JP3428652B2 - 導電性かつ電極活性機能化された共役ポリマーとその使用方法 - Google Patents
導電性かつ電極活性機能化された共役ポリマーとその使用方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
ポリピロール、ポリチオフェン、ポリアニリン、ポリ
フェニレン、及びそれらの誘導体といった共役ポリマー
は、その電極活性によって知られており、“有機導電性
ポリマー・ハンドブック（Handbook of organic Conduc
ting Polymers）、（T.J.Skotheim編、Marcel Dekker、
ニューヨーク、1986）”等の総説に広く記載されてい
る。これらのポリマーは、電極上のフィルムの形態、自
己支持フィルム（self−supporting film）の形態、も
しくはポリカチオン性またはポリアニオン性ポリマーと
組み合わせた複合体の形態で得られ、有機電極のように
振る舞う。即ち、アノード酸化過程に従って、電解質媒
体からのイオンの挿入によって充電される。この電気化
学的過程は可逆的であり、還元によって、この共役ポリ
マーまたは電極活性複合体からイオンが放出される。
フェニレン、及びそれらの誘導体といった共役ポリマー
は、その電極活性によって知られており、“有機導電性
ポリマー・ハンドブック（Handbook of organic Conduc
ting Polymers）、（T.J.Skotheim編、Marcel Dekker、
ニューヨーク、1986）”等の総説に広く記載されてい
る。これらのポリマーは、電極上のフィルムの形態、自
己支持フィルム（self−supporting film）の形態、も
しくはポリカチオン性またはポリアニオン性ポリマーと
組み合わせた複合体の形態で得られ、有機電極のように
振る舞う。即ち、アノード酸化過程に従って、電解質媒
体からのイオンの挿入によって充電される。この電気化
学的過程は可逆的であり、還元によって、この共役ポリ
マーまたは電極活性複合体からイオンが放出される。
また、これらの付加的機能を有する共役ポリマーを与
えることのできる官能基を、ポリマーのモノマー単位に
グラフト共有結合させることによる、共役ポリマーの第
２の生成手段が文献に記載されている。例を挙げると、
電気触媒性金属錯体をポリピロールのモノマー単位にグ
ラフトさせたり、特異的に錯形成した大環状基をポリピ
ロールまたはポリチオフェン鎖にグラフトさせ、電解質
媒体中のカチオンを認識させたり、キラル基をポリチオ
フェンにグラフトさせて、光学活性アニオンを認識させ
たりしている。これらすべての機能化の過程も、以下の
文献に詳述された改善方法の主題を構成する（F.Gernie
r,Angew.Chemie,1989,101,529;A.Deronzier,J.C.Moute
r,Acc.Chem.Res.,1989.22,249;J.Roncali,Chem.Rev.,19
92,92,711）。
えることのできる官能基を、ポリマーのモノマー単位に
グラフト共有結合させることによる、共役ポリマーの第
２の生成手段が文献に記載されている。例を挙げると、
電気触媒性金属錯体をポリピロールのモノマー単位にグ
ラフトさせたり、特異的に錯形成した大環状基をポリピ
ロールまたはポリチオフェン鎖にグラフトさせ、電解質
媒体中のカチオンを認識させたり、キラル基をポリチオ
フェンにグラフトさせて、光学活性アニオンを認識させ
たりしている。これらすべての機能化の過程も、以下の
文献に詳述された改善方法の主題を構成する（F.Gernie
r,Angew.Chemie,1989,101,529;A.Deronzier,J.C.Moute
r,Acc.Chem.Res.,1989.22,249;J.Roncali,Chem.Rev.,19
92,92,711）。
最近数年間に、著者らは、特に診断目的において、機
能化導電性ポリマーを分析物の捕捉剤の改善に用いるこ
とに注目してきた。しかし、欧州特許出願0,314,009号
公報に示されているように、ピロールポリマーで、その
ピロール環の窒素原子または炭素原子において直接置換
されているものは、分析物の捕捉剤として良好ではな
く、特に、官能基がヘテロ原子環に導入されているとき
は、そのポリマーの導電性が低下することが学界で一般
に認められている。この問題を解決するために、本特許
出願の著者らは、ピロール環の３−位において、有機分
子と共有結合することのできる反応性部位をグラフトさ
せた2,5−ジ（２−チエニルピロール）ポリマーに注目
した。しかしながら、チオフェン環の親油性のために、
記載したポリマーは水性媒質中では導電性でも電極活性
でもなく、従って、生物学的サンプルにおける分析物の
捕捉及び／または特性化には適しないことがわかった
（J.Roncali,等、Chem.Comm.,1986,783頁及びG.Tourill
on,等、Electroanal.Chem.,161,407,1984参照）。
能化導電性ポリマーを分析物の捕捉剤の改善に用いるこ
とに注目してきた。しかし、欧州特許出願0,314,009号
公報に示されているように、ピロールポリマーで、その
ピロール環の窒素原子または炭素原子において直接置換
されているものは、分析物の捕捉剤として良好ではな
く、特に、官能基がヘテロ原子環に導入されているとき
は、そのポリマーの導電性が低下することが学界で一般
に認められている。この問題を解決するために、本特許
出願の著者らは、ピロール環の３−位において、有機分
子と共有結合することのできる反応性部位をグラフトさ
せた2,5−ジ（２−チエニルピロール）ポリマーに注目
した。しかしながら、チオフェン環の親油性のために、
記載したポリマーは水性媒質中では導電性でも電極活性
でもなく、従って、生物学的サンプルにおける分析物の
捕捉及び／または特性化には適しないことがわかった
（J.Roncali,等、Chem.Comm.,1986,783頁及びG.Tourill
on,等、Electroanal.Chem.,161,407,1984参照）。
ここで、極めて驚嘆すべきことに、また専門家の従来
の認識に反して、ピロール環の３−または４−位におい
て、目的とする官能基がピロール環から離間するように
させる機能化試薬を用いて官能基をグラフトさせると、
ポリピロールの導電性及び電極活性が保持されることが
見出された。アンチリガンドは、この官能基の自由端に
共有結合し、上述したような修飾ポリピロールの性質を
示さない。そのような機能化されたポリマーは、今日ま
で開示されておらず、それらが生物学的リガンドの捕捉
剤に極めて適していることが示された。さらにポリピロ
ールは、その生体適合性によって優れたポリマーである
ことがわかった。最後に、そのように機能化されたポリ
ピロールは、かなりの厚さ（数ミリメートル厚）の電極
活性及び導電性ポリマーの調製を可能にし、それによっ
て高い機能部位密度が得られるので、それに比例して感
度が向上する。
の認識に反して、ピロール環の３−または４−位におい
て、目的とする官能基がピロール環から離間するように
させる機能化試薬を用いて官能基をグラフトさせると、
ポリピロールの導電性及び電極活性が保持されることが
見出された。アンチリガンドは、この官能基の自由端に
共有結合し、上述したような修飾ポリピロールの性質を
示さない。そのような機能化されたポリマーは、今日ま
で開示されておらず、それらが生物学的リガンドの捕捉
剤に極めて適していることが示された。さらにポリピロ
ールは、その生体適合性によって優れたポリマーである
ことがわかった。最後に、そのように機能化されたポリ
ピロールは、かなりの厚さ（数ミリメートル厚）の電極
活性及び導電性ポリマーの調製を可能にし、それによっ
て高い機能部位密度が得られるので、それに比例して感
度が向上する。
よって本発明の主題は、次式Ｉで表される導電性で電
極活性機能化された（electroactive functionalized）
共役ポリマーである。
極活性機能化された（electroactive functionalized）
共役ポリマーである。
ただし、ｎは零でない整数であり、ｉは２からｎ−１の
整数であり、R1、Ri及びRnは、同じでも異なっていても
よく、Ｈ、あるいは、アンチリガンド（antiligand）と
共有結合しうる官能基を表す。前記ポリマーは、非−機
能化（non−fuctionalized）共役ポリマー、即ち、式Ｉ
においてR1、Ri及びRnがＨであるものと実質的に同じオ
ーダーの導電性及び電極活性を有する。
整数であり、R1、Ri及びRnは、同じでも異なっていても
よく、Ｈ、あるいは、アンチリガンド（antiligand）と
共有結合しうる官能基を表す。前記ポリマーは、非−機
能化（non−fuctionalized）共役ポリマー、即ち、式Ｉ
においてR1、Ri及びRnがＨであるものと実質的に同じオ
ーダーの導電性及び電極活性を有する。
より詳細には、この官能基は、下記の官能基の群から
独立に選択される。
独立に選択される。
Yp−Ｃ−Ｘ、但しＸはＨ、OH、置換または非置換低級
Ｏ−アルキルラジカル、あるいはハロゲン、特にC1を表
す;Yp−HNZ、但しＺはＨまたはアルキルラジカルを表
す;Yp−NH−CO−CF3;Yp−Ｘ、但しＸは上記の定義によ
り、ｐは好ましくは０、１または２の整数;Si（アルキ
ル）３、−Si（アルコキシ）３またはＮ−ヒドロキシス
クシンイミドのような活性化エステル基である。
Ｏ−アルキルラジカル、あるいはハロゲン、特にC1を表
す;Yp−HNZ、但しＺはＨまたはアルキルラジカルを表
す;Yp−NH−CO−CF3;Yp−Ｘ、但しＸは上記の定義によ
り、ｐは好ましくは０、１または２の整数;Si（アルキ
ル）３、−Si（アルコキシ）３またはＮ−ヒドロキシス
クシンイミドのような活性化エステル基である。
好ましくは、前記Ｙは、１から５の炭素原子を持つア
ルキル基、１から５の炭素原子を持つアルコキシル基、
一般式（CH2−CH2−０）ｍ、−（CH2）m'−に対応する
ポリエーテル、但しｍは１から３の整数でありm'は１又
は２の整数である、から選択される基である。
ルキル基、１から５の炭素原子を持つアルコキシル基、
一般式（CH2−CH2−０）ｍ、−（CH2）m'−に対応する
ポリエーテル、但しｍは１から３の整数でありm'は１又
は２の整数である、から選択される基である。
本発明の他の主題は、少なくとも１つのアンチリガン
ドと共有結合した官能基を含む導電性で電極活性機能化
された共役ポリマーであって、下記式IIで表されるポリ
マーである。
ドと共有結合した官能基を含む導電性で電極活性機能化
された共役ポリマーであって、下記式IIで表されるポリ
マーである。
ただし、ｎは零でない整数であり、ｉは２からｎ−１の
整数であって、R'1、R'i及びR'nは、同じでも異なって
いてもよく、Ｈ、あるいは、アンチリガンドと共有結合
しうるまたは共有結合した官能基を表す。
整数であって、R'1、R'i及びR'nは、同じでも異なって
いてもよく、Ｈ、あるいは、アンチリガンドと共有結合
しうるまたは共有結合した官能基を表す。
前記アンチリガンドに結合した官能基は、そのアンチ
リガンドとの反応の前に、下記の官能基の群から選択さ
れる。
リガンドとの反応の前に、下記の官能基の群から選択さ
れる。
Yp−Ｃ−Ｘ、但しＸはＨ、OH、置換または非置換低級
Ｏ−アルキルラジカル、あるいはハロゲン、特にC1を表
す;Yp−NHZ、但しＺはＨまたはアルキルラジカルを表
す;Yp−NH−CO−CF3;Yp−Ｘ、但しＸは上記の定義によ
り、ｐは好ましくは０、１または２の整数；−Si（アル
キル）３、−Si（アルコキシ）３またはＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドのような活性化エステル基である。
Ｏ−アルキルラジカル、あるいはハロゲン、特にC1を表
す;Yp−NHZ、但しＺはＨまたはアルキルラジカルを表
す;Yp−NH−CO−CF3;Yp−Ｘ、但しＸは上記の定義によ
り、ｐは好ましくは０、１または２の整数；−Si（アル
キル）３、−Si（アルコキシ）３またはＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドのような活性化エステル基である。
特に、前記アンチリガンドと結合した官能基は、それ
がアンチリガンドと反応する前においては、同一であ
り、−（CH2）−COOHからなる。また、アンチリガンド
は、ペプチドまたはペプチド誘導体、特にGly−Phe、Ph
e−Pro、及びPhe−Hea−Proから、及び、CCTAAGAGGGAGT
Gの配列のオリゴヌクレオチドのようなポリヌクレオチ
ドから選択される。
がアンチリガンドと反応する前においては、同一であ
り、−（CH2）−COOHからなる。また、アンチリガンド
は、ペプチドまたはペプチド誘導体、特にGly−Phe、Ph
e−Pro、及びPhe−Hea−Proから、及び、CCTAAGAGGGAGT
Gの配列のオリゴヌクレオチドのようなポリヌクレオチ
ドから選択される。
本発明のさらに他の主題は、アンチリガンドとは異な
り、アンチリガンドと特異的に相互作用するリガンド
を、インビトロまたはインビボで検出または検定するた
めの上記の共役ポリマーの使用方法であって、その方法
においては、前記リガンドと結合していない共役ポリマ
ーと該リガンドと結合した共役ポリマーとの間の、電位
差または電流変化を観察及び／または測定することによ
ってリガンドが検出及び／または検定される。
り、アンチリガンドと特異的に相互作用するリガンド
を、インビトロまたはインビボで検出または検定するた
めの上記の共役ポリマーの使用方法であって、その方法
においては、前記リガンドと結合していない共役ポリマ
ーと該リガンドと結合した共役ポリマーとの間の、電位
差または電流変化を観察及び／または測定することによ
ってリガンドが検出及び／または検定される。
特に、本発明のポリマーは、タンパク質分解酵素、中
でもカルボキシペプチダーゼＡ、またはポリヌクレオチ
ドを検出及び／または検定するために、あるいは、アン
チリガンドとは異なり、アンチリガンドと特異的に相互
作用するリガンドを、インビトロまたはインビボで抽出
するために用いられる。
でもカルボキシペプチダーゼＡ、またはポリヌクレオチ
ドを検出及び／または検定するために、あるいは、アン
チリガンドとは異なり、アンチリガンドと特異的に相互
作用するリガンドを、インビトロまたはインビボで抽出
するために用いられる。
本発明の１つの実施態様では、前記共役ポリマーが、
金属または炭素誘導体などの導電性基体に析出される
か、または自己支持フィルム状に形成される。
金属または炭素誘導体などの導電性基体に析出される
か、または自己支持フィルム状に形成される。
最後に、本発明は、金属または炭素誘導体などの導電
性基体と、上述のポリマーとからなる電極及び自己支持
フィルムに関する。
性基体と、上述のポリマーとからなる電極及び自己支持
フィルムに関する。
ひとつの実施態様において、アンチリガンドはリガン
ドまたは標的分子に特異的である。このアンチリガンド
は、特にアンチリガンド／標的分子複合体を形成するよ
うに選択される。一例を挙げると、この複合体は、特
に、任意のペプチド／抗体、抗体／ハプテン、ホルモン
／レセプター、ポリヌクレオチドハイブリッド／ポリヌ
クレオチド、ポリヌクレオチド／核酸の組み合わせ等で
ある。
ドまたは標的分子に特異的である。このアンチリガンド
は、特にアンチリガンド／標的分子複合体を形成するよ
うに選択される。一例を挙げると、この複合体は、特
に、任意のペプチド／抗体、抗体／ハプテン、ホルモン
／レセプター、ポリヌクレオチドハイブリッド／ポリヌ
クレオチド、ポリヌクレオチド／核酸の組み合わせ等で
ある。
本発明で用いる「ポリヌクレオチド」という用語は、
少なくとも５つのデオキシリボヌクレオチドまたはリボ
ヌクレオチドの配列であって、例えば、イノシン（inoc
ine）、５−メチルデオキシシチジン（citidine）、５
−ジメチルアミノ−デオキシウリジン、デオキシウリジ
ン、2,6−ジアミノプリン、５−ブロモデオキシウリジ
ン、または他のハイブリデーション（hybridation）で
きる修飾塩基といった修飾塩基を含むヌクレオチド等の
修飾ヌクレオチドを任意に含むものを意味する。このポ
リヌクレオチドは、（例えば、ホスホロチオエート（ph
osphorothioate）、Ｈ−ホスホネート（Ｈ−phosphonat
e）、及びアルキルホスホネート結合のような）ヌクレ
オチド間結合において、または、例えばα−オリゴヌク
レオチド（仏国特許2,607,507号公報）あるいはPNAs
（M.Egholm,等、J.Am.Chem.Soc.,（1992）,114,1895−1
897）の骨格において修飾されていてもよい。これらの
修飾を組み合わせてもよい。
少なくとも５つのデオキシリボヌクレオチドまたはリボ
ヌクレオチドの配列であって、例えば、イノシン（inoc
ine）、５−メチルデオキシシチジン（citidine）、５
−ジメチルアミノ−デオキシウリジン、デオキシウリジ
ン、2,6−ジアミノプリン、５−ブロモデオキシウリジ
ン、または他のハイブリデーション（hybridation）で
きる修飾塩基といった修飾塩基を含むヌクレオチド等の
修飾ヌクレオチドを任意に含むものを意味する。このポ
リヌクレオチドは、（例えば、ホスホロチオエート（ph
osphorothioate）、Ｈ−ホスホネート（Ｈ−phosphonat
e）、及びアルキルホスホネート結合のような）ヌクレ
オチド間結合において、または、例えばα−オリゴヌク
レオチド（仏国特許2,607,507号公報）あるいはPNAs
（M.Egholm,等、J.Am.Chem.Soc.,（1992）,114,1895−1
897）の骨格において修飾されていてもよい。これらの
修飾を組み合わせてもよい。
本発明における「ペプチド」という用語は、特に少な
くとも２つのアミノ酸の任意のペプチドであって、特に
抽出され、分離され、または実質的に単離または合成さ
れたタンパク質、タンパク質フラグメント、またはオリ
ゴヌクレオチドで特に化学合成または組み替え生物での
発現によって得られたもの；任意のペプチドであって、
CO−NH結合の少なくとも１つ、好ましくは全てのCO−NH
結合が、１つ（またはそれ以上）のNH−CO結合で置換さ
れているもの；任意のペプチドであって、CO−NH結合の
少なくとも１つ、好ましくは全てのCO−NH結合が、１つ
またはそれ以上のNH−CO結合で置換されており、各アミ
ノアシル残基のキラリティーが、上記の１つまたはそれ
以上のCO−NH結合に含まれているか否かにかかわらず、
参照ペプチドを構成するアミノアシル残基に対して、保
存または反転しているものを意味し、これからの化合物
は、イムノレトロイド（immunoretroids）、ミモトープ
（mimotope）とも呼ばれる。
くとも２つのアミノ酸の任意のペプチドであって、特に
抽出され、分離され、または実質的に単離または合成さ
れたタンパク質、タンパク質フラグメント、またはオリ
ゴヌクレオチドで特に化学合成または組み替え生物での
発現によって得られたもの；任意のペプチドであって、
CO−NH結合の少なくとも１つ、好ましくは全てのCO−NH
結合が、１つ（またはそれ以上）のNH−CO結合で置換さ
れているもの；任意のペプチドであって、CO−NH結合の
少なくとも１つ、好ましくは全てのCO−NH結合が、１つ
またはそれ以上のNH−CO結合で置換されており、各アミ
ノアシル残基のキラリティーが、上記の１つまたはそれ
以上のCO−NH結合に含まれているか否かにかかわらず、
参照ペプチドを構成するアミノアシル残基に対して、保
存または反転しているものを意味し、これからの化合物
は、イムノレトロイド（immunoretroids）、ミモトープ
（mimotope）とも呼ばれる。
ペプチドの多くの種類はグラフトしていてもよく、以
下に例を挙げるが、これらに限られるものではない。副
腎皮質刺激ホルモンまたはそのフラグメント、アンギオ
テンシン類似体またはその阻害剤（腎性高血圧症を調節
するレニン−アンギオテンシン系の成分）、ナトリウム
排泄増加性ペプチド、ブラジキニン及びそのペプチド誘
導体、走化性ペプチド、ダイノルフィン及びその誘導
体、エンドルフィンまたは類似体、エンセファリン（en
cephalins）またはその誘導体、酵素（プロテアーゼ
等）の阻害剤、フィブロネクチンのフラグメント及び誘
導体、消化管ペプチド、成長ホルモン放出に関連したペ
プチド、ニューロテンシン及び類似体、オピオイドペプ
チド、オキシトシン、バソプレッシン、バソトシン及び
誘導体、キナーゼタンパク質。
下に例を挙げるが、これらに限られるものではない。副
腎皮質刺激ホルモンまたはそのフラグメント、アンギオ
テンシン類似体またはその阻害剤（腎性高血圧症を調節
するレニン−アンギオテンシン系の成分）、ナトリウム
排泄増加性ペプチド、ブラジキニン及びそのペプチド誘
導体、走化性ペプチド、ダイノルフィン及びその誘導
体、エンドルフィンまたは類似体、エンセファリン（en
cephalins）またはその誘導体、酵素（プロテアーゼ
等）の阻害剤、フィブロネクチンのフラグメント及び誘
導体、消化管ペプチド、成長ホルモン放出に関連したペ
プチド、ニューロテンシン及び類似体、オピオイドペプ
チド、オキシトシン、バソプレッシン、バソトシン及び
誘導体、キナーゼタンパク質。
ペプチド及びポリヌクレオチドは、高い生物学的活性
を持ち、多くの生物学的機能を制御することが知られて
いる（A.S.Dutta,薬物研究の進歩（Advances in Drug R
esearch）,B.Testa編,Academic Press,ニューヨーク,19
91,21,145）。例えば、ペプチドは、アゴニストまたは
拮抗体として極めて高い治療能力を示し、酵素に強く結
合する阻害剤として非常に強力であり、このことが親和
性クロマトグラフィーの基礎になっている。さらに、他
の標的核酸フラグメントまたはヌクレオチドとの選択的
ハイブリダイゼーション反応により、ポリヌクレオチド
は有利な認識現象を生じ、特に新規な遺伝子捕捉剤とし
て用いられるようになる。従って、標的核酸または核酸
フラグメントを検出及び／または検定するために、少な
くとも部分的にアンチリガンドポリヌクレオチドと結合
した機能化ポリマーを、標的を含むと思われるサンプル
に接触させると、ハイブリダイゼーション反応が起こっ
ているか否かを検出することができる。この検出は、非
−結合ポリマーと、標的と反応した結合ポリマーとの間
の電位差または電流変化の直接測定であってもよいし、
標的と反応しうる付加的ポリヌクレオチドの検出を用い
た上記の測定による間接的なものでもよい。この付加的
ポリヌクレオチドは、アンチリガンドポリヌクレオチド
に隣接し、電極活性分子でラベルされているのが好まし
い。
を持ち、多くの生物学的機能を制御することが知られて
いる（A.S.Dutta,薬物研究の進歩（Advances in Drug R
esearch）,B.Testa編,Academic Press,ニューヨーク,19
91,21,145）。例えば、ペプチドは、アゴニストまたは
拮抗体として極めて高い治療能力を示し、酵素に強く結
合する阻害剤として非常に強力であり、このことが親和
性クロマトグラフィーの基礎になっている。さらに、他
の標的核酸フラグメントまたはヌクレオチドとの選択的
ハイブリダイゼーション反応により、ポリヌクレオチド
は有利な認識現象を生じ、特に新規な遺伝子捕捉剤とし
て用いられるようになる。従って、標的核酸または核酸
フラグメントを検出及び／または検定するために、少な
くとも部分的にアンチリガンドポリヌクレオチドと結合
した機能化ポリマーを、標的を含むと思われるサンプル
に接触させると、ハイブリダイゼーション反応が起こっ
ているか否かを検出することができる。この検出は、非
−結合ポリマーと、標的と反応した結合ポリマーとの間
の電位差または電流変化の直接測定であってもよいし、
標的と反応しうる付加的ポリヌクレオチドの検出を用い
た上記の測定による間接的なものでもよい。この付加的
ポリヌクレオチドは、アンチリガンドポリヌクレオチド
に隣接し、電極活性分子でラベルされているのが好まし
い。
本発明における「抗体」という用語は、任意のモノク
ローナルまたはポリクローナル抗体、Fab、Fab'2、また
はFcフラグメントといった前記抗体のフラグメント、及
び、遺伝子修飾または組み替えによって得られるにんい
の抗体意味する。
ローナルまたはポリクローナル抗体、Fab、Fab'2、また
はFcフラグメントといった前記抗体のフラグメント、及
び、遺伝子修飾または組み替えによって得られるにんい
の抗体意味する。
ピロール環の３−または４−位におけるポリピロール
の機能化は、モノマー単位に施してから重合してもよい
し、予め重合したポリマーのモノマー単位に施してもよ
い。ピロール環の３及び／または４位の原子と反応しう
る少なくとも１つの反応性基を含む任意の適当な機能化
試薬を用いることができる。この機能化試薬は、単機能
試薬であって、ポリピロール環へのグラフト過程の後
に、引き続くアンチリガンドとの反応のための新規な反
応性機能が導入されるものであってもよく、この新規な
反応性機能は、２官能性試薬、特にホモ−またはヘテロ
−２官能性試薬のような多機能性である。例を挙げる
と、機能化試薬は、置換または非置換アルキルまたはア
ルコキシまたはポリエーテル鎖であって、末端に反応性
基を持つものから選択される。この反応性基は、カルボ
キシル、ヒドラジド、アミン、ニトリル、アルデヒド、
チオール、ジスルフィド、ヨードアセチル、エステル、
無水、トシル、メシル、トリチル、またはシリル基等の
ような官能基で表される。
の機能化は、モノマー単位に施してから重合してもよい
し、予め重合したポリマーのモノマー単位に施してもよ
い。ピロール環の３及び／または４位の原子と反応しう
る少なくとも１つの反応性基を含む任意の適当な機能化
試薬を用いることができる。この機能化試薬は、単機能
試薬であって、ポリピロール環へのグラフト過程の後
に、引き続くアンチリガンドとの反応のための新規な反
応性機能が導入されるものであってもよく、この新規な
反応性機能は、２官能性試薬、特にホモ−またはヘテロ
−２官能性試薬のような多機能性である。例を挙げる
と、機能化試薬は、置換または非置換アルキルまたはア
ルコキシまたはポリエーテル鎖であって、末端に反応性
基を持つものから選択される。この反応性基は、カルボ
キシル、ヒドラジド、アミン、ニトリル、アルデヒド、
チオール、ジスルフィド、ヨードアセチル、エステル、
無水、トシル、メシル、トリチル、またはシリル基等の
ような官能基で表される。
本発明の機能化ポリピロールと、例えばポリヌクレオ
チドといったアンチリガンドとの共有結合の結果得られ
る共役の形成は、周知の、いわゆる直接法または間接法
に従って行うことができる。
チドといったアンチリガンドとの共有結合の結果得られ
る共役の形成は、周知の、いわゆる直接法または間接法
に従って行うことができる。
例えばポリヌクレオチドの場合、直接法に従えば、ヌ
クレオチド鎖の任意の位置、例えば、5'末端または3'末
端または塩基またはヌクレオチド間ホスフェートまたは
糖の2'位に反応性基を有するポリヌクレオチドが調製さ
れる。次いで、このポリヌクレオチドは、予め調製さ
れ、上記の反応性基と相補的な反応性基を含むポリマー
と結合される。即ち、一方はポリヌクレオチド由来であ
り、他方はこの機能化ポリマー由来である２つの相補的
反応性基間の反応により、共有結合を形成する。例え
ば、よく知られているように、１級アミンは活性化した
カルボン酸またはアルデヒドと結合できるし、また、チ
オール基はハロアルキルと結合できる。好ましくは、ポ
リマーと結合するためのポリヌクレオチド上の反応性基
は、5'または3'末端である。
クレオチド鎖の任意の位置、例えば、5'末端または3'末
端または塩基またはヌクレオチド間ホスフェートまたは
糖の2'位に反応性基を有するポリヌクレオチドが調製さ
れる。次いで、このポリヌクレオチドは、予め調製さ
れ、上記の反応性基と相補的な反応性基を含むポリマー
と結合される。即ち、一方はポリヌクレオチド由来であ
り、他方はこの機能化ポリマー由来である２つの相補的
反応性基間の反応により、共有結合を形成する。例え
ば、よく知られているように、１級アミンは活性化した
カルボン酸またはアルデヒドと結合できるし、また、チ
オール基はハロアルキルと結合できる。好ましくは、ポ
リマーと結合するためのポリヌクレオチド上の反応性基
は、5'または3'末端である。
間接的結合法では、ポリヌクレオチドとポリマーとが
各々反応性基を持ち、これらの反応性基は互いに同じで
も異なっていてもよいが、これらの反応性基は相補的で
はなく、２官能性の中間結合試薬とは反応する（２つの
反応性基が同一であれば中間結合試薬はホモ２官能性で
あり、反応性基が異なればヘテロ２官能性である）。ホ
モ２官能性結合試薬の中では、DITC（1,4−フェニレン
ジイソチオソアネート）、DSS（ジスクシンイミジルス
ベレート（suberate））、またはその類似体を挙げるこ
とができる。ヘテロ２官能性結合試薬の中では、SMCC
（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シ
クロヘキサン−１−カルボキシレート）、SMPB（スクシ
ンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレー
ト）を挙げることができ、それらは、一方では１級アミ
ンと反応でき、他方ではチオールと反応できる。
各々反応性基を持ち、これらの反応性基は互いに同じで
も異なっていてもよいが、これらの反応性基は相補的で
はなく、２官能性の中間結合試薬とは反応する（２つの
反応性基が同一であれば中間結合試薬はホモ２官能性で
あり、反応性基が異なればヘテロ２官能性である）。ホ
モ２官能性結合試薬の中では、DITC（1,4−フェニレン
ジイソチオソアネート）、DSS（ジスクシンイミジルス
ベレート（suberate））、またはその類似体を挙げるこ
とができる。ヘテロ２官能性結合試薬の中では、SMCC
（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シ
クロヘキサン−１−カルボキシレート）、SMPB（スクシ
ンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレー
ト）を挙げることができ、それらは、一方では１級アミ
ンと反応でき、他方ではチオールと反応できる。
本発明は、添付した図面を参照して以下の詳細な説明
を読むことによって、より理解されるであろう。
を読むことによって、より理解されるであろう。
図１は、共役ポリマーを例示した図であり、１）はポ
リアセチレン、２）はポリピロール、３）はポリチオフ
ェン、４）はポリフェニレン、そして５）はポリアニリ
ンである。
リアセチレン、２）はポリピロール、３）はポリチオフ
ェン、４）はポリフェニレン、そして５）はポリアニリ
ンである。
図2Aは、３位を酢酸（１）で置換したポリピロールを
示し、図2B、2C、2D、2E、及び2Fは、３位を種々のペプ
チド（各々（２）から（６））で置換したポリピロール
を示す。
示し、図2B、2C、2D、2E、及び2Fは、３位を種々のペプ
チド（各々（２）から（６））で置換したポリピロール
を示す。
図３は、以下に説明する４種の機能化ポリマーの0.5M
のH2O−NaCl媒質中でのボルタモグラムである。
のH2O−NaCl媒質中でのボルタモグラムである。
（１）はポリ（ピロール−酢酸）、（２）はポリ（ピ
ロール（Gly−DPhe））、（３）はポリ（ピロール（Va
l））、そして（４）はポリ（ピロール（Phe））であ
る。
ロール（Gly−DPhe））、（３）はポリ（ピロール（Va
l））、そして（４）はポリ（ピロール（Phe））であ
る。
図４は、0.5MのH2O−NaCl媒質中での、カルボキシペ
プチダーゼＡ存在下でのポリ（２）のボルタモグラムで
ある。
プチダーゼＡ存在下でのポリ（２）のボルタモグラムで
ある。
カルボキシペプチダーゼＡの濃度は、（ａ）5cm3の電
解液中0.0g、（ｂ）5cm3の電解液中1.2g、（ｃ）5cm3の
電解液中2.4g、及び、（ｄ）5cm3の電解液中5.0gであ
る。
解液中0.0g、（ｂ）5cm3の電解液中1.2g、（ｃ）5cm3の
電解液中2.4g、及び、（ｄ）5cm3の電解液中5.0gであ
る。
図５は、電極、ポリ（２）のアンペロメトリック応答
を、媒質中に存在する酵素、カルボキシペプチダーゼＡ
のナノモルで表した量の関数として表したグラフであ
る。飽和カロメル電極に対して0.3Vの電位において、酵
素の量と電流値との間に比例関係が観察された。
を、媒質中に存在する酵素、カルボキシペプチダーゼＡ
のナノモルで表した量の関数として表したグラフであ
る。飽和カロメル電極に対して0.3Vの電位において、酵
素の量と電流値との間に比例関係が観察された。
図６は、機能化された導電性ポリマーによって認識さ
れた生物学的化学種の存在を（増幅して）検出するため
の電解効果微小電気化学トランジスターの理論図であ
る。略語は以下の意味を持つ。Ｐはポリマー、Subは基
板、Ｓ及びＤは、各々ソース及びドレインである。CEは
格子Ｇとして振る舞う対向電極、Ｒは参照電極であり、
Potentはポテンシオスタットである。
れた生物学的化学種の存在を（増幅して）検出するため
の電解効果微小電気化学トランジスターの理論図であ
る。略語は以下の意味を持つ。Ｐはポリマー、Subは基
板、Ｓ及びＤは、各々ソース及びドレインである。CEは
格子Ｇとして振る舞う対向電極、Ｒは参照電極であり、
Potentはポテンシオスタットである。
図７は、機能化ポリピロール膜を有する２−区画の電
気化学セルの理論図であり、電極活性な共役ポリマー鎖
にグラフトされた置換基によって生物学的化学種を抽出
するためのものである。
気化学セルの理論図であり、電極活性な共役ポリマー鎖
にグラフトされた置換基によって生物学的化学種を抽出
するためのものである。
図８は、0.1MのLiClO4−アセトニトリル媒質中での、
飽和カロメル参照電極に対するポリ［Ｎ−３−ヒドロキ
シスクシンイミドピロール］のボルタモグラムであり、
高い電極活性及び高い電気化学的可逆性を示している。
飽和カロメル参照電極に対するポリ［Ｎ−３−ヒドロキ
シスクシンイミドピロール］のボルタモグラムであり、
高い電極活性及び高い電気化学的可逆性を示している。
図９は、ポリ（［ピロール−ODN］［ピロール−COO
H］）コポリマー電極のボルタモグラムであり、ODNはCC
TAAGAGGGAGTGの配列を持つポリヌクレオチドまたはオリ
ゴヌクレオチドである。このポリマーを、非標的配列で
あるGGTGATAGAAGTATCとインキュベートした後では、変
化が見られなかった。
H］）コポリマー電極のボルタモグラムであり、ODNはCC
TAAGAGGGAGTGの配列を持つポリヌクレオチドまたはオリ
ゴヌクレオチドである。このポリマーを、非標的配列で
あるGGTGATAGAAGTATCとインキュベートした後では、変
化が見られなかった。
図10は、ポリ（［ピロール−ODN］［ピロール−COO
H］）コポリマー電極のボルタモグラムであり、ODNはCC
TAAGAGGGAGTGの配列を持つオリゴヌクレオチドである。
この電極を、標的である335nmolのCACTCCCTCTTAGGと、3
7℃で２時間インキュベートした。その後、この電極を
リンスし、電気化学媒質中で分析した。先のボルタモグ
ラムに対して電位のシフトが見られた。
H］）コポリマー電極のボルタモグラムであり、ODNはCC
TAAGAGGGAGTGの配列を持つオリゴヌクレオチドである。
この電極を、標的である335nmolのCACTCCCTCTTAGGと、3
7℃で２時間インキュベートした。その後、この電極を
リンスし、電気化学媒質中で分析した。先のボルタモグ
ラムに対して電位のシフトが見られた。
本発明のポリマーは、サンプル中に存在し、アンチリ
ガンドまたはグラフトしたアンチリガンドと反応しうる
生物学的活性種の検出に特に使用することができる。確
かに、上述したように、ヘテロ環の３−位において、１
つまたはそれ以上のアンチリガンドでグラフトして機能
化した共役ポリマーは、１つまたはそれ以上のリガンド
と反応した後、生物学的媒質中のリガンドと反応してい
ない参照用ポリマーに対して、電気化学的応答が変化す
ることが示された。このことは、酸化電位の変化によっ
て見ることができる。電気化学的ボルタモグラムにおけ
るポリマーのこの酸化還元の変化は、捕捉剤型機能に伝
えられ、従って、生物学的活性種の定量的測定に用いる
ことができる。その測定は、一定電流での電位変化、ま
たは一定電圧での電流変化、あるいは電界効果微小電気
化学的トランジスターの形成によって行われる。
ガンドまたはグラフトしたアンチリガンドと反応しうる
生物学的活性種の検出に特に使用することができる。確
かに、上述したように、ヘテロ環の３−位において、１
つまたはそれ以上のアンチリガンドでグラフトして機能
化した共役ポリマーは、１つまたはそれ以上のリガンド
と反応した後、生物学的媒質中のリガンドと反応してい
ない参照用ポリマーに対して、電気化学的応答が変化す
ることが示された。このことは、酸化電位の変化によっ
て見ることができる。電気化学的ボルタモグラムにおけ
るポリマーのこの酸化還元の変化は、捕捉剤型機能に伝
えられ、従って、生物学的活性種の定量的測定に用いる
ことができる。その測定は、一定電流での電位変化、ま
たは一定電圧での電流変化、あるいは電界効果微小電気
化学的トランジスターの形成によって行われる。
さらに、本発明のポリマーは、溶液中の生物学的活性
種の抽出にも用いることができる。多くの場合、溶液中
の生物学的活性種は、生物活性ペプチドやポリヌクレオ
チドといったポリマー膜にグラフトしたアンチリガンド
に強く結合し、それによって、媒質中から生物学的活性
種を選択的に抽出することができる。このタイプの抽出
は、インビトロでも行えるし、支持ポリマーが、例えば
ポリピロール等の生体適合性であれば、インビボでも行
うことができる。
種の抽出にも用いることができる。多くの場合、溶液中
の生物学的活性種は、生物活性ペプチドやポリヌクレオ
チドといったポリマー膜にグラフトしたアンチリガンド
に強く結合し、それによって、媒質中から生物学的活性
種を選択的に抽出することができる。このタイプの抽出
は、インビトロでも行えるし、支持ポリマーが、例えば
ポリピロール等の生体適合性であれば、インビボでも行
うことができる。
最後に、本発明のポリマーは、生物学的活性種（酵素
など）の、ある媒質中から他の媒質中への放出源ともな
る。
など）の、ある媒質中から他の媒質中への放出源ともな
る。
本発明の電極活性導電性ポリマーの、生物学的に興味
のある化合物に対する認識を示すグループによる機能化
は、核酸（NA）の認識にまで拡張することができる。従
って、ポリマーの共役した鎖に沿ってポリヌクレオチド
またはオリゴヌクレオチドであるODNをグラフトするこ
とによって、生物学的媒質中の対応するNAまたはNAフラ
グメントを識別できるようになる。この認識は、ポリマ
ー上にグラフトされたODNと、機能化ポリマーのフィル
ムが浸漬される外部媒質中に存在する対応NAとの間の選
択的ハイブリダイゼーションによって行われ、後に述べ
る「ペプチド／酵素」の認識に類似している。この「OD
N/NA」の複合によって、共役ポリマーの物理化学的性質
が変化し、その特性化によって意図したNAの存在が確認
される。
のある化合物に対する認識を示すグループによる機能化
は、核酸（NA）の認識にまで拡張することができる。従
って、ポリマーの共役した鎖に沿ってポリヌクレオチド
またはオリゴヌクレオチドであるODNをグラフトするこ
とによって、生物学的媒質中の対応するNAまたはNAフラ
グメントを識別できるようになる。この認識は、ポリマ
ー上にグラフトされたODNと、機能化ポリマーのフィル
ムが浸漬される外部媒質中に存在する対応NAとの間の選
択的ハイブリダイゼーションによって行われ、後に述べ
る「ペプチド／酵素」の認識に類似している。この「OD
N/NA」の複合によって、共役ポリマーの物理化学的性質
が変化し、その特性化によって意図したNAの存在が確認
される。
要点は、「ODN/NA」認識の間に変化する予定のポリマ
ーの物理化学的特性の性質に関連している。確かに、NA
の存在を測定するための高速、高感度、及び定量的な方
法を発展させるために、本発明の目的は、「ODN/NA」ハ
イブリダイゼーションの後に電気化学的応答が変化する
電極活性材料の開発に関する。この変化は、ポリマーの
酸化電位の変化といったポテンシオメトリック型、また
は、所定の電位で観察される酸化（または還元）電流の
変化といったアンペロメトリック型を含んでいる。電気
化学的応答におけるこれらの変化は定量的に測定でき、
機能化ポリマーフィルムは、上述したようなポリピロー
ルにグラフトしたペプチドによる酵素の認識の場合と同
様に、アンペロメトリック型またはポテンシオメトリッ
ク型、あるいは電界効果微小電気化学的トランジスター
の形態のいずれでも用いることができる。このタイプの
測定の利点は、速さ、感度、及び、ｎの標的と非標的OD
Nを含む2n測定部材を容易に作製できる可能性を持つこ
とであり、従って、媒質中の遺伝子の有無を容易に識別
できる。
ーの物理化学的特性の性質に関連している。確かに、NA
の存在を測定するための高速、高感度、及び定量的な方
法を発展させるために、本発明の目的は、「ODN/NA」ハ
イブリダイゼーションの後に電気化学的応答が変化する
電極活性材料の開発に関する。この変化は、ポリマーの
酸化電位の変化といったポテンシオメトリック型、また
は、所定の電位で観察される酸化（または還元）電流の
変化といったアンペロメトリック型を含んでいる。電気
化学的応答におけるこれらの変化は定量的に測定でき、
機能化ポリマーフィルムは、上述したようなポリピロー
ルにグラフトしたペプチドによる酵素の認識の場合と同
様に、アンペロメトリック型またはポテンシオメトリッ
ク型、あるいは電界効果微小電気化学的トランジスター
の形態のいずれでも用いることができる。このタイプの
測定の利点は、速さ、感度、及び、ｎの標的と非標的OD
Nを含む2n測定部材を容易に作製できる可能性を持つこ
とであり、従って、媒質中の遺伝子の有無を容易に識別
できる。
上述した酵素的認識と同様に、第２の要点は、認識現
象に対する電気化学的応答を得るためには、ヘテロ環
（ピロール）の３−位における機能化が必要であるとい
う事実に関する。
象に対する電気化学的応答を得るためには、ヘテロ環
（ピロール）の３−位における機能化が必要であるとい
う事実に関する。
これらのポリマーの正確な電気化学的応答を確立する
ために、共役鎖を機能化が、機能化ポリマーの相当な電
極活性に匹敵することが必要である。そのような電極活
性要求を満たすには、ポリピロールのような親水性ポリ
ヘテロ環の場合には、ピロール環の３−位において機能
化を実施しなければならない。本発明のポリマーは電極
活性ポリマーであり、その全てのモノマー単位がオリゴ
ヌクレオチドのようなアンチリガンドで機能化されてい
てもよいし、数個のモノマー単位がそのように機能化さ
れていてもよい。モノマー単位は、同種あるいは異種の
アンチリガンドで機能化されていてよく、異種の場合
は、本発明のポリマーは同じサンプル中で数個の標的リ
ガンドを検出するために用いることができる。本発明の
ポリマーは、以下の異なる経路で調製することができ
る。
ために、共役鎖を機能化が、機能化ポリマーの相当な電
極活性に匹敵することが必要である。そのような電極活
性要求を満たすには、ポリピロールのような親水性ポリ
ヘテロ環の場合には、ピロール環の３−位において機能
化を実施しなければならない。本発明のポリマーは電極
活性ポリマーであり、その全てのモノマー単位がオリゴ
ヌクレオチドのようなアンチリガンドで機能化されてい
てもよいし、数個のモノマー単位がそのように機能化さ
れていてもよい。モノマー単位は、同種あるいは異種の
アンチリガンドで機能化されていてよく、異種の場合
は、本発明のポリマーは同じサンプル中で数個の標的リ
ガンドを検出するために用いることができる。本発明の
ポリマーは、以下の異なる経路で調製することができ
る。
ａ）全部が機能化されたポリマー
この経路では、第１の工程は、ピロール等のモノマー
の、所定のオリゴヌクレオチド等のアンチリガンドによ
る機能化である。次いで第２の工程は、このモノマーの
重合であり、その結果、全てのモノマー単位が機能化さ
れたポリマーのフィルムを得る。
の、所定のオリゴヌクレオチド等のアンチリガンドによ
る機能化である。次いで第２の工程は、このモノマーの
重合であり、その結果、全てのモノマー単位が機能化さ
れたポリマーのフィルムを得る。
ｂ）部分的に機能化されたコポリマー
標的が核酸である特別な場合、一般的にそのサイズが
大きいことを考えると、ポリマー中の小さなサイズのモ
ノマー単位全てを機能化する必要がない。そこで、一つ
の経路はコポリマーの合成であり、そのコポリマーは、
上記ａ）に記載した機能化モノマー単位と、アンチリガ
ンドオリゴヌクレオチドで機能化していないピロール単
位とを含んでいる。
大きいことを考えると、ポリマー中の小さなサイズのモ
ノマー単位全てを機能化する必要がない。そこで、一つ
の経路はコポリマーの合成であり、そのコポリマーは、
上記ａ）に記載した機能化モノマー単位と、アンチリガ
ンドオリゴヌクレオチドで機能化していないピロール単
位とを含んでいる。
ｃ）前駆体ポリマーの機能化
ポリマーフィルムの部分的な機能化は、共役ポリマー
からも実施できるが、そこには、オリゴヌクレオチド等
のアンチリガンドのグラフト化に適合する化学的基が予
め導入されている。この経路では、［Ｎ−３−ヒドロキ
シスクシニミドピロール］等の、グラフト用シントンを
含むモノマーが最初に合成される。このシントンである
［Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド］は、後にオリゴヌク
レオチドをグラフトさせることが知られている。このモ
ノマーは、引き続いて重合、または他のピロール誘導体
と共重合される。次いで、得られたポリマーフィルム
を、オリゴヌクレオチドを含む反応媒体中に浸漬し、ピ
ロールモノマーにこのオリゴヌクレオチドをグラフトさ
せる反応を起こさせる。実際に、このグラフト化は、ポ
リマーを構成するピロールモノマー単位のうちの数個の
みを含む。
からも実施できるが、そこには、オリゴヌクレオチド等
のアンチリガンドのグラフト化に適合する化学的基が予
め導入されている。この経路では、［Ｎ−３−ヒドロキ
シスクシニミドピロール］等の、グラフト用シントンを
含むモノマーが最初に合成される。このシントンである
［Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド］は、後にオリゴヌク
レオチドをグラフトさせることが知られている。このモ
ノマーは、引き続いて重合、または他のピロール誘導体
と共重合される。次いで、得られたポリマーフィルム
を、オリゴヌクレオチドを含む反応媒体中に浸漬し、ピ
ロールモノマーにこのオリゴヌクレオチドをグラフトさ
せる反応を起こさせる。実際に、このグラフト化は、ポ
リマーを構成するピロールモノマー単位のうちの数個の
みを含む。
実施例1:モノマーの合成
以下の実施例において、ポリピロール（１）が、その
生体適合性によって共役ポリマー支持体として選択され
た（H.Naarmann,私信）。アセチルスペーサー手Ａをピ
ロール環の３位の炭素原子とペプチド置換体との間にグ
ラフトさせ、対応する機能化ポリピロールが導電性と電
極活性を保持するようにした。保護されないカルボキシ
ル末端またはメチルエステル形で保護されたカルボキシ
ル末端を持つ種々のペプチドを、それらの生物学的関連
性から選択し、ピロール−酢酸モノマー、PyA（１）、
にグラフトさせた。数種のモノ−またはジ−ペプチドを
グラフトさせ、図２に示した以下のピロール誘導体を導
いた。
生体適合性によって共役ポリマー支持体として選択され
た（H.Naarmann,私信）。アセチルスペーサー手Ａをピ
ロール環の３位の炭素原子とペプチド置換体との間にグ
ラフトさせ、対応する機能化ポリピロールが導電性と電
極活性を保持するようにした。保護されないカルボキシ
ル末端またはメチルエステル形で保護されたカルボキシ
ル末端を持つ種々のペプチドを、それらの生物学的関連
性から選択し、ピロール−酢酸モノマー、PyA（１）、
にグラフトさせた。数種のモノ−またはジ−ペプチドを
グラフトさせ、図２に示した以下のピロール誘導体を導
いた。
ピロール−酢酸、PyA（１）、ピロール（グリシン−ｄ
フェニルアラニン）、Py（Gly−DPhe）（２）、カルボ
キシペプチダーゼＡ（シグマ）及びトリプシン（シグ
マ）のようなタンパク質分解酵素との複合体形成能力に
よる（J.R.Uren,Biochem.Acta,1971,236,67）、ピロー
ル（バリン）、Py（Val）（３）、ピロール（フェニル
アラニン）、Py（Phe）（４）、ピロール（フェニルア
ラニン−プロリン）、Py（Phe−Pro）（５）。フェニル
アラニン−ヒドロキシエチルアミン−プロリン、Py（Ph
e［HEA］Pro）のような嵩高いジペプチドもグラフトさ
せた。これは、AIDSのHIV−１ウイルスの伴う蛋白質分
解酵素の有効な阻害剤として知られている。これらのモ
ノマーは、開示されている化学的経路に従って合成され
た（D.Delabouglise,F.Garnier,Synth.Met.,1991,39,11
7）。これらのモノマーは、精製し、NMR、微小分析、及
びマス・スペクトルによって同定した。
フェニルアラニン）、Py（Gly−DPhe）（２）、カルボ
キシペプチダーゼＡ（シグマ）及びトリプシン（シグ
マ）のようなタンパク質分解酵素との複合体形成能力に
よる（J.R.Uren,Biochem.Acta,1971,236,67）、ピロー
ル（バリン）、Py（Val）（３）、ピロール（フェニル
アラニン）、Py（Phe）（４）、ピロール（フェニルア
ラニン−プロリン）、Py（Phe−Pro）（５）。フェニル
アラニン−ヒドロキシエチルアミン−プロリン、Py（Ph
e［HEA］Pro）のような嵩高いジペプチドもグラフトさ
せた。これは、AIDSのHIV−１ウイルスの伴う蛋白質分
解酵素の有効な阻害剤として知られている。これらのモ
ノマーは、開示されている化学的経路に従って合成され
た（D.Delabouglise,F.Garnier,Synth.Met.,1991,39,11
7）。これらのモノマーは、精製し、NMR、微小分析、及
びマス・スペクトルによって同定した。
実施例2:重合
これらのモノマーを、0.7cm2の白金電極上、及び表面
積10cm2の白金格子上で、0.5MのNaClを含むプロピレン
カーボネート媒質中で、0.8V/SCEの定電位で重合させ
た。厚さ10μｍまでの密なポリマーフィルムが得られ
た。図３に示したように、これらのポリマーの電極活性
は、中性pH7の0.5MのH2O−NaCl媒質中でのサイクリック
ボルタンメトリーによって確認した。酸化電位は、0.30
V/SCEのオーダーであり、非置換のポリピロールの値と
近く、これらのポリピロールの電極活性がジペプチドで
機能化されたことが確認された。
積10cm2の白金格子上で、0.5MのNaClを含むプロピレン
カーボネート媒質中で、0.8V/SCEの定電位で重合させ
た。厚さ10μｍまでの密なポリマーフィルムが得られ
た。図３に示したように、これらのポリマーの電極活性
は、中性pH7の0.5MのH2O−NaCl媒質中でのサイクリック
ボルタンメトリーによって確認した。酸化電位は、0.30
V/SCEのオーダーであり、非置換のポリピロールの値と
近く、これらのポリピロールの電極活性がジペプチドで
機能化されたことが確認された。
実施例3:カルボキシペプチダーゼＡの認識
これらのポリピロールのタンパク質分解酵素に対する
複合体形成の特異的性質が、中性pHにおいて（Gly−DPh
e）と安定な複合体を形成することが知られているカル
ボキシペプチダーゼＡを用いて分析された。0.5MのH2O
−NaCl中でのカルボキシペプチダーゼＡの濃度を、5cm3
中で1mgから5mgの範囲で増加させた溶液で分析した。非
置換ポリピロール、またはポリ（３、４、５、または
６）等の非特異的電極を溶液中に浸漬したときは、実施
例２で得られたものと同じボルタモグラムが観察され、
変化が見られなかった。しかし、ポリ（ピロール（Gly
−DPhe））、ポリ（２）、を用いると、ボルタモグラム
は高電位側にシフトし、最初のカルボキシペプチダーゼ
Ａがゼロのときの0.340V/SCEから、溶液中に5mgの化ル
ポ岸ペプチダーゼＡがある上限のときの0.500V/SCEまで
変化した。この結果を図４に示すが、明らかに電位シフ
トが見られ、それは、酵素とポリマー鎖のジペプチド骨
格との複合体形成の間に生じるピロール鎖の立体障害及
び硬化によると思われる。この酵素とポリ（ピロール−
ジペプチド）との複合体形成は、従来から親和性クロマ
トグラフィーで行われているように、pH3の酸性媒質中
に酸素が放出されることによって確認された（I.M.Chai
ken,M.Wilcheck,I.Parikh,Affinity Chromatography an
d Biological Recognition,Academic Press,ニューヨー
ク,1983）。放出された酵素は、マークシーブリリアン
トブルーによる酵素活性の測定を含む、標準ウシ血清ア
ルブミンを用いた従来のブラッドフォード（Bradford）
試験により特性化した。１クーロンの重合電気量に相当
する５×10-6のモノマー単位を含むポリ（Gle−DPhe）
フィルムを用いた場合、酸性媒質中への放出の後、400
ミリグラムという相当な量のカルボキシペプチダーゼＡ
が得られた。307アミノ酸ユニットというこの酵素の大
きさを考慮すると、この放出された量は、（ピロール−
ジペプチド）の200のモノマー単位当たりに、約１分子
の酵素が複合していたことを示し、これは（約100倍と
いう）大きさの違いからも妥当である。この結果は、酵
素がポリマーフィルムの内側に分配され、それによっ
て、酵素に対するこのフィルムの透過性が現れることも
示している。酵素としてトリプシンを用いた比較データ
も得られている。
複合体形成の特異的性質が、中性pHにおいて（Gly−DPh
e）と安定な複合体を形成することが知られているカル
ボキシペプチダーゼＡを用いて分析された。0.5MのH2O
−NaCl中でのカルボキシペプチダーゼＡの濃度を、5cm3
中で1mgから5mgの範囲で増加させた溶液で分析した。非
置換ポリピロール、またはポリ（３、４、５、または
６）等の非特異的電極を溶液中に浸漬したときは、実施
例２で得られたものと同じボルタモグラムが観察され、
変化が見られなかった。しかし、ポリ（ピロール（Gly
−DPhe））、ポリ（２）、を用いると、ボルタモグラム
は高電位側にシフトし、最初のカルボキシペプチダーゼ
Ａがゼロのときの0.340V/SCEから、溶液中に5mgの化ル
ポ岸ペプチダーゼＡがある上限のときの0.500V/SCEまで
変化した。この結果を図４に示すが、明らかに電位シフ
トが見られ、それは、酵素とポリマー鎖のジペプチド骨
格との複合体形成の間に生じるピロール鎖の立体障害及
び硬化によると思われる。この酵素とポリ（ピロール−
ジペプチド）との複合体形成は、従来から親和性クロマ
トグラフィーで行われているように、pH3の酸性媒質中
に酸素が放出されることによって確認された（I.M.Chai
ken,M.Wilcheck,I.Parikh,Affinity Chromatography an
d Biological Recognition,Academic Press,ニューヨー
ク,1983）。放出された酵素は、マークシーブリリアン
トブルーによる酵素活性の測定を含む、標準ウシ血清ア
ルブミンを用いた従来のブラッドフォード（Bradford）
試験により特性化した。１クーロンの重合電気量に相当
する５×10-6のモノマー単位を含むポリ（Gle−DPhe）
フィルムを用いた場合、酸性媒質中への放出の後、400
ミリグラムという相当な量のカルボキシペプチダーゼＡ
が得られた。307アミノ酸ユニットというこの酵素の大
きさを考慮すると、この放出された量は、（ピロール−
ジペプチド）の200のモノマー単位当たりに、約１分子
の酵素が複合していたことを示し、これは（約100倍と
いう）大きさの違いからも妥当である。この結果は、酵
素がポリマーフィルムの内側に分配され、それによっ
て、酵素に対するこのフィルムの透過性が現れることも
示している。酵素としてトリプシンを用いた比較データ
も得られている。
所定の電極電位において、図４に見られるように、酵
素濃度による電流値の変化が観察される。この結果は、
電極のアンペロメトリック応答に対応し、この応答の有
利な性質の一つは、図５に示したように応答が比例関係
であることである。この比例関係は、溶液中の生物学的
化学種の定量的検定の提案を可能にする。この検定は、
電気化学タイプの捕捉剤を用いてもよいし、図６に模式
的に示したような電界効果トランジスターの発達によっ
てもよい。この作動原理は以下の通りである。ポリマー
は、基板上に配列されたソース及びドレイン電極上に形
成される。この組立物を、分析する溶液中に浸漬し、同
じ媒質中の対向電極が、このトランジスターの格子（gr
ille）を表す。この格子電極が、酵素濃度によるボルタ
モグラムの変化が最大となる、図４に示した場合では約
0.2Vとされたとき、ポリマーの導電性が酵素濃度によっ
てかなり変化する。そのときソースとドレインとの間に
かけられた電圧が、増幅した信号を得ることを可能に
し、このトランジスターは、電界効果トランジスターの
原理に従って作動する。
素濃度による電流値の変化が観察される。この結果は、
電極のアンペロメトリック応答に対応し、この応答の有
利な性質の一つは、図５に示したように応答が比例関係
であることである。この比例関係は、溶液中の生物学的
化学種の定量的検定の提案を可能にする。この検定は、
電気化学タイプの捕捉剤を用いてもよいし、図６に模式
的に示したような電界効果トランジスターの発達によっ
てもよい。この作動原理は以下の通りである。ポリマー
は、基板上に配列されたソース及びドレイン電極上に形
成される。この組立物を、分析する溶液中に浸漬し、同
じ媒質中の対向電極が、このトランジスターの格子（gr
ille）を表す。この格子電極が、酵素濃度によるボルタ
モグラムの変化が最大となる、図４に示した場合では約
0.2Vとされたとき、ポリマーの導電性が酵素濃度によっ
てかなり変化する。そのときソースとドレインとの間に
かけられた電圧が、増幅した信号を得ることを可能に
し、このトランジスターは、電界効果トランジスターの
原理に従って作動する。
実施例4:酵素の制御された放出
これらの電極のさらなる有利な特徴は、文献に記載さ
れているように、ポリ（ピロール−酢酸）またはポリ
（１）が、電気学的に酸化したときに電解質媒体中にプ
ロトンを放出することである（P.Bauerle等,Adv.Mate
r.,1990,2,490）。小容量の電解質では、pHが大きく変
化し、３のオーダーまで変化する。このプロトンの放出
は、カルボキシル基がピロール環から離間しているとき
にも観察され、例えば、保護されていないアミノ酸また
はペプチドがピロールにグラフトされている場合に見ら
れる。プロトンの制御された放出には２つの経路があ
る。カルボキシル末端基COOHが保護されていないペプチ
ドを用いるものと、ピロール−酢酸とピロール−保護さ
れたペプチドとのコポリマーを用いるものである。この
第２の経路について述べる。Py（Ａ）、（１）、と、Py
（Gly−DPhe）、（２）、とのコポリマーを、上述と同
条件で電気化学的に合成する。0.3V/SCEでの電気化学的
酸化によって、このポリ（１、２）のコポリマーは、電
極近傍において、pH＝４までの大きなpH変化をもたら
す。
れているように、ポリ（ピロール−酢酸）またはポリ
（１）が、電気学的に酸化したときに電解質媒体中にプ
ロトンを放出することである（P.Bauerle等,Adv.Mate
r.,1990,2,490）。小容量の電解質では、pHが大きく変
化し、３のオーダーまで変化する。このプロトンの放出
は、カルボキシル基がピロール環から離間しているとき
にも観察され、例えば、保護されていないアミノ酸また
はペプチドがピロールにグラフトされている場合に見ら
れる。プロトンの制御された放出には２つの経路があ
る。カルボキシル末端基COOHが保護されていないペプチ
ドを用いるものと、ピロール−酢酸とピロール−保護さ
れたペプチドとのコポリマーを用いるものである。この
第２の経路について述べる。Py（Ａ）、（１）、と、Py
（Gly−DPhe）、（２）、とのコポリマーを、上述と同
条件で電気化学的に合成する。0.3V/SCEでの電気化学的
酸化によって、このポリ（１、２）のコポリマーは、電
極近傍において、pH＝４までの大きなpH変化をもたら
す。
このポリ（１、２）コポリマーを用いて、あるいは、
カルボキシル基が自由なポリ（２）ポリマーを用いて、
抽出のための２つの過程を実施することができる。一方
はバッチ過程であり、他方は連続過程である。
カルボキシル基が自由なポリ（２）ポリマーを用いて、
抽出のための２つの過程を実施することができる。一方
はバッチ過程であり、他方は連続過程である。
ａ）バッチ過程
この過程は、上述の材料に基づいた膜又は電極を用い
ることからなり、それを他の化学種と共存する意図した
生物学的活性種を含む媒質に接触させる。グラフトした
ペプチドの意図した化学種に対する選択的な親和性が、
この化学種の、電極又は膜のポリマーにグラフトされた
ペプチドへの複合体形成を起こす。この膜又は電極を、
分析媒質から取り出して、回復媒質と呼ばれる他の媒質
中に導入する。NaCl型の支持塩を含むこの回復媒質中
で、電極または膜は電気化学的酸化を受け、それがカル
ボキシル基によるプロトンの放出を起こして、解離及び
意図した化学種の放出に十分なpHにまでなる。
ることからなり、それを他の化学種と共存する意図した
生物学的活性種を含む媒質に接触させる。グラフトした
ペプチドの意図した化学種に対する選択的な親和性が、
この化学種の、電極又は膜のポリマーにグラフトされた
ペプチドへの複合体形成を起こす。この膜又は電極を、
分析媒質から取り出して、回復媒質と呼ばれる他の媒質
中に導入する。NaCl型の支持塩を含むこの回復媒質中
で、電極または膜は電気化学的酸化を受け、それがカル
ボキシル基によるプロトンの放出を起こして、解離及び
意図した化学種の放出に十分なpHにまでなる。
ｂ）連続過程
ポリ（１、２）コポリマー、またはカルボキシル基が
フリーなポリ（２）を、膜または電極形状に調製した。
任意に、ポリカオチン性またはポリスチレンスルホン酸
型のポリアニオン性の支持ポリマー、あるいはNAFIONの
ようなパーフルオロ膜を用いた。この複合電極または膜
は、図７に模式的に示したように、２つの区画Ａ及びＢ
の間に接合を形成する。この過程によるカルボキシペプ
チダーゼＡの連続抽出の一例を以下に説明する。
フリーなポリ（２）を、膜または電極形状に調製した。
任意に、ポリカオチン性またはポリスチレンスルホン酸
型のポリアニオン性の支持ポリマー、あるいはNAFIONの
ようなパーフルオロ膜を用いた。この複合電極または膜
は、図７に模式的に示したように、２つの区画Ａ及びＢ
の間に接合を形成する。この過程によるカルボキシペプ
チダーゼＡの連続抽出の一例を以下に説明する。
図７に概略を示したものの場合、バイオ選択性部材
は、NAFION（Aldrich）膜中で重合した上記のポリ
（１、２）コポリマーからなる。この膜は、非常に微小
な白金格子上で、線状高級アルコール（Aldrich）の混
合物中の、NAFIONの５％溶液10μｌを蒸発させることに
よって得た。そのようにして得たNAFION膜は、約５μｍ
の厚さを持ち、ポリ（１、２）コポリマーの電気重合の
支持体として働いて、ポリ（１、２）−NAFION電極活性
複合膜を得る。
は、NAFION（Aldrich）膜中で重合した上記のポリ
（１、２）コポリマーからなる。この膜は、非常に微小
な白金格子上で、線状高級アルコール（Aldrich）の混
合物中の、NAFIONの５％溶液10μｌを蒸発させることに
よって得た。そのようにして得たNAFION膜は、約５μｍ
の厚さを持ち、ポリ（１、２）コポリマーの電気重合の
支持体として働いて、ポリ（１、２）−NAFION電極活性
複合膜を得る。
最初の工程１において、0.5MのH2O−NaCl媒質中の10g
のカルボキシペプチダーゼＡを、区画Ａに導入する。す
ると、［ポリ（１、２）］−NAFION複合膜上での複合体
形成が、上記実施例３で述べたように、（２）のペプチ
ド単位において即座に起こる。次いで、区画Ｂに導入し
た対向電極と参照電極とを用いて酸化を施す。第二の工
程２における電気化学的酸化は、区画Ｂにおいて約pH4
になるまでのプロトンの放出と、カルボキシペプチダー
ゼＡの迅速な放出をもたらす。この連続過程の１回のサ
イクルの終了後、酵素活性検定で決定したところ、1.2
グラムのカルボキシペプチダーゼＡが区画Ａで回収され
た。
のカルボキシペプチダーゼＡを、区画Ａに導入する。す
ると、［ポリ（１、２）］−NAFION複合膜上での複合体
形成が、上記実施例３で述べたように、（２）のペプチ
ド単位において即座に起こる。次いで、区画Ｂに導入し
た対向電極と参照電極とを用いて酸化を施す。第二の工
程２における電気化学的酸化は、区画Ｂにおいて約pH4
になるまでのプロトンの放出と、カルボキシペプチダー
ゼＡの迅速な放出をもたらす。この連続過程の１回のサ
イクルの終了後、酵素活性検定で決定したところ、1.2
グラムのカルボキシペプチダーゼＡが区画Ａで回収され
た。
これらの結果により、これらの電極の酵素に対する認
識現象、及び、これらの酵素を抽出する能力が確認され
た。この挙動は、ポリピロール鎖にグラフトされたジペ
プチドの化学的性質と１対１に結びついている。
識現象、及び、これらの酵素を抽出する能力が確認され
た。この挙動は、ポリピロール鎖にグラフトされたジペ
プチドの化学的性質と１対１に結びついている。
実施例5:ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドで
機能化されたポリピロールの合成 この合成は以下の３工程に従って行なわれた。
機能化されたポリピロールの合成 この合成は以下の３工程に従って行なわれた。
ａ）［Ｎ−３−ヒドロキシ−スクシンイミドピロール］
モノマーの合成 0.4molのピロール−酢酸（Ｉ）、30mlのクロロホル
ム、及び0.4molのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NH
S）を、三つ口フラスコに導入した。この混合物を撹拌
し、20mlクロロホルム中のヂシクロヘキシルカルボジイ
ミド（DCC）の0.4molを滴下した。２時間の撹拌後、白
色固体が形成され、それを濾過してクロロホルムで洗浄
した。不要な反応生成物を取り除くため、蒸発及び洗浄
を施した後、生成物をクロロホルムから再結晶させた。
意図した化合物の［Ｎ−３−ヒドロキシ−スクシンイミ
ドピロール］（III）が、白色粉状で得られた。
モノマーの合成 0.4molのピロール−酢酸（Ｉ）、30mlのクロロホル
ム、及び0.4molのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NH
S）を、三つ口フラスコに導入した。この混合物を撹拌
し、20mlクロロホルム中のヂシクロヘキシルカルボジイ
ミド（DCC）の0.4molを滴下した。２時間の撹拌後、白
色固体が形成され、それを濾過してクロロホルムで洗浄
した。不要な反応生成物を取り除くため、蒸発及び洗浄
を施した後、生成物をクロロホルムから再結晶させた。
意図した化合物の［Ｎ−３−ヒドロキシ−スクシンイミ
ドピロール］（III）が、白色粉状で得られた。
融点、m.p.＝135℃、1HNMR（ppm）：（NH、1H、９、
ｓ）；ピロール（2H、6.7、ｍ）：ピロール（1H、6.1、
ｓ）;CH2（2H、3.8、ｓ）；ヒドロキシスクシンイミド
（4H、2.8、ｓ）。
ｓ）；ピロール（2H、6.7、ｍ）：ピロール（1H、6.1、
ｓ）;CH2（2H、3.8、ｓ）；ヒドロキシスクシンイミド
（4H、2.8、ｓ）。
ｂ）電気重合によるポリマーの合成
0.5MのLiClO4と0.1Mのモノマーを含むアセトニトリル
溶液の電気化学的重合。電気重合は、表面積0.7cm2の白
金電極上で、飽和カロメル電極に対して0.9Vの電位で、
30mCの電気量をもちいて実施した。電極上に、ポリ（II
I）に相当する黒色の膜が現れ、その厚さは約200nmであ
った。
溶液の電気化学的重合。電気重合は、表面積0.7cm2の白
金電極上で、飽和カロメル電極に対して0.9Vの電位で、
30mCの電気量をもちいて実施した。電極上に、ポリ（II
I）に相当する黒色の膜が現れ、その厚さは約200nmであ
った。
このポリマーの電極活性を0.5MのLiClO4−アセトニトリ
ル中で分析したところ、図８に示したように、酸化ピー
クが0.28V/SCEであり、還元ピークが0.24V/SCEであっ
た。これらの酸化及び還元ピーク間の40mVというわずか
な相違は、このポリマーの極めて優れた電極活性及び可
逆性を確信させる。
ル中で分析したところ、図８に示したように、酸化ピー
クが0.28V/SCEであり、還元ピークが0.24V/SCEであっ
た。これらの酸化及び還元ピーク間の40mVというわずか
な相違は、このポリマーの極めて優れた電極活性及び可
逆性を確信させる。
ｃ）オリゴヌクレオチドODNのグラフト化
ポリマーフィルムを有する上記の電極を反応場質中に
浸漬した。この反応媒質は、ジメチルホルムアミドと、
10％の0.1Mホウ酸バッファー（pH9.3）及び26.2ナノモ
ルの14−塩基オリゴヌクレオチド（ODN）との混合物か
らなる。ODNは、CCTAAGAGGGAGTGの配列、及び、5'アミ
ノ基を含み、このアミノ基が、ポリマーのピロール単位
のＮ−ヒドロキシスクシンイミド基とのカップリング反
応を起こす。このカップリング反応は２時間以上起こさ
せる。グラフト化は、酢酸中における、オリゴヌクレオ
チドで置換されないスクシンイミド基の加水分解も伴
う。このようにして得られた電極上のポリマーは、ポリ
（［ピロール−ODN］［ピロール−COOH］）コポリマー
に相当する。
浸漬した。この反応媒質は、ジメチルホルムアミドと、
10％の0.1Mホウ酸バッファー（pH9.3）及び26.2ナノモ
ルの14−塩基オリゴヌクレオチド（ODN）との混合物か
らなる。ODNは、CCTAAGAGGGAGTGの配列、及び、5'アミ
ノ基を含み、このアミノ基が、ポリマーのピロール単位
のＮ−ヒドロキシスクシンイミド基とのカップリング反
応を起こす。このカップリング反応は２時間以上起こさ
せる。グラフト化は、酢酸中における、オリゴヌクレオ
チドで置換されないスクシンイミド基の加水分解も伴
う。このようにして得られた電極上のポリマーは、ポリ
（［ピロール−ODN］［ピロール−COOH］）コポリマー
に相当する。
実施例6:認識現象の特性化
認識現象を、実施例５（ｃ）で得たポリ（［ピロール
−ODN］［ピロール−COOH］）ポリマーフィルムを電気
化学的に特性化することによって確認した。電気化学的
分析は、まず、合成後に得られた電極にそのまま実施
し、次いで、この電極を標的ODN及び非標的ODN存在下に
配置してから実施した。従って、このポリマーのハイブ
リダイゼーション反応は、PEGで緩衝した水溶液中にお
いて、相補的ODN（標的）及び非相補的ODN（非標的）の
存在下で行った。インキュベーションは、335ナノモル
の濃度の標的ODNであるCACTCCCTCTAGGの存在下、また
は、272ナノモルの濃度の非標的ODNであるGGTGATAGAAGT
ATCの存在下で、37℃で２時間行った。反応後、フィル
ムをPEGバッファーで洗浄し、再クリックボルタンメト
リーで分析した。得られたボルタモグラムを図９及び図
10に示す。図９の結果によると、合成後標的または非標
的配列の存在下に配置する前は、ポリマーは0.34V/SCE
において可逆的な酸化ピークを示し、この機能化ポリマ
ーの電極活性が確認された。非標的配列の存在下でのイ
ンキュベーション反応の後に洗浄した後では、ボルタモ
グラムには変化が見られなかった。一方、このポリマー
を標的の存在下でインキュベートしたときは、得られた
ボルタモグラムは、図10に示すように異なっており、酸
化電位は60mV上昇して、0.4V/SCEとなった。この上昇
が、ODNと対応する標的との間に生じたハイブリダイゼ
ーションを全体的に示している。この酸化電位の上昇
は、ポリピロール鎖に吊り下げられた腕の複合体形成現
象によるものであり、従って、このポリマーの酸化に必
要なエネルギーが増加したことによる。
−ODN］［ピロール−COOH］）ポリマーフィルムを電気
化学的に特性化することによって確認した。電気化学的
分析は、まず、合成後に得られた電極にそのまま実施
し、次いで、この電極を標的ODN及び非標的ODN存在下に
配置してから実施した。従って、このポリマーのハイブ
リダイゼーション反応は、PEGで緩衝した水溶液中にお
いて、相補的ODN（標的）及び非相補的ODN（非標的）の
存在下で行った。インキュベーションは、335ナノモル
の濃度の標的ODNであるCACTCCCTCTAGGの存在下、また
は、272ナノモルの濃度の非標的ODNであるGGTGATAGAAGT
ATCの存在下で、37℃で２時間行った。反応後、フィル
ムをPEGバッファーで洗浄し、再クリックボルタンメト
リーで分析した。得られたボルタモグラムを図９及び図
10に示す。図９の結果によると、合成後標的または非標
的配列の存在下に配置する前は、ポリマーは0.34V/SCE
において可逆的な酸化ピークを示し、この機能化ポリマ
ーの電極活性が確認された。非標的配列の存在下でのイ
ンキュベーション反応の後に洗浄した後では、ボルタモ
グラムには変化が見られなかった。一方、このポリマー
を標的の存在下でインキュベートしたときは、得られた
ボルタモグラムは、図10に示すように異なっており、酸
化電位は60mV上昇して、0.4V/SCEとなった。この上昇
が、ODNと対応する標的との間に生じたハイブリダイゼ
ーションを全体的に示している。この酸化電位の上昇
は、ポリピロール鎖に吊り下げられた腕の複合体形成現
象によるものであり、従って、このポリマーの酸化に必
要なエネルギーが増加したことによる。
この結果により、この新規な部類の電極活物質である
３−位をオリゴヌクレオチドで置換された共役ポリヘテ
ロ環が、相補的なDNAの認識現象を効果的にもたらし、
さらに、これらの材料がこの選択的ハイブリダイゼーシ
ョンを電気化学的に読み取れることが確認された。この
電気化学的読み取りは、電気化学的、アンペロメトリッ
ク型またはポテンシオメトリック型の電気化学的遺伝子
捕捉剤への道を開き、さらに、アンペロメトリック応答
に基づく電界効果微小電気化学的トランジスターの遺伝
子捕捉剤への道を開くものである。
３−位をオリゴヌクレオチドで置換された共役ポリヘテ
ロ環が、相補的なDNAの認識現象を効果的にもたらし、
さらに、これらの材料がこの選択的ハイブリダイゼーシ
ョンを電気化学的に読み取れることが確認された。この
電気化学的読み取りは、電気化学的、アンペロメトリッ
ク型またはポテンシオメトリック型の電気化学的遺伝子
捕捉剤への道を開き、さらに、アンペロメトリック応答
に基づく電界効果微小電気化学的トランジスターの遺伝
子捕捉剤への道を開くものである。
Claims (14)
- 【請求項１】次式： ［ただし、ｎは零でない整数であり、ｉは２からｎ−１
の整数であり、 R1、Ri及びRnは、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、あ
るいは、アンチリガンドと共有結合しうる官能基を表す
が、R1、Ri及びRnが、同時にＨを表すことはない］ で表される導電性で電極活性機能化された共役ポリマー
であって、非−機能化共役ポリマー、即ち、式Ｉにおい
てR1、Ri及びRnがＨであるものと同じオーダーの導電性
及び電極活性を有するポリマー。 - 【請求項２】前記官能基が、下記の官能基の群： Yp−Ｃ−Ｘ（但しＸはＨ、OH、置換または非置換低級Ｏ
−アルキルラジカル、あるいはハロゲン、特にC1を表
す）;Yp−NHZ（但しＺはＨまたはアルキルラジカルを表
す）;Yp−HN−CO−CF3;Yp−Ｘ（但しＸは上記の定義に
より、ｐは好ましくは０、１または２の整数である）；
−Si（アルキル）３、−Si（アルコキシ）３またはＮ−
ヒドロキシスクシンイミドのような活性化エステル基： から独立に選択される請求項１記載のポリマー。 - 【請求項３】前記Ｙが、１から５の炭素原子を持つアル
キル基、１から５の炭素原子を持つアルコキシル基、一
般式（CH2−CH2−０）ｍ−（CH2）m'−に対応するポリ
エーテルで、ｍが１から３の整数でありm'は１又は２の
整数であるものから選択される基である請求項２記載の
ポリマー。 - 【請求項４】少なくとも１つのアンチリガンドと共有結
合した官能基を含む導電性で電極活性機能化された共役
ポリマーであって、下記式II: ［ただし、ｎは零でない整数であり、ｉは２からｎ−１
の整数であり、 R'1、R'i及びR'nは、同じでも異なっていてもよく、
Ｈ、あるいは、アンチリガンドと共有結合しうるまたは
共有結合した官能基を表すが、R'1、R'i及びR'nが、同
時にＨを表すことはない］ で表されるポリマー。 - 【請求項５】前記アンチリガンドに結合した官能基が、
アンチリガンドとの反応の前に、下記の官能基の群： Yp−Ｃ−Ｘ（但しＸはＨ、OH、置換または非置換低級Ｏ
−アルキルラジカル、あるいはハロゲン、特にC1を表
す）;Yp−NHZ（但しＺはＨまたはアルキルラジカルを表
す）;Yp−NH−CO−CF3;Yp−Ｘ（但しＸは上記の定義に
より、ｐは好ましくは０、１または２の整数である）；
−Si（アルキル）３、−Si（アルコキシ）３またはＮ−
ヒドロキシスクシンイミドのような活性化エステル基： から選択される請求項４記載のポリマー。 - 【請求項６】前記アンチリガンドと結合した官能基が、
同一であり、アンチリガンドとの反応の前に、−（C
H2）−COOHである請求項４または５に記載のポリマー。 - 【請求項７】アンチリガンドが、ペプチドまたはペプチ
ド誘導体、特にGly−Phe、Phe−Pro、及びPhe−Hea−Pr
oから、及び、CCTAAGAGGGAGTGの配列のオリゴヌクレオ
チドのようなポリヌクレオチドから選択される請求項６
記載の共役ポリマー。 - 【請求項８】アンチリガンドとは異なり、アンチリガン
ドと特異的に相互作用するリガンドを、インビトロまた
はインビボで検出または検定するための請求項４から７
のいずれかの共役ポリマーの使用方法であって、 前記リガンドと結合していない共役ポリマーと該リガン
ドと結合した共役ポリマーとの間の、電位差または電流
変化を観察及び／または測定することによってリガンド
が検出及び／または検定される方法。 - 【請求項９】タンパク質分解酵素、特にカルボキシペプ
チダーゼＡなどの酵素を検出及び／または検定するため
の請求項７のポリマーの請求項８記載の使用方法。 - 【請求項１０】CCTAAGAGGGAGTGの配列のオリゴヌクレオ
チドのようなポリヌクレオチドを検出及び／または検定
するための請求項４から７のいずれかのポリマーの請求
項８記載の使用方法。 - 【請求項１１】アンチリガンドとは異なり、アンチリガ
ンドと特異的に相互作用するリガンドを、インビトロま
たはインビボで抽出するための請求項４から７のいずれ
かの共役ポリマーの使用方法。 - 【請求項１２】前記共役ポリマーを、金属または炭素誘
導体などの導電性基体に析出させるか、または自己支持
フィルム状に形成する請求項４から７のいずれかの共役
ポリマーの使用方法。 - 【請求項１３】金属または炭素誘導体などの導電性基体
と、請求項４から７のいずれかのポリマーとからなる電
極。 - 【請求項１４】請求項４から７のいずれかのポリマーか
らなるポリマーの自己支持フィルム。
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