)で表される置換ピロールを、上記オリゴヌクレオチドの最終ヌクレオチドにおいて、5’位又は3’位で置換する工程、
c)前記保護基R2を開裂させる工程;
からなる、一般式(I)
(式中、R1、X及びYは、前記の意義を有する)のオリゴヌクレオチド置換ピロールの製造方法からなる。
(IV)の置換ピロールで置換する。
(ホスホジエステル、ホスホルアミダイト、H-ホスホネート)と反応させる。
図面の説明
図1:1-[N-(トシル)]-3-[7-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミジチ ル)ヒドロキシエチル]の結合の前及び後の、5’ OHオリゴヌクレオチドのクロマトグラム
オリゴヌクレオチドの図1 A 配列:
5’ ttt ttt ttt ttg cct tga cga tac agc ta、滞留時間(Rt):14.87分
オリゴヌクレオチドの図1B 配列:
5’ ピロール トシル-ttt ttt ttt ttg cct tga cga tac agc ta、Rt:16.35分
2個のオリゴヌクレオチドの図1C コインジェクション(coinjection)
(Rt:15.07分及び17.40分)
オリゴヌクレオチドの図2 A 配列:
5’ ピロール トシル-ttt ttt ttt ttg cct tga cga tac agc ta、Rt:14.9分
オリゴヌクレオチドの図2 B 配列:
5’ ピロール トシル-ttt ttt ttt ttg cct tga cga tac agc ta (20%)、Rt:15.25分
5’ ピロール-ttt ttt ttt ttg cct tga cga tac agc ta (80%)、Rt:13.48分:
55℃の0.5M NaOH溶液中で24時間後
オリゴヌクレオチドの配列:5’ ピロール-ctc ggg aat ctc aat gtt ag、Rt:17.6分。
図5:モノマーを含まない電解質中に移行させた3-(ヒドロキシエチル)ピロールの重合体フィルムで変性された電極についてのサイクリックボルタンメトリー曲線
図6:白金電極上での、ピロール−3位のODNの5μM溶液におけるサイクリックボルタンメトリーの最初のサイクル
図7:モノマーを含まない電解質溶液中に移行させた、3-(ヒドロキシエチル)ピロールのプレフィルム上での、ピロール−3位のODNのフィルムで変性された電極についてのサイクリックボルタンメトリー曲線
図8:種々の媒体に曝露された変性電極の電気化学的信号の変性
図9:モノマーを含まない電解質溶液中に移行させたプレフィルム上での、共重合体で変性された電極についてのサイクリックボルタンメトリー曲線
図10:種々の媒体に曝露された変性電極の電気化学的信号の変性
図11:種々の媒体に曝露された共重合体で変性された電極の電気化学的信号の変性
Materials Science and Engineering C15 (2001) 265-268に記載されるごとく行った。第1工程においては、1-(N-トシル)ピロールを、強塩基、カリウム tert-ブトキシドの存在下、塩化トシルを使用してピロールから合成した。ついで、1-(N-トシル)ピロールを無水酢酸でアシル化して1-トシル-3-アセチルピロールを製造し、これをモンモリロナイトの存在下、硝酸タリウムを使用して、酸化転位(oxidative transposition)によりメチル 2-[3-(1-N-トシルピロール)]アセテートに転化した。ボラン ジメチル スルフィドを使用して、温和な条件下で還元して、所望の生成物、1-(N-トシル)-3-(ヒドロキシエチル)ピロールを得た。反応の全体的収率は21.8%であった。
1-[N-(p-モノメトキシトリチル)]-3-(ヒドロキシエチル)ピロールは下記の合成法によって得られた。
1-[N-(p-モノメトキシトリチル)]-3-(ヒドロキシエチル)ピロールの1H NMR:
1-[N-(トシル)]-3-[7-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミジチル)ヒドロキシエチル]ピロールは下記の合成法によって得られる。
DIPEA(ジイソプロピルエチルアミン)を添加した。クロロホスフィン(48μl,72mg,
275μmol,1.1当量)を滴下し、全混合物を撹拌しながら、5分間、放置した。反応混合物を回転蒸発器でその容量の1/2まで濃縮しついでシクロヘキサン/トリエチルアミン(99:1)混合物中に注入されたシリカゲルカラム上に通送し、シクロヘキサンで洗浄した。ついで、生成物をシクロヘキサン/酢酸エチル(80:20)混合物で溶離した。適切なフラクションを一緒にし、濃縮した。得られた黄色油状物をアセトニトリルに溶解させ、ミレックス
(Millex) PVDF 0.22μmフィルターを通過させてろ過しついで再度、濃縮して67mg(144
μmol、77%)の生成物を得た。
1-[N-(p-モノメトキシトリチル)]-3-[7-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミジチル)ヒドロキシエチル]ピロールの合成は下記の反応図に従って行った。
330μmol,1.1当量)を滴下し、全混合物を撹拌しながら、5分間、放置した。反応混合物を回転蒸発器でその容量の1/2まで濃縮しついでシクロヘキサン/トリエチルアミン(99:1)混合物中に注入されたシリカゲルカラム上に通送し、シクロヘキサンで洗浄した。ついで、生成物をシクロヘキサン/酢酸エチル(90:10)混合物で溶離した。適切なフラクションを一緒にし、濃縮した。得られた黄色油状物をアセトニトリルに溶解させ、ミレックス
PVDF 0.22μmフィルターを通過させてろ過し、ついで再度、濃縮して120mg(205μmol、68%)の生成物を得た。
1-(N-トシル)-3-[2-(トリエチルオキシ)ヒドロキシルエチル]ピロールは下記の反応図に従って合成した。
1-(N-トシル)-2-(ヒドロキシエチル)ピロールは下記の反応図に従って合成した。
Beaucage及びLyerにより記載されたホスホルアミダイト法(Tetrahedron 48,223-2311,1992)により固体支持体(調節気孔ガラス、CPG)上でオリゴヌクレオチドを合成した。
合成の最終サイクルは、実施例3にその合成が記載されているピロールモノマー、
1-[N-(トシル)]-3-[7-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミジチル)ヒドロキシエチル]ピロールを使用して行った。このモノマーを慣用のヌクオレチド合成
(synthon)と全く同一の条件下で使用した;唯一の相違はカップリング時間であり、この時間は結合(組み込み)(incorporation)において生じ得る問題を考慮して、1.3分の代わりに15分にした。反応工程図は以下に示す。30%アンモニア水溶液中で脱保護した後(55℃、16時間)、粗オリゴヌクレオチドをイオン交換HPLCにより分析した(図1)。図1は、結合を示すために、ピロールを伴なったオリゴと伴なわないオリゴのコインジェクション
(coinjection)を表す[20分で400〜640mM NaClの勾配、Gen Pack Fax(登録商標)カラム
(Waters;登録商標)、0.75ml/分]。
トシル基は2.5M 水酸化ナトリウム溶液中では、75℃で、4時間で除去されるが、これらの条件下では、オリゴヌクレオチドが完全に分解される。従って、本発明者は、オリゴヌクレオチドの分解を防止し、同時に、ピロールによって担持されているトシル基の80%が開裂するようにするために、より温和な加水分解条件(0.5M NaOH溶液、55℃、24時間)を使用した。かくして、HPLCにより、2個のオリゴヌクレオチドを分離し、完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを単離することができた(図2)。図2は0.5M NaOH溶液、55℃でのトシル基の開裂を示している[20分での、440〜680mM NaClの勾配、Gen Pack Fax(登録商標)カラム(Waters;登録商標)、0.75ml/分]。
合成の最終サイクルは、実施例4にその合成が記載されているピロールモノマーを使用して行った。このモノマーを慣用の塩基と全く同一の条件下で使用した;唯一の相違はカップリング時間であり、この時間は結合において生じ得る問題を考慮して、1.3分の代わりに15分にした。
モノメトキシトリチル化モノマーを使用することの大きな利点は、これをオリゴヌクレオチドの精製に使用し得ること及びこれを酸性媒体中で容易に除去し得ることである。従って、これはトシル基と比較して好ましいであろう。
[CTGen MDP−WS 1000(登録商標)カラム]。この装置系はOPC(登録商標)カートリッジ
[Applied Biosystems(登録商標)]に類似しており、この系においてはMMT基を担持しているオリゴヌクレオチドを逆相上に特異的に滞留し、これに対し、MMTを担持していない不純物を液相中に溶離する。
(Waters)上でのイオン交換クロマトグラフィーにより調節した(図3)。図3は3位で置換されているピロールを担持しているかつMMTを担持しているモノマーから合成された精製オリゴヌクレオチドを表す(20分において、340〜580mMのNaClの勾配、ゲン パック ファックスカラム(Waters)、0.75ml/分)。
その純度はトシル化モノマーを使用して得られるものより明らかに大きい。
操作は、全て、水性媒体中で、オートラブ(Autolab) PGSTAT 100(登録商標)ポテンシオスタットに連結された三電極電気化学的集成体を使用して行った。この装置は、参照電極と作動電極の間に一定の電位差を生じさせ、対向電極は、セルの電気的特性に関係なく、作動電極と参照電極の間で所望の安定な電位差が得られるように、電流を調節する働きをする。操作は水性媒体中で行われるので、使用される電極は下記通りである:参照電極=飽和カロメル電極(SCE)、対向電極=白金ワイアー及び作動電極=直径1mmの白金ディスク。
(1) H 2 O中のLiClO 4 電解質
過塩素酸リチウムは検討している溶液中で使用されている電解質である。生成物は、蒸留水に容易に溶解する粉末の形である(モル質量 106.39 g/モル)
LiClO4電解液=H2O中、0.5M
LiClO 4 電解液=H 2 O中、0.5M。
ODN(オリゴヌクレオチド)は下記の配列を有する:
5’ GCCTTGACGATACAGCTA 3’
3-(ヒドロキシエチル)ピロール=0.1M
[ピロール-ODN]=5μM
LiClO4=H20中、0.5M
[ピロール-ODN]=5μM
LiClO4=H20中、0.5M
1X HBはハイブリダイゼーション溶液として使用される電解液媒体である。この溶液は下記の組成を有する:
−9.5mMホスフェートバッファー
−0.515 M NaCl
−2.6 mM KCl
−0.048% トゥイーン(Twenn)
−1Xデンハルト(1X Denhardt’s)
−10μg/mlサルモン(salmon) DNA
例えば下記の配列: 5’ CGCCAGCAGCTCCAA 3’の非相補的標的オリゴヌクレオチドを1X HB中、0.1μMの濃度で使用した。
ポリピロールフィルム中で固定されたODNに対して相補的なオリゴヌクレオチドを1X HB中、0.1μMの濃度で使用した。
5’ TAGCTGTATCGTCAAGGC 3’
本発明の重合体は、特に、試料中に存在し得るかつ重合体鎖上に存在するODNと反応することのできる生物学的に活性な種を検出するのに使用し得る。特に、後記するごとく、その複素環の3位で官能化された共役重合体は、1種又はそれ以上のリガンドとの反応の後には、生物学的媒体のリガンドと反応させていない参照重合体と比較して、酸化電位の変化によって目視される電気化学的応答の変化を示す。重合体の電気化学的信号におけるこの変化によりセンサー機能が付与され、かくして、一定の電流での電位の変化により、又は、一定の電位での電流の変化により、生物学的に活性な種を定量的に測定するのに使用し得る。
A− 3-(ヒドロキシエチル)ピロールの重合体プレフィルム上での、ピロール-3位ODNの重合
1− 3-(ヒドロキシエチル)ピロールの重合体プレフィルムの製造
溶液(2)を使用して、0.75Vの電流を2.4秒(51 mC.cm-2の電荷)を通電した。
図4:白金電極(直径1mm)上での、3-(ヒドロキシエチル)ピロールモノマーの0.1M溶液についての、サイクリックボルタンメトリーの最初のサイクル(H20中、0.5M LiClO4電解質、v=50mV.s-1)。
(H20中、0.5M LiClO4電解質、v=50mV.s-1)。
(a) 3-(ヒドロキシエチル)ピロールの重合体下層について(Q=57 mC.cm-2)、(b) 下層及びポリピロール−3-位ODN(Q=15 mC.cm-2)についての、H2O中の0.5M LiClO4中でのサイクル、v=50mV.s-1。
1X HBにおけるサイクル、v=50 mV.s-1.a:1X HB中に3日;b:M5中に1時間;c:CP中に2時間。
1−3-(ヒドロキシエチル)ピロールの重合体プレフィルムの製造
溶液(2)を使用して、0.75Vの電流を0.5秒通電した(9mC.cm2の電荷)。
2−溶液(3)を使用して、3-(ヒドロキシエチル)ピロール/ピロール-3位ODNの、プレフィルム上での共重合を0.75Vで1.3秒行った(30 mC cm-2の荷電)。
a.ハイブリダイゼーションバッファー
b.非相補的ターゲットの存在下でのハイブリダイゼーション溶液
c.相補的ターゲットの存在下でのハイブリダイゼーション溶液
に曝露した変性電極の電気化学的信号の変性。
3-(ヒドロキシエチル)ピロールとピロール−3-位ODNとの共重合のための溶液
この溶液はピロール単位20000当リ、ピロール−ODN1の比で調製した。
[ピロール−ODN]=0.5μM
LiClO4電解質=H2O中、0.5M。
b.20分後の、非相補的プローブの存在下でのハイブリダイゼーションバッファー中での20mV/sでのサイクリックボルタンメトリー;
c.相補的プローブの存在下での20mV/sのハイブリダイゼーションバッファー中でのサイクリックボルタンメトリー、t=20分;
d.20分後の、相補的プローブの存在下でのハイブリダイゼーションバッファー中での
20mV/sでのサイクリックボルタンメトリー;
にかけた変性電極の電気化学的信号の変化。
20分後、相補的ターゲットの存在により、約60mVの置換が生じた。
Claims (30)
- 一般式(I)
(式中、
R1はオリゴヌクレオチドを表し、
YはS又はOを表し、
Xは-(CH2)n-O-、-(CH2)p-O-[(CH2)2-O]q-、-(CH2)r-CO-NR’-(CH2)r’-O-、
-(CH2)r-NCH3-(CH2)r’-O-、-(CH2)r-CO-NR’-[(CH2)2-O]s-、-(CH2)r-NCH3-[(CH2)2-O]s-
から選ばれたスペーサーアームを表し、
R’は-H又は-CH3を表し、
nは1〜5の整数であり、
pは1〜2の整数であり、
qは1〜4の整数であり、
rは1〜3の整数であり、
r’は1〜3の整数であり、
sは1〜3の整数であり、
n、p、q、r、r’及びsは同一であるか異なるものであり、ピロール環は2-、3-、4-又は5-位で置換されている)で表される、オリゴヌクレオチド置換ピロール。 - Xが-(CH2)n-O-であり、nが2に等しい、請求項2に記載のオリゴヌクレオチド置換ピロール。
- Xが-(CH2)n-O-であり、nが2に等しい、請求項4に記載のオリゴヌクレオチド置換ピロール。
- a) 請求項2及び3のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド置換ピロールから選ばれた少なくとも1種のモノマーを準備する工程、
b) 他のピロールと重合し得る置換ピロールから選ばれた少なくとも1種のモノマーを準備する工程、
c) 工程a)のモノマーを工程b)のモノマーと電気化学的に共重合させる工程、
からなるオリゴヌクレオチドで官能性化された導電性、電気的活性共重合体の製造方法。 - 工程a)の置換ピロールと工程b)の置換ピロールとのモル比が1/1000〜1/100000である、請求項6に記載のオリゴヌクレオチドで官能性化された導電性、電気的活性共重合体の製造方法。
- a) 他のピロールと重合し得る置換ピロールから選ばれた少なくとも1種のモノマーを準備する工程、
b) 工程a)のモノマーを電気化学的に重合させて第1の導電性、電気的活性重合体を製造する工程、
c) 請求項2及び3のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド置換ピロールから選ばれたモノマーを準備する工程、
d) 他のピロールと重合し得る置換ピロールから選ばれた少なくとも1種のモノマーを準備する工程、
e) 工程c)のモノマーと工程d)のモノマーとを、工程b)で形成された第1の導電性、電気的活性重合体上で電気化学的に共重合させて、オリゴヌクレオチドで官能性化された導電性、電気的活性共重合体を製造する工程、
からなるオリゴヌクレオチドで官能性化された導電性、電気的活性共重合体の製造方法。 - 工程c)の置換ピロールと工程d)の置換ピロールとのモル比が1/1000〜1/100000である、請求項8に記載のオリゴヌクレオチドで官能性化された導電性、電気的活性共重合体の製造方法。
- a) 他のピロールと重合し得る置換ピロールから選ばれた少なくとも1種のモノマーを準備する工程、
b) 工程a)のモノマーを電気化学的に重合させて第1の導電性、電気的活性重合体を製造する工程、
c) 請求項2及び3のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド置換ピロールから選ばれたモノマーを準備する工程、
d) 工程c)のモノマーを、工程b)で形成された第1の導電性、電気的活性重合体上で電気化学的に重合させて、オリゴヌクレオチドで官能性化された導電性、電気的活性重合体を製造する工程、
からなるオリゴヌクレオチドで官能性化された導電性、電気的活性共重合体の製造方法。 - a) 他のピロールと重合し得る置換ピロールから選ばれた少なくとも1種のモノマーを準備する工程、
b) 工程a)のモノマーを電気化学的に重合させて第1の導電性、電気的活性重合体を製造する工程、
c) 請求項4及び5のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド置換ピロールを準備する工程、
d) 工程c)の置換ピロールを、工程b)で形成された第1の導電性、電気的活性重合体上で電気化学的にカップルさせて、オリゴヌクレオチドで官能性化された導電性、電気的活性共重合体を製造する工程、
からなるオリゴヌクレオチドで官能性化された導電性、電気的活性共重合体の製造方法。 - 請求項6〜11の一つに記載の方法によって得られる、オリゴヌクレオチドで官能性化された導電性、電気的活性共重合体。
- 請求項12に記載のオリゴヌクレオチドで官能性化された導電性、電気的活性共重合体の少なくとも1種で表面被覆された導電性支持体からなる電極。
- 請求項13に記載の電極の少なくとも1つからなる、電極のマトリックス。
- 請求項12に記載の共重合体の少なくとも1種及び/又は請求項13に記載の電極の少なくとも1種からなる、試料中の検体を検出するための装置。
- 請求項14に記載の電極のマトリックスの少なくとも1つからなる、試料中の検体を検出するための装置。
- a) 請求項12に記載のオリゴヌクレオチドで官能性化された導電性、電気的活性共重合体又は請求項13に記載のオリゴヌクレオチドで官能性化された導電性、電気的活性共重合体で表面被覆された導電性支持体からなる電極を準備する工程、
b) 工程a)の前記電気的活性共重合体又は電極と試料とを、検体と上記オリゴヌクレオチドとの特異的な相互作用に適当な条件下で接触させる工程、
c) 上記オリゴヌクレオチドと結合した検体を電気的測定により検出する工程、
からなる、試料中の検体の検出方法。 - 工程c)において、導電性、電気的活性共重合体のオリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするDNA又はRNAを検出する、請求項17に記載の方法。
- 工程c)において、電位の変化又は電流の変化を測定する、請求項17及び18のいずれかに記載の方法。
- 一般式(IV)
(式中、
R2はモノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トシル、トリイソプロピルシリル、tert-ブトキシカルボニル、9-フルオレニルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル及びアセチルから選ばれたアミン保護基であり、
R3はホスホトリエステル、H-ホスホネート又はホスホルアミダイト基から選ばれた、遊離の水酸基と反応し得るリン含有基であり、
Xは-(CH2)n-O-、-(CH2)p-O-[(CH2)2-O]q-、-(CH2)r-CO-NR’-(CH2)r’-O-、
-(CH2)r-NCH3-(CH2)r’-O-、-(CH2)r-CO-NR’-[(CH2)2-O]s-、-(CH2)r-NCH3-[(CH2)2-O]s-
から選ばれたスペーサーアームを表し、
R’は-H又は-CH3を表し、
nは1〜5の整数であり、
pは1〜2の整数であり、
qは1〜4の整数であり、
rは1〜3の整数であり、
r’は1〜3の整数であり、
sは1〜3の整数であり、
n、p、q、r、r’及びsは同一であるか異なるものであり、ピロール環は2-、3-、4-又は5-位で置換されている)で表される置換ピロール。 - R2はモノメトキシトリチルである、請求項21に記載の置換ピロール。
- R3はホスホルアミダイト基である、請求項21及び22のいずれかに記載の置換ピロール。
- Xが-(CH2)n-O-であり、nが2に等しい、請求項21〜23の一つに記載の置換ピロール。
- R2はモノメトキシトリチルである、請求項25に記載の置換ピロール。
- R3はホスホルアミダイト基である、請求項25及び26のいずれかに記載の置換ピロール。
- Xが-(CH2)n-O-であり、nが2に等しい、請求項25〜27の一つに記載の置換ピロール。
- 工程b)において、保護基R2はモノメトキシトリチルであり、工程c)において、保護基を酸媒体中で処理することにより開裂させる、請求項29に記載の方法。
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