PL239699B1 - Nowy bisbitiofenowy analog oktanukleotydu o sekwencji nukleotydów CGCCGCCG, sposób jego otrzymywania, czujnik elektrochemiczny zawierający ten analog, sposób wytworzenia tego czujnika i zastosowanie czujnika elektrochemicznego - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest nowy bisbitiofenowy analog oktanukleotydu o sekwencji nukleotydów guaninowo-cytozynowych CGCCGCCG, w którym kwas peptydonukleinowy (PNA) o sekwencji GCGGCGGC (o wzorze 1) stanowi szablon molekularnego wdrukowania (tzw. szablon PNA za pomocą: bisbitiofenowych monomerów funkcyjnych: 1-cytozynooctanu 4-(di-2,2'-bitiofeno-5-ylometylo)fenylu (o wzorze 2) eteru 2-guaninoetylowo-4-(di-2,2'-bitiofen-5-ylometylo)fenylowego (o wzorze 3) oraz monomeru sieciującego, 2,4,5,2'.4',5'-heksa(tiofeno-2-ylo)-3,3'-bitiofenu (o wzorze 4). Przedmiotem zgłoszenia jest też sposób otrzymania nowego analogu oraz czujnik elektrochemiczny do selektywnego wykrywania i oznaczania oligonukleotydu GCGGCGGC zawierający nowy analog oraz sposób wytworzenia tego czujnika. Zgłoszenie obejmuje również sposób pomiaru z wykorzystaniem nowego chemoczujnika i jego zastosowanie w inżynierii genetycznej do budowy mikromatryc DNA.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowy bisbitiofenowy analog oktanukleotydu o zaprogramowanej sekwencji nukleotydów, CGCCGCCG, sposób jego otrzymywania, czujnik elektrochemiczny zawierający nowy analog oktanukleotydu o zaprogramowanej sekwencji nukleotydów, CGCCGCCG, sposób wytworzenia tego czujnika, jego zastosowanie do selektywnego wykrywania i oznaczania oktanukleotydu.

Stan techniki

Fragmentom DNA bogatym w nukleotydy guaninowo-cytozynowe (G-C) genetyka przypisuje ważną rolę a badania z ich udziałem przyczyniają się do wzbogacania wiedzy o DNA (Doluca, O. et al., Chem. Rev. 2013, 113, 3044-3083). Przykładem takich fragmentów są oktadeoksyrybonukleotydy zawierające w cząsteczce trzy podstawniki cytozynowe (C) i pięć podstawników guaninowych (G) ułożonych w kolejności 5’-GCGGCGGC-3’. Struktury DNA bogate w G i C regulują wiele czynności komórki. Dlatego ich nadekspresja jest utożsamiana z występowaniem w tych miejscach łańcucha DNA charakterystycznych sekwencji regulatorowych genów (Wilson, A. G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997, 94, 3195-3199). Mogą to być promotory rozproszone, czyli miejsca rozpoczęcia transkrypcji, które pomimo tego, że znajdują się daleko od promotorów skupionych, np. kasety TATA (T - tymina, A - adenina), to pełnią ważną funkcję w inicjacji ekspresji genów. Są to także wzmacniacze (ang. enhancers) transkrypcji, czyli krótkie (od 50 do 1500 par zasad nukleinowych) fragmenty DNA, które wspomagają i regulują przetwarzanie informacji genetycznej. W ten sposób przyczyniają się one do wzrostu wydajności transkrypcji genu. Wiążą się do nich specyficzne czynniki transkrypcyjne, tzw. czynniki trans. Fragmenty oligonukleotydów złożone z nukleotydów zawierających G i C, pełniące rolę promotorów lub wzmacniaczy, występują najczęściej w genach odpowiedzialnych za prawidłowy metabolizm i utrzymanie podstawowych funkcji życiowych komórki (ang. housekeeping genes). Występują one także w antyonkogenach i genach tkankowo specyficznych (Mamedov, T. G. etal., Comp. Biol. Chem. 2008, 32, 452-457). Przeważnie niezmetylowane zasady C i G tworzą te bogate w C i G fragmenty DNA. Jednakże w przypadku zmetylowania może dojść do zaburzonej syntezy produktów tych genów, tj. miRNA. Geny te są następnie zaangażowane w etiopatogenezę nowotworów (Weber, B. et al., Cell Cycle 2007, 6, 1001—1005; Wu, W. et al., Int. J. Cancer 2007, 120, 953-960). Ta etiopatogeneza występuje na skutek zaburzonej regulacji ekspresji innych genów, za którą odpowiedzialne jest miRNA; miRNA jest zaangażowane w to rozpoznawanie swoim 2-8 nukleotydowym końcem (ang. seed pairing) transkryptu (Lim, L. P. et al., Nature 2005, 433, 769-773).

Oprócz powyższej roli regulującej, fragmenty DNA z ponadmiarowo/anomalnie wysoką zawartością G i C pełnią istotną rolę w diagnostyce medycznej. Fragmenty genów z ekspansją, wynikającą z mutacji dynamicznych, trójek nukleotydowych przyczyniają się do uszkodzenia białek, a przez to są przyczyną poważnych chorób genetycznych. Dlatego fragmenty te są traktowane jako charakterystyczne wskaźniki tych chorób.

Nie tylko ludzki genom zawiera fragmenty DNA bogate w G i C. Również niektóre patogeny w swoim genomie zawierają bardzo dużo nukleotydów GC. Przykładem takiego patogenu może być pałeczka ropy błękitnej (Pseudomonas aeruginosa) wywołująca zakażenie u ludzi z obniżoną odpornością. Jest ona jednym z najważniejszych i najgroźniejszych drobnoustrojów odpowiedzialnych za zakażenia szpitalne.

W najczęściej stosowanych metodach oznaczania DNA wykorzystywana jest głównie reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. polymerase chain reaction, PCR). Pozwala ona wykrywać, powielane w tej reakcji, pojedyncze nici DNA, które są następnie identyfikowane na żelu agarowym w trakcie rozdzielania elektroforetycznego. Natomiast PCR w czasie rzeczywistym (ang. real-time PCR) umożliwia jednoczesne wykrywanie i oznaczanie wielu fragmentów DNA. Reakcja ta jest prowadzona w obecności barwników fluorescencyjnych, takich jak bromek etydyny lub daunomycyny, które, niestety, nie tylko wiążą się z danym fragmentem DNA, ale także z innymi jego fragmentami. Nie jest więc to selektywna metoda oznaczania. Zamiast tych barwników, zastosowanie sond fluorescencyjnych, na powierzchni których osadzone są fragmenty DNA selektywnie wiążące produkt PCR, ma większe znaczenie z punktu widzenia użyteczności PCR w oznaczaniu DNA. Za pomocą PCR opracowano testy do wykrywania niektórych wirusów, np. wirusa HIV, wirusa opryszczki (HSV) i powszechnie utożsamianym ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka szyjki macicy - ludzkiego wirusa brodawczaka. Za pomocą PCR można również wykryć wiele zakażeń bakteryjnych. Jednak najważniejszym zastosowaniem PCR jest diagnostyka chorób genetycznych. Można dzięki niej rozpoznać mukowiscyPL 239 699 Β1 dozę, pląsawicę Huntingtona i wiele innych chorób genetycznych. Ponadto obecnie opracowywane są coraz to nowe sposoby oznaczania DNA, w których wykorzystywana jest hybrydyzacja wybranych fragmentów DNA niewymagających powielenia za pomocą PCR. Skonstruowane w tym celu czujniki do oznaczania DNA różnią się między sobą swoimi elementami rozpoznającymi. Różny jest też w nich sposób generowania sygnału analitycznego i techniki jego pomiaru. Ze względu na te techniki, czujniki do oznaczania DNA można podzielić na czujniki z detekcją optyczną (Garcia-Martinez, G. et al., Sensors 2011, 11, 7656-7664; Ma, W. et al., Nat. Commun. 2013, 4, 8), fluorescencyjną (Zhan, F. F. etal., Anal. Chim. Acta 2013, 761, 71-77), z detekcją masy (Zhao, Y. et al., Smali 2014, 10, 4770-4777) i elektrochemiczną (Tang, J. et al., Chem. Commun. 2013, 49, 1530-1532).

Czujniki elektrochemiczne coraz częściej stosuje się do oznaczania DNA. Przyczyną ich rosnącej popularności są zalety, w tym prostota budowy i działania oraz szybkość i czułość oznaczeń. Przeważnie czujniki te są niewielkie, co może dodatkowo prowadzić do ich dalszej łatwej miniaturyzacji. Co więcej, koszty wytwarzania elektrochemicznych czujników do oznaczania DNA i pomiarów wykonanych z ich pomocą są o wiele niższe niż koszty oznaczeń wykonanych za pomocą innych technik analitycznych (Xiao, T. F. et al., 2017. Anal. Chem. 89, 300-313; Zhu, C. Z. et al., 2015. Anal. Chem. 87, 230-249).

W elektrochemicznych czujnikach DNA elementy rozpoznające osadzane są na powierzchni elektrody. Za rozpoznawanie DNA głównie odpowiedzialne są kwasy nukleinowe (Hvastkovs, E. G. etal., 2010. Analyst 135, 1817-1829; Lazerges, M. et al., 2013. Anal. Bioanal. Chem. 405, 3705-3714; Qian, Y. et al., 2015. Biosens. Bioelectron. 64, 177-181; Zeng, D. D. et al., 2015. Biosens. Bioelectron. 71, 434-438), które coraz częściej wymieniane są na ich trwalsze analogi niefizjologiczne (Aoki, H. et al., 2000. Electroanalysis 12, 1272-1276; Hu, Q. et al., 2015. Biosens. Bioelectron. 63, 269-275; Wang, K. et al., 2011. Biosens. Bioelectron. 26, 2870-2876). Jednym z takich najczęściej stosowanych analogów jest kwas peptydonukleinowy (PNA). Ze względu na swoje wysokie powinowactwo do komplementarnego DNA lub RNA, analog ten jest szeroko stosowany do detekcji kwasów nukleinowych o istotnym znaczeniu w diagnostyce medycznej lub obrazowaniu (BrindAmour, J. and Lansdorp, P. M., 2011. Nat. Methods 8, 484-486; Nielsen, P. E. et al., 2004. Mol. Biotechnol. 26, 233-248). PNA jest nieodwracalnie przytwierdzany do powierzchni elektrody. Na przykład do elektrody złotej jest on przymocowywany za pomocą grupy tiolowej dołączonej do danego fragmentu PNA (Abi, A. and Ferapontova, E. E., 2012. J. Am. Chem. Soc. 134, 14499-14507; Farjami, E. et al., 2011. Anal. Chem. 83, 1594-1602), za pomocą złącza awidyna-biotyna, lub poprzez pokrycie powierzchni elektrody polimerem sprzężonym z PNA (Kongpeth, J. et al., 2016. Talanta 146, 318-325; Reisberg, S. et al., 2008. Talanta 76, 206-210; Thipmanee, O. et al., 2012. Biosens. Bioelectron. 38, 430-435). Wymienione powyżej sposoby unieruchomienia PNA na powierzchni elektrody to procesy wieloetapowe, dlatego czasochłonne, wymagające żmudnej optymalizacji i zastosowania wielu odczynników.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest nowy bisbitiofenowy analog oktanukleotydu o sekwencji nukleotydów guaninowo-cytozynowych CGCCGCCG, w którym kwas peptydonukleinowy (PNA) o sekwencji GCGGCGGC (1) stanowi szablon molekularnego wdrukowania (szablon PNA) za pomocą bisbitiofenowych monomerów funkcyjnych: 4-bis(2,2’-bitien-5-ylo)metylobenzoesanu 2-(cytozyn-1-ylo)etylowego (2), eteru 2-guaninoetylowo-4-(di-2,2’-bitiofen-5-ylometylo)fenylowego (3), oraz monomeru sieciującego 2,4,5,2’,4’,5’-heksa(tiofeno-2-ylo)-3,3’-bitiofenu (4).

PL 239 699 Β1

Wynalazek również obejmuje sposób otrzymania nowego bisbitiofenowego analogu oktanukleotydu o zaprogramowanej, ściśle określonej, sekwencji nukleotydów guaninowo-cytozynowych CGCCGCCG, w którym tworzy się kompleks pre-polimeryzacyjny pomiędzy kwasem peptydonukleinowym (PNA) o sekwencji GCGGCGGC (1), pełniącym funkcję szablonu wdrukowania molekularnego, a cząsteczkami bisbitiofenowych monomerów funkcyjnych, tj. 4-bis(2,2’-bitien-5-ylo)metylobenzoesanem 2-(cytozyn-1-ylo)etylowym (2), eterem 2-guaninoetylowo-4-(di-2,2’-bitiofen-5-ylometylo)fenylowym (3), w obecności monomeru sieciującego, 2,4,5,2’,4’,5’-heksa(tiofeno-2-ylo)-3,3’-bitiofenu (4).

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania czujnika elektrochemicznego do selektywnego wykrywania i oznaczania oligonukleotydu o sekwencji GCGGCGGC. W sposobie tym pre-polimeryzacyjny kompleks bisbitiofenowego analogu oktanukleotydu według wynalazku, kwasu peptydon u klei nowego (PNA) o sekwencji GCGGCGGC (szablon PNA) z bisbitiofenowymi monomerami funkcyjnymi:

4-bis(2,2’-bitien-5-ylo)metylobenzoesanem 2-(cytozyn-1-ylo)etylowym (2) i eterem 2-guaninoetylowo-4-(di-2,2’-bitiofen-5-ylometylo)fenylowym (3), najpierw poddaje się elektropolimeryzacji, w obecności monomeru sieciującego, 2,4,5,2’,4’,5’-heksa(tiofeno-2-ylo)-3,3’-bitiofenu (4), w warunkach potencjodynamicznych. W wyniku tej elektropolimeryzacji wytwarzana jest warstwa polimeru molekularnie wdrukowanego, którą osadza się na elektrodzie, a następnie z tej warstwy polimeru molekularnie wdrukowanego usuwa się szablon PNA.

Korzystnie, szablon PNA usuwa się z warstwy MIP-u za pomocą ekstrakcji 0,1 M trietyloaminą. Wówczas korzystnie, ekstrakcję prowadzi się w podwyższonej temperaturze. W najkorzystniejszym wariancie realizacji wynalazku ekstrakcję prowadzi się w temperaturze 60°C, w czasie 60 min.

Korzystnie, stosuje się elektrodę z metalu szlachetnego, korzystniej, gdy jest nią dyskowa elektroda platynowa.

Korzystnie, w procesie elektropolimeryzacji potencjał zmieniany jest liniowo z szybkością od 10 do 1000 mV/s, korzystnie 50 mV/s, w zakresie od -1,0 do +2,50 V vs. Ag/AgCI, korzystnie od 0,50 do 1,25 V vs. Ag/AgCI.

Przedmiotem wynalazku jest również czujnik elektrochemiczny do selektywnego wykrywania i oznaczania oligonukleotydu o sekwencji GCGGCGGC, otrzymany powyższym sposobem, zawierający element rozpoznający w postaci unieruchomionej na powierzchni elektrody warstwy polimeru molekularnie wdrukowanego, z lukami molekularnymi do rozpoznawania cytozynę i guanidynę, ułożonymi w kolejności i orientacji przestrzennej komplementarnie do wiążących miejsc oznaczanego oligonukleotydu o sekwencji GCGGCGGC oraz zdolne do wiązania tego oligonukleotydu, przy czym warstwa polimeru molekularnie wdrukowanego ma grubość od około 120 nm do około 130 nm, korzystnie około 125 nm.

Korzystnie elektrodę stanowi elektroda z metalu szlachetnego, korzystniej, gdy jest nią platynowa elektroda dyskowa. Ponadto czujnik można regenerować. Dlatego może on być stosowany do oznaczeń wielokrotnie, jako że wiązanie oznaczanego oktanukleotydu przez warstwę rozpoznającą MIP-u jest odwracalne.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przedstawionego czujnika elektrochemicznego do selektywnego wykrywania i oznaczania komplementarnego oktanukleotydu o sekwencji GCGGCGGC.

PL 239 699 B1

Wynalazek jest poniżej bliżej przedstawiony w korzystnych przykładach wykonania, z odniesieniem do załączonych figur i schematów, uszeregowanych w kolejności występowania w tekście:

Fig. 1. (a) Termogram miareczkowania 75 μΜ PNA 8-μl porcjami 4,0 mM 2. (b) Krzywa tego miareczkowania z dopasowaną izotermą wiązania titrantu 2 z analitem 1.

Fig. 2. (a) Krzywe potencjodynamiczne zarejestrowane za pomocą platynowej elektrody dyskowej (krzywa przerywana) w 0,05 mM 1 i (krzywe ciągłe) 0,05 mM 1, 0,1 mM 2, 0,06 mM 3, i 0,1 mM 4, w 0,1 M (TBA)CIO4 roztworze rozpuszczalników, acetonitrylu i wody, zmieszanych w stosunku objętościowym 9 : 1. (b) Krzywe potencjodynamiczne zarejestrowane w trakcie osadzania polimeru kontrolnego, NIP-u, w roztworze jak wyżej, ale w nieobecności PNA.

Fig. 3. Krzywe różniczkowej wolamperometrii pulsowej zarejestrowane za pomocą platynowej elektrody dyskowej pokrytej warstwą MIP-u (1) przed ekstrakcją szablonu PNA oraz po (2) 15, (3) 45, (4) 60 min ekstrakcji szablonu PNA z warstwy MIP-u 0,1 M trietyloaminą w 60°C, a także (5) po 15-min zanurzeniu wyekstrahowanej warstwy MIP-u do roztworu 20 μM PNA. Krzywe zarejestrowano dla 0,1 M K4Fe(CN)s, 0,1 M K3Fe(CN)s w 0,1 M roztworze soli fizjologicznej w buforze fosforanowym, PBS, o pH = 7,4. Amplituda pulsu 25 mV, czas trwania pulsu 50 ms, skok potencjału 5 mV.

Fig. 4. Zależność składowej urojonej od składowej rzeczywistej impedancji zarejestrowana za pomocą platynowej elektrody dyskowej pokrytej warstwą MIP-u z wyekstrahowanym PNA w 0,1 M PBS (pH = 7,4), 0,1 M K4[Fe(CN)s] i 0,1 M K3[Fe(CN)s]. Dopasowane dane (czerwona krzywa) do wybranego modelu obwodu zastępczego (wstawka II).

Fig. 5. (a) Zależność składowej urojonej od składowej rzeczywistej impedancji zarejestrowane za pomocą platynowej elektrody dyskowej pokrytej warstwą MIP-u oddziałującej przez 5 min z oligonukleotydem GCGGCGGC o stężeniu (1) 3, (2) 8, (3) 15, (4) 34, (5) 52, (6) 70, (7) 87 nM w obecności 0,1 M K4Fe(CN)₆ i 0,1 M K3Fe(CN)s, w 0,1 M PBS (pH = 7,4). Wstawka przedstawia zależność składowej rzeczywistej impedancji warstwy (1) MIP-u i (2) NIP-u od stężenia oligonukleotydu GCGGCGGC. (b) Zależność zmiany składowej rzeczywistej impedancji warstwy MIP-u z wyekstrahowanym szablonem PNA od stężenia (1 ’) GCGGCGGC, (2’) GCGATGGC DNA, (3’) GCTGCTGC PNA i (4’) GCGATCGC PNA.

Fig. 6. (a) Zmiany w czasie kąta odbicia w spektroskopii rezonansu plazmonów powierzchniowych (ang. surface plasmon resonance, SPR) zarejestrowane w warunkach analizy przepływowo-wstrzykowej w obecności oznaczanego oligonukleotydu GCGGCGGC o różnych stężeniach podanych przy krzywych, (b) Krzywe kalibracji dla (1) GCGGCGGC, (2) GCTGCTGC, (3) GCGATCGC dla warstwy MIP-u z wyekstrahowanym szablonem PNA osadzonej na dysku SPR, a także dla (4) GCGGCGGC dla polimeru kontrolnego, NIP-u. Prędkość przepływu roztworu nośnego, 0,1 M PBS (pH = 7,4), wynosiła 33 μl min^-1.

Korzystne przykłady wykonania wynalazku

Materiały i odczynniki

Acetonitryl, dimetylosulfotlenek (DMSO), nadchloran tetra-n-butyloamoniowy [(TBA)CIO4], heksacyjanożelazian(lll) potasu i trietyloaminę zakupiono w firmie Sigma-Aldrich. Wszystkie sole, tj. chlorek sodu, chlorek potasu, wodorofosforan sodu i diwodorofosforan potasu, zastosowane do przygotowania 0,1 M PBS (pH = 7,4), a także azotan potasu i heksacyjanożelazian(ll) potasu zastosowane do przygotowania próbnika redoks, pochodziły z POCH.

Płyn Dulbecco wytworzono w Pracowni Chemii Ogólnej Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN. Wszystkie kwasy peptydonukleinowe (PNA), tj. GCGGCGGC, GCTGCTGC i GCGATCGC zsyntetyzowano według znanej procedury blokowania grupy aminowej grupą butyloksykarbonylową (BOC) zgodnie z procedurą opisaną w literaturze (Nielsen, P. E. et al., 2004. w: Nielsen, P. E. (Ed.), Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications p. 37. Horizon Bioscience, Wymondham, UK). Oligodeoksyrybonukleotyd GCGATGGC zakupiono w Oligo.pl, Eter 2-guaninoetylowo-4-(di-2,2’-bitiofen-5-ylometylo)fenylowego 3 zsyntetyzowano według procedury opisanej poniżej.

Najpierw rozpuszczono 4-hydroksybenzaldehyd (5 g, 40,9 mmoli) w acetonie, a następnie dodano K2CO3 (28 g, 202,5 mmoli). Całość mieszano przez 30 min w atmosferze azotu, po czym wkroplono 10,6 ml dibromometanu i mieszano przez dalsze 20 godz. w 80°C. Następnie odfiltrowano K2CO3 a rozpuszczalnik odparowano. Żółtą oleistą pozostałość rozcieńczono dichlorometanem i przemyto wodą w celu całkowitego usunięcia K2CO3. Po tym warstwę organiczną osuszono bezwodnym Na2SO4 a następnie odparowano. Na koniec surowy produkt, 4-(2-bromoetoksy)benzaldehyd, oczyszczono za pomocą chromatografii cieczowej na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym.

PL 239 699 B1

Jako eluent zastosowano roztwór heksanu i chloroformu w stosunku objętościowym w zakresie od 1 : 1 do 8 : 2. Guaninę (916 mg, 4 mmol) i K2CO3 mieszano w kolbie okrągłodennej zawierającej 100 ml DMF przez 1 godzinę pod azotem. Następnie dodano 4-(2-bromoetoksy)benzaldehyd (916 mg, 4 mmole) po czym całość mieszano przez kolejne 69 godzin w 120°C. Następnie DMF odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymaną żółtą oleistą pozostałość, 4-[2-(guanin-9-ylo)etoksy]benzaldehyd, wstępnie oczyszczono za pomocą chromatografii cieczowej na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym. Jako eluent zastosowano roztwór dichlorometanu i metanolu w stosunku objętościowym w zakresie od 95 : 5 do 80 : 20. Następnie oczyszczony produkt zmieszano z 2,2’-bitiofenem (499 g, 3 mmole) i glikolem etylenowym (50 ml, 910 mmoli). Powstałą mieszaninę reakcyjną mieszano przez 30 min w atmosferze azotu, a następnie dodano 70% HCIO4 (19,5 ml, 300 mmoli). Całość mieszano w 60°C przez 16 godz. Po tym czasie mieszaninę ochłodzono do temperatury pokojowej, po czym dodano nadmiar dichlorometanu w celu rozpuszczenia pożądanego produktu. Mieszaninę tę następnie zobojętniono nasyconym roztworem Na2CO3. Zebraną organiczną warstwę ciekłą przemyto wodą a następnie wysuszono bezwodnym Na2SO4. Po odparowaniu rozpuszczalnika z warstwy organicznej, surowy produkt oczyszczono za pomocą chromatografii cieczowej na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym z zastosowaniem roztworu dichlorometanu i etanolu w stosunku objętościowym od 95 : 5 do 60 : 50 jako eluent. Natomiast wcześniej opisano już syntezę 4-bis(2,2’-bitien-5-ylo)metylobenzoesanu 2-(cytozyn-1-ylo)etylowego 2 (Huynh, T.-P. et al., 2015. Biosens. Bioelectron. 70, 153-160) i 2,4,5,2’,4’,5’-heksa(tiofeno-2-ylo)-3,3’-bitiofenu 4 (Sannicolo, F. et al., 2016.

Chem. Eur. J. 22, 10839-10847).

Techniki i procedury

Do opracowana niniejszego wynalazku zastosowano technikę potencjodynamiczną, woltamperometrię cykliczną (CV), elektrochemiczną spektroskopię impedancyjną (EIS), a także woltamperometrię pulsową różnicową (DPV). Techniki te wykorzystano do przygotowania i scharakteryzowania MIP-u i NIP-u, a także sprawdzenia ich zdolności do wiązania i rozpoznawania analitu oraz substancji przeszkadzających. W pomiarach zastosowano platynową elektrodę dyskową o średnicy 1 mm, elektrodę chlorosrebrową i elektrodę z drutu platynowego jako, odpowiednio, elektrodę pracującą, pseudo-odniesienia i pomocniczą. Widmo EIS próbnika redoks, K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6, w roztworze PBS zarejestrowano za pomocą prądu zmiennego o amplitudzie 10 mV i częstotliwości wybranej z zakresu od 100 mHz do 200 kHz przy potencjale równym potencjałowi otwartego obwodu. Zebrane dane przetworzono za pomocą oprogramowania ZView. Krzywe DPV zarejestrowano z zastosowaniem 0,1 M K4Fe(CN)6 i 0,1 M K3Fe(CN)6 w 0,1 M PBS (pH = 7,4). Amplituda pulsu, czas trwania pulsu i skok potencjału wynosiły, odpowiednio, 25 mV, 50 ms i 5 mV.

Pomiary izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ang. isothermal titration calorimetry, ITC) przeprowadzono pod stałym ciśnieniem (atmosferycznym), w 295 K. Przed miareczkowaniem roztwory odgazowano. Krzywa tła ustalała się po 30 min. Po tym czasie prowadzono pomiar polegający na zastrzykiwaniu, do naczynka z analitem, 10-μl porcji titranta w czasie 3 min przy jednoczesnym mieszaniu roztworu za pomocą obracania biurety z tym roztworem z prędkością 250 obrotów na minutę.

Pomiary spektroskopii SPR przeprowadzono w warunkach analizy przepływowo-wstrzykowej. W analizie tej roztwór nośny, 0,1 M PBS (pH = 7,4), przepływał z prędkością 33 μl min^-1 przez kuwetę SPR. Po ustaleniu się linii tła, do naczynka wstrzykiwano 50-μl porcje oligonukleotydu, rozpuszczonego w 0,1 M PBS (pH = 7,4), z tą samą prędkością, tj. 33 μl min^-1. Zmianę sygnału kąta odbicia rejestrowano przez 25 min.

P r z y k ł a d 1 - Przygotowanie nowego bisbitiofenowego oktanukleotydu o zaprogramowanej sekwencji nukleotydów GCGGCGGC

Kompleksowanie zasad nukleinowych PNA przez komplementarne zasady nukleinowe monomerów funkcyjnych

W celu przygotowania tzw. kompleksu pre-polimeryzacyjnego, jako szablon wdrukowania molekularnego zastosowano kwas peptydonukleinowy, PNA, o sekwencji GCGGCGGC (wzór strukturalny 1). Jego konformacja w niefizjologicznych warunkach elektropolimeryzacji, tj. w roztworze rozpuszczalnika organicznego, była trwała. Wokół cząsteczki tego szablonu samo-organizowały się cząsteczki bisbitiofenowych monomerów funkcyjnych, każdy wyposażony albo w zasadę C albo G (o wzorach odpowiednio, 2 i 3). Z uwagi na obecność tych zasad, szablon ulegał w roztworze kompleksowaniu przez te monomery, w sposób określony przez komplementarne parowanie zasad Watsona-Cricka. Dzięki ww. parowaniu wytworzono kompleks pre-polimeryzacyjny.

PL 239 699 B1

Komplementarne parowanie zasad nukleinowych szablonu PNA i monomerów funkcyjnych w roztworze do polimeryzacji eksperymentalnie potwierdzono za pomocą eksperymentów z wykorzystaniem ITC. W celu osiągnięcia stężenia szablonu i monomerów na tyle wysokiego, aby można było wykonać miareczkowanie, jako rozpuszczalnik zastosowano DMSO. Rozpuszczalnik ten nie wpłynął na trwałość PNA. Eksperymenty ITC przeprowadzono w warunkach niefizjologicznych zbliżonych do tych, w których przygotowano kompleksy pre-polimeryzacyjne a następnie przeprowadzono elektropolimeryzację.

W eksperymentach ITC roztwór 0,075 mM PNA zmiareczkowano roztworem 4,0 mM 2 (Fig. 1a). Do zebranych danych doświadczalnych dopasowano dwustopniową izotermę teoretyczną (Fig. 1b) i wyznaczono charakterystyczne parametry miareczkowania, tj. zmianę entalpii towarzyszącą kompleksowaniu (Δ H) i stałą trwałości kompleksu (Ks), wynoszące Δ H1 = -102,0 kJ mol^-1 i Δ H2 = -34,3 kJ mol^-1) oraz Ks,1 = 107 M^-1 i Ks,2 = 9,0x105 M^-1, odpowiednio, dla pierwszego i drugiego etapu kompleksowania. Cząsteczki guaninowego monomeru funkcyjnego 2 związały najpierw trzy a następnie dwa podstawniki cytozynowe PNA w, odpowiednio, pierwszym i drugim etapie kompleksowania. Na podstawie tych danych obliczono zmianę entalpii swobodnej (Δ G) i zmianę entropii (Δ S) towarzyszącej temu kompleksowaniu wynoszące Δ G1 = -40,6 kJ mol^-1 i Δ G 2 = -34,0 kJ mol^-1 oraz Δ S1 = -206,0 J mol^-1 K^-1 i Δ S 2 = -1,0 J mol^-1 K^-1, odpowiednio, dla pierwszego i drugiego etapu kompleksowania. Następnie przeprowadzono kolejne miareczkowanie, które miało na celu sprawdzenie czy część bis(2,2-bitienylo)metylofenylowa monomeru miała wpływ na ustawienie cząsteczek monomerów funkcyjnych względem cząsteczki szablonu PNA. W tym celu PNA zmiareczkowano 4-bis(2,2’-bitienylo)metylobenzoesanem 2-aminoetylu, tj. titrantem o strukturze odpowiadającej monomerowi funkcyjnemu, ale nie zawierającym podstawnika cytozynowego. Miareczkowaniu temu nie towarzyszyło wydzielanie ciepła, co w sposób jednoznaczny wykluczyło udział ugrupowania bis(2,2-bitienylo)metylofenylowego w kompleksowaniu PNA. Ugrupowaniu temu można przypisać udział w stabilizacji kompleksu i ułożeniu cząsteczek monomerów funkcyjnych w taki sposób, aby zapewnić jak najwydajniejsze parowanie szablonu.

Zdolność monomerów funkcyjnych do komplementarnego rozpoznawania i parowania zasad nukleinowych oligonukleotydów potwierdzono miareczkując za pomocą 2 oligomery o sekwencjach niespecyficznych, tj. GCTGCTGC i GCGATCGC. W obu tych przypadkach stechiometria otrzymanych kompleksów odpowiadała liczbie utworzonych par guaninowo-cytozynowych, tj. 3 : 1.

P r z y k ł a d 2 - Wytworzenie czujnika elektrochemicznego do selektywnego wykrywania i oznaczania oktanukleotydu o sekwencji GCGGCGGC

W ramach niniejszego wynalazku opracowano i wykonano czujnik do selektywnego wykrywania i oznaczania wybranych oligonukleotydów zawierających C i G. Elementem rozpoznającym jest w nim syntetyczny, trwały polimer bisbitiofenowy zawierający zasady C i G. W tym celu wytworzony w Przykładzie 1 kompleks przeniesiono na powierzchnię elektrody za pomocą polimeryzacji elektrochemicznej.

Osadzanie polimeru molekularnie wdrukowanego kwasem peptydonukleinowym (PNA) na elektrodach

Zgodnie z wyznaczoną stechiometrią kompleksu pre-polimeryzacyjnego, potwierdzoną za pomocą miareczkowania ITC opisanego powyżej, do elektropolimeryzacji przygotowano roztwór acetonitrylu i wody o stosunku objętościowym 9 : 1, który był 0,02 mM względem PNA, 0,1 mM względem 2, 0,06 mM względem 3, 0,1 mM względem 4 i 0,1 M względem (TBA)CIO4. Ponadto dziesięcioprocentowa zawartość wody była w tym roztworze niezbędna do rozpuszczenia PNA i zachowania jego konformacji.

Warstwy MIP-u wdrukowanego za pomocą PNA osadzono na platynowej elektrodzie dyskowej, złoconej płytce szklanej i elektrodzie złotej szklanego dysku SPR za pomocą elektropolimeryzacji w warunkach potencjodynamicznych przy liniowo zmienianym, przez pięć cykli z szybkością 50 mV/s, potencjale w zakresie od 0,50 do 1,25 V. Podczas tego osadzania na krzywej potencjodynamicznej pierwszego cyklu pojawiły się dwa piki anodowe (krzywe ciągłe, Fig. 2a). Pierwszy z nich, przy 1,02 V, całkowicie zniknął w dwóch ostatnich cyklach. Drugi, w pierwszym cyklu występujący przy 1,13 V, w kolejnych cyklach przesunął się w kierunku wyższych potencjałów. Oznacza to, że osadzony polimer pełnił rolę warstwy zaporowej utrudniającej dalsze utlenianie elektroaktywnych cząsteczek monomerów obecnych w roztworze, a przez to dalsze osadzanie polimeru. Jednakże żaden z tych pików nie był związany z utlenianiem szablonu PNA (krzywa przerywana, Fig. 2a). Pomimo tego, że oligonukleotyd ten był bogaty w elektroaktywne ugrupowania guaninowe, nie ulegały one utlenieniu podczas elektropolimeryzacji. Natomiast obserwowane piki były związane z utlenianiem części tiofenowych monomerów funkcyjnych 2 i 3 oraz monomeru sieciującego 4, ponieważ były one również obecne

PL 239 699 Β1 na potencjodynamicznych krzywych elektropolimeryzacji prowadzącej do osadzenia warstwy niewdrukowanego polimeru kontrolnego, NIP-u (Fig. 1 b).

Przygotowanie warstwy MIP-u wdrukowanego kwasem peptydonukleinowym (PNA) do oznaczania PNA

Osadzoną na elektrodzie, jak powyżej, warstwę MIP-u przemyto acetonem, aby usunąć z niej zarówno niezwiązane i nieprzereagowane składniki kompleksu pre-polimeryzacyjnego jak i nadmiar elektrolitu podstawowego i buforu. Następnie szablon PNA wyekstrahowano z warstwy MIP-u mieszanym magnetycznie roztworem 0,1 M trietyloaminy (pH = 12,0), ogrzanym do 60°C, w którym umieszczono elektrodę pokrytą warstwą MIP-u na 60 min. Usunięcie szablonu z tej warstwy potwierdzono za pomocą pomiarów XPS, DPV i EIS. Taką samą procedurę zastosowano do przygotowania warstwy kontrolnej NIP-u, jednakże w nieobecności szablonu w roztworze do elektropolimeryzacji.

Przed pomiarami spektroskopii SPR, na umieszczonym w kuwecie szklanym dysku SPR z napyloną warstwą złota, pełniącą rolę elektrody pracującej, osadzono w warunkach potencjodynamicznych warstwę MIP-u. W kuwecie umieszczona również była platynowa elektroda pomocnicza i chlorosrebrowa elektroda odniesienia. Po osadzeniu, warstwę MIP-u pokryto roztworem 0,1 M trietyloaminy na 3 godziny w celu usunięcia z niej szablonu PNA.

Skuteczność molekularnego wdrukowania szablonu PNA a następnie jego usunięcia z warstwy MIP-u

Po elektropolimeryzacji, z warstwy MIP-u usunięto sposobem opisanym powyżej szablon PNA, w ten sposób opróżniając wdrukowane luki molekularne, przez to umożliwiając ich oddziaływanie z analitem. W celu wyekstrahowania szablonu PNA, elektrodę pokrytą warstwą MIP-u zanurzono w podgrzanym do 60°C roztworze 0,1 M trietyloaminy. W warunkach zasadowych (pH>10) guanina ulega zdeprotonowaniu przyjmując postać anionową. Prowadzi to do osłabienia i w rezultacie do zerwania wiązań wodorowych par G-C, do czego przyczynia się również podwyższona temperatura. Ekstrakcja w podwyższonej temperaturze doprowadziła do skrócenia czasu usuwania szablonu z trzech do jednej godziny w porównaniu do ekstrakcji przeprowadzonej w temperaturze pokojowej. To usuwanie szablonu monitorowano za pomocą XPS, DPV i EIS.

W widmach wysokorozdzielczej XPS MIP-u wdrukowanego za pomocą PNA, zarejestrowanych przed i po ekstrakcji PNA, jak i polimeru kontrolnego, NIP-u, nie było charakterystycznych pików, które umożliwiłyby rozróżnienie poszczególnych polimerów. Jednakże rozróżnienie to okazało się możliwe na podstawie względnego stosunku atomowego azotu do siarki (N : S), wyznaczonego z atomowej zawartości procentowej tych pierwiastków. Z uwagi na wysoką względną zawartość azotu, szablon PNA stanowił dodatkowe źródło tego pierwiastka w ΜΙΡ-ie przed ekstrakcją PNA. Dlatego stosunek atomowy N : S dla tego MIP-u, wynoszący 1,7 (Tabela 1), był znacznie wyższy niż dla NIP-u, który wynosił ~0,5. Natomiast odpowiadał on stosunkowi obliczonemu na podstawie stechiometrii kompleksu pre-polimeryzacyjnego, wynoszącemu 2,0.

Tabela 1. Względna zawartość azotu i siarki w warstwie MIP-u z wdrukowanym PNA wyznaczona za pomocą wysokorozdzielczej XPS. Warstwę MIP-PNA osadzono na złoconej płytce szklanej za pomocą elektropolimeryzacji potencjodynamicznej monomerów funkcyjnych 2 i 3 oraz monomeru sieciującego 4 w obecności szablonu PNA, GCGGCGGC, w mieszaninie acetonitrylu i wody o stosunku objętościowym 9:1.

Pierwiastek

Energia wiązaniaeV

Względna zawartość atomowa %

N IsA	400,04	1,37
N IsB	402,13	3,10
N		4,47
S 2p3A	164,18	1,72
S 2plA	165,36	0,86
S		2,58

Co więcej, stosunek ten dla MIP-u obniżył się do ~0,4 po usunięciu z niego szablonu PNA (Tabela 2) stając się bliski temu stosunkowi dla NIP-u, wynoszącemu ~0,5.

PL 239 699 Β1

Tabela 2. Względna zawartość azotu i siarki w warstwie MIP-u z wyekstrahowanym szablonem PNA wyznaczona za pomocą wysokorozdzielczej XPS.

Energia wiązaniaeV

Względna zawartość atomowa

Pierwiastek

N lsA	400,22	3,46
N		3,46
S 2p3A	164,34	6,18
S 2plA	165,52	3,09
S		9,27

Ta ostatnia wartość odpowiadała stosunkowi atomowemu N : S w NIP-ie (Tabela 3).

Tabela 3. Względna zawartość azotu i siarki w warstwie NIP-u wyznaczona za pomocą wysokorozdzielczej XPS. Warstwę NIP-u osadzono na płytce szklanej pokrytej złotem za pomocą elektropolimeryzacji potencjodynamicznej monomerów funkcyjnych 2 i 3 oraz monomeru sieciującego 4 w mieszaninie acetonitrylu i wody w stosunku 9:1.

Pierwiastek	Energia wiązaniaeV	Względna zawartość atomowa %
N lsA	400,17	4,92
N -razem		4,92
5 2p3A	164,03	6,42
S 2plA	165,21	3,21
S 2p3B	168,30	0,30
S 2plB	169,48	0,15
S -razem		10,08

Zatem analiza XPS potwierdziła zarówno wdrukowanie szablonu PNA w MIP, jak i jego późniejsze usunięcie.

Następnie wykonano pomiary DPV dla roztworu o składzie 0,1 M heksacyjanożelazian(ll) i 0,1 M heksacyjanożelazian(lll) w 0,1 M PBS (pH = 7,4). Układ Fe(CN)6⁴7Fe(CN)6³' spełniał rolę próbnika redoks. Pomiary te miały na celu pośrednie potwierdzenie obecności szablonu PNA w warstwie MIP-u a następnie jego usunięcie, za pomocą ekstrakcji, na podstawie zmieniającej się wysokości pików DPV utlenienia próbnika redoks. Po elektropolimeryzacji, wdrukowany szablon PNA blokował dyfuzję próbnika przez polimer, a przez to jego utlenienie na elektrodzie (krzywa 1 na Fig. 3). Wraz z postępem ekstrakcji, pik był coraz wyższy (krzywe 2 i 3 na Fig. 3), ponieważ coraz mniej cząsteczek szablonu pozostawało w lukach molekularnych MIP-u. Dlatego dyfuzja próbnika do powierzchni elektrody była coraz mniej utrudniona. Po osiągnięciu maksymalnej wartości piku (krzywa 4 na Fig. 3), elektrodę pokrytą warstwą MIP-u zanurzono w roztworze 20 μΜ PNA na 15 min, a następnie ponownie zarejestrowano krzywą DPV (krzywa 5 na Fig. 3). Wówczas wysokość piku utlenienia próbnika była niższa w wyniku ponownego zajęcia przez cząsteczki PNA luk molekularnych w ΜΙΡ-ie a przez to ponowne blokowanie dyfuzji próbnika.

PL 239 699 Β1

Charakterystyka polimerów za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM)

Za pomocą obrazowania mikroskopią sił atomowych (AFM) zbadano morfologię i wyznaczono grubość warstwy MIP-u przed i po ekstrakcji szablonu PNA, a także NIP-u (Tabela 4).

Tabela 4. Obrazowanie powierzchni MIP-u, przed i po ekstrakcji PNA, jak i NIP-u za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) oraz obliczona grubość warstwy i średnica ziaren MIP-u. Wielkość zdjęć (2x2) mm².

Polimer

Obraz AFM

Grubość warstwy polimeru, nm

Wielkość ziarna, nm

30-60

NIP

MIP po ekstrakcji PNA

125+3

50-70

B 114+4

30-60

Obrazowanie to wykazało, że warstwę MIP-u tworzyły ziarna o wielkości od 30 do 60 nm. Grubość warstwy, równą 151(±3) nm, wyznaczono z wysokości uskoku uformowanego po zeskrobaniu, teflonową szpatułką, części warstwy z podłoża. Była ona nieco większa od grubości warstwy NIP-u 114(±4) nm o tej samej masie, co mogłoby świadczyć o obecności szablonu w ΜΙΡ-ie. Różnica ta mogła również być związana z ułatwioną polimeryzacją monomerów funkcyjnych i sieciującego w obecności szablonu. Po usunięciu PNA z MIP-u, grubość warstwy zmalała do 125(±3) nm, a średnica ziaren nieco wzrosła do 50-70 nm. Najwyraźniej warstwa MIP-u nieznacznie skurczyła się, najprawdopodobniej z powodu niskiej zawartości monomeru sieciującego 4 w jej strukturze. Jednakże wysokie usieciowanie MIP-u za pomocą 4 mogłoby sprawić, że MIP ten byłby bardziej sztywny, co mogłoby utrudnić usunięcie szablonu z warstwy (Li, S. J. et al., Próg. Polym. Sci. 2014, 39, 145-163).

Badania właściwości polimerów za pomocą elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej (EIS)

Zbadano właściwości warstwy MIP-u osadzonej na platynowej elektrodzie dyskowej za pomocą EIS w warunkach stacjonarnych. Po usunięciu szablonu z luk molekularnych MIP-u elektrodę pokrytą warstwą tego MIP-u zanurzono w 0,1 M PBS (pH = 7,4), który był 0,1 M względem próbnika redoks, i zarejestrowano widmo EIS. Skonstruowany wykres Nyquista składał się z małego półokręgu przy wysokich częstotliwościach, na którego nakładał się duży półokrąg, i z prostej przy niskich częstotliwościach (Fig. 4). Do zebranych danych doświadczalnych dopasowano parametry zmodyfikowanego obwodu zastępczego Randlesa-Erszlera (wstawka I do Fig. 4). Dwa półokręgi na płaszczyźnie zespolonej reprezentowały porowatą strukturę MIP-u. W tym ujęciu warstwę MIP-u potraktowano jako porowatą membranę złożoną z dwóch faz, tj. z przewodzącego polimeru i z porów wypełnionych roztwo

PL 239 699 Β1 rem elektrolitu. Dzięki przepływowi tego roztworu, w porach znajdowały się jony ulegające ciągłej wymieniane na jony z roztworu. Faza ta charakteryzowała się niewielkim stałym oporem związanym z transportem jonów, oznaczonym na obwodzie zastępczym (wstawka II do Fig. 4) jako R_po. Na granicy tej fazy z fazą MIP-u wytworzyła się podwójna warstwa elektryczna. Reakcję zachodzącą na granicy porów charakteryzował opór Ret, związany z heterogeniczną wymianą ładunku, równolegle połączony z impedancją Waburga, l/l/o, reprezentującą dyfuzję nośników ładunku w polimerze. Inne parametry obwodu zastępczego związane były z oporem roztworu i elementów naczynka, R_s, i elementu stałofazowego, CPE, charakteryzującego pseudopojemność przy niskich częstotliwościach i pojemność podwójnej warstwy elektrycznej polimeru niehomogenicznego.

Figura 5a przedstawia wykres Nyquista dla chemoczujnika, którego warstwa MIP-u, po ekstrakcji szablonu PNA, oddziaływała przez 5 min z analitem, GCGGCGGC, o różnym stężeniu. Do zebranych danych doświadczalnych dopasowano parametry zastępczego obwodu elektrycznego i dla każdego stężenia analitu wyznaczono wartość Ret. Wartości tego parametru zmieniały się proporcjonalnie do postępującego wiązania analitu w lukach molekularnych MIP-u, a jego zależność od stężenia oznaczanego oligonukleotydu przedstawiono w postaci krzywej kalibracyjnej (wstawka do Fig. 5a). Mierzony sygnał zmiany składowej rzeczywistej impedancji liniowo wzrastał ze wzrostem stężenia analitu w roztworze w zakresie od 3 do 87 nM. Równanie regresji opisujące sygnał odpowiedzi czujnika ma postać (Rct,f - «ct,D [Ω] = 780(±9,0) [Ω] + 55,53(±0,28) [Ω nM¹] canalit [nM], (1) w którym opór przeniesienia ładunku próbnika redoks dla warstwy MIP-u przed i po oddziaływaniu z analitem oznaczono jako, odpowiednio, Ra,t i Ret,i. Czułość i dolna granica wykrywalności, wyznaczone przy stosunku sygnału do szumu równym 3:1, wynosiły, odpowiednio, 0,053(±0,002) kQ nM'¹ i 200 pM. Selektywność czujnika wyznaczono ze stosunku nachylenia krzywej kalibracyjnej dla oznaczanego oligonukleotydu do nachylenia krzywych kalibracyjnych dla oligonukleotydów przeszkadzających w oznaczeniu analitu, różniących się dwiema lub trzeba zasadami nukleinowymi od analitu (Fig. 5b). Okazało się, że chemoczujnik był ~3,0 i 3,8 razy czulszy względem oznaczanego oligonukleotydu GCGGCGGC niż względem oligonukleotydu, odpowiednio, o dwóch GCGATGGC DNA, GCTGCTGC PNA i trzech niedopasowanych nukleotydach, GCGATCGC PNA, strukturalnie do niego podobnych. Wyznaczono również odpowiedzi chemoczujnika z kontrolną warstwą NIP-u na obecność analitu w roztworze badanym. Jego powinowactwo do oznaczanego oligonukleotydu GCGGCGGC było aż czterokrotnie niższe od powinowactwa chemoczujnika z warstwą MIP-u.

Oznaczanie oligonukleotydu GCGGCGGC za pomocq spektroskopii rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR)

Wiązanie analitu w lukach molekularnych MIP-u potwierdzono za pomocą spektroskopii SPR. Technika ta umożliwia bezpośrednie wykrywanie pojedynczej nici DNA (ang. single-stranded DNA, ssDNA) w czasie rzeczywistym. Wykrywanie to polega na hybrydyzowaniu DNA przez próbnik lub warstwę rozpoznającą. Hybrydyzowanie to prowadzi do wzrostu masy i proporcjonalną do niego zmianę współczynnika załamania światła. Zmianę tę mierzy się jako zmianę kąta odbicia wiązki p-spolaryzowanego światła padającego.

Pomiary spektroskopii SPR przeprowadzono w warunkach analizy przepływowo-wstrzykowej. Zarejestrowano sygnał dla analitu o różnych stężeniach w zakresie od 50 do 750 nM (Fig. 6a). Całkowity sygnał SPR, mierzony przez 25 min, składał się z trzech etapów reprezentujących trzy kolejne stadia oddziaływania MIP-u z analitem, tj. hybrydyzację, ustalenie równowagi i dehybrydyzację. Sporządzono krzywą kalibracji oddziaływania analitów i substancji przeszkadzających na podstawie sygnałów reprezentujących etap równowagi tego procesu. Równanie regresji ma następującą postać

Δ/? [m°] = 15,77(± 0,67) [m°] + 0,032(+ 0,002) [m^D nM¹] canalit [nM], (2) w którym AR oznacza zmianę kąta odbicia. Czułość, współczynnik korelacji i granicę wykrywalności, wyznaczone przy stosunku sygnału do szumu równym 3:1, wynosiły, odpowiednio, 0,032(±0,002) m° nM'¹, 0,98 i 50 nM. Z nachylenia krzywych kalibracji dla oligonukleotydów przeszkadzających (krzywe 2 i 3 na Fig. 6b) wyznaczono współczynniki selektywności. Czujnik MIP był ~2,5 i ~2,7 razy bardziej czuły na oznaczany oligonukleotyd GCGGCGGC niż na oligonukleotydy różniące się, odpowiednio, dwiema i trzema zasadami nukleinowymi. Z nachylenia krzywej kalibracyjnej charakteryzującej odpowiedź chemoczujnika z kontrolną warstwą NIP-u wyznaczono pozorny współczynnik wdrukowania (krzywa 4 na Fig. 6b). Był on bardzo wysoki, wynosił bowiem 11.

PL 239 699 Β1

Analiza danych kinetycznych uzyskanych z pomiarów SPR

Reakcję pomiędzy oktamerowym bisbitiofenowym analogiem CGCCGCCG, kowalencyjnie unieruchomionym w lukach molekularnych MIP-u (L) a oznaczanym oligonukleotydem, GCGGCGGC, bogatym w guaninę i cytozynę (A) w roztworze, która prowadzi do wytworzenia kompleksu (LA), opisuje Równanie (3).

k_s ^+A Z^LA <³>

W równaniu tym k_a i kd to stała szybkości, odpowiednio, asocjacji L i A oraz dysocjacji kompleksu LA. Zmianę stężenia wytworzonego kompleksu w czasie wyraża Równanie (4):

d[LAl = MaM - k_d [LA] (4)

W równaniu tym Ca to stężenie oznaczanego oligonukleotydu znajdującego się blisko powierzchni MIP-u, [L] to stężenie molowe nieobsadzonych luk molekularnych w ΜΙΡ-ie reprezentujących analog okatmerowy, a t to czas. Stężenie kompleksu było proporcjonalne do wielkości mierzonej odpowiedzi (R_eq). Zgodnie ze specyfikacją układu pomiarowego, osadzenie na powierzchni dysku SPR analitu o gęstości powierzchniowej 1 ng/mm² powoduje zmianę kąta odbicia o 120 milistopni. Oznacza to, że zmiana kąta o 1 milistopień odpowiada zmianie gęstości powierzchniowej osadzonej substancji o 8,33 pg/mm². Co więcej, stężenie wolnego ligandu można wyrazić jako R_max-R, jeżeli maksymalne stężenie kompleksu (Rmax) jest znane. Wówczas Równanie (4) można zapisać jako (5): ^=fc_aCA(/?_max-/?)-/id« ₍₅₎

Po scałkowaniu, Równanie (5) przyjmuje postać (6):

R = /?_eq [1 - e^-(kacA+fcd)(t-tO)]

Do zmiany sygnału w czasie dopasowano krzywą teoretyczną, a z jej parametrów wyznaczono stałe szybkości k_a i kd oraz stałą trwałości kompleksu, K_s = kjkd, które wynosiły, odpowiednio, 3,25χ10⁴ M'¹ s'¹ i 3,38χ10'³ s^-1 oraz 9,61x10® M’¹. Ze zmian kąta odbicia obliczono stężenie związanego w lukach molekularnych analitu. Stężenie to było równe stężeniu kompleksu [LA].

Za pomocą Równania (7) obliczono równowagowe stężenie nieobsadzonych luk [L]eq, fcaCft[L]eq ⁼ /Cd[LA]eq (7) a następnie całkowite ich stężenie, Clo, w MlP-ie.

Clq - [Lleq + [LA]eq (g)

Reakcję tworzenia kompleksu scharakteryzowano obliczając, ze stosunku równowagowej liczby kompleksów do całkowitej liczby luk molekularnych w ΜΙΡ-ie, wydajność hybrydyzacji, x_ef, (Tabela 5).

Tabela 5. Wydajności hybrydyzacji dla różnych stężeń analitu.

Stężenie
zastrzykniętego analitu, M	A/?eq	[LA], ng/mm2	cLg, ng/mm2	xef, %
3,00107	26	0,22	0,27	81
5,00107	31	0,26	0,31	84
7,5010-7	38	0,34	0,38	89

PL 239 699 Β1

Dla poszczególnych stężeń analitu w roztworze jej wartość zawierała się w zakresie od 80 do 90%.

Oznaczanie wybranego oligonukleotydu, GCGGCGGC, w próbkach rzeczywistych

Jeżeli do oznaczania DNA nie jest wymagany etap powielania za pomocą PCR, to oznaczanie to można podzielić na trzy następujące etapy: (a) ekstrakcja DNA z komórek, (b) oddzielenie DNA od pozostałych elementów komórek i (c) cięcie wyizolowanego DNA na krótsze fragmenty przez enzymy restrykcyjne. Etap (b) najczęściej wymaga stosowania czasochłonnej procedury obejmującej oddzielenie kwasu nukleinowego od pozostałych składników komórki, zagęszczenie preparatu DNA, a następnie usunięcie zanieczyszczeń niskocząsteczkowych. W ten sposób eliminowane są substancje towarzyszące analitowi, które mogą mieć wpływ na wielkość sygnału analitycznego. Dlatego opracowywane są metody analityczne, które nie są wrażliwe na zaburzenia sygnału przez substancje przeszkadzające w postaci tzw. efektów matrycowych.

Jako przykład oznaczania oktanukleotydu w próbkach rzeczywistych wyznaczono elektrochemiczną sprawność wykorzystywanego w niniejszych badaniach czujnika do oznaczania oligonukleotydu GCGGCGGC w roztworze zawierającym substancje pochodzenia komórkowego. W tym celu zarejestrowano sygnały EIS i skonstruowano wykresy Nyquista dla próbnika redoks po dodaniu do roztworu badanego płynu Dulbecco (DMEM) zawierającego analit GCGGCGGC o znanym stężeniu. Następnie zmierzono sygnały EIS i porównano je z sygnałami EIS zarejestrowanymi dla analitu rozpuszczonego w 0,1 M PBS (pH = 7,4). Na podstawie stosunku wielkości tych sygnałów oszacowano efekt matrycowy. Jak wynika z Tabeli 6, obecne w próbce substancje przeszkadzające nie mają wpływu na sprawność tego czujnika - efekt matrycowy nie występuje.

Tabela 6. Wyznaczenie efektu matrycowego na podstawie oznaczenia oligonukleotydu GCGGCGGC DNA w Płynie Dulbecco (DMEM).

Numer próbki	cGCGGCGGC wyznsczonp w DMEM, nM	cGCGGCGGC wyznaczone w PBSrf , Efekt
(pH = 7.4), nM	matrycowy, %
1.	2,68	2,99	89,63
2.	7,56	7,93	95,33
3.	38,82	33,81	114,81
4.	54,61	52,13	104,76
5.	71,10	69,77	101,90
Średnia			101,29

Przykład 3 - Zastosowanie czujnika elektrochemicznego zawierającego nowy analog oktanukleotydu

Przygotowany według opisu w Przykładzie 2 zintegrowany czujnik elektrochemiczny stanowiący układ polimer-elektroda, nadaje się do wykorzystania, m.in. w inżynierii genetycznej do budowy mikromatrycy DNA. Matryce te w dalszej perspektywie ułatwią przeprowadzenie bardziej zaawansowanych badań DNA i ekspresji genów oraz umożliwią szybkie i tanie badania genetyczne. Niniejszy wynalazek umożliwia wczesne wykrycie wielu dziedzicznych chorób genetycznych. Choroby te to problem kliniczny w każdej specjalności medycznej. Niniejsze badania stwarzają nowe możliwości diagnostyczne i terapeutyczne, w szczególności w odniesieniu do chorób nowotworowych, za które odpowiedzialne są zmutowane geny.

PL 239 699 Β1

Wnioski

Dzięki zastosowaniu wdrukowania molekularnego opracowano łatwą, szybką i niewymagającą katalizatora syntezę trwałego polibisbitiofenowego analogu DNA do oznaczania bogatego w nukleotydy guaninowo-cytozynowe oktanukleotydu, GCGGCGGC. Synteza ta nie wymaga ani modyfikacji cząsteczki szablonu (zastosowano kwas peptydonukleinowy, PNA, którego konformacja w niefizjologicznych warunkach elektropolimeryzacji była trwała) w celu poprawienia jego zdolności parowania, ani wprowadzenia grup umożliwiających jego osadzenie na powierzchni przetwornika. Zaprojektowano i zsyntetyzowano 2,2’-bitiofeno-5-ylowe monomery funkcyjne, które dzięki obecności w nich zasad nukleinowych naśladowały naturalne nukleotydy w parowaniu komplementarnych zasad PNA w roztworze. Co więcej, dzięki obecności elektroaktywnego podstawnika bisbitiofenowego w monomerach funkcyjnych możliwe było szybkie, kontrolowane przeniesienie tego kompleksu, za pomocą elektropolimeryzacji, na powierzchnię elektrody. Kompleks szablonu PNA zhybrydyzowanego ze spolimeryzowanymi monomerami funkcyjnymi przypomina podwójną helisę naturalnego DNA, zaś usunięcie PNA z luk molekularnych MIP-u odpowiada dehybrydyzacji. Odsłonięte dzięki temu wdrukowane luki molekularne z miejscami rozpoznającymi C i G, ułożonymi co do swej kolejności i orientacji przestrzennej komplementarnie do wiążących miejsc G i C oznaczanego oktanukleotydu, przypominają pojedyncze nici oligonukleotydu. Stąd też są zdolne do wiązania oznaczanego oligonukleotydu komplementarnego, co potwierdzono za pomocą pomiarów EIS i SPR.

Za pomocą pomiarów ITC wykazano, że stałe trwałości par komplementarnych zasad G i Cw, odpowiednio, 1 i 2 są zbliżone do stałych trwałości par A i T w analogicznych monomerach funkcyjnych, (Bartold, K. et al., 2017. ACS Appl. Mater. Interfaces 9, 3948-3958). Wyniki te powiązano ze zdolnością zsyntetyzowanego bisbitiofenowego analogu oznaczanego oligonukleotydu do rozpoznawania oligonukleotydów o sekwencjach różniących się punktowymi zmianami dwóch lub trzech zasad nukleinowych. To rozróżnienie zapewniło zadowalającą selektywność opracowanej metody oznaczania oligonukleotydu GCGGCGGC. Obliczono najniższe stężenie oligonukleotydu, wynoszące 200 pM, które można wyznaczyć za pomocą opracowanego i wytworzonego chemoczujnika przy stosunku sygnału do szumu wynoszącego 3:1. Okazało się, że wpływ matrycy na sprawność tego chemoczujnika jest zaniedbywalny. Wykazano, za pomocą pomiarów SPR w warunkach analizy przepływowo-wstrzykowej, że wiązanie oznaczanego oktanukleotydu przez warstwę rozpoznającą MIP-u jest odwracalne. Oznacza to, że po zregenerowaniu, chemoczujnik może być stosowany do oznaczeń wielokrotnie.

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Nowy bisbitiofenowy analog oktanukleotydu o sekwencji nukleotydów guaninowo-cytozynowych CGCCGCCG, w którym kwas peptydonukleinowy (PNA) o sekwencji GCGGCGGC (1) stanowi szablon molekularnego wdrukowania (szablon PNA) za pomocą bisbitiofenowych monomerów funkcyjnych: 4-bis(2,2’-bitien-5-ylo)metylobenzoesanu 2-(cytozyn-1-ylo)etylowego (o wzorze 2), eteru 2-guaninoetylowo-4-(di-2,2’-bitiofen-5-ylometylo)fenylowego (3), oraz monomeru sieciującego 2,4,5,2’,4’,5’-heksa(tiofeno-2-ylo)-3,3’-bitiofenu (4).

   PL 239 699 Β1
2. 2. Sposób wytwarzania nowego bisbitiofenowego analogu oktanukleotydu o sekwencji nukleotydów guaninowo-cytozynowych CGCCGCCG, w którym to sposobie tworzy się kompleks pre-polimeryzacyjny pomiędzy kwasem peptydon u klei nowym (PNA) o sekwencji GCGGCGGC (1) pełniącym funkcję szablonu wdrukowania molekularnego (szablon PNA) a cząsteczkami bisbitiofenowych monomerów funkcyjnych, tj.:

   4-bis(2,2’-bitien-5-ylo)metylobenzoesanu 2-(cytozyn-1-ylo)etylowego (2), eteru 2-guaninoetylowo-4-(di-2,2’-bitiofen-5-ylometylo)fenylowego (3), w obecności monomeru sieciującego, 2,4,5,2’,4’,5’-heksa(tiofeno-2-ylo)-3,3’-bitiofenu (4).
3. 3. Sposób wytworzenia czujnika elektrochemicznego do selektywnego wykrywania i oznaczania oligonukleotydu o sekwencji GCGGCGGC, w którym pre-polimeryzacyjny kompleks bisbitiofenowego analogu oktanukleotydu, określony w Zastrzeżeniu 1 i/albo otrzymany sposobem określonym w Zastrzeżeniu 2, kwasu peptydon u klei nowego (PNA) o sekwencji GCGGCGGC (szablon PNA, 1) z bisbitiofenowymi monomerami funkcyjnymi:

   4-bis(2,2’-bitien-5-ylo)metylobenzoesanem 2-(cytozyn-1-ylo)etylowym (2) i eterem 2-guaninoetylowo-4-(di-2,2’-bitiofen-5-ylometylo)fenylowym (3), najpierw poddaje się elektropolimeryzacji, w obecności monomeru sieciującego, 2,4,5,2’,4’,5’-heksa(tiofeno-2-ylo)-3,3’-bitiofenu (4), w warunkach potencjodynamicznych z wytworzeniem warstwy polimeru molekularnie wdrukowanego, którą osadza się na elektrodzie, a następnie z tej warstwy polimeru molekularnie wdrukowanego usuwa się szablon PNA.
4. 4. Sposób wytworzenia czujnika według Zastrzeżenia 2, znamienny tym, że szablon PNA usuwa się poprzez ekstrakcję z warstwy MIP-u roztworem zasady organicznej, korzystnie 0,1 M trietyloaminą.
5. 5. Sposób wytworzenia czujnika według Zastrzeżenia 3, znamienny tym, że ekstrakcję prowadzi się w podwyższonej temperaturze.
6. 6. Sposób wytworzenia czujnika według Zastrzeżenia 4, znamienny tym, że ekstrakcję prowadzi się w temperaturze 60°C, w czasie 60 min.
7. 7. Sposób wytworzenia czujnika według któregokolwiek z Zastrzeżeń od 2 do 5, znamienny tym, że stosuje się elektrodę z metalu szlachetnego, korzystnie platynową elektrodę dyskową.
8. 8. Sposób wytworzenia czujnika według któregokolwiek z Zastrzeżeń od 3 do 7, znamienny tym, że w procesie elektropolimeryzacji potencjał zmieniany jest liniowo z szybkością od 10 do 1000 mV/s, korzystnie 50 mV/s, w zakresie od -1,0 do +2,50 Vvs. Ag/AgCI, korzystnie od 0,50 do 1,25 V.
9. 9. Czujnik elektrochemiczny do selektywnego wykrywania i oznaczania oligonukleotydu o sekwencji GCGGCGGC, wytworzony sposobem określonym w którymkolwiek z Zastrzeżeń od 2 do 7, zawierający element rozpoznający w postaci unieruchomionej na powierzchni elektrody warstwy polimeru molekularnie wdrukowanego, z lukami molekularnymi do rozpoznawania cytozynę i guanidynę, ułożonymi w kolejności i orientacji przestrzennej komplementarnie do wiążących miejsc oznaczanego oligonukleotydu o sekwencji GCGGCGGC oraz zdolne do wiązania tego oligonukleotydu, przy czym warstwa polimeru molekularnie wdrukowanego ma grubość od około 120 nm do około 130 nm, korzystnie około 125 nm.

   PL 239 699 Β1
10. 10. Czujnik według Zastrzeżenia 8, znamienny tym, że elektrodę stanowi elektroda z metalu szlachetnego, korzystniej, gdy jest nią platynowa elektroda dyskowa.
11. 11. Zastosowanie czujnika elektrochemicznego, określonego w Zastrzeżeniu 9, do selektywnego wykrywania i oznaczania oktanukleotydu o sekwencji GCGGCGGC.