JPH09504334A

JPH09504334A - 導電性かつ電極活性機能化された共役ポリマーとその使用方法

Info

Publication number: JPH09504334A
Application number: JP7527410A
Authority: JP
Inventors: フランシィスガルニエ，
Original assignee: ベーイーオーメリュー
Priority date: 1994-04-22
Filing date: 1995-04-24
Publication date: 1997-04-28
Anticipated expiration: 2018-07-22
Also published as: WO1995029199A1; DE69531717T2; US6201086B1; CA2165978A1; FR2720832A1; EP0705291A1; EP0705291B1; ATE249487T1; JP3428652B2; US6096825A; DE69531717D1; ES2204949T3

Abstract

(57)【要約】導電性かつ電極活性の共役ポリマー及びその使用方法であり、このポリマーは、少なくとも１つの第１の生物分子またはアンチリガンドと共有結合した官能基を含み、下記式（ＩＩ）で表される。ただし、ｎは零でない整数であり、ｉは２からｎ−１の整数であり、Ｒ¹、Ｒ’ⁱ、及びＲ’ⁿは、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、あるいは、第１の生物分子またはアンチリガンドと共有結合しうるまたは共有結合した官能基を表す。

Description

【発明の詳細な説明】導電性かつ電極活性機能化された共役ポリマーとその使用方法ポリピロール、ポリチオフェン、ポリアニリン、ポリフェニレン、及びそれらの誘導体といった共役ポリマーは、その電極活性によって知られており、“有機導電性ポリマー・ハンドブック(Handbook of organic Conducting Polymers)、（T.J．Skotheim編、Marcel Dekker、ニューヨーク、１９８６）”等の総説に広く記載されている。これらのポリマーは、電極上のフィルムの形態、自己支持フィルム(self-supporting film)の形態、もしくはポリカチオン性またはポリアニオン性ポリマーと組み合わせた複合体の形態で得られ、有機電極のように振る舞う。即ち、アノード酸化過程に従って、電解質媒体からのイオンの挿入によって充電される。この電気化学的過程は可逆的であり、還元によって、この共役ポリマーまたは電極活性複合体からイオンが放出される。また、これらの付加的機能を有する共役ポリマーを与えることのできる官能基を、ポリマーのモノマー単位にグラフト共有結合させることによる、共役ポリマーの第２の生成手段が文献に記載されている。例を挙げると、電気触媒性金属錯体をポリピロールのモノマー単位にグラフトさせたり、特異的に錯形成した大環状基をポリピロールまたはポリチオフェン鎖にグラフトさせ、電解質媒体中のカチオンを認識させたり、キラル基をポリチオフェンにグラフトさせて、光学活性兄音を認識させたりしている。これらすべての機能化の過程も、以下の文献に詳述された改善方法の主題を構成する（F．Gernier，Angew．Chemie，1989，101， 529; A．Deronzier，J.C．Moutet，Acc．Chem．Res.，1989，22，249; J．Ronca li，Chem．Rev.，1992，92，711）。最近数年間に、著者らは、特に診断目的において、機能化導電性ポリマーを分析物の捕捉剤の改善に用いることに注目してきた。しかし、欧州特許出願０，３１４，００９号公報に示されているように、ピロールポリマーで、そのピロール環の窒素原子または炭素原子において直接置換されているものは、分析物の捕捉剤として良好ではなく、特に、官能基がヘテロ原子環に導入されているときは、そのポリマーの導電性が低下することが学界で一般に認められている。この問題を解決するために、本特許出願の著者らは、ピロール環の３−位において、有機分子と共有結合することのできる反応性部位をグラフトさせた２，５−ジ（２− チエニルピロール）ポリマーに注目した。しかしながら、チオフェン環の親油性のために、記載したポリマーは水性媒質中では導電性でも電極活性でもなく、従って、生物学的サンプルにおける分析物の捕捉及び／または特性化には適しないことがわかった（J．Roncali,等、Chem．Comm.，1986，783頁及びG.Tourillon，等、Electroanal．Chem.，161．407，1984参照）。ここで、極めて驚嘆すべきことに、また専門家の従来の認識に反して、ピロール環の３−または４−位において、目的とする官能基がピロール環から離間するようにさせる機能化試薬を用いて官能基をグラフトさせると、ポリピロールの導電性及び電極活性が保持されることが見出された。アンチリガンドは、この官能基の自由端に共有結合し、上述したような修飾ポリピロールの性質を示さない。そのような機能化されたポリマーは、今日まで開示されておらず、それらが生物学的リガンドの捕捉剤に極めて適していることが示された。さらにポリピロールは、その生体適合性によって優れたポリマーであることがわかった。最後に、そのように機能化されたポリピロールは、かなりの厚さ（数ミリメートル厚）の電極活性及び導電性ポリマーの調製を可能にし、それによって高い機能部位密度が得られるので、それに比例して感度が向上する。よって本発明の主題は、次式Ｉで表される導電性で電極活性機能化された(ele ctroactive functionalized)共役ポリマーである。ただし、ｎは零でない整数であり、ｉは２からｎ−１の整数であり、Ｒ１、Ｒｉ及びＲｎは、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、あるいは、第１の生物分子またはアンチリガンド(antiligand)と共有結合しうる官能基を表す。前記ポリマーは、非−機能化(non-functionalized)共役ポリマー、即ち、式ＩにおいてＲ１、Ｒｉ及びＲｎがＨであるものと実質的に同じオーダーの導電性及び電極活性を有する。より詳細には、この官能基は、下記の官能基の群から独立に選択される。Ｙｐ−Ｃ−Ｘ、但しＸはＨ、ＯＨ、置換または非置換低級Ｏ−アルキルラジカル、あるいはハロゲン、特にＣｌを表す；Ｙｐ−ＮＨＺ、但しＺはＨまたはアルキルラジカルを表す；Ｙｐ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＦ₃；Ｙｐ−Ｘ、但しＸは上記の定義により、ｐは好ましくは０、１または２の整数；−Ｓｉ（アルキル）３、−Ｓｉ（アルコキシ）３またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドのような活性化エステル基である。好ましくは、前記Ｙは、１から５の炭素原子を持つアルキル基、１から５の炭素原子を持つアルコキシル基、一般式（ＣＨ２−ＣＨ２−０）ｍ、−（ＣＨ２）ｍ’−に対応するポリエーテル、但しｍは１から３の整数でありｍ’は１又は２の整数である、から選択される基である。本発明の他の主題は、少なくとも１つの第１の生物分子またはアンチリガンドと共有結合した官能基を含む導電性で電極活性機能化された共役ポリマーであって、下記式ＩＩで表されるポリマーである。ただし、ｎは零でない整数であり、ｉは２からｎ−１の整数であって、Ｒ’¹、Ｒ’ⁱ及びＲ’ⁿは、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、あるいは、第１の生物分子またはアンチリガンドと共有結合しうるまたは共有結合した官能基を表す。前記生物分子またはリガンドに結合した官能基は、その生物分子またはリガンドとの反応の前に、下記の官能基の群から選択される。Ｙｐ−Ｃ−Ｘ、但しＸはＨ、ＯＨ、置換または非置換低級Ｏ−アルキルラジカル、あるいはハロゲン、特にＣｌを表す；Ｙｐ−ＮＨＺ、但しＺはＨまたはアルキルラジカルを表す；Ｙｐ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＦ₃；Ｙｐ−Ｘ、但しＸは上記の定義により、ｐは好ましくは０、１または２の整数；−Ｓｉ（アルキル）３、−Ｓｉ（アルコキシ）３またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドのような活性化エステル基である。特に、前記生物分子と結合した官能基は、それが第１の生物分子と反応する前においては、同一であり、−（ＣＨ₂）−ＣＯＯＨからなる。また、前記第１の生物分子またはアンチリガンドは、ペプチドまたはペプチド誘導体、特にＧｌｙ −Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ、及びＰｈｅ−Ｈｅａ−Ｐｒｏから、及び、ＣＣＴＡＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧの配列のオリゴヌクレオチドのようなポリヌクレオチドから選択される。本発明のさらに他の主題は、アンチリガンドとは異なり、アンチリガンドと特異的に相互作用する第２の生物分子またはリガンドを、インビトロまたはインビボで検出または検定するための上記の共役ポリマーの使用方法であって、その方法においては、前記リガンドと結合していない共役ポリマーと該リガンドと結合した共役ポリマーとの間の、電位差または電流変化を観察及び／または測定することによってリガンドが検出及び／または検定される。特に、本発明のポリマーは、タンパク質分解酵素、中でもカルボキシペプチダーゼＡ、またはポリヌクレオチドを検出及び／または検定するために、あるいは、アンチリガンドとは異なり、アンチリガンドと特異的に相互作用する第２の生物分子またはリガンドを、インビトロまたはインビボで抽出するために用いられる。本発明の１つの実施態様では、前記共役ポリマーが、金属または炭素誘導体などの導電性基体に析出されるか、または自己支持フィルム状に形成される。最後に、本発明は、金属または炭素誘導体などの導電性基体と、上述のポリマーとからなる電極及び自己支持フィルムに関する。ひとつの実施態様において、アンチリガンドはリガンドまたは標的分子に特異的である。このアンチリガンドは、特にアンチリガンド／標的分子複合体を形成するように選択される。一例を挙げると、この複合体は、特に、任意のペプチド／抗体、抗体／ハプテン、ホルモン／レセプター、ポリヌクレオチドハイブリッド／ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド／核酸の組み合わせ等である。本発明で用いる「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも５つのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列であって、例えば、イノシン (inocine)、５−メチルデオキシシチジン(citidine)、５−ジメチルアミノ−デオキシウリジン、デオキシウリジン、２，６−ジアミノプリン、５−ブロモデオキシウリジン、または他のハイブリデーション(hybridation)できる修飾塩基といった修飾塩基を含むヌクレオチド等の修飾ヌクレオチドを任意に含むものを意味する。このポリヌクレオチドは、（例えば、ホスホロチオエート(phosphoroth ioate)、Ｈ−ホスホネート(H-phosphonate)、及びアルキルホスホネート結合のような）ヌクレオチド間結合において、または、例えばα−オリゴヌクレオチド（仏国特許２，６０７，５０７号公報）あるいはＰＮＡｓ（M．Egholm，等、J.A m.Chem.Soc.，(1992)，114，1895-1897）の骨格において修飾されていてもよい。これらの修飾を組み合わせてもよい。本発明における「ペプチド」という用語は、特に少なくとも２つのアミノ酸の任意のペプチドであって、特に抽出され、分離され、または実質的に単離または合成されたタンパク質、タンパク質フラグメント、またはオリゴヌクレオチドで特に化学合成または組み替え生物での発現によって得られたもの；任意のペプチドであって、ＣＯ−ＮＨ結合の少なくとも１つ、好ましくは全てのＣＯ−ＮＨ結合が、１つ（またはそれ以上）のＮＨ−ＣＯ結合で置換されているもの；任意のペプチドであって、ＣＯ−ＮＨ結合の少なくとも１つ、好ましくは全てのＣＯ− ＮＨ結合が、１つまたはそれ以上のＮＨ−ＣＯ結合で置換されており、各アミノアシル残基のキラリティーが、上記の１つまたはそれ以上のＣＯ−ＮＨ結合に含まれているか否かにかかわらず、参照ペプチドを構成するアミノアシル残基に対して、保存または反転しているものを意味し、これらの化合物は、イムノレトロイド(immunoretroids)、ミモトープ(mimotope)とも呼ばれる。ペプチドの多くの種類はグラフトしていてもよく、以下に例を挙げるが、これらに限られるものではない。副腎皮質刺激ホルモンまたはそのフラグメント、アンギオテンシン類似体またはその阻害剤（腎性高血圧症を調節するレニン−アンギオテンシン系の成分）、ナトリウム排泄増加性ペプチド、ブラジキニン及びそのペプチド誘導体、走化性ペプチド、ダイノルフィン及びその誘導体、エンドルフィンまたは類似体、エンセファリン(encephalins)またはその誘導体、酵素（プロテアーゼ等）の阻害剤、フィブロネクチンのフラグメント及び誘導体、消化管ペプチド、成長ホルモン放出に関連したペプチド、ニューロテンシン及び類似体、オピオイドペプチド、オキシトシン、バソプレッシン、バソトシン及び誘導体、貴なーぜタンパク質。ペプチド及びポリヌクレオチドは、高い生物学的活性を持ち、多くの生物学的機能を制御することが知られている（A.S．Dutta，薬物研究の進歩(Advances in Drug Research)，B．Testa 編，Academic Press，ニューヨーク，1991，21，14 5）。例えば、ペプチドは、アゴニストまたは拮抗体として極めて高い治療能力を示し、酵素に強く結合する阻害剤として非常に強力であり、このことが親和性クロマトグラフィーの基礎になっている。さらに、他の標的核酸フラグメントまたはヌクレオチドとの選択的ハイブリダイゼーション反応により、ポリヌクレオチドは有利な認識現象を生じ、特に新規な遺伝子捕捉剤として用いられるようになる。従って、標的核酸または核酸フラグメントを検出及び／または検定するために、少なくとも部分的にアンチリガンドポリヌクレオチドと結合した機能化ポリマーを、標的を含むと思われるサンプルに接触させると、ハイブリダイゼーション反応が起こっているか否かを検出することができる。この検出は、非−結合ポリマーと、標的と反応した結合ポリマーとの間の電位差または電流変化の直接測定であってもよいし、標的と反応しうる付加的ポリヌクレオチドの検出を用いた上記の測定による間接的なものでもよい。この付加的ポリヌクレオチドは、アンチリガンドポリヌクレオチドに隣接し、電極活性分子でラベルされているのが好ましい。本発明における「抗体」という用語は、任意のモノクローナルまたはポリクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、またはＦｃフラグメントといった前記抗体のフラグメント、及び、遺伝子修飾または組み替えによって得られるにんいの抗体意味する。ピロール環の３−または４−位におけるポリピロールの機能化は、モノマー単位に施してから重合してもよいし、予め重合したポリマーのモノマー単位に施してもよい。ピロール環の３及び／または４位の原子と反応しうる少なくとも１つの反応性基を含む任意の適当な機能化試薬を用いることができる。この機能化試薬は、単機能試薬であって、ポリピロール環へのグラフト過程の後に、引き続く安置リガンドとの反応のための新規な反応性機能が導入されるものであってもよく、この新規な反応性機能は、２官能性試薬、特にホモ−またはヘテロ−２官能性試薬のような多機能性である。例を挙げると、機能化試薬は、置換または非置換アルキルまたはアルコキシまたはポリエーテル鎖であって、末端に反応性基を持つものから選択される。この反応性基は、カルボキシル、ヒドラジド、アミン、ニトリル、アルデヒド、チオール、ジスルフィド、ヨードアセチル、エステル、無水、トシル、メシル、トリチル、またはシリル基等のような官能基で表される。本発明の機能化ポリピロールと、例えばポリヌクレオチドといったアンチリガンドとの共有結合の結果得られる共役の形成は、周知の、いわゆる直接法または間接法に従って行うことができる。例えばポリヌクレオチドの場合、直接法に従えば、ヌクレオチド鎖の任意の位置、例えば、５’末端または３’末端または塩基またはヌクレオチド間ホスフェートまたは糖の２’位に反応性基を有するポリヌクレオチドが調製される。次いで、このポリヌクレオチドは、予め調製され、上記の反応性基と相補的な反応性基を含むポリマーと結合される。即ち、一方はポリヌクレオチド由来であり、他方はこの機能化ポリマー由来である２つの相補的反応性基間の反応により、共有結合を形成する。例えば、よく知られているように、１級アミンは活性化したカルボン酸またはアルデヒドと結合できるし、また、チオール基はハロアルキルと結合できる。好ましくは、ポリマーと結合するためのポリヌクレオチド上の反応性基は、５’または３’末端である。間接的結合法では、ポリヌクレオチドとポリマーとが各々反応性基を持ち、これらの反応性基は互いに同じでも異なっていてもよいが、これらの反応性基は相補的ではなく、２官能性の中間結合試薬とは反応する（２つの反応性基が同一であれば中間結合試薬はホモ２官能性であり、反応正規が異なればヘテロ２官能性である）。ホモ２官能性結合試薬の中では、ＤＩＴＣ（１，４−フェニレンジイソチオソアネート）、ＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベレート(suberate)）、またはその類似体を挙げることができる。ヘテロ２官能性結合試薬の中では、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１− カルボキシレート）、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート）を挙げることができ、それらは、一方では１級アミンと反応でき、他方ではチオールと反応できる。本発明は、添付した図面を参照して以下の詳細な説明を読むことによって、より理解されるであろう。図１は、共役ポリマーを例示した図であり、１）はポリアセチレン、２）はポリピロール、３）はポリチオフェン、４）はポリフェニレン、そして５）はポリアニリンである。図２Ａは、３位を酢酸（１）で置換したポリピロールを示し、図２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、及び２Ｆは、３位を種々のペプチド（各々（２）から（６））で置換したポリピロールを示す。図３は、以下に説明する４種の機能化ポリマーの、０．５ＭのＨ₂Ｏ−ＮａＣｌ媒質中でのボルタモグラムである。（１）はポリ（ピロール−酢酸）、（２）はポリ（ピロール（Ｇｌｙ−ＤＰｈｅ））、（３）はポリ（ピロール（Ｖａｌ））、そして（４）はポリ（ピロール（Ｐｈｅ））である。図４は、０．５ＭのＨ₂Ｏ−ＮａＣｌ媒質中での、カルボキシペプチダーゼＡ存在下でのポリ（２）のボルタモグラムである。カルボキシペプチダーゼＡの濃度は、（ａ）５ｃｍ³の電解液中０．０ｇ、（ｂ）５ｃｍ³の電解液中１．２ｇ、（ｃ）５ｃｍ³の電解液中２．４ｇ、及び、（ｄ）５ｃｍ³の電解液中５．０ｇである。図５は、電極、ポリ（２）のアンペロメトリック応答を、媒質中に存在する酵素、カルボキシペプチダーゼＡのナノモルで表した量の関数として表したグラフである。飽和カロメル電極に対して０．３Ｖの電位において、酵素の量と電流値との間に比例関係が観察された。図６は、機能化された導電性ポリマーによって認識された生物学的化学種の存在を（増幅して）検出するための電界効果微小電気化学トランジスターの理論図である。略語は以下の意味を持つ。Ｐはポリマー、Ｓｕｂは基板、Ｓ及びＤは、各々ソース及びドレインである。ＣＥは格子Ｇとして振る舞う対向電極、Ｒは参照電極であり、Ｐｏｔｅｎｔはポテンシオスタットである。図７は、機能化ポリピロール膜を有する２−区画の電気化学セルの理論図であり、電極活性な共役ポリマー鎖にグラフトされた置換基によって生物学的化学種を抽出するためのものである。図８は、０．１ＭのＬｉＣｌＯ₄−アセトニトリル媒質中での、飽和カロメル参照電極に対するポリ［Ｎ−３−ヒドロキシスクシンイミドピロール］のボルタモグラムであり、高い電極活性及び高い電気化学的可逆性を示している。図９は、ポリ（［ピロール−ＯＤＮ］［ピロール−ＣＯＯＨ］）コポリマー電極のボルタモグラムであり、ＯＤＮはＣＣＴＡＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧの配列を持つポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。このポリマーを、非標的配列であるＧＧＴＧＡＴＡＧＡＡＧＴＡＴＣとインキュベートした後では、変化が見られなかった。図１０は、ポリ（［ピロール−ＯＤＮ］［ピロール−ＣＯＯＨ］）コポリマー電極のボルタモグラムであり、ＯＤＮはＣＣＴＡＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧの配列を持つオリゴヌクレオチドである。この電極を、標的である３３５ｎｍｏｌのＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＴＡＧＧと、３７℃で２時間インキュベートした。その後、この電極をリンスし、電気化学媒質中で分析した。先のボルタモグラムに対して電位のシフトが見られた。本発明のポリマーは、サンプル中に存在し、アンチリガンドまたはグラフトしたアンチリガンドと反応しうる生物学的活性種の検出に特に使用することができる。確かに、上述したように、ヘテロ環の３−位において、１つまたはそれ以上のアンチリガンドでグラフトして機能化した共役ポリマーは、１つまたはそれ以上のリガンドと反応した後、生物学的媒質中のリガンドと反応していない参照用ポリマーに対して、電気化学的応答が変化することが示された。このことは、酸化電位の変化によって見ることができる。電気化学的ボルタモグラムにおけるポリマーのこの酸化還元の変化は、捕捉剤型機能に伝えられ、従って、生物学的活性種の定量的測定に用いることができる。その測定は、一定電流での電位変化、または一定電圧での電流変化、あるいは電界効果微小電気化学的トランジスターの形成によって行われる。さらに、本発明のポリマーは、溶液中の生物学的活性種の抽出にも用いることができる。多くの場合、溶液中の生物学的活性種は、生物活性ペプチドやポリヌクレオチドといったポリマー鎖にグラフトしたアンチリガンドに強く結合し、それによって、媒質中から生物学的活性種を選択的に抽出することができる。このタイプの抽出は、インビトロでも行えるし、支持ポリマーが、例えばポリピロール等の生体適合性であれば、インビボでも行うことができる。最後に、本発明のポリマーは、生物学的活性種（酵素など）の、ある媒質中から他の媒質中への放出源ともなる。本発明の電極活性導電性ポリマーの、生物学的に興味のある化合物に対する認識を示すグループによる機能化は、核酸（ＮＡ）の認識にまで拡張することができる。従って、ポリマーの共役した鎖に沿ってポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであるＯＤＮをグラフトすることによって、生物学的媒質中の対応するＮＡまたはＮＡフラグメントを識別できるようになる。この認識は、ポリマー上にグラフトされたＯＤＮと、機能化ポリマーのフィルムが浸漬される外部媒質中に存在する対応ＮＡとの間の選択的ハイブリダイゼーションによって行われ、後に述べる「ペプチド／酵素」の認識に類似している。この「ＯＤＮ／ＮＡ」の複合によって、共役ポリマーの物理化学的性質が変化し、その特性化によって意図したＮＡの存在が確認される。要点は、「ＯＤＮ／ＮＡ」認識の間に変化する予定のポリマーの物理化学的特性の性質に関連している。確かに、ＮＡの存在を測定するための高速、高感度、及び定量的な方法を発展させるために、本発明の目的は、「ＯＤＮ／ＮＡ」ハイブリダイゼーションの後に電気化学的応答が変化する電極活性材料の開発に関する。この変化は、ポリマーの酸化電位の変化といったポテンシオメトリック型、または、所定の電位で観察される酸化（または還元）電流の変化といったアンペロメトリック型を含んでいる。電気化学的応答におけるこれらの変化は定量的に測定でき、機能化ポリマーフィルムは、上述したようなポリピロールにグラフトしたペプチドによる酵素の認識の場合と同様に、アンペロメトリック型またはポテンシオメトリック型、あるいは電界効果微小電気化学的トランジスターの形態のいずれでも用いることができる。このタイプの測定の利点は、速さ、感度、及び、ｎの標的と非標的ＯＤＮを含む２ｎ測定部材を容易に作製できる可能性を持つことであり、従って、媒質中の遺伝子の有無を容易に識別できる。上述した酵素的認識と同様に、第２の要点は、認識現象に対する電気化学的応答を得るためには、ヘテロ環（ピロール）の３−位における機能化が必要であるという事実に関する。これらのポリマーの正確な電気化学的応答を確立するために、共役鎖を機能化が、機能化ポリマーの相当な電極活性に匹敵することが必要である。そのような電極活性要求を満たすには、ポリピロールのような親水性ポリヘテロ環の場合には、ピロール環の３−位において機能化を実施しなければならない。本発明のポリマーは電極活性ポリマーであり、その全てのモノマー単位がオリゴヌクレオチドのようなアンチリガンドで機能化されていてもよいし、数個のモノマー単位がそのように機能化されていてもよい。モノマー単位は、同種あるいは異種のアンチリガンドで機能化されていてよく、異種の場合は、本発明のポリマーは同じサンプル中で数個の標的リガンドを検出するために用いることができる。本発明のポリマーは、以下の異なる経路で調製することができる。ａ）全部が機能化されたポリマーこの経路では、第１の工程は、ピロール等のモノマーの、所定のオリゴヌクレオチド等のアンチリガンドによる機能化である。次いで第２の工程は、このモノマーの重合であり、その結果、全てのモノマー単位が機能化されたポリマーのフィルムを得る。ｂ）部分的に機能化されたコポリマー標的が核酸である特別な場合、一般的にそのサイズが大きいことを考えると、ポリマー中の小さなサイズのモノマー単位全てを機能化する必要がない。そこで、一つの経路はコポリマーの合成であり、そのコポリマーは、上記ａ）に記載した機能化モノマー単位と、アンチリガンドオリゴヌクレオチドで機能化していないピロール単位とを含んでいる。ｃ）前駆体ポリマーの機能化ポリマーフィルムの部分的な機能化は、共役ポリマーからも実施できるが、そこには、オリゴヌクレオチド等のアンチリガンドのグラフト化に適合する化学的基が予め導入されている。この経路では、［Ｎ−３−ヒドロキシスクシニミドピロール］等の、グラフト用シントンを含むモノマーが最初に合成される。このシントンである［Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド］は、後にオリゴヌクレオチドをグラフトさせることが知られている。このモノマーは、引き続いて重合、または他のピロール誘導体と共重合される。次いで、得られたポリマーフィルムを、オリゴヌクレオチドを含む反応媒体中に浸漬し、ピロールモノマーにこのオリゴヌクレオチドをグラフトさせる反応を起こさせる。実際に、このグラフト化は、ポリマーを構成するピロールモノマー単位のうちの数個のみを含む。実施例１：モノマーの合成以下の実施例において、ポリピロール（１）が、その生体適合性によって共役ポリマー支持体として選択された（H．Naarmann，私信）。アセチルスペーサー手Ａをピロール環の３位の炭素原子とペプチド置換体との間にグラフトさせ、対応する機能化ポリピロールが導電性と電極活性を保持するようにした。保護されないカルボキシル末端またはメチルエステル形で保護されたカルボキシル末端を持つ種々のペプチドを、それらの生物学的関連性から選択し、ピロール−酢酸モノマー、ＰｙＡ（１）、にグラフトさせた。数種のモノ−またはジ−ペプチドをグラフトさせ、図２に示した以下のピロール誘導体を導いた。ピロール−酢酸、ＰｙＡ（１）、ピロール（グリシン−ｄフェニルアラニン）、Ｐｙ（Ｇｌｙ−ＤＰｈｅ）（２）、カルボキシペプチダーゼＡ（シグマ）及びトリプシン（シグマ）のようなタンパク質分解酵素との複合体形成能力による（J ．R．Uren，Biochem．Acta，1971，236，67）、ピロール（バリン）、Ｐｙ（Ｖａｌ）（３）、ピロール（フェニルアラニン）、Ｐｙ（Ｐｈｅ）（４）、ピロール（フェニルアラニン−プロリン）、Ｐｙ（Ｐｈｅ−Ｐｒｏ）（５）。フェニルアラニン−ヒドロキシエチルアミン−プロリン、Ｐｙ（Ｐｈｅ［ＨＥＡ］Ｐｒｏ）のような嵩高いジペプチドもグラフトさせた。これは、ＡＩＤＳのＨＩＶ−１ウイルスの伴う蛋白質分解酵素の有効な阻害剤として知られている。これらのモノマーは、開示されている化学的経路に従って合成された（D．Delabouglise，F ．Garnier，Synth．Met.，1991，39，117）。これらのモノマーは、精製し、ＮＭＲ、微小分析、及びマス・スペクトルによって同定した。実施例２：重合これらのモノマーを、０．７ｃｍ²の白金電極上、及び表面積１０ｃｍ²の白金格子上で、０．５ＭのＮａＣｌを含むプロピレンカーボネート媒質中で、０．８Ｖ／ＳＣＥの定電位で重合させた。厚さ１０μｍまでの密なポリマーフィルムが得られた。図３に示したように、これらのポリマーの電極活性は、中性ｐＨ７の０．５ＭのＨ₂Ｏ−ＮａＣｌ媒質中でのサイクリックボルタンメトリーによって確認した。酸化電位は、０．３０Ｖ／ＳＣＥのオーダーであり、非置換のポリピロールの値と近く、これらのポリピロールの電極活性がジペプチドで機能化されたことが確認された。実施例３：カルボキシペプチダーゼＡの認識これらのポリピロールのタンパク質分解酵素に対する複合体形成の特異的性質が、中性ｐＨにおいて（Ｇｌｙ−ＤＰｈｅ）と安定な複合体を形成することが知られているカルボキシペプチダーゼＡを用いて分析された。０．５ＭのＨ₂Ｏ− ＮａＣｌ中でのカルボキシペプチダーゼＡの濃度を、５ｃｍ³中で１ｍｇから５ｍｇの範囲で増加させた溶液で分析した。非置換ポリピロール、またはポリ（３、４、５、または６）等の非特異的電極を溶液中に浸漬したときは、実施例２で得られたものと同じボルタモグラムが観察され、変化が見られなかった。しかし、ポリ（ピロール（Ｇｌｙ−ＤＰｈｅ））、ポリ（２）、を用いると、ボルタモグラムは高電位側にシフトし、最初のカルボキシペプチダーゼＡがゼロのときの０．３４０Ｖ／ＳＣＥから、溶液中に５ｍｇの化ルポ岸ペプチダーゼＡがある上限のときの０．５００Ｖ／ＳＣＥまで変化した。この結果を図４に示すが、明らかに電位シフトが見られ、それは、酵素とポリマー鎖のジペプチド骨格との複合体形成の間に生ずるピロール鎖の立体障害及び硬化によると思われる。この酵素とポリ（ピロール−ジペプチド）との複合体形成は、従来から親和性クロマトグラフィーで行われているように、ｐＨ３の酸性媒質中に酵素が放出されることによって確認された（I.M．Chaiken，M．Wilcheck，I．Parikh，Affinity Chromat ography and Biological Recognition，Academic Press，ニューヨーク，1983）。放出された酵素は、クーマシーブリリアントブルーによる酵素活性の測定を含む、標準ウシ血清アルブミンを用いた従来のブラッドフォード(Bradford)試験により特性化した。１クーロンの重合電気量に相当する５×１０^-6のモノマー単位を含むポリ（Ｇｌｅ−ＤＰｈｅ）フィルムを用いた場合、酸性媒質中への放出の後、４００ミリグラムという相当な量のカルボキシペプチダーゼＡが得られた。３０７アミノ酸ユニットというこの酵素の大きさを考慮すると、この放出された量は、（ピロール−ジペプチド）の２００のモノマー単位当たりに、約１分子の酵素が複合していたことを示し、これは（約１００倍という）大きさの違いからも妥当である。この結果は、酵素がポリマーフィルムの内側に分配され、それによって、酵素に対するこのフィルムの透過性が現れることも示している。酵素としてトリプシンを用いた比較データも得られている。所定の電極電位において、図４に見られるように、酵素濃度による電流値の変化が観察される。この結果は、電極のアンペロメトリック応答に対応し、この応答の有利な性質の一つは、図５に示したように応答が比例関係であることである。この比例関係は、溶液中の生物学的化学種の定量的検定の提案を可能にする。この検定は、電気化学タイプの捕捉剤を用いてもよいし、図６に模式的に示したような電界効果トランジスターの発達によってもよい。この作動原理は以下の通りである。ポリマーは、基板上に配列されたソース及びドレイン電極上に形成される。この組立物を、分析する溶液中に浸漬し、同じ媒質中の対向電極が、このトランジスターの格子(grille)を表す。この格子電極が、酵素濃度によるボルタモグラムの変化が最大となる、図４に示した場合では約０．２Ｖとされたとき、ポリマーの導電性が酵素濃度によってかなり変化する。そのときソースとドレインとの間にかけられた電圧が、増幅した信号を得ることを可能にし、このトランジスターは、電界効果トランジスターの原理に従って作動する。実施例４：酵素の制御された放出これらの電極のさらなる有利な特徴は、文献に記載されているように、ポリ（ピロール−酢酸）またはポリ（１）が、電気学的に酸化したときに電解質媒体中にプロトンを放出することである（P．Bauerle等，Adv．Mater.，1990，2，490 ）。小容量の電解質では、ｐＨが大きく変化し、３のオーダーまで変化する。このプロトンの放出は、カルボキシル基がピロール環から離間しているときにも観察され、例えば、保護されていないアミノ酸またはペプチドがピロールにグラフトされている場合に見られる。プロトンの制御された放出には２つの経路がある。カルボキシル末端基ＣＯＯＨが保護されていないペプチドを用いるものと、ピロール−酢酸とピロール−保護されたペプチドとのコポリマーを用いるものである。この第２の経路について述べる。Ｐｙ（Ａ）、（１）、と、Ｐｙ（Ｇｌｙ −ＤＰｈｅ）、（２）、とのコポリマーを、上述と同条件で電気化学的に合成する。０．３Ｖ／ＳＣＥでの電気化学的酸化によって、このポリ（１、２）のコポリマーは、電極近傍において、ｐＨ＝４までの大きなｐＨ変化をもたらす。このポリ（１、２）コポリマーを用いて、あるいは、カルボキシル基が自由なポリ（２）ポリマーを用いて、抽出のための２つの過程を実施することができる。一方はバッチ過程であり、他方は連続過程である。ａ）バッチ過程この過程は、上述の材料に基づいた膜又は電極を用いることからなり、それを他の化学種と共存する意図した生物学的活性種を含む媒質に接触させる。グラフトしたペプチドの意図した化学種に対する選択的な親和性が、この化学種の、電極又は膜のポリマーにグラフトされたペプチドへの複合体形成を起こす。この膜又は電極を、分析媒質から取り出して、回復媒質と呼ばれる他の媒質中に導入する。ＮａＣｌ型の支持塩を含むこの回復媒質中で、電極または膜は電気化学的酸化を受け、それがカルボキシル基によるプロトンの放出を起こして、解離及び意図した化学種の放出に十分なｐＨにまでなる。ｂ）連続過程ポリ（１、２）コポリマー、またはカルボキシル基がフリーなポリ（２）を、膜または電極形状に調製した。任意に、ポリカチオン性またはポリスチレンスルホン酸型のポリアニオン性の支持ポリマー、あるいはＮＡＦＩＯＮのようなパーフルオロ膜を用いた。この複合電極または膜は、図７に模式的に示したように、２つの区画Ａ及びＢの間に接合を形成する。この過程によるカルボキシペプチダーゼＡの連続抽出の一例を以下に説明する。図７に概略を示したものの場合、バイオ選択性部材は、ＮＡＦＩＯＮ（Ａｌｄｒｉｃｈ）膜中で重合した上記のポリ（１、２）コポリマーからなる。この膜は、非常に微小な白金格子上で、線状高級アルコール（Ａｌｄｒｉｃｈ）の混合物中の、ＮＡＦＩＯＮの５％溶液１０μｌを蒸発させることによって得た。そのようにして得たＮＡＦＩＯＮ膜は、約５μｍの厚さを持ち、ポリ（１、２）コポリマーの電気重合の支持体として働いて、ポリ（１、２）−ＮＡＦＩＯＮ電極活性複合膜を得る。最初の工程１において、０．５ＭのＨ₂Ｏ−ＮａＣｌ媒質中の１０ｇのカルボキシペプチダーゼＡを、区画Ａに導入する。すると、［ポリ（１、２）］−ＮＡＦＩＯＮ複合膜上での複合体形成が、上記実施例３で述べたように、（２）のペプチド単位において即座に起こる。次いで、区画Ｂに導入した対向電極と参照電極とを用いて酸化を施す。第二の工程２における電気化学的酸化は、区画Ｂにおいて約ｐＨ４になるまでのプロトンの放出と、カルボキソペプチダーゼＡの迅速な放出をもたらす。この連続過程の１回のサイクルの終了後、酵素活性検定で決定したところ、１．２グラムのカルボキシペプチダーゼＡが区画Ａで回収された。これらの結果により、これらの電極の酵素に対する認識現象、及び、これらの酵素を抽出する能力が確認された。この挙動は、ポリピロール鎖にグラフトされたジペプチドの化学的性質と１対１に結びついている。実施例５：ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドで機能化されたポリピロールの合成この合成は以下の３工程に従って行なわれた。ａ）［Ｎ−３−ヒドロキシ−スクシンイミドピロール］モノマーの合成０．４ｍｏｌのピロール−酢酸（Ｉ）、３０ｍｌのクロロホルム、及び０．４ｍｏｌのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を、三つ口フラスコに導入した。この混合物を撹拌し、２０ｍｌクロロホルム中のヂシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の０．４ｍｏｌを滴下した。２時間の撹拌後、白色固体が形成され、それを濾過してクロロホルムで洗浄した。不要な反応生成物を取り除くため、蒸発及び洗浄を施した後、生成物をクロロホルムから再結晶させた。意図した化合物の［Ｎ−３−ヒドロキシ-スクシンイミドピロール］（ＩＩＩ）が、白色粉状で得られた。融点、ｍ．ｐ．＝１３５℃、¹ＨＮＭＲ（ｐｐｍ）：（ＮＨ、１Ｈ、９、ｓ）；ピロール（２Ｈ、６．７、ｍ）：ピロール（１Ｈ、６．１、ｓ）；ＣＨ₂（２Ｈ、３．８、ｓ）；ヒドロキシスクシンイミド（４Ｈ、２．８、ｓ）。ｂ）電気重合によるポリマーの合成０．５ＭのＬｉＣｌＯ₄と０．１Ｍのモノマーを含むアセトニトリル溶液の電気化学的重合。電気重合は、表面積０．７ｃｍ²の白金電極上で、飽和カロメル電極に対して０．９Ｖの電位で、３０ｍＣの電気量をもちいて実施した。電極上に、ポリ（ＩＩＩ）に相当する黒色の膜が現れ、その厚さは約２００ｎｍであった。このポリマーの電極活性を０．５ＭのＬｉＣｌＯ₄−アセトニトリル中で分析したところ、図８に示したように、酸化ピークが０．２８Ｖ／ＳＣＥであり、還元ピークが０．２４Ｖ／ＳＣＥであった。これらの酸化及び還元ピーク間の４０ｍＶというわずかな相違は、このポリマーの極めて優れた電極活性及び可逆性を確信させる。ｃ）オリゴヌクレオチドＯＤＮのグラフト化ポリマーフィルムを有する上記の電極を反応場質中に浸漬した。この反応媒質は、ジメチルホルムアミドと、１０％の０．１Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ９．３）及び２６．２ナノモルの１４−塩基オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）との混合物からなる。ＯＤＮは、ＣＣＴＡＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧの配列、及び、５’アミノ基を含み、このアミノ基が、ポリマーのピロール単位のＮ−ヒドロキシスクシンイミド基とのカップリング反応を起こす。このカップリング反応は２時間以上起こさせる。グラフト化は、酢酸中における、オリゴヌクレオチドで置換されないスクシンイミド基の加水分解も伴う。このようにして得られた電極上のポリマーは、ポリ（［ピロール−ＯＤＮ］［ピロール−ＣＯＯＨ］）コポリマーに相当する。実施例６：認識現象の特性化認識現象を、実施例５（ｃ）で得たポリ（［ピロール−ＯＤＮ］［ピロール− ＣＯＯＨ］）ポリマーフィルムを電気化学的に特性化することによって確認した。電気化学的分析は、まず、合成後に得られた電極にそのまま実施し、次いで、この電極を標的ＯＤＮ及び非標的ＯＤＮ存在下に配置してから実施した。従って、このポリマーのハイブリダイゼーション反応は、ＰＥＧで緩衝した水溶液中において、相補的ＯＤＮ（標的）及び非相補的ＯＤＮ（非標的）の存在下で行った。インキュベーションは、３３５ナノモルの濃度の標的ＯＤＮであるＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＡＧＧの存在下、または、２７２ナノモルの濃度の非標的ＯＤＮであるＧＧＴＧＡＴＡＧＡＡＧＴＡＴＣの存在下で、３７℃で２時間行った。反応後、フィルムをＰＥＧバッファーで洗浄し、再クリックボルタンメトリーで分析した。得られたボルタモグラムを図９及び図１０に示す。図９の結果によると、合成後標的または非標的配列の存在下に配置する前は、ポリマーは０．３４Ｖ／ＳＣＥにおいて可逆的な酸化ピークを示し、この機能化ポリマーの電極活性が確認された。非標的配列の存在下でのインキュベーション反応の後に洗浄した後では、ボルタモグラムには変化が見られなかった。一方、このポリマーを標的の存在下でインキュベートしたときは、得られたボルタモグラムは、図１０に示すように異なっており、酸化電位は６０ｍＶ上昇して、０．４Ｖ／ＳＣＥとなった。この上昇が、ＯＤＮと対応する標的との間に生じたハイブリダィゼーションを全体的に示している。この酸化電位の上昇は、ポリピロール鎖に吊り下げられた腕の複合体形成現象によるものであり、従って、このポリマーの酸化に必要なエネルギーが増加したことによる。この結果により、この新規な部類の電極活物質である３−位をオリゴヌクレオチドで置換された共役ポリヘテロ環が、相補的なＤＮＡの認識現象を効果的にもたらし、さらに、これらの材料がこの選択的ハイブリダイゼーションを電気化学的に読み取れることが確認された。この電気化学的読み取りは、電気化学的、アンペロメトリック型またはポテンシオメトリック型の電気化学的遺伝子捕捉剤への道を開き、さらに、アンペロメトリック応答に基づく電界効果微小電気化学的トランジスターの遺伝子捕捉剤への道を開くものである。

Claims

【特許請求の範囲】１．次式で表される導電性で電極活性機能化された共役ポリマーであって、非− 機能化共役ポリマー、即ち、式ＩにおいてＲ１、Ｒｉ及びＲｎがＨであるものと同じオーダーの導電性及び電極活性を有するポリマー。ただし、ｎは零でない整数であり、ｉは２からｎ−１の整数であり、Ｒ１、Ｒｉ及びＲｎは、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、あるいは、第１の生物分子またはアンチリガンドと共有結合しうる官能基を表す。２．前記官能基が、下記の官能基の群から独立に選択される請求項１記載のポリマー。Ｙｐ−Ｃ−Ｘ、但しＸはＨ、ＯＨ、置換または非置換低級Ｏ−アルキルラジカル、あるいはハロゲン、特にＣｌを表す；Ｙｐ−ＮＨＺ、但しＺはＨまたはアルキルラジカルを表す；Ｙｐ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＦ₃；Ｙｐ−Ｘ、但しＸは上記の定義により、ｐは好ましくは０、１または２の整数；−Ｓｉ（アルキル）₃、−Ｓｉ（アルコキシ）₃またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドのような活性化エステル基である。３．前記Ｙが、１から５の炭素原子を持つアルキル基、１から５の炭素原子を持つアルコキシル基、一般式（ＣＨ２−ＣＨ２−０）ｍ−（ＣＨ２）ｍ’−に対応するポリエーテルで、ｍが１から３の整数でありｍ’は１又は２の整数であるものから選択される基である請求項２記載のポリマー。４．少なくとも１つの第１の生物分子またはアンチリガンドと共有結合した官能基を含む導電性で電極活性機能化された共役ポリマーであって、下記式ＩＩで表されるポリマー。ただし、ｎは零でない整数であり、ｉは２からｎ−１の整数であり、Ｒ’１、Ｒ’ｉ及びＲ’ｎは、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、あるいは、第１の生物分子またはアンチリガンドと共有結合しうるまたは共有結合した官能基を表す。５．前記生物分子またはリガンドに結合した官能基が、生物分子またはリガンドとの反応の前に、下記の官能基の群から選択される請求項４記載のポリマー。Ｙｐ−Ｃ−Ｘ、但しＸはＨ、ＯＨ、置換または非置換低級Ｏ−アルキルラジカル、あるいはハロゲン、特にＣｌを表す；Ｙｐ−ＮＨＺ、但しＺはＨまたはアルキルラジカルを表す；Ｙｐ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＦ₃；ＹＰ−Ｘ、但しＸは上記の定義により、ｐは好ましくは０、１または２の整数；−Ｓｉ（アルキル）３、−Ｓｉ（アルコキシ）３またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドのような活性化エステル基である。６．前記生物分子と結合した官能基が、同一であり、第１の生物分子との反応の前に、−（ＣＨ₂）−である請求項４または５に記載のポリマー。７．前記第１の生物分子またはアンチリガンドが、ペプチドまたはペプチド誘導体、特にＧｌｙ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ、及びＰｈｅ−Ｈｅａ−Ｐｒｏから、及び、ＣＣＴＡＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧの配列のオリゴヌクレオチドのようなポリヌクレオチドから選択される請求項６記載の共役ポリマー。８．アンチリガンドとは異なり、アンチリガンドと特異的に相互作用する第２の生物分子またはリガンドを、インビトロまたはインビボで検出または検定するための請求項４から７のいずれかの共役ポリマーの使用方法であって、前記リガンドと結合していない共役ポリマーと該リガンドと結合した共役ポリマーとの間の、電位差または電流変化を観察及び／または測定することによってリガンドが検出及び／または検定される方法。９．タンパク質分解酵素、特にカルボキシペプチダーゼＡなどの酵素を検出及び／または検定するための請求項７のポリマーの請求項８記載の使用方法。１０．ＣＣＴＡＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧの配列のオリゴヌクレオチドのようなポリヌクレオチドを検出及び／または検定するための請求項４から７のいずれかのポリマーの請求項８記載の使用方法。１１．アンチリガンドとは異なり、アンチリガンドと特異的に相互作用する第２の生物分子またはリガンドを、インビトロまたはインビボで抽出するための請求項４から７のいずれかの共役ポリマーの使用方法。１２．前記共役ポリマーを、金属または炭素誘導体などの導電性基体に析出させるか、または自己支持フィルム状に形成する請求項４から７のいずれかの共役ポリマーの使用方法。１３．金属または炭素誘導体などの導電性基体と、請求項４から７のいずれかのポリマーとからなる電極。１４．請求項４から７のいずれかのポリマーからなるポリマーの自己支持フィルム。