ES2204949T3

ES2204949T3 - Polimeros conjugados funcionalizados, electricamente conductores y electroactivos, y sus utilizaciones.

Info

Publication number: ES2204949T3
Application number: ES95918636T
Authority: ES
Inventors: Francis Garnier
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1994-04-22
Filing date: 1995-04-24
Publication date: 2004-05-01
Anticipated expiration: 2015-04-24
Also published as: FR2720832A1; JPH09504334A; WO1995029199A1; US6096825A; EP0705291B1; DE69531717T2; ATE249487T1; CA2165978A1; US6201086B1; JP3428652B2; EP0705291A1; DE69531717D1

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A POLIMEROS CONJUGADOS, ELECTRICAMENTE CONDUCTORES, Y ELECTROACTIVOS Y SUS UTILIZACIONES, COMPRENDIENDO ESTOS POLIMEROS AL MENOS UN GRUPO FUNCIONAL UNIDO, POR COVALENCIA, A UNA PRIMERA MOLECULA BIOLOGICA O ANTILIGANDO QUE RESPONDE A LA FORMULA (II) EN LA QUE N ES UN NUMERO ENTERO NO NULO E I ES UN NUMERO ENTERO QUE VARIA DE 2 A N-1, R{SUP,''1}, R{SUP,''I}, R{SUP,''N}, IDENTICOS O DIFERENTES, REPRESENTAN CADA UNO H O UN GRUPO FUNCIONAL SUSCEPTIBLE DE UNIRSE, O UNIDO, POR COVALENCIA, A UNA PRIMERA MOLECULA BIOLOGICA O ANTILIGANDO.

Description

Polímeros conjugados funcionalizados, eléctricamente conductores y electroactivos, y sus utilizaciones.

Los polímeros conjugados, tales como los polipirroles, politiofenos, polianilinas, polifenilenos, y sus derivados, son conocidos por su carácter electroactivo, ampliamente descrito en las obras especializadas de revisión, tales como "Handbook of Organic Conducting Polymeres",- Manual de polímeros orgánicos conductores-, (T. J. Skotheim Editeur, Marcel Dekker, New York, 1986). Estos polímeros, se obtienen bajo la forma de una película sobre electrodo, bajo la forma de películas auto-portantes (auto-soportadas), o incluso bajo la forma de materiales compuestos ("composites"), cuando se encuentran ligados a un polímero policatiónico o polianiónico y se comportan como electrodos orgánicos, los cuales se cargan siguiendo un procedimiento de oxidación anódica, por inserción de iones del medio electrolítico. Este proceso electroquímico, es reversible, provocando, la reducción, la expulsión de los iones de este polímero conjugado o del compuesto electroactivo.

Una segunda generación de los polímeros conjugados, ha sido descrita, a continuación, en la literatura especializada, la cual se obtiene mediante injerto covalente, sobre las unidades monómeras de los polímeros, de grupos funcionalizados, capaces de aportar una función adicional a estos polímeros conjugados electroactivos. A título de ejemplo, se ha procedido a injertar complejos metálicos electroactivos, sobre las unidades monómeras del polipirrol, se ha procedido a injertar macrociclos complejantes específicos sobres las cadenas del polipirrol o de politiofeno, para el reconocimiento de los cationes en el medio electrolítico, y se han injertado grupos quirálicos sobre politiofenos, para el reconocimiento de aniones ópticamente activos. El conjunto de estas vías de funcionalización, ha sido también el objetivo de las puestas a punto detalladas en la literatura especializada (F. Garnier, Angew, Chemie, 1989, 101, 529; A. Deronzier, J.C. Moutet, Acc, Chem. Res. 1989, 22, 249; J. Roncali, Chem. Rev., 1992, 92, 711).

En estos últimos años, determinados autores, se han interesado por la utilización de los polímeros conductores funcionalizados, para el desarrollo de captores de analitos, especialmente, a título de diagnóstico. De todos modos, tal y como se indica en la solicitud de patente europea EP 0 314 009, se ha admitido, de una forma común, por parte de la comunidad científica, el hecho de que, los polímeros de pirrol sustituidos al nivel de, o bien ya sea el átomo de nitrógeno, o bien ya sea directamente al nivel de los átomos de carbono del ciclo pirrol, no eran buenos candidatos para el desarrollo de captores de analitos, debido al hecho, especialmente, de la pérdida de conductividad de los citados polímeros, cuando se introducen grupos funcionales sobre el ciclo heteroatómico. Para resolver este problema, los autores de esta solicitud de patente, habían por lo tanto pretendido el utilizar polímeros 2,5-di(2-tienilpirrol), sobre los cuales se encontraba injertada, en la posición 3 del núcleo pirrol, un parte reactiva a la cual se le podía enlazar, por covalencia, una molécula orgánica. Es conveniente, no obstante, el tomar debida nota en cuanto al hecho de que, debido a la hidrofobicidad de los núcleos tiofenos, los polímeros descritos, no puede ser conductores y electroactivos en los medios acuosos y, debido a ello, no parecen muy adaptados para la detección y / o caracterización de un analito en una muestra biológica (véase J. Roncali y colegas, Chem. Comm. 1986, página 783 y G. Tourillon y colegas., Electronal. Chem. 161, 407, 1984).

Se ha descubierto ahora, de una forma del todo sorprendente, y en contra de lo que se había admitido hasta ahora por parte de los especialistas, el hecho de que, la conductividad y la electroactividad de los polipirroles, se conservan, con la condición de que se efectúe el injerto de un grupo funcional, en la posición 3 ó 4, sobre el núcleo de pirrol, con la ayuda de un agente de funcionalización que permite el alejamiento de la función pretendida, con relación al núcleo pirrol. En la extremidad libre del grupo funcional, se encuentra enlazado, por covalencia, un anti-ligando, sin que se modifiquen las propiedades anteriormente citadas del polímero. Tales tipos de polímeros funcionalizados, no han sido descritos nunca, hasta ahora, y se han revelado como siendo perfectamente apropiados como captores de un ligando biológico. Además de ello, los polipirroles, se revelan como siendo polímeros interesantes, debido al hecho de su biocompatibilidad. Finalmente, los polipirroles funcionalizados de esta forma, permiten el realizar polímeros electroactivos y conductores de espesores importantes (hasta varios milímetros), lo cual autoriza una gran densidad de sitios funcionalizados y mejora en la misma medida la sensibilidad.

La invención, tiene por lo tanto como un primer objetivo, un polímero funcionalizado, eléctricamente conductor y electroactivo, que responde a la fórmula I:

1

en la cual:

* n, es un número entero, no igual a cero, e i, es un número entero variante de 2 a n-1, y

* R^{1}, R^{i}, R^{n}, idénticas o diferentes, representan H o un grupo funcional, con la exclusión de CH_{2}-COOH, susceptible de enlazarse, por covalencia, a una primera molécula biológica o anti-ligante,

y caracterizado por el hecho de que, el citado polímero, presenta una conductividad y una electroactividad sensiblemente del mismo orden que la del polímero conjugado, no funcionalizado, correspondiente, es decir, del polímero de fórmula I correspondiente, en el cual, R^{1}, R^{i}, R^{n}, representan cada una H.

De una forma más particular, el grupo funcionalizado, o los grupos funcionalizados, se eligen, de una forma independiente, entre el conjunto de grupos funcionalizados siguientes:

Y_{p}-C-X en donde, X, representa H, OH, un radical O-alquilo inferior, sustituido o no, un halógeno, especialmente, Cl,; Y_{p}-NHZ, en donde, Z, representa, o bien ya sea H o bien ya sea un radical alquilo; Y_{p}-NH-CO-CFe_{3}; Y_{p}-X, en donde X, responde a la definición anterior, descrita arriba, siendo p un número entero, de una forma preferente, igual a 0, 1 ó 2; -Si(alquilo)_{3}-, -Si(alcoxilo)_{3}, o un grupo éster activado, tal como la n-hidroxi-succinimida.

Y, representa un grupo elegido de entre los alquilos que tienen de 1 a 5 átomos de carbono, los alcoxilos que tienen de 1 a 5 átomos de carbono, los poliéteres que responden a la fórmula general (CH_{2}-CH_{2}-O)_{m}-(CH_{2})_{m'}-, representando m un número entero, que varía de 3 1 a 3, y m', un número entero, igual a 1 ó 2.

La invención, tiene como segundo objetivo un polímero funcionalizado, eléctricamente conductor y electroactivo, que comprende por lo menos un grupo funcionalizado, enlazado, por covalencia, a una primera molécula biológica, o anti-ligando, que responde a la fórmula I:

2

en la cual:

* R'^{1}, R'^{i}, R'^{n}, idénticas o diferentes, representan H o un grupo funcional, susceptible de enlazarse, o enlazado, por covalencia, a una primera molécula biológica o anti-ligando.

Los grupos funcionales ligados a una molécula biológica o ligando, se eligen, antes de reacción con ésta última, de entre el conjunto de grupos funcionalizados siguientes:

Y_{p}-C-X en donde, X, representa H, OH, un radical O-alquilo inferior, sustituido o no, un halógeno, especialmente, Cl,; Y_{p}-NHZ, en donde, Z, representa o bien ya sea H o bien ya sea un radical alquilo; Y_{p}-NH-CO-CFe_{3}; Y_{p}-X en donde, X, responde a la definición anterior, descrita arriba, siendo p un número entero, de una forma preferente, igual a 0, 1 ó 2; -Si(alquilo)_{3}-, -Si(alcoxilo)_{3}, o un grupo éster activado, tal como la n-hidroxi-succinimida.

De una forma particular, los grupos funcionales enlazados a una molécula biológica, son idénticos, y constituyen, antes de la reacción con la primera molécula biológica o con las primeras moléculas biológicas, en (CH_{2})-COOH, eligiéndose, las citadas primeras moléculas biológicas o anti-ligandos, de entre los péptidos o derivados de péptidos, especialmente, Gly-Phe, Phe-Pro, Phe-HEA-Pro, y de entre los polinucleótidos, tales como el oligonucleótido de secuencia: CCTAAGAGGGAGTG.

Un tercer objetivo de la invención, es la utilización de un polímero conjugado, tal y como se define, precedentemente, según el segundo objetivo de la invención, para detectar o dosificar, in vitro o in vivo, una segunda molécula biológica o ligando, diferente del anti-ligando, e interaccionado específicamente con éste último, efectuándose, la detección y / o la dosificación del citado ligando, por observación y / o medición de una diferencia de potencial o de una variación de corriente, entre el polímero conjugado no enlazado al ligando, y el polímero conjugado enlazado al ligando.

De una forma particular, los polímeros de la invención, se utilizan para detectar y / o dosificar una enzima, tal como una enzima proteolítica, especialmente, la carboxipeptidasa A, o un polinucleótido o, por el contrario, in vitro o in vivo, una segunda molécula biológica o ligando, diferente del anti-ligando, y que interactiva específicamente con éste último.

En una forma de realización de la invención, el polímero conjugado, se deposita sobre un substrato conductor, tal como el metal o un derivado del carbono, o bajo la forma de una película auto-portante (auto-soportada).

Finalmente, la invención, se refiere a un electrodo y una película auto-portante, constituidos por un substrato conductor, tal como un metal o derivado del carbono, y de un polímero tal y como se ha definido anteriormente, según el segundo objetivo de la invención.

En una forma de realización, el anti-ligando, es específico del ligando o molécula diana. El anti-ligando, se elige, principalmente, para formar un complejo anti-ligando / molécula diana. A título de ejemplo, el complejo, puede estar principalmente representado, por toda pareja péptido / anticuerpo, anticuerpo / hapteno, hormona / receptor, los híbridos polinucleótido / polinucleótido, polinucleótido / ácido nucléico, o análogos.

El término polinucleótido, tal y como se utiliza en la presente invención, designa un encadenamiento de por lo menos cinco desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, que comprenden, eventualmente, por lo menos un nucleótido modificado, por ejemplo, un nucleótido que comprende una base modificada, tal como la inosina, la metil-5-desoxicitidina, la dimetilamino-5-desoxiuridina, la desoxiuridina, la diamino-2,6-purina, la bromo-5-desoxiuridina, o toda otra base modificada que permita la hibridación. Este polinucleótido, puede igualmente estar modificado al nivel del enlace internucleotídico, (como por ejemplo, los enlaces fosforotioato, H-fosfonato, alquil-fosfonato), al nivel del esqueleto, como por ejemplo, los alfa-oligonucleótidos, (FR 2 607 507), o los PNA (M. Elgholm y colegas, J. Am. Chem. Soc., (1992), 114, 1895, 1897). Cada una de estas modificaciones, puede tomarse en combinación.

El término "péptido", tal y como se utiliza en la presente solicitud, significa principalmente todo péptido de por lo menos dos aminoácidos, principalmente, proteína o fragmento de proteína, oligopéptido, extracto, separado o substancialmente aislado o sintetizado, principalmente, aquéllos obtenidos por síntesis químicas o por expresión en un organismo recombinante; todo péptido, en cuya secuencia se reemplazan uno o varios aminoácidos de la serie L, por un aminoácido de la serie D, y vice-versa; todo péptido, en donde, por lo menos uno de los enlaces CO-NH y, de una forma ventajosa, todos los enlaces CO-NH de la cadena peptídica, se encuentra(n) reemplazado(s) por un enlace o enlaces NH-CO; todo péptido en donde, por lo menos uno de los enlaces CO-NH y, de una forma ventajosa, todos los enlaces CO-NH, se encuentra(n) reemplazado(s) por un enlace o enlaces NH-CO, encontrándose, la quiralidad de cada residuo aminoacilo, tanto si se encuentra implicado o no en uno do varios enlaces CO-NH, submencinados, bien ya sea conservada, o bien ya sea invertida, con relación a los residuos aminoacilos, que constituyen un péptido de referencia, siendo estos compuestos todavía designados como inmuno-retroides, un mimotopo.

Pueden injertarse numerosas clases de péptidos, tal y como lo muestra la lista exhaustiva que se facilita posteriormente, a continuación: hormonas adrenocorti-cotrópicas o sus fragmentos; análogos de angiotensinas o sus inhibidores (compuestos del sistema renino-angiotensina, que regulan la hipertensión renal); péptidos natriuréticos; bradiquinina o sus derivados peptídicos; péptidos quimiotácticos, dinorfina y sus derivados; endorfinas o análogos; encefalinas o sus derivados; inhibidores de enzimas (tales como las proteasas); fragmentos de fibronectina y derivados; péptidos gastrointestinales; péptidos asociados a la liberación de hormonas de crecimiento; neurotensinas y análogos; péptidos opiodes; oxitocina, vasopresina, vasotocina y derivados; proteínas quinasas.

Los péptidos o los polinucleótidos, poseen una actividad biológica elevada, y son conocidos para controlar numerosas funciones biológicas (A.S. Dutta, Advances in Drug Research,- Avances en la investigación de fármacos -, B. Testa Editeur, Academic Press, New York, 1991, 21, 145). Los péptidos, muestran, por ejemplo, un potencial terapéutico muy importante, en calidad de receptor agonista o antagonista, en calidad de inhibidores muy potentes, que se enlazan de forma fuerte a las enzimas, principio sobre el cual se basa la cromatografía denominada de afinidad. Además de ello, los polinucleótidos, pueden dar lugar, mediante la reacción de hibridación selectiva con otros nucleótidos o fragmentos de ácidos nucléicos diana, a fenómenos de reconocimiento interesantes, que permiten principalmente el desarrollo de nuevos captores de genes. Así, de esta forma, para detectar y / o dosificar un ácido nucléico o un fragmento de ácido nucléico diana, se procede a poner en contacto un polímero funcionalizado unido por lo menos parcialmente a un polinucleótido anti-ligando, con una muestra susceptible de contener una diana y, a continuación, se detecta la reacción de hibridación, si ésta ha tenido lugar, bien ya sea directamente, mediante la medición de una diferencia de potencial o de variación de la corriente entre el polímero no enlazado y el polímero enlazado que haya reaccionado con la diana, o bien ya sea indirectamente, mediante la misma medición que precedentemente, pero con la ayuda de un polinucleótido suplementario de detección, susceptible de reaccionar con la diana, siendo, el polinucleótido suplementario, de una forma preferente, contiguo al polinucleótido anti-ligando y encontrándose marcado con una molécula eletroactiva.

El término "anticuerpo", tal y como se utiliza en la presente solicitud, significa todo anticuerpo monoclonal o policlonal, todo fragmento de un denominado anticuerpo tal como fragmento Fab, Fab'2, o Fc, así como todo anticuerpo obtenido por modificación o recombinación genética.

La funcionalización del polipirrol en posición 3 ó 4 del ciclo pirrol, puede efectuarse, bien ya sea sobre las unidades monómeras con una etapa de polimerización subsiguiente, o bien ya sea sobre las unidades monómeras de un polímero sintetizado previamente. Puede utilizarse todo agente de funcionalización apropiado, con la condición de que, éste, comprenda por lo menos una función reactiva susceptible de reaccionar con los átomos 3 y / o 4 del núcleo pirrol. El agente de funcionalización, puede de esta forma ser un agente unifuncional, con la condición de que, después de la etapa de injerto sobre el núcleo pirrol, se introduzca una función reactiva, por reacción subsiguiente con un anti-ligando, ya sea polifuncional, tal como agentes bifuncionales y, en particular, homo o heterobifuncional. A título de ejemplo, el agente de funcionalización, se elige de entre las cadenas alquilos o alcoxialquilos o poliéteres sustituidos o no, y terminados por un grupo que porta una función reactiva. La función reactiva, se representa principalmente por un grupo funcional tal como un grupo carboxílico, hidracina, amina, nitrilo, aldehído, tiol, disulfuro iodoacetilo, éster, anhídrido, tosilo, mesilo, tritilo, sililo o análogos.

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La formación de un conjugado resultante de acoplamiento covalente de un anti-ligando, como por ejemplo, un polinucleótido a un polipirrol funcionalizado en concordancia con la invención, puede efectuarse según los procedimientos denominados directos o indirectos, conocidos.

Por ejemplo, en el caso de un polinucleótido, según el procedimiento directo, se procede a sintetizar un polinucleótido que tenga una función reactiva sobre un sitio cualquiera de la cadena nucleotídica, como por ejemplo, la extremidad 5' o la extremidad 3', o sobre una base o sobre un fosfato inernucleotídico, o sobre la posición 2' de un azúcar. Se procede, a continuación, a acoplar el polinucleótido al polímero, previamente preparado, y que comporta una función reactiva complementaria de la precedente, es decir, que permita la formación de un enlace covalente, por reacción entre las dos funciones reactivas complementarias, aportándose una de ellas por el nucleótido, y aportándose la otra por el polímero funcionalizado. Así, por ejemplo, de una forma conocida, se pueden acoplar aminas primarias con un ácido carboxílico activado o un aldehído, o bien una función tiol, con un halogenoalquilo. De una forma preferente, la función reactiva del polinucleótido, para el acoplamiento sobre el polímero, se encuentra en el extremo 5' o 3'.

En el procedimiento de acoplamiento indirecto, el polinucleótido y el polímero, son cada uno de ellos portadores de una función reactiva, pudiendo ser, dichas funciones reactivas, idénticas o diferentes la una con la otra, no siendo estas dos funciones complementarias, pero sí siendo capaces de reaccionar con un agente intermediario de acoplamiento, que es un reactivo bifuncional (homobifuncional, si las dos funciones son idénticas, o heterobifuncional, si las dos funciones son diferentes). Entre los agentes de acoplamiento homobifuncionales, se pueden citar el DITC (fenilen-1,4-diisotiocianato), el DSS (disuccinimidilsuberato) o análogos. Entre los agentes de acoplamiento heterobifuncionales, se pueden citar el SMCC (succinimidil-4-(N-meleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato), o el SMPB (succinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato), capaces de reaccionar, por una parte, con una amina primaria y, por otra parte, con un tiol.

La invención, se comprenderá de una forma mejor, mediante la lectura de la descripción detallada, la cual se va a facilitar, a continuación, y que se hace en referencia a las figuras anexadas, en las cuales,

la figura 1, representa ejemplos de polímeros conjugados, tal como 1), poliacetileno, 2) polipirrol; 3) politiofeno; 4) polifenileno; 5) polianilina;

la figura 2A, representa un polipirrol sustituido en la posición 3, con el ácido acético (1), y representando, las figuras 2B, 2C, 2D, 2E, y 2F, polipirroles sustituidos en la posición 3, con diferentes péptidos (de 2 a 6, respectivamente);

la figura 3, representa los voltamogramas de cuatro polímeros funcionalizados, que se citan posteriormente, abajo, identificados en medio H_{2}O-NaCl 0,5 M;

el poli(pirrol-ácido acético) en (1), el poli(pirrol(Gly, DPhe)) en (2), el poli(pirrol(Val)) en 3), y el poli(pirrol(Phe)) en 4);

la figura 4, representa el voltamograma de Poly(2), en medio H_{2}O-NaCl, 0,5 M, en presencia de carboxipeptidasa A, en una concentración de, respectivamente, 0,0 mg, en 5 cm^{3} de electrolito (a), 1,2 mg de 5 cm^{3} de electrolito (b), 2,4 mg en 5 cm^{3} de electrolito (c), y 5,0 mg, en 5 cm^{3} de electrolito (d);

la figura 5, corresponde a la respuesta amperométrica de un electrodo, Poly(2), en función de la cantidad de enzima, carboxipeptidasa A, en nanomoles, existente en el medio. La relación lineal entre la corriente observada y cantidad de enzima, a un potencial de 0,3, viene dada por relación a un electrodo calomel saturado,

la figura 6, es un esquema de principio, de un transistor microelectroquímico de efecto de campo, para la detección (amplificada) de la presencia de una especie biológica reconocida por un polímero conductor funcionalizado. Las abreviaciones que se facilitan a continuación, significan, respectivamente: P, polímero; Sub, substrato; S,D, electrodos de fuente y de drenaje, respectivamente; Ce, contra-electrodo, interpretando el rol de una reja; G,R, electrodo de referencia; Poten., potenciostato;

la figura 7, es un esquema de principio, de una célula electroquímica de membrana polipirrol, funcionalizada y de dos compartimientos, para la extracción de especies biológicas reconocidas por un sustituyente injertado sobre una cadena de polímero conjugado electroactivo;

la figura 8, representa el voltamograma del poli[N-hidroxisuccionimido-3-pirrol], en medio acetonitrilo - 0,1 M LiClO_{4}, con un electrodo de referencia al calomel saturado, que muestra una electroactividad y una reversibilidad electroquímica elevadas;

La figura 9, representa el voltamograma de un electrodo de copolímero poli([pirrol-ODN][pirrol-COOH]), con, como polinucleótido u oligonucleótido, ODN de secuencia CCTAAGAGGGAGTG. No se observó ninguna modificación, después de la incubación de este polímero con una secuencia no diana GGTGATAGAAGTATC, y

La figura 10, representa el voltamograma de un electrodo de copolímero Poli([pirrol-ODN][pirrol-COOH]), con, como oligonucleótido, ODN de secuencia CCTAAGAGGGAGTG. Este electrodo, se incubó en presencia de una diana, CACTCCCTCTTAGG, 335 mmol, a una temperatura de 37ºC, durante un transcurso de tiempo de 2 horas. Se procedió, a continuación, a lavar este electrodo, y a analizarlo en medio electroquímico. Se observó un desplazamiento de potencial, con relación al voltamograma precedente.

Los polímeros en concordancia con la invención, se utilizan principalmente para la detección de especies biológicamente activas, susceptibles de encontrase presentes en una muestra, y de reaccionar con el anti-ligando los anti-ligandos injertados. En efecto, tal y como se muestra posteriormente, a continuación, se observa el hecho de que, los polímeros conjugados funcionalizados en posición 3 de su heterociclo, y a los cuales se encuentran injertados uno varios anti-ligandos, después de la reacción con uno o varios ligandos, presentan una modificación de la respuesta electroquímica, con relación a un polímero de referencia que no haya reaccionado con el ligando o los ligandos de un medio biológico, visualizado por un cambio del potencial de oxidación. Esta variación del voltamograma electrolítico de oxido-reducción del polímero, confiere una función de captor, y puede de esta forma utilizarse para una medición cuantitativa de la especie biológicamente activa, bien ya sea mediante la variación del potencial, de corriente fija, o bien ya sea mediante la variación de la corriente, a potencial fijo, o incluso mediante la realización de transistores microelectroquímicos de efecto de campo.

Además, los polímeros de la invención, son igualmente utilizables para la extracción de especies biológicamente activas en solución. En varios casos, la especie biológicamente activa en solución, se combina de una forma fuerte al anti-ligando injertado sobre la cadena de polimerasa, tal como un péptido bioactivo o un polinucleótido, lo cual permite, por lo tanto, el extraer la especie biológicamente activa, de una forma selectiva, de un medio. Este tipo de extracción, puede realizarse in vitro, o incluso in vivo, cuando el polímero de soporte, es biocompatible, tal como el polipirrol, por ejemplo.

Finalmente, los polímeros de la invención, pueden ser una fuente de reliberación de un medio en otro medio, de especies biológicamente activas (enzimas, entre otras).

La funcionalización de los polímeros conductores electroactivos de la invención, tales como los polipirroles, mediante grupos que muestran un reconocimiento con respecto a los compuestos de interés biológico, puede ser esperada en el reconocimiento de ácidos nucléicos (AN). Así, de esta forma, el injerto de polinucleótidos u oligonucleótidos, ODN, a lo largo de la cadena conjugada del polímero, debe permitir la discriminación en el seno de un medio biológico de los AN o fragmentos de AN correspondientes. Este reconocimiento, se llevará a cabo operando mediante hibridación selectiva entre el ODN, injertado sobre el polímero, y el AN correspondiente, existente en el medio externo, en el cual se encuentra sumergido la película de polímero funcionalizado, a la imagen del reconocimiento "péptido / enzima", descrito ulteriormente. La complejación "ODN/AN", da como resultado otra modificación de las propiedades fisicoquímicas del polímero conjugado, cuya característica, permitirá confirmar la presencia del AN buscado.

El punto esencial, concierne a la naturaleza de las propiedades fisicoquímicas del polímero, llamadas a ser modificadas, en el momento del reconocimiento "ODN/AN". Efectivamente, con el fin de desarrollar un procedimiento de medición rápida, sensible y cuantitativo, de la presencia de AN, la finalidad de la presente invención, se refiere a la elaboración de materiales electroactivos, cuya respuesta electroquímica, será modificada después de la hibridación "ODN/AN". La modificación, se referirá a una variación del tipo petenciométrico, como vibración del potencial de oxidación del polímero, o amperométrica, por variación de la corriente de oxidación (o de reducción), observada a un potencial determinado. Estas variaciones de respuesta electrolítica, podrán medirse cuantitativamente utilizándose las películas de polímeros funcionalizados, ya sea como captores electroquímicos de tipo amperométrico, o potenciométrico, o bien ya sea todavía en una estructura de transistor microelectrónico de efecto de campo, de la forma que se ha descrito precedentemente, en el caso del reconocimiento enzimático a partir de péptidos injertados sobre polipirrol. El interés de este tipo de mediciones, se refiere a la rapidez, la sensibilidad, y la posibilidad de realizar cartas matriciales de 2n elementos de medición, comportando n ODN, dianas y no dianas, capaces por lo tanto de discriminar rápidamente la presencia o la ausencia de genes en un medio.

De la misma forma que en el caso del reconocimiento enzimático precedentemente descrito, un segundo punto esencial, se refiere al hecho de que, para obtener una respuesta electroquímica a un fenómeno de reconocimiento, la funcionalización en posición 3 de un núcleo heterocíclico (pirrol) es indispensable.

Con el fin de asegurar una respuesta del tipo electroquímico precisa para estos polímeros, es necesario el hecho de que, la funcionalización de las cadenas conjugadas, sea compatible con la electroactividad importante del polímero funcionalizado. La necesidad de una electroactividad de este tipo, exige, en el caso de poliheterociclos hidrófilos, tales como el polipirrol, el que, la funcionalización, se opere en la posición 3 del ciclo pirrólico. Los polímeros de la invención, son polímeros electroactivos en los cuales, o bien todas las unidades monómeras se encuentran funcionalizadas con un anti-ligando, tal como un oligonucleótido, o bien una parte solamente de las unidades monómeras, se funcionalizan de esta forma. Se entenderá bien, de esta forma, el hecho de que, las unidades, pueden funcionalizarse por anti-ligandos idénticos o diferentes, pudiendo utilizarse los polímeros de la invención, en este último caso, para la detección de varios ligandos diana, en un misma muestra. Los polímeros de la invención, pueden realizarse mediante las distintas vías siguientes:

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a) Polímeros totalmente funcionalizados

En esta vía, la primera etapa, concierne a la funcionalización del monómero, tal como pirrol, mediante un anti-ligando, tal como un oligonucleótido determinado. La segunda etapa, concierne, a continuación, a la polimerización de este monómero, dando como resultado una película de polímero, en la cual, todas las unidades monómeras, son funcionarizadas.

b) Copolímeros parcialmente funcionalizados

En el caso particular de los ácido nucléicos diana, y tendiendo en cuenta el hecho de su tamaño, generalmente importante, la funcionalización de todas las unidades monómeras, de pequeños tamaños, del polímero, no es necesaria y, una de las vías, concernirá por lo tanto a la realización, de un copolímero, el cual hará intervenir, por una parte, las unidades monómeros funcionalizadas descritas en a) y, igualmente, unidades pirrol no funcionalizadas, con el oligonucleótido anti-ligando.

c) Funcionalización de un polímero precursor

La funcionalización parcial de una película de polímero, puede también realizarse, a partir de una película de polímero conjugado, en el cual se introducen, previamente, grupos químicos compatibles con el injerto de un anti-ligando, tal como un oligonucleótido. En esta vía, se realizará, en primer lugar, un monómero que comporta un "synthon" de injerto, tal como el [N-hidroxi-succinimido-3-pirrol]. El shynton [N-hidroxisuccinimida], es conocido por permitir el injerto ulterior de un oligonucleótido. Se procederá, a continuación a polimerizar este monómero, o incluso, se copolimerizará con otro derivado de pirrol. La película de copolímero obtenida, se sumergirá, a continuación, en un medio reactivo, que contenga un oligonucleótido, y se emprenderá la reacción de injerto de este oligonucleótido, sobre los monómeros pirrol. Este injerto, no intervendrá, de hecho, más que sobre una parte de las unidades monómeras pirrol, constitutivas del polímero.

Ejemplo 1 Síntesis de los monómeros

En el ejemplo que se describe en la parte que sigue a continuación, el polipirrol (1), se ha elegido como soporte polímero conjugado, teniendo en cuenta su biocompatibilidad (H. Naarimann, comunicación personal). Se procede a injertar un brazo espaciador A, entre el átomo de carbono 3 del núcleo pirrol, y el sustituyente peptídico, para preservar la conductividad y la electroactividad del polipirrol funcionalizado correspondiente. Se procedió a elegir diferentes péptidos, con su función terminal carboxílica no protegida o protegida, en forma de éster metílico, por su pertinencia biológica, y se injertaron sobre un monómero pirrol-ácido acético, PyA (1). Se procedió a injertar diversos mono y dipéptidos, y condujeron a los derivados pirrólicos siguientes, representados sobre la figura 2: pirrol - ácido acético, PyA (1), pirrol(Glicina-dFenilalanina), Py(Gly-Dphe) (2), por su capacidad de complejación con las enzimas proteológicas tales como la carboxipeptidasa A (Sigma) y tripsina (Sigma) (J.R. Uren, Biochim. Acta, 1971, 236, 67), pirrol(valina), Py(Val) (3), pirrol(fenilalanina), Py(Phe) (4), pirrol(Fenilalanina-Prolina), Py(Phe-Pro), (5). Pueden también injertarse derivados de dipéptido, más voluminosos, tales como el Fenilalanina-Hidroxietilalamina-Prolina, Py(Phe[HEA]Pro (6), conocido por ser un inhibidor potencial interesante para la proteasa, asociado al virus HIV-1 del SIDA. Estos monómeros, se sintetizaron siguiendo una vía química descrita (D. Delabouglise, F. Garnier, Synth. Met., 1990, 39, 117). Estos monómeros, se purificaron y caracterizaron por RMN, microanálisis, y espectrometría de masa.

Ejemplo 2 Polimerización

Estos monómeros, se polimerizaron por vía electroquímica, sobre electrodo de platino, de 0,7 cm^{2}, así como sobre una rejilla de platino, de 10 cm^{2} de superficie, en medio carbonato de propileno, con 0,5 M de NaCl, a un potencial constante de 0,8 V/SCE. Se obtuvieron películas espesas de polímero, hasta espesores de unos valores correspondientes a 10 \mum. Tal y como se muestra en la figura 3, la electroactividad de estos polímeros, se confirmó mediante volumetría cíclica en medio H_{2}O-NaCl 0,5 M, a un pH neutro de 7. Los valores de potencial de oxidación, del orden de 0,30 V/SCE, próximos a los de un polipirrol no sustituido, confirman la electroactividad de estos polipirroles funcionalizados, con dipéptidos.

Ejemplo 3 Reconocimiento de carboxipeptidasa A

Se procedió a analizar las propiedades específicas de complejación de estos polímeros, con respecto a las enzimas proteolíticas, con la carboxipeptidasa A, con la cual (Gly-DPhe) se conoce para formar complejos de pH neutro. Se procedió a analizar soluciones de concentración creciente de carboxipeptidasa A, que iban desde 1 mg hasta 5 mg, en 5 cm^{3} de electrodos de H_{2}O-NaCl 0,5 M. Cuando se procede a sumergir, en esta solución, electrodos no específicos, tales como polipirrol no sustituido, o poli(3, 4, 5 ó 6), se observa un voltamograma idéntico al que se ha obtenido en el ejemplo 2, sin modificación alguna. Cuando, mientras tanto, se utiliza el poli(pirrol(Gly-Dphe)), poli (2), el voltamograma, muestra un desplazamiento hacia los potenciales más elevados, de 0,340 V/SCE, para una cantidad inicial nula en carboxipeptidasa A, hasta un valor límite de 0,500 mV/SCE, para una cantidad de 5 mg de carboxipeptidasa A en la solución. Este resultado, se reporta en la figura 4, la cual muestra el desplazamiento de potencial, atribuido a una voluminosidad y una rigidificación de la cadena de polipirrol, producida durante la complejación de la enzima sobre el dipéptido portado para la cadena polímera. La formación de este complejo entre enzima y poli(pirrol-dipéptido), ha sido confirmada por la reliberación de la enzima en medio ácido a un pH = 3, tal y como ello se realiza, de una forma clásica, en cromatografía de afinidad (I.M. Chaiken, M. Wilchek, I. Parikh, Affinity Cromatography and Biological Recognition, - Cromatografía de afinidad y reconocimiento biológico -, Academic Press, New York, 1983). La enzima reliberada, se caracterizó de una forma clásica, mediante el test de ensayo de Bradford, procediendo a medir la actividad enzimática con el azul brillante de Comassii, y mediante la utilización de un patrón standard de albúmina de suero bovino. Cuando se utilizó una película de poli(Gly-DPhe), que contenía 5 x 10^{6} unidades monómeras, correspondientes a una carga de polimerización de 1 Coulomb, se obtuvo una cantidad significativa de 400 microgramos de carboxipeptidasa A, después de reliberación en medio ácido. Considerando la talla de esta enzima, de 307 unidades de aminoácidos, esta cantidad de enzimas reliberadas, muestra que se ha complejado aproximadamente 1 molécula de enzima, para 200 unidades monómeras de (pirrol-dipéptido), lo cual parece razonables teniendo en cuanta de la diferencia de tamaño (de aproximadamente un factor de 100). Este resultado, muestra igualmente el hecho de que, la enzima, debe distribuirse hacia el interior de la película de polímero, lo cual demuestra su permeabilidad con respecto a la enzima. Se obtuvieron resultados comparables, cuando se utilizó tripsina como enzima.

A un potencial determinado de electrodo, tal y como se muestra en la figura 4, se observó una variación de corriente, en función de la concentración de la enzima. Este resultado, corresponde a la respuesta amperométrica del electrodo y, una de las características interesantes de esta respuesta, concierne a su linealidad con la concentración de la enzima, tal y como se muestra en la figura 5. Una relación lineal de este tipo, permite el proponer una dosificación cuantitativa de la especie biológica en solución, bien ya se mediante la utilización de un captor de tipo electroquímico, o bien ya sea mediante el desarrollo de un transistor de efecto de campo, representado esquemáticamente en la figura 6. El principio de funcionamiento, es el siguiente. El polímero, de realiza sobre los electrodos de fuente y de drenaje, depositados sobre un substrato. Este conjunto, se sumerge en la solución a analizar, y se procede a emplazar un contraelectrodo de rejilla, a un potencial en donde, la variación del voltamograma, en función de la concentración de la enzima, es máxima, hacia 0,2 V, en el caso representado en la figura 4, la conductividad del polímero, varía de forma importante con la concentración de enzima. Un potencial aplicado entonces, entre los electrodos de fuente y el drenaje, permite una señal amplificada, funcionando, este transistor, según el principio de un transmisor de efecto de campo.

Ejemplo 4 Reliberación controlada de una enzima

Una característica suplementaria interesante de estos electrodos, se refiere al hecho de que, se ha mostrado, en la literatura especializada, el hecho de que, el poli(pirrol acético ácido), o poli(1)reliberación de protones en el medio electrolítico, cuando éstos se someten a la oxidación electrolítica (P. Baüerle y colegas, Adv. Mater., 1990, 2, 490). Pueden observarse variaciones importantes del pH, en un reducido volumen electrolítico, hasta valores del orden de 3. Esta reliberación de protones, se observa igualmente cuando la función carboxílica, se aleja del núcleo pirrol, tal como es el caso para un aminoácido o un péptido no protegido injertado sobre el pirrol. Existen dos vías para el reliberación controlada de los protones, consistentes en, o bien ya sea la utilización de un péptido cuya función terminal carboxílica no se encuentra protegida, COOH, o bien ya sea mediante la utilización de un copolímero entre pirrol - ácido acético y pirrol - péptido protegido. Se proporciona un ejemplo de esta segunda vía. Se procedió a realizar, electroquímicamente, un copolímero, entre Py(A), (1) y Py(Gly-Dphe), (2), en las mismas condiciones que precedentemente. Este copolímero, Poli(1,2), conduce, cuando se somete a la electrooxidación, a 0,3 V/SCE, a una variación importante del pH, hasta un valor pH = 4, en las cercanías del electrodo.

A partir de este copolímero poli(1,2), o a partir del polímero Poli(2), cuya función catalítica es libre, pueden llevarse a cabo dos procedimientos para la extracción, un procedimiento en discontinuo y un procedimiento en continuo.

a) Procedimiento discontinuo

Este procedimiento, consiste en utilizar una membrana o electrodo a base de los materiales anteriormente citados, en ponerla en contacto con el medio en el cual la especie biológicamente activa investigada, coexiste con otras especies. La afinidad selectiva aportada por el péptido injertado con respecto a esta especie investigada, provocará la complejación de ésta última sobre el péptido injertado sobre el polímero del electrodo o de la membrana. Esta membrana o electrodo, se retira, a continuación, del medio de análisis, y se introduce en otro medio, denominado de recuperación. En este medio de recuperación, que contiene una sal soporte de tipo NaCl, el electrodo o membrana, se somete a una oxidación electroquímica, que provoca la expulsión de protones, mediante los grupos ácidos carboxílicos, hasta un pH suficiente como para la disociación y reliberación de la especie investigada.

b) Procedimiento en continuo

El copolímero poli(1,2), o el copolímero poli(2), con su función carboxílica libre, se realiza en forma de membrana o electrodo, con eventualmente la ayuda de un polímero soporte, policatiónico o polianiónico, del tipo poliestireno sulfonato, o incluso una membrana perfluorada, tal como el Nafion. Este electrodo o membrana, eventualmente compuesta (composite), constituye la unión entre dos compartimientos A y B, tal y como se esquematiza en la figura 7. Un ejemplo de extracción de carboxipeptidasa A por este último procedimiento en continuo, se describe en la parte que sigue, a continuación.

El elemento bioselectivo, se encuentra constituido, en el caso expuesto en la figura 7, por un copolímero Poli(1,2), descrito anteriormente, arriba, polimerizado en una membrana de NAFION (Aldrich), obtenida por evaporación sobre una rejilla muy fina de platino, de 10 \mul, de una solución al 5% de NAFION, en una mezclas de alcoholes lineales superiores (Aldrich). La película de NAFION, que se obtiene como resultado, la cual presenta un espesor de aproximadamente 5 \mum, sirve entonces de soporte para la electropolimerización del copolímero poli(1,2), dando como resultado final, una membrana de material compuesto (composite) elctroactivo Poli(1,2)-NAFION.

En una primera etapa 1, se procede a introducir una cantidad de 10 gramos de carboxipeptidasa A, en el compartimiento A, en un medio H_{2}O-NaCl 0,5M. Sigue inmediatamente, sobre las unidades peptídicas de (2), una complejación sobre la membrana de material compuesto del tipo composite [Poli(1-2)]-NAFION, tal y como se ha descrito anteriormente, arriba, en el ejemplo 3. A continuación, se procede a realizar una oxidación, por mediación de un contra-electrodo y electrodo de referencia, introducidos en el compartimiento B. En una segunda etapa 2, la oxidación electroquímica, conduce a la reliberación de protones en este compartimiento B, hasta un pH del orden de 4, y al reliberación inmediata de la carboxipeptidasa A. Se recuperó, a continuación, una cantidad de 1,2 gramos de carboxipeptidasa A, en el compartimiento B, durante un ciclo de este proceso en continuo, tal y como se ha determinado mediante dosificación de la actividad enzimática.

Estos resultados, confirman, de esta forma, el fenómeno del reconocimiento de estos electrodos, con respecto a las enzimas, así como su capacidad de extracción de estas enzimas. Este comportamiento, se encuentra ligado, de una forma biunívoca, a la naturaleza química del dipéptido injertado sobre la cadena de polipirrol.

Ejemplo 5 Síntesis de un polipirrol funcionalizado con un polinucleótido u oligonucleótido

Esta síntesis, se efectúa siguiendo las tres etapas siguientes:

a) Síntesis del monómero [N-hidroxisuccinimido-3-pirrol]

Se procede a añadir, a un matraz de tres bocas, 0,4 mol de pirrol - ácido acético, (I), 30 ml de cloroformo y 0,4 mol de N-hidroxisuccinimida, NHS; (II). La mezcla, se somete a agitación y, a continuación, se añade, gota a gota, una solución de 0,4 mol de diciclohexilcarbodiimida, DCC, en 20 ml de cloroformo. Después de agitación, durante un transcurso de tiempo de 2 horas, se forma un sólido blanco, que se filtra y se lava con cloroformo. Después de evaporación y lavado con acetonitrilo, para desembarazarse de los productos de la reacción no necesarios, se recristaliza el producto en cloroformo. Se obtiene entonces el compuesto investigado y buscado, [N-hidroxisuccinimido-3-pirrol], (III), en forma de un materia en polvo de color blanco.

3

Punto de fusión, T_{F} = 135ºC, ^{1H}RMN (ppm); (NH, 1H, 9, s)=; pirrol (2H, 6,7, m): pirrol (1H, 6,1; s); CH_{2}(2H, 3,8, s); Hidroxisuccinimida (4H, 2,8, s).

b) Síntesis del polímero por electropolimerización

La solución de electropolimerización, contiene 0,5 M LiClO4, 0,1 M de monómero (III) en acetonitrilo. La electropolimerización, se realiza sobre electrodo de platino, de 0,7 cm^{2} de superficie, al potencial de 0,9 V, con relación a un electrodo saturado al calomel, ECS, utilizando una carga de electropolimerización de 30 mC. Aparece una película negra sobre el electrodo, que corresponde a poli(III), cuyo espesor es de aproximadamente 200 nm.

4

La electroactividad de este polímero, se analizó en un medio acetonitrilo - 0,6 M LiClO_{4}, mostrando un pico de oxidación a 0,28 V/ECS, y un pico de reducción a 0,24 V/ECS, tal y como se muestra en la figura 8. La reducida separación entre estos picos de oxidación y de reducción, 40 mV, confirma la muy gran electroactividad y reversibilidad de este polímero.

c) Injerto de un oligonucleótido ODN

Se procede a impregnar el electrodo precedente que porta la película de polímero, en un medio reactivo formado por una mezcla de dimetilformamida con 10% de tampón borato 0,1 M, a un pH de 9,3, y 26,2 nanomol de oligonucleótido, ODN, de 14 bases, comportando la secuencia CCTAAGAGGGAGTG, así como una función amina en 5', sobre la cual se operará la reacción de acoplamiento con el grupo N-hidroxisuccinimida, portado por las unidades pirrol del polímero. Esta reacción de acoplamiento, se efectúa en un transcurso de tiempo de 2 horas. El injerto, se acompaña igualmente de la hidrólisis de los grupos succinimida, no sustituidos con el oligonucleótido, en ácido acético. El polímero obtenido sobre el electrodo, corresponde por lo tanto a un copolímero poli([pirrol-ODN][pirrol-COOH]).

5

Ejemplo 6 Caracterización del fenómeno de reconocimiento

El fenómeno de reconocimiento, se confirmó mediante la caracterización electroquímica de la película de polímero poli([Pirrol-ODN][pirrol-COOH]), obtenida en el ejemplo 5c. El análisis electroquímico, se llevó a cabo, en primer lugar de una forma directa, sobre el electrodo obtenido después de la síntesis y, a continuación, después de que este electrodo se pusiera en presencia de ODN diana y de ODN no diana. La reacción de hibridación de este polímero, se realizó de esta forma en presencia de ODN complementario (diana) y de ODN no complementario (no diana), en una solución acuosa tamponizada con PEG. La incubación, se efectuó a una temperatura de 37ºC, durante un transcurso de tiempo de 2 horas, en presencia de, o bien ya sea ODN diana, CACTCCCTCTTAGG, en concentración de 335 nanomol, o bien ya sea en presencia de ODN no diana, GGTGATAGAAGTATC, en una concentración de 272 nanomoles. Después de reacción, las películas, se lavaron con el tampón PEG y se analizaron mediante voltametría cíclica. Los voltamogramas obtenidos, se representan en las figuras 9 y 10. Los resultados, muestran en primer lugar, figura 9, el hecho de que, el polímero después de síntesis, y antes de ponerse en presencia de la secuencia diana o no diana muestran un pico de oxidación reversible, que se sitúa a 0,34 V/ECS, confirmando la electroactividad de este polímero funcionalizado. Después de la reacción de incubación en presencia de la secuencia no diana, y después de lavado, el voltamograma obtenido, no muestra ninguna modificación. Cuando, por el contrario, este polímero, se incuba en presencia de la diana, el voltamograma obtenido, figura 10, es diferente, con un crecimiento del potencial de oxidación a 0,40 V/ECS, a saber, una aumento de 60 mV. Este crecimiento, es del todo significativo de una hibridación que tiene lugar entre el ODN y la diana correspondiente. Este aumento del potencial de oxidación, se atribuye a un fenómeno de complejación del brazo, durante la longitud de las cadenas de polipirrol, acompañándose, por lo tanto, de un incremento de la energía necesaria para la oxidación de este polímero.

Este resultado, confirma el hecho de que, esta nueva clase de materiales electroactivos, de poliheterociclos conjugados, sustituidos en la posición 3, por un oligonucleótido, da lugar, efectivamente, a un fenómeno de reconocimiento de ADN complementario y, por otra parte, el hecho de que, estos materiales, permiten una lectura electroquímica de esta hibridación selectiva. Esta lectura electroquímica, abre la vía a genocaptores del tipo electroquímico, amperométrico o potenciométrico y, por otra parte, a genocaptores de tipo transistor microelectroquímico de efecto de campo, basados sobre una respuesta amperométrica.

Claims

1. Polímero conjugado, eléctricamente conductor y electroactivo, caracterizado por el hecho de que, éste, responde a la fórmula I:

6

en la cual:

* R^{1}, R^{i}, R^{n}, idénticas o diferentes, representan H o un grupo funcional, con la exclusión de CH_{2}-COOH, susceptible de enlazarse, por covalencia, a una primera molécula biológica o anti-ligante, comprendiendo por lo menos un grupo funcionalizado, independientemente elegido de entre el conjunto de los grupos funcionales siguientes:

Y_{p}-C-X en donde, X, representa H, OH, un radical O-alquilo inferior, sustituido o no, un halógeno, especialmente, Cl,;

Y_{p}-NHZ, en donde, Z, representa, o bien ya sea H o bien ya sea un radical alquilo;

Y_{p}-NH-CO-CFe_{3};

Y_{p}-X, en donde X, responde a la definición anterior, descrita arriba, -Si(alquilo)_{3}-, -Si(alcoxilo)_{3}, o un grupo éster activado, que contiene n-hidroxi-succinimida, siendo p un número entero, de una forma preferente, igual a 0, 1 ó 2;

en los cuales, Y, representa un grupo elegido de entre los alquilos que tienen de 1 a 5 átomos de carbono, los alcoxilos que tienen de 1 a 5 átomos de carbono, los poliéteres que responden a la fórmula general (CH_{2}-CH_{2}-O)_{m}
-(CH_{2})_{m'}-, representando m un número entero, que varía de 1 a 3, y m', un número entero, igual a 1 ó 2.

2. Polímero conjugado, eléctricamente conductor y electroactivo, que comprende por lo menos un grupo funcionalizado, enlazado, por covalencia, a una primera molécula biológica, elegida de entre los polinucleótidos y los péptidos o anti-ligandos, caracterizado por el hecho de que, el citado polímero, responde a la fórmula II:

7

en la cual:

* R^{1}, R^{i}, R^{n}, idénticas o diferentes, representan H ó un grupo funcional, susceptible de enlazarse, o estando enlazado, por covalencia, a una primera molécula biológica o anti-ligante, y en donde, por lo menos uno, es un grupo funcional, enlazado por covalencia, a una primera molécula biológica o antiligando,

* eligiéndose, el citado o citados grupos funcionales, ligados a una molécula biológica o ligando, antes de la reacción con ésta última, de entre el conjunto de los grupos funcionales siguientes:

Y_{p}-NH-CO-CFe_{3};

Y_{p}-X, en donde X, responde a la definición anterior, descrita arriba, -Si(alquilo)_{3}-, -Si(alcoxilo)_{3}, o un grupo éster activado, que contiene tal como la n-hidroxi-succinimida, siendo p un número entero, de una forma preferente, igual a 0, 1 ó 2;

en los cuales, Y, representa un grupo elegido de entre los alquilos que tienen de 1 a 5 átomos de carbono, los alcoxilos que tienen de 1 a 5 átomos de carbono, los poliéteres que responden a la fórmula general (CH_{2}-CH_{2}-O)_{m}-(CH_{2})_{m'}-,
representando m un número entero, que varía de 1 a 3, y m', un número entero, igual a 1 ó 2, o CH_{2}-COOH, con la condición de que, los grupos funcionales enlazados a una molécula biológica, elegida de entre los polinucleótidos y los péptidos, sean idénticos, si éstos consisten, antes de la reacción con la primera molécula biológica, en (CH_{2})-COOH.

3. Polímero conjugado, según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que, la primera o las primeras moléculas biológicas o anti-ligandos, se eligen de entre los péptidos o derivados de péptidos, principalmente, Gly,-Phe, Phe-Pro; Phe-Hea-Pro, y de entre los polinucleótidos tales como el oligonucleótido de la secuencia CCTAAGAGGGAGTG.

4. Utilización de un polímero conjugado, tal y como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, para detectar o dosificar, in vitro o in vivo, una segunda molécula biológica o ligando, diferente del anti-ligando, y que interacciona específicamente con éste último, efectuándose, la detección y / o la dosificación del citado ligando, mediante la observación y / o la medición de una diferencia de potencial o de una variación de la corriente, entre el polímero conjugado no enlazado y el polímero conjugado enlazado al ligando.

5. Utilización, según la reivindicación 4, de un polímero definido en la reivindicación 3, para detectar y / o dosificar una enzima, tal como una enzima proteolítica, principalmente, la carboxipeptidasa A.

6. Utilización, según la reivindicación 4, de un polímero definido en una de las reivindicaciones 3 a 5, para detectar y / o dosificar un polinucleótido, tal como el oligonucleótido de secuencia CACTCCCTCTTAGG.

7. Utilización de un polímero conjugado, según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, para extraer, in vitro o in vivo, una segunda molécula biológica o ligando, diferente del anti-ligando, y que interacciona específicamente con ésta última.

8. Utilización de un polímero conjugado, según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, caracterizada por el hecho de que, el polímero conjugado, se deposita sobre un substrato conductor, tal como el metal o un derivado del carbono, y bajo la forma de una película autoportante.

9. Electrodo, caracterizado por el hecho de que, éste, está constituido por un substrato conductor, tal como un metal o un derivado del carbono, y por un polímero tal y como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3.

10. Película autoportante, de un polímero, caracterizada por el hecho de que, ésta, está constituida por un polímero tal y como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3.