JP2004534933A - 電気活性複合体、電気活性プローブ及びその調製方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、少なくとも二のモノマーのホモポリマー又はコポリマーの電気活性ポリマー、アンチリガンド、及び前記アンチリガンドと特異的に相互作用したリガンドからなる電気活性複合体において、前記アンチリガンドは、直接又は間接的に、電気活性ポリマーと連結しており、さらに、前記電気活性複合体は、前記アンチリガンドに直接又は間接に連結した少なくとも一の電子供与基を含むことを特徴とする、電気活性複合体、その調製方法に関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リガンドと特異的に相互作用することが意図されたアンチリガンドが結合されている電気活性ポリマーから作製される、有機電極に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リガンドとアンチリガンドの特異的な相互作用は、電気活性ポリマーの電気化学的特性における、実質的かつ選択的な変動、例えばそのポリマーの電気活性度の減少、を含む。この変動は、グラフト化されたリガンドの濃度に依存するもので、これは、観察、測定することが可能であり、直接、グラフト化リガンドの量に相関する。この技術の必須の応用のひとつは、したがって、生物的試料に存在するリガンドの検出、同定、及びおそらくそのアッセイにある。
【０００３】
前記変動は、電位差滴定タイプのもの、例えば、相互作用前後の電気活性ポリマーの酸化電位の変動、又は電流滴定法タイプのもの、例えば、ハイブリダイゼーションの前後のポリマーの酸化又は還元電流の変動で、規定された電位で測定されたものである。
【０００４】
前記ポリマーの電気化学的反応を特異的に特徴づけするために、これは高い電気活性を有していなければならない。
【０００５】
したがって、本発明の目的のひとつは、少なくとも一のアンチリガンドが結合した電気活性ポリマーを主体とするプローブであって、高い電気活性を有するプローブを提供することである。
【０００６】
ＷＯ−Ａ−９５／２９１９９公報は、各々、プローブポリヌクレオチドでピロール環の３位の炭素において共有結合により置換された、各々ピロール環からなるモノマーから形成されたポリピロールを教示している。
【０００７】
こうして得られたポリピロールは、検出及び、おそらくはリガンドのインビトロ又はインビボアッセイの可能性のために、適用される。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、常に、よりよい電気活性特性を有するポリマーを生産することが期待されている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、その電気活性ポリマーの感度が、ＷＯ−Ａ−９５／２９１９９公報の主題を形成するポリピロールなどの、既知の改変電気活性ポリマーより百倍高いのオーダーのものであり得る少なくとも一のアンチリガンドを有する改変された電気活性ポリマーを提供する。
【００１０】
こうして、本発明の第１の主題は、少なくとも二のモノマーのホモポリマー又はコポリマーの電気活性ポリマー、アンチリガンド、及び前記アンチリガンドと特異的に相互作用したリガンドからなる電気活性複合体であって、前記複合体は、さらに少なくとも一の電子供与基を含むものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明によれば、電子供与基が、フェロセン、キノンおよびこれらの誘導体から選ばれることが有利であり、及び／又は電気活性ポリマーが、ポリピロール、ポリアセチレン、ポリアジン、ポリ（ｐ−フェニレン）、ポリ（ｐ−フェニレンビニレン）、ポリピレン、ポリチオフェン、ポリフラン、ポリセレノフェン、ポリピリダジン、ポリカルバゾール、ポリアニリン及び二重鎖ポリヌクレオチド類から選ばれることが好ましい。
【００１２】
本発明を詳細に説明する前に、明細書及び請求項で用いる用語は以下の通りである。
【００１３】
用語「電子供与基」は、細く、速く、可逆的な酸化波を有するレドックス対、例えばフェロセン、キノン、及びそれらの誘導体、例えば、それらの置換された誘導体を意味するものと理解される。
【００１４】
用語「アンチリガンド」及び「リガンド」は、ポリヌクレオチド類又はペプチド類などの生物的分子だけを意味するのではなく、化学的分子類をも意味するものである。
【００１５】
アンチリガンドは、特異的にリガンドと相互作用して、リガンド／アンチリガンドコンジュゲートを形成することができる。コンジュゲートの例として、あらゆるペプチド／抗体対、抗体／ハプテン対、ホルモン／レセプター対、ポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド対、ポリヌクレオチド／核酸対などを挙げることができる。
【００１６】
本発明で用いられる用語「ポリヌクレオチド」は、天然又は修飾された、適当なハイブリダイゼーション条件下で、少なくとも部分的に相補するポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる、少なくとも五のヌクレオチド類（デオキシリボヌクレオチド類又はリボヌクレオチド類）の連結配列を意味する。用語「修飾されたブクレオチド」は、例えば、修飾塩基を有するヌクレオチド、及び／又は、ヌクレオチド内部の結合及び／又はバックボーンに修飾を有するヌクレオチドを意味するものと理解される。修飾塩基の例としては、イノシン、５−メチルデオキシシチジン、５−ジメチルアミノデオキシウリジン、２，６−ジアミノプリン及び５−ブロモデオキシウリジンを挙げることができる。修飾されたヌクレオチド内部の結合を示すと、ホスホロチオアート、Ｈ−ホルホナート及びアルキルホルホナート結合を挙げることができる。α−オリゴヌクレオチド、例えば、ＦＲ−Ａ−２６０７５０７号に掲載されたもの、及びＭ．Ｅｇｈｏｌｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９２），１１４，１８９５−１８９７による論文の主題を形成するＰＮＡｓを、バックボーンが修飾されているヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの例として挙げることができる。
【００１７】
用語「ペプチド」は、特に、少なくとも二のアミノ酸のあらゆる連結配列、例えば、タンパク質、タンパク質断片又はオリゴペプチドを意味し、それらは、抽出され、分離され、単離され又は合成されたものであり、例えば、化学合成により、又は組換え生物における発現により、得られるペプチドである。Ｌ系列の一以上のアミノ酸が、Ｄ系列の一以上のアミノ酸で置換されている、又はその反対の配列における、あらゆるペプチド；そのＣＯ−ＮＨ結合の少なくとも一が、ＮＨ−ＣＯ結合で置換されていて、各アミノアシル基のキラリティが、前記ＣＯ−ＮＨの一以上に含まれていてもいなくても、参照ペプチドを構成するアミノアシル基に対して、保存されあるいは反対であるあらゆるペプチド（又はイムノレトロイド類）；及びあらゆるミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）も含まれる。
【００１８】
問題となるペプチドの種々のクラスを例示すると、副腎皮質刺激ホルモン類又はその断片類、アンジオテンシンアナログ類及びそれらのインヒビター類、ナトリウム排泄増加性ペプチド類、ブラジキニン及びそのペプチド誘導体類、走化性ペプチド類、ジノルフィン及びその誘導体類、エンドルフィン類及びその誘導体類、エンケファリン類及びその誘導体類、酵素インヒビター類、フィブロネクチン断片類及びその誘導体類、胃腸のペプチド類、オピオイドペプチド類、オキシトシン、バソプレッシン、バソトシン、及びその誘導体類、キナーゼタンパク質類を挙げることができる。
【００１９】
用語「抗体」とは、あらゆるモノクローナル又はポリクローナル抗体、前記抗体のあらゆる断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’２又はＦｃ断片類、及び遺伝的に修飾又は組換えにより得られたあらゆる抗体を定義する。
【００２０】
用語「グラフト」、「結合」及び「結合する」とは、何も示されていないときは、この文脈では、その化学的性質を定義せずに、２つの物体の間のあらゆる関係を示すために用いられる。したがって、弱い結合または共有結合でもよい。
【００２１】
本発明の連結基は、活性化又は活性化可能な基により、この相互作用の目的で、少なくとも一方が前もって活性化されたか活性化され得る２つの化学的物体の相互作用の後、２つの化学的物体を、共有結合により連結する。連結基は、したがって、他の物体の反応性官能基において、一の物体の前記活性化又は活性化可能な基の反応により、又はその反対により、他の物体の他の前記活性化された又は活性化可能な基において、一方の物体の前記活性化又は活性化可能な基の反応により、得ることができる。
【００２２】
用語「活性化された基」とは、その仲介により、それが結合している物体と他の物体と相互作用させる基を意味するものと理解される。例えば、これは、−ＣＯ−［Ｏ−Ｎ−フタルイミド］基などの活性化エステル基でもよい。用語「活性化され得る基」は、例えば、ある反応条件下で、又はそれと相互作用可能な活性化された基と接触させたときに、活性化された基に転換されることができる基を意味するものと理解される。
【００２３】
上述の本発明の複合体は、下記の特性を個別に又は組み合わせて満足することが有利である。
【００２４】
前記リガンドと前記アンチリガンドは生物的分子であり、特にポリヌクレオチド類及びポリペプチド類から選ばれ、直接又は間接的に、シグナルを発生することができるトレーサーにより標識されることができる。
【００２５】
複合体は以下の構造の一つを有する：
前記電子供与基が、直接又は間接的に、一方は電気活性ポリマーに、他方はアンチリガンド又はリガンドに連結し、あるいは、
前記電子供与基が、直接又は間接的にアンチリガンドに連結し、アンチリガンド自身は、直接又は間接的に電気活性ポリマーに連結し、あるいは、
前記電子供与基が、直接又は間接的的にアンチリガンドと相互作用したリガンドに結合し、前記アンチリガンドは、直接又は間接的に電気活性ポリマーに連結する。
【００２６】
電気供与基が電気活性ポリマーに連結するとき、好ましくは第１の連結基を介して共有結合で連結される。
【００２７】
アンチリガンド又はリガンドが電子供与基に及び／又は電気活性ポリマーに連結するとき、それらは各々第２及び第３の連結基を介して、共有結合で連結することが有利である。
【００２８】
第１及び／又は第２及び／又は第３の連結基は、各々、前記電子供与基を前記電気活性ポリマーに、電子供与基をアンチリガンドまたはリガンドに、アンチリガンド又はリガンドを前記電気活性ポリマーに、結合腕を介して、連結するものである。
【００２９】
電子供与基がリガンドに連結している本発明の複合体の構造において、それは不活性支持体、例えばポリスチレンビーズ、磁気ビーズ又はガラスビーズを介して、又は生物的支持体、例えばを前記電子供与基が内在化された細胞を介して、連結されることもできる。
【００３０】
本発明の好ましい複合体によれば、電気活性ポリマーは、各々ピロール環からなる少なくとも二のモノマーから形成されるポリピロールであり、前記電気供与基がフェロセンであり、特にアンチリガンドはプローブポリヌクレオチドでありリガンドは少なくとも一部が前記アンチリガンドとハイブリダイズされるターゲットポリヌクレオチドである。
【００３１】
この好ましい複合体は、さらに以下の特性を、個別に、又は組み合わせて有する。
【００３２】
フェロセンは、一方はプローブポリヌクレオチドに、他方はポリピロールモノマーのピロール環に連結しており、この場合プローブポリヌクレオチドは、フェロセンの一のシクロペンタジエン環の１位の炭素に結合しており、フェロセンはピロール環に、他のシクロペンタジエン環の１’位の炭素を介して、結合している。あるいは、プローブポリヌクレオチドは、少なくともフェロセンと前記モノマーのピロール環に連結していて、この場合プローブポリヌクレオチドはフェロセンの一のシクロペンタジエン環の１位の炭素に結合している。
【００３３】
ピロール環は好ましくは３位の炭素において置換されている。
【００３４】
ポリピロールは、コポリマーであり、該コポリマーに含まれるモノマーは、そのピロール環が、−ＣＨ２−ＣＯＯＨ又は−ＣＨ２−ＣＨ２ＯＨ基で置換されているものである。
【００３５】
有利には、フェロセンとピロール環との間の第１の連結基は、−ＣＯＮＨ−ＣＨ２−基であり、及び／又は、フェロセンとプローブポリヌクレオチド又はターゲットポリヌクレオチドとの間の第２の連結基は−ＣＯ−基であり、及び／又は、プローブポリヌクレオチド又はターゲットポリヌクレオチドとピロール環との間の第３の連結基は−ＣＨ２−ＣＯ−基である。
【００３６】
間接的に、フェロセンをピロール環に、フェロセンをプローブポリヌクレオチド又はターゲットポリヌクレオチドに、及びピロール環をプローブポリヌクレオチド又はターゲットポリヌクレオチドに、各々連結する、第１及び／又は第２及び／又は第３の連結基は、結合腕を介して連結することができる。結合腕は、有利には、少なくとも二の炭素原子、好ましくは少なくとも２又は３の炭素原子を有する飽和炭化水素鎖である。
【００３７】
プローブポリヌクレオチド又はターゲットポリヌクレオチドは、少なくとも、各々、第２及び／又は第３の連結基を介して、およびプローブポリヌクレオチド又はターゲットポリヌクレオチドの少なくとも一のアミノ官能基を介して、フェロセン及び／又はモノマーのピロール環に結合する。
【００３８】
本発明の別の目的は、少なくとも二のモノマーのホモポリマー又はコポリマーの電気活性ポリマー、リガンドと特異的に相互作用することができるアンチリガンドからなる電気活性プローブであって、前記プローブは、さらに、少なくとも一の電子供与基を含むものである。
【００３９】
前記プローブは、以下の特徴の少なくとも一を有することが有利である。
【００４０】
電気活性ポリマーは、ポリピロール、ポリアセチレン、ポリアジン、ポリ（ｐ−フェニレン）、ポリ（ｐ−フェニレンビニレン）、ポリピレン、ポリチオフェン、ポリフラン、ポリセレノフェン、ポリピリダジン、ポリカルバゾール、ポリアニリン及び二重鎖ポリヌクレオチド類から選ばれ、及び／又は前記電子供与基がフェロセン、キノンおよびこれらの誘導体類から選ばれ、及び／又は前記アンチリガンドは生物的分子であり、特にポリヌクレオチド類及びポリペプチド類から選ばれ、任意に直接又は間接的に、シグナルを発生することができるトレーサーにより標識されている。
【００４１】
電子供与基は、直接又は間接的に、一方は電気活性ポリマーに、他方はアンチリガンドに連結されている。この場合、電子供与基は、好ましくは、第１の連結基を介して、電子活性ポリマーに、共有結合で連結されているか、あるいは電子供与基は、直接または間接的に、アンチリガンドに連結され、前記アンチリガンド自体は、直接又は間接的に、電気活性ポリマーに連結されている。
【００４２】
アンチリガンドは、第２の連結基を介して共有結合により電子供与基に連結され、及び／又は、アンチリガンドは、第３の連結基を介して共有結合により電気活性ポリマーに連結されている。
【００４３】
第１及び／又は第２及び／又は第３の連結基は、各々、結合腕を介して、電子供与基を電気活性ポリマーに、電子供与基をアンチリガンドに、及びアンチリガンドを電気活性ポリマーに、連結させる。
【００４４】
本発明の有利なプローブは、少なくとも二のモノマーから形成されたポリピロール（各モノマーはピロール環からなる）、フェロセン、及び適当なハイブリダイゼーション条件下でターゲットポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるプローブポリヌクレオチドからなる特定のアンチリガンドを含む。
【００４５】
プローブポリヌクレオチド（ＰＮｐｒｏｂｅ）は、少なくとも前記モノマーのフェロセン（Ｆｅ）及びピロール環（Ｐ）の間に結合することもでき、あるいはピロール環に結合したフェロセンに結合することもできる。
【００４６】
プローブポリヌクレオチドがフェロセンとピロール環との間に結合するとき、（Ｐ−ＰＮｐｒｏｂｅ−Ｆｅと称する）、本発明のプローブは、個別に、又は組み合わせて以下の特徴を有する：
−プローブポリヌクレオチドは、フェロセンの一のシクロペンタジエン環の１位の炭素に結合している；
−プローブポリヌクレオチドは、直接又は間接的に、第３の連結基を介してピロール環に結合している；第３の連結基は、−ＣＨ２−ＣＯ−基であることが有利である。
【００４７】
プローブポリヌクレオチドがフェロセンに結合し、フェロセンがピロール環に結合しているとき（Ｐ−Ｆｅ−ＰＮｐｒｏｂｅと称する）、本発明のプローブは、個別に、又は組み合わせて以下の特徴を有する：
−プローブポリヌクレオチドは、フェロセンの一のシクロペンタジエン環の１位の炭素に結合しており、フェロセンは他のシクロペンタジエン環の１’位の炭素を介してピロール環に結合している；
−フェロセンは、直接又は間接に、第１の連結基を介して少なくとも前記モノマーのピロール環に結合している；第１の連結基は、−ＣＯＮＨ−ＣＨ２−基であることが有利である。
【００４８】
プローブの構造に関わらず、フェロセンは、直接又は間接に、第２の連結基を介して、プローブポリヌクレオチドに結合している。第２の連結基は、好ましくは−ＣＯ−基からなる。
【００４９】
さらに、プローブポリヌクレオチドは、少なくともモノマーのピロール環に、及び／又はフェロセンに、各々第３及び／又は第２の連結基を介して、及びプローブポリヌクレオチドの少なくとも一のアミノ官能基を介して、結合している。
【００５０】
本発明のプローブの有利な構造によれば、前記第１及び／又は第２及び／又は第３の連結基が、結合腕を介して、間接的に、フェロセンをピロール環に、プローブポリヌクレオチドをピロール環に、プローブポリヌクレオチドをピロール環に連結するものである。
【００５１】
この結合腕は、好ましくは、少なくとも二の炭素、好ましくは少なくとも２又は３の炭素原子を有する飽和炭化水素鎖である。
【００５２】
本発明の修飾ポリピロールは、ホモポリマー又はコポリマーとすることができる。ピロール環は、３位の炭素において、置換されており、したがって、本発明のいかなるコポリマーも少なくとも２のモノマーを有していて、そのうちの少なくとも一つは、前記位置で置換されてないものであろう。あるいは、それは、少なくとも、前記位置で異なって置換されている２つのモノマーを有しており、ＰＮｐｒｏｂｅ置換基が異なるか、及び／又は、ＰＮｐｒｏｂｅとＦｅ置換基の組み合わせが、モノマーのピロール環で異なるか、及び／又は第１及び／又は第２及び／又は第３の連結基及び／又は結合腕が異なるものであろう。本発明の修飾モノマーに加えて、コポリマーは、そのピロール環が−ＣＨ２−ＣＯＯＨ又はＣＨ２−ＣＨ２ＯＨ基で置換されている、少なくとも一のモノマーを含むことができる。
【００５３】
ポリマーのすべてのモノマーが同様に修飾されているとき、本発明のホモポリマーポリピロールを得る。
【００５４】
本発明は、本発明のプローブを調製する方法にも関する。
【００５５】
ポリピロールの修飾モノマーがすべて、Ｐ−ＰＮｐｒｏｂｅ−Ｆｅ構造を有しているとき、方法は、以下の工程を含むものである。
（ａ）各々ピロール環からなる少なくとも二のモノマーから形成されるホモポリマー又はコポリマーポリピロールを得る工程、ここで前記ピロール環は３位の炭素において、プローブポリヌクレオチドで置換されている；
（ｂ）一のシクロペンタジエン環の１位の炭素において、少なくとも一の活性化された又は活性化され得る基を有するフェロセンを得る工程
（ｃ）プローブポリヌクレオチドで置換された前記ホモポリマー又はコポリマーポリピロールを、前記活性化された又は活性化され得る基を有するフェロセンと接触させる工程。
【００５６】
ポリピロールの修飾モノマーがすべて、Ｐ−ＦｅＰＮｐｒｏｂｅ構造を有しているとき、方法は、以下の工程を含むものである。
（ａ）少なくとも二の活性化された又は活性化され得る基を有するフェロセンを得る工程、ここで少なくとも一の基は、一のシクロペンタジエン環の１位の炭素に結合しており、他方の基は、フェロセンの他のシクロペンタジエン環の１’位の炭素に結合しているものである；
（ｂ）活性化された又は活性化され得る基で３位の炭素において置換されたピロール環からなるモノマーを得る工程；
（ｃ）活性化された又は活性化され得る基を有する過剰のフェロセンを、置換されたモノマーと反応させる工程；
（ｄ）（ｃ）で得られた化合物の電気重合を行なう工程；及び
（ｅ）工程（ｄ）で得られたポリマーをプローブポリヌクレオチドと接触させる工程。
【００５７】
本発明のプローブ調製方法は、さらに以下の特性を有することが有利である；
−前記フェロセンの活性化された又は活性化され得る基が、同一又は異なっていてもよく、好ましくは活性化された又は活性化され得るエステル基であり、好ましくは−ＣＯ−［Ｎ−ヒドロキシフタルイミド］基である；それらは結合腕を介してフェロセンに結合していることが有利である；
−ピロール環の活性化された基が、−ＣＨ２−ＮＨ２である；
−ピロール環の活性化された又は活性化され得る基が、ピロール環に結合腕を介して結合している；
−好ましい結合腕は、少なくとも二の炭素原子、好ましくは少なくとも２又は３の炭素原子を有する飽和炭化水素鎖である。
【００５８】
電気重合工程は、当業者によく知られた技術を用いて行なわれる。例えば、モノマーを、酸化及び還元により重合が続いておこるのに十分な電位変動に供することにより行なうことができる。あるいは、強制電流（クロノポテンシオメトリ）下で、又は強制電位（クロノアメトリ）下で、重合により行なうことができる。
【００５９】
本発明の別の主題は、中間体産物としてのリガンド／フェロセン化合物であって、直接又は間接的に、フェロセン、キノン、又はこれらの誘導体類などの電子供与基に連結したリガンドからなる。特に、この化合物は、本発明のＰ−ＰＮｐｒｏｂｅ−Ｆｅプローブを調製するための方法における本発明のプローブの調製における中間体としてのポリヌクレオチド／フェロセン化合物である。それは、好ましくは−ＣＯ−基である第２の連結基を介して、フェロセンの一のシクロペンタジエン環の１位の炭素に結合したポリヌクレオチドからなる。
【００６０】
この第２の連結基は、フェロセンとプローブポリヌクレオチドを、結合腕を介して間接的に、連結することができ、この結合腕は、有利には少なくとも二の炭素原子、好ましくは少なくとも２又は３の炭素原子を有する飽和炭化水素鎖からなる。
【００６１】
本発明のプローブは、診断への応用がある。かくして、本発明は、前記プローブが、適当なハイブリダイゼーション条件下で接触すること、及び接触前のプローブと接触後のプローブの間の、電位差又は電流の変動を示すか又は定量することを特徴とする、生物的試料中のターゲットポリヌクレオチドの検出方法にも関する。
【００６２】
本発明は、生物的試料中のターゲットポリヌクレオチドを検出するためのプローブの使用にも関するものであり、この使用においては、前記プローブを、適当なハイブリダイゼーション条件下で接触させ、接触前のプローブと接触後のプローブの間の、電位差又は電流の変動を示すか又は定量するものである。
【００６３】
本発明の主題は、表面の全て又は一部が前記プローブで被覆された電極にも関する。そのような電極は、当業者に知られているいかなる従来の技術を用いても、得ることができる。例えば、この調製は、白金、金、金で被覆されたクロム又はチタン、ガラス炭素、又は、酸化チタン又は酸化インジウム−スズ混合物などの導電性酸化物から作製された電極の表面上に、本発明のポリピロールを析出させることにより行なうことができる。
【００６４】
本発明は、リガンドと相互作用することができるアンチリガンドが結合する電気活性ポリマーの電気活性を増加させるための、電子供与基の使用にも関するもので、この電子供与基はアンチリガンドと同じモノマーに存在するものである。
【００６５】
【実施例】
本発明の種々の主題を、添付した図１乃至１５を参照しながら以下の実施例で示す。これらにより好適で有利な態様が明らかになるであろう。
【００６６】
実施例１：Ｐ−ＰＮｐｒｏｂｅ−Ｆｅ構造を有するモノマーと、−ＣＨ２−ＣＯＯＨ基で置換されたモノマーとからなるコポリマーポリピロールの調製
この構造体の作製は、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（ＮＨＰ）基で置換されたフェロセンの合成、プローブポリヌクレオチドのポリピロールへの結合、ついで得られた活性化されたフェロセンの、ポリピロールに結合したプローブポリヌクレオチドへの結合を必要とする。
【００６７】
１Ａ 活性化されたフェロセン：１−フェロセン−プロピル−ＮＨＰの形成
合成のスキームは以下の通りであった。
【００６８】
【化１】
【００６９】
こうして得られた１−フェロセン−プロピル−ＮＨＰの電気化学的反応を分析することにより、０．３Ｖ／ＳＣＥの電位で可逆性の電気化学系が示された。ＮＨＰ基で直接置換されたフェロセンの反応と比較して、この反応は、約２００ｍＶの電位で増加を示した。
【００７０】
１Ｂ−コポリマーポリピロール［ＰｙＣＯＯＨ，ＰｙＣＯＮＨ−ＮＨＰ］へのプローブポリヌクレオチドの結合
この工程は、ＷＯ−Ａ−９５／２９１９９公報に記載したものと同じ条件下で、その３’と５’末端がアミノ基により官能化された（一方の基が活性化されたポリピロールポリマーへの結合のため、他方が活性化されたフェロセンの結合のためである）プローブポリヌクレオチドを用いて、行なった。
【００７１】
１Ｃ コポリマーポリピロール ポリ［ＰｙＣＯＯＨ，Ｐｙ−ＰＮｐｒｏｂｅ］へのプローブポリヌクレオチドの結合
ポリ［ＰｙＣＯＯＨ，Ｐｙ−ＰＮｐｒｏｂｅ］電極を、１Ａで得られた１−フェロセン−プロピル−ＮＨＰを含む溶液に、室温で１時間浸漬することにより、ＰＮｐｒｏｂｅのグラフト化を行なった。ついで電極を洗浄し、０．５ＭのＮａＣｌ溶液中で電気化学的に分析した。
【００７２】
図１に示した反応（実線：Ｆｅ−（ＣＨ３）ＮＨＰ；点線：Ｆｅ−ＮＨＰ）は、ＰＮｐｒｏｂｅのグラフト化の後の、ＰＮｐｒｏｂｅにおいて置換されたフェロセンに特徴的な水性媒体中０．３５Ｖ／ＳＣＥの電位での、電気化学的シグナル出現により特徴付けられる。酸化の間に交換した電化の測定は、電気活性フェロセン部位の存在を示す。この測定は、ＰＮｐｒｏｂｅに結合したフェロセンの合計量の測定を可能にする。
【００７３】
実施例２：ターゲットポリヌクレオチド（ＰＮｔａｒｇｅｔ）にハイブリダイズするための実施例１で得られたポリピロールの使用
ハイブリダイゼーションは、実施例１で得られたポリピロールで覆われた電極を、１時間、３７℃、２５ｎｍｏｌのＰＮｔａｒｇｅｔの存在下でＰＥＧバッファー中に置くことにより行なった。電極は、ついで洗浄し、サイクリックボルタンメトリーにより分析した。
【００７４】
図２（実線：ハイブリダイゼーション前；点線；ハイブリダイゼーション後）に示された電気化学反応は、ハイブリダイゼーションの後のフェロセンからのシグナルの電気活性の大幅な減少を示す。電流は、７０μＡ減少する。この大幅な減少は、フェロセンのＰＮｔａｒｇｅｔハイブリダイゼーションに対する感度が高いことを示す。
【００７５】
このポリピロールを最適化するために、ＰＮｐｒｏｂｅへのグラフト化のための単一の部位を規定して、グラフト化されたフェロセンの位置と量を制御し、その結果を完全に再現性のあるものにすることが必要である。この最適化は実施例３の主題を構成する。
【００７６】
実施例３：Ｐ−Ｆｅ−ＰＮｐｒｏｂｅ構造を有するモノマーからなるコポリマーポリピロールの調製
この調製は、脱離基を有するフェロセンによるポリピロールの官能化からなる。ＰＮｐｒｏｂｅは、一方が［ＰｙＮＨ−Ｆｅ−ＮＨＰ］ホモポリマーに、他方が［ＰｙＮＨ−Ｆｅ−ＮＨＰ−ＰｙＣＯＯＨ］コポリマーに結合する。
【００７７】
ＰＮｐｒｏｂｅは、ＰＮｔａｒｇｅｔに対する認識特性を有しており、ＰＮｐｒｏｂｅがフェロセンに結合した後もこの認識が保持されているかをチェックし、そしてこの認識に対するフェロセンの電気化学反応の性質を調べた。
【００７８】
最初に、３位において、活性化エステル基を有するフェロセンで置換されたピロールモノマーを合成した。ついで得られたモノマーの重合を、電気化学的に行ない、ＰＮｐｒｏｂｅを、得られたポリマーにグラフト化した。
【００７９】
３Ａ ３−ピロール−フェロセン−ＮＨＰモノマーの合成
フェロセンとＮＨＰ基の両方を有するピロールの作製は数回の合成工程を必要とした。第１は、アミノブチル基で置換されたピロール、すなわち（４−アミノブチル）−３−ピロールの合成であり、第２の工程は、１，１’−ジプロパノアート−Ｎ−ヒドロキシフタルイミド−フェロセンの合成、第３の工程は３−ピロール−フェロセン−ＮＨＰの合成であった。
【００８０】
（４−アミノブチル）−３−ピロールの合成
【化２】
【００８１】
（４−アミノブチル）−３−ピロールは、ピロールを、縮合反応によって活性化エステル基により官能化させることができるアミノ官能基によって、合成した。このモノマーを合成するために、トシルピロールにおいてアシル化反応を行なって、（３−ブロモプロピオニル）−３−トシルピロールを、収率６３％で得た。この反応の後、カルボニル官能基の還元を行なった。（３−ブロモプロピル）−１−トシルピロールを収率７８％で得た。シアン化ナトリウムを用いて、臭素をシアン化官能基で、収率５０％で置換した。シアン化物のアミンへの転換は、リチウムアンモニウムヒドリドを用いた還元反応で行なった（収率７７％）。ＮａＯＨ塩基によるトシル基の加水分解により、（４−アミノブチル）−３−ピロールを、収率６２％で得た。
【００８２】
１，１’−フェロセン−プロピル−ＮＨＰ
合成スキームは以下の通りであった。
【００８３】
【化３】
【００８４】
このフェロセンは、水酸化ナトリウムとメタノールの存在下で、１，１’−（シアノプロピル）フェロセンの、１，１’−（プロピル）フェロセン酸への転換により、収率９５％で得た。フェロセンのカルボキシル基を脱離基、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（ＮＨＰ）で置換した。ＮＨＰフェロセンをフェロセン酸から、ＤＣＣ存在下でエステル化により得た。ＤＣＣは、脱水剤として作用して、ＤＣＵに転換され、こうして反応の間形成された水を捕捉した。
【００８５】
３−ピロール−フェロセン−ＮＨＰの合成
合成スキームは以下の通りであった。
【００８６】
【化４】
【００８７】
フェロセンの２つのＮＨＰ基においてピロール置換を避けるためにフェロセンの大過剰の条件下で、アセトニトリル中で、３−ピロール−ブチルアミンと１，１’−フェロセン−プロピル−ＮＨＰとの間の結合反応により、３−ピロール−フェロセン−ＮＨＰを得た。
【００８８】
モノマーの電気化学的特徴づけ
０．１Ｍ のＬｉＣｌＯ４支持体電極の存在下で、アセトニトリル中の溶液中で、電気化学的にモノマーを分析した。
【００８９】
図３は、得られたボルタモグラムを示す。２つの酸化−還元系を見ることができる。第１の系は、可逆特性を有し、その酸化電位は０．２６Ｖである。この系は、ピロールにおいて置換されたフェロセンの酸化−還元に相当する。第２の電気化学的系は、不可逆性であり、その酸化電位は、１．１７Ｖ／ＳＣＥである；それはピロールの酸化に相当する。
【００９０】
フェロセン基で置換されたピロールのこの酸化電位は、非置換ピロール又はカルボキシル基で置換されたピロールの酸化電位に、匹敵しており、一般的に約０．８乃至０．９Ｖ／ＳＣＥである。
【００９１】
３Ｂ ポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰ］ホモポリマーの調製
重合スキームは以下の通りであった。
【００９２】
【化５】
【００９３】
０．２Ｍテトラブチルアンモニウムテトラフルオロボラート（Ｎ＋Ｂｕ２ＢＦ４）を含むアセトニトリル媒体中の、モノマーポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰ］の溶液中に、白金電極を浸漬することにより、ポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰ］膜を得た。１．１Ｖ／ＳＣＥに制御された電位において、モノマーの酸化電位に基づいて、電気重合を行なった。デポジットされた電荷は、７０ｍＣであった。
【００９４】
重合の後、溶液中に沈澱が形成された。これはおそらく短鎖オリゴマーの形成のためであろう。
【００９５】
ポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰ］ホモポリマーの電気化学的特徴づけ
得られたポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰ，ＰｙＣＯＯＨ］ホモポリマーの膜を、０．１ＭのＬｉＣｌＯ４の存在下で、アセトニトリル媒体中で、電気化学的に分析した。図４は、得られたボルタモグラムを示す。このボルタモグラムは、ポリマー膜の高い電気活性を示す。酸化電位は２８８ｍＶ／ＳＣＥであり、還元電位は２３６ｍＶ／ＳＣＥである。これらの２つの値の差異と酸化ピーク電流（１３．５μＡ）の還元ピーク電流（１１μＡ）に対する比は、この電気化学的系が良好な可逆性を示すことを表している。酸化又は還元の間に交換した電荷は、０．１ｍＣである。この値は、重合の間にデポジットされた電荷にあまり匹敵していない。酸化電荷から、電極にデポジットされた電気活性フェロセンの量を決定することが可能である。その酸化プロセスの間に、フェロセンが一の電子を交換することから、ファラデーの法則を確立することができる：
ＱＯＸ＝Ｎ（Ｆｅ）＊Ｆ
【００９６】
電極上のフェロセンの、又は電気活性ピロール単位のモル数は、１０−９モルであった。
【００９７】
重合電荷からフェロセンのモル数を計算すると、約１０−７モルの非常に高い値を得る。
【００９８】
しかしながら、これらの結果は、重合収率が、非常に低いことを示す。２つの因子が、この低い収率の原因である：一方は、重合電荷のある部分が、溶液中でフェロセンを酸化するために機能することである。他方は、ピロールにおいて、置換されたフェロセン−ＮＨＰ基の立体障害が、これらの２つのピロール単位の間の結合を防止して、溶液中に沈澱する短鎖オリゴマーをもたらすことである。
【００９９】
３Ｃ ホモポリマーへのＰＮｐｒｏｂｅの結合
結合スキームは以下の通りであった。
【０１００】
【化６】
【０１０１】
用いられたＰＮｐｒｏｂｅは、ＳＥＱＩＤＮｏ．１として示される、以下の配列を有する２５対の塩基を有する、ポリヌクレオチドであった。
５’ＴＣＡ−ＡＴＣ−ＴＣＧ−ＧＧＡ−ＡＴＣ−ＴＣＡ−ＡＴＧ−ＴＴＡ−Ｇ３’
【０１０２】
ＰＮｐｒｏｂｅは、ポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰ］前駆体ホモポリマーに結合した。この置換の化学的条件は、ポリ［ＰｙＣＣＮＨ−ＮＨＰ］ポリマーへの結合の条件と同様であった。
【０１０３】
アミノ基をその５’位に有するＰＮｐｒｏｂｅとピロール−Ｆｅ−ＮＨＰとの間の結合は、２５μｍｏｌ／ｌ酢酸塩バッファーが１０％存在するアセトニトリル溶液中に電極を浸漬することにより達成された。反応は室温で２時間行われた。
【０１０４】
得られた膜を、サイクリックボルタンメトリにより０．５ＭのＮａＣｌが存在する水中で分析した。図５は、酸化−還元系を示すもので、酸化と還元のピークが各々、２７３ｍＶと２５８ｍＶに存在している。
【０１０５】
水性媒体中のフェロセンの電気化学系は、アセトニトリルでの膜の分析ほど可逆性ではない。この電気活性の損失はおそらく、ドーピングイオンの、又は水中のポリマーマトリックスの溶媒和の問題のためであろう。
【０１０６】
実施例４：実施例３で得られたポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＰＮｐｒｏｂｅ］ホモポリマーにおけるＰＮｔａｒｇｅｔのハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションのスキームは以下の通りであった。
【０１０７】
【化７】
【０１０８】
［Ｐｙ−Ｆｅ−ＰＮｐｒｏｂｅ］コポリマーの膜を、生物的バッファー中２５ｎｍｏｌ（２５μｍｏｌ／ｌ）のＰＮｔａｒｇｅｔの存在下で、３時間、３７℃の温度で、１ｍｌの容量でインキュベートした。
【０１０９】
ＰＮｔａｒｇｅｔは、ＰＮｐｒｏｂｅの塩基と２５対の相補を有し、ＳＥＱＩＤＮｏ．２と称する以下の配列を有する：
５’ＣＴＡ−ＡＣＡ−ＴＴＧ−ＡＧＡ−ＴＴＣ−ＣＣＧ−ＡＧＡ−ＴＴＧ−Ａ３’
【０１１０】
サケＤＮＡをハイブリダイゼーションバッファー中で、他の電極をインキュベートすることによりブランクテストを行ない、非特異的相互作用の影響を測定した。
【０１１１】
電気化学的特徴づけ
ポリマーの電気化学的反応を、０．５ＭのＮａＣｌが存在する水性媒体中のサイクリックボルタンメトリにより分析した。
【０１１２】
ブランクテスト電極
図６のボルタモグラム（実線：ハイブリダイゼーション前；点線：ハイブリダイゼーション後）は、ＰＥＧバッファーの存在下でインキュベートされた対照の電極の電気化学的反応を示す。
【０１１３】
対照電極としての電極が、酸化電位の変動と電気活性の減少を示すことがわかる。このことは、非特異的な相互作用が、フェロセンの電気化学反応にわずかな効果を有することを示す。
【０１１４】
ハイブリダイゼーションの後にテストされたポリマー
水性媒体中のＰＮｔａｒｇｅｔの存在下でインキュベートされた電極の電気化学分析を図７に示す（実線：ハイブリダイゼーション前；点線：ハイブリダイゼーション後）。
【０１１５】
インキュベーション後の電極が、高い電位に対する酸化電位におけるシフト、及び電気活性の減少を示す。酸化の間に交換された電荷は、同じく減少した還元のものである。
【０１１６】
フェロセンの電気化学反応における変動がブランク電極を上回ることもわかる。
【０１１７】
実施例５：Ｐ−Ｆｅ−ＮＨＰ構造を有するモノマーと、−ＣＨ２−ＣＯＯＨ基で置換されたモノマーからなるコポリマーポリピロールの調製
５Ａ ポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰ， ＰｙＣＯＯＨ］ポリマーの調製
合成のスキームは以下の通りであった。
【０１１８】
【化８】
【０１１９】
３−ピロール酢酸（ＰｙＣＯＯＨ）と３−ピロール−Ｆｅ−ＮＨＰ（Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰ）との間の共重合は、この嵩高いモノマーをポリマーマトリックス中で希釈して、立体性で誘導される摂動を最小化することを可能にした。さらに、３−ピロール酢酸との共重合は、膜の多孔性を増加することを可能にした。
【０１２０】
ＰｙＣＯＯＨとＰｙ−Ｆｅ−ＮＨＰモノマーの各濃度の選択は、これらの２つのモノマーの重合電位を参照することにより決定した。ＰｙＣＯＯＨは、０．９Ｖ／ＳＣＥで酸化するが、Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰは１．１Ｖ／ＳＣＥで酸化する。Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰよりも、ＰｙＣＯＯＨの濃度が低いことが必要であった。したがってコポリマーの電気重合に用いられたこれらの２つのモノマーの濃度は、ＰｙＣＯＯＨの場合０．０２Ｍ、Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰの場合０．０８Ｍであった。
【０１２１】
コポリマーは、０．２ＭのＬｉＣｌ２の存在下で、プロピレンカーボナート媒体中で７００ｃｍ２の面積を有する白金電極上に、１．１Ｖ／ＳＣＥの強制電位で析出した。電気重合の間にデポジットされた電荷は、３５ｍＣであった。電気重合の間に測定された電荷のうちの一部を用いて、溶液中のフェロセンを酸化したので、重合電荷から膜の厚みを測定することが困難であった。
【０１２２】
得られたポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰ， ＰｙＣＯＯＨ］ポリマーの電気化学的特徴づけ
この特徴づけは、０．１ＭのＬｉＣｌＯ４の存在下のアセトニトリル媒体中で行なった。図８のボルタモグラムは、２５４ｍＶの電位において酸化ピークを、２３４ｍＶの電位で対称的還元ピークを有する可逆的電気化学系を示す。半分の高さの幅は、１５０ｍＶである。この電気化学反応は、フェロセンからのシグナルを表しており、この電気化学的プローブが高い電気活性を有することを示す。ポリマーのコンジュゲート鎖に沿った電子移動は、非常に広範囲であって、これはポリピロールが導電性であることを示す。フェロセンの酸化の間に交換された電荷は、約０．１５ｍＣであった。このフェロセン酸化電荷により、すべてのフェロセン部位が電気活性であると仮定すると、ポリマー中にフェロセン基を有するピロールのモル数を計算することができる。
【０１２３】
ファラデーの法則から、
ＱＯＸ＝Ｎ＊Ｆ
ここで、Ｎは、フェロセンのモル数であり、Ｆはファラデー定数である。
【０１２４】
電気活性フェロセンのモル数は約１０−９モルである。
【０１２５】
５Ｂ プローブポリヌクレオチドの、ポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰ，ＰｙＣＯＯＨ］コポリマーポリピロールへの結合
結合スキームは以下の通りであった。
【０１２６】
【化９】
【０１２７】
用いられたＰＮｐｒｏｂｅは、ポリヌクレオチドＳＥＱＩＤＮｏ．１であった。
【０１２８】
１０％の酢酸塩バッファーの存在下でアセトニトリル溶液中で電極を浸漬することにより、ポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰ，ＰｙＣＯＯＨ］前駆体コポリマーにＰＮｐｒｏｂｅ（２５μｍｏｌ／ｌ）を結合させた。
【０１２９】
得られたポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＰＮｐｒｏｂｅ，ＰｙＣＯＯＨ］ポリマーの電気化学的特徴づけ
図９は、０．５ＭのＮａＣｌの存在下で、水性媒体中にＰＮｐｒｏｂｅをグラフト化した後の、電極の電気化学的反応を示す。ボルタモグラムは、強くて細い酸化ピークと広い還元ピークによって特徴付けられる酸化還元系を示す。
【０１３０】
酸化と還元ピークの電位は、各々、３４１ｍＶと２７５ｍＶであり、半分の高さの幅は、酸化ピークが１００ｍＶ、還元ピークが２００ｍＶである。酸化又は還元の間に交換された電荷は、約０．１ｍＣであった。
【０１３１】
実施例６：実施例５で得られたポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＰＮｐｒｏｂｅ，ＰｙＣＯＯＨ］コポリマー上のＰＮｔａｒｇｅｔのハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションのスキームは以下の通りであった。
【０１３２】
【化１０】
【０１３３】
ポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＰＮｐｒｏｂｅ，ＰｙＣＯＯＨ］コポリマーの膜を、前記と同じ条件下で、２５塩基からなるＰＮｔａｒｇｅｔの存在下で、インキュベートした。
【０１３４】
対照の電極を、ＰＮｔａｒｇｅｔを含まない同じ生物的バッファー中でインキュベートした。
【０１３５】
電気化学的特徴づけ
ターゲットと非ターゲットの存在下でインキュベートされた電極の電気化学的反応を、アセトニトリル媒体中と水性媒体中で、分析した。
【０１３６】
ブランクテスト電極
図１０及び１１は、アセトニトリル媒体と水性媒体中での非ターゲット（サケＤＮＡ）の存在下でのハイブリダイゼーション前（実線）と後（点線）のボルタモグラムを示す。
【０１３７】
アセトニトリル媒体において、フェロセンの電気化学的反応が、酸化電位が安定で、ピーク電流の変動がごくわずかであることを示すことがわかる。
【０１３８】
０．５ＭのＮａＣｌの存在下の、水性媒体中の対照電極の電気化学的反応の分析は、フェロセンの電気化学的反応における変動−酸化電位の増加とピーク電流の減少を示す。
【０１３９】
ハイブリダイゼーションの後にテストされたポリマー
水性媒体中のターゲットの存在下でインキュベートされた電極の電気化学分析を図１２に示す（実線：ハイブリダイゼーション前；点線：ハイブリダイゼーション後）。ボルタモグラムは、ハイブリダイゼーション後の電気化学的シグナルにおける大きな変動を示す。酸化電位は、より高い電位方向へシフトしていて、ハイブリダイゼーション後には、３４０ｍＶから３８７ｍＶに移っている。酸化電流は６０％減少している。酸化の間の交換された電荷は２５％減少している。
【０１４０】
０．１ｎｍｏｌのＰＮｔａｒｇｅｔの存在下でインキュベートされた電極のアセトニトリル中の電気化学的反応の分析を、図１３に示す（実線：ハイブリダイゼーション前；点線：ハイブリダイゼーション後）。インキュベーション後のボルタモグラムは、有機媒体中のフェロセンの可逆的系が保持されていることを示す。フェロセンの酸化と還元電位は低い電位の方向にシフトしている。
【０１４１】
水性媒体中と有機媒体中の電気化学的反応におけるこの変動は、フェロセンにグラフト化されたＰＮｐｒｏｂｅと、ＰＮｔａｒｇｅｔとの間に選択的で特異的なハイブリダイゼーションが存在することを表す。
【０１４２】
ターゲットの存在下でインキュベートされたこれらの電極は、電気化学的反応において大きな変動を示したが、ターゲットを含まない生物的バッファー中のインキュベーション後のフェロセンの反応における変動の起源を決定することが必要である。
【０１４３】
実施例６：電気活性に対する、重合電荷の影響
実施例５のポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＰＮｐｒｏｂｅ，ＰｙＣＯＯＨ］から重合の間にデポジットされた電荷の影響を、３つの電荷値、５，１０，１５ｍＣについて調べた。
【０１４４】
図１４は、酸化電流はデポジットされた電荷の量に伴い減少することを示す。
【０１４５】
実施例７：電極の電気化学的再現性
ポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＰＮｐｒｏｂｅ，ＰｙＣＯＯＨ］の電気化学的再現性を、６つの薄膜電極でテストした。
【０１４６】
０．１ＭのＬｉＣｌＣＯ４の存在下で、アセトニトリル媒体中で行なわれた、これらの電極の電気化学的特徴づけを図１５に示す。この図は、６つの電極について、ＰＮｐｒｏｂｅがグラフト化された後に、実質的に同じボルタモグラムが得られることを示す。
【０１４７】
実施例８：ＰＮｐｒｏｂｅに対する、ＰＮｔａｒｇｅｔハイブリダイゼーション条件の影響８Ａ ハイブリダイゼーションバッファーの効果
実施例５と同じポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＰＮｐｒｏｂｅ，ＰｙＣＯＯＨ］（Ｑ＝５ｍＣ）電極を２つの異なるバッファー中でインキュベートした：
−２時間及び３時間、３７℃のＴＥ−ＮａＣｌバッファー
−２時間及び３時間、３７℃、ＳＳＰＥＧバッファー。
【０１４８】
各々、インキュベーションの前と後で、それぞれ上記バッファーで、０．１ＭのＬｉＣｌＯ４の存在下でアセトニトリル媒体で行なわれた電気化学的特徴づけ（ボルタモグラムは示さず）は、電極がより安定であるというＳＳＰＥＧバッファーの利点を示す。
【０１４９】
８Ｂ ＰＮｔａｒｇｅｔ濃度の効果
いくつかのポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＰＮｐｒｏｂｅ、ＰｙＣＯＯＨ］膜を、種々のＰＮｔａｒｇｅｔ濃度（０．０１、０．０５及び０．５ｎｍｏｌ／ｌ）の存在下で、ＳＳＰＥＧバッファーでインキュベートした。
【０１５０】
各々、ハイブリダイゼーションの前と後の、上述の種々の濃度の存在下、０．１ＭのＬｉＣｌＯ４の存在におけるアセトニトリル媒体中の電気化学的特徴づけ（ボルタモグラムは示さない）は、ハイブリダイゼーションの前と後の電気化学的反応における変動が、ＰＮｔａｒｇｅｔ濃度に伴い増加することを示す。これは、初期ピークの電位に相当する２８０ｍＶ／ＳＣＥの電位で、電流の増加がＰＮｔａｒｇｅｔ濃度に伴い変化することが観察されたためである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１に示した反応（実線：Ｆｅ−（ＣＨ３）ＮＨＰ；点線：Ｆｅ−ＮＨＰ）は、ＰＮｐｒｏｂｅのグラフト化の後の、ＰＮｐｒｏｂｅにおいて置換されたフェロセンに特徴的な水性媒体中０．３５Ｖ／ＳＣＥの電位での、電気化学的シグナル出現により特徴付けられる。
【図２】図２（実線：ハイブリダイゼーション前；点線；ハイブリダイゼーション後）に示された電気化学反応は、ハイブリダイゼーションの後のフェロセンからのシグナルの電気活性の大幅な減少を示す。
【図３】図３は、得られたボルタモグラムを示す。
【図４】図４は、得られたボルタモグラムを示す。
【図５】図５は、酸化−還元系を示す。
【図６】図６のボルタモグラム（実線：ハイブリダイゼーション前；点線：ハイブリダイゼーション後）は、ＰＥＧバッファーの存在下でインキュベートされた対照の電極の電気化学的反応を示す。
【図７】水性媒体中のＰＮｐｒｏｂｅの存在下でインキュベートされた電極の電気化学分析を図７に示す（実線：ハイブリダイゼーション前；点線：ハイブリダイゼーション後）。
【図８】図８のボルタモグラムは、２５４ｍＶの電位において酸化ピークを、２３４ｍＶの電位で対称的還元ピークを有する可逆的電気化学系を示す。
【図９】図９は、０．５ＭのＮａＣｌの存在下で、水性媒体中にＰＮｐｒｏｂｅをグラフト化した後の、電極の電気化学的反応を示す。
【図１０】アセトニトリル媒体と水性媒体中での非ターゲットの存在下でのハイブリダイゼーション前（実線）と後（点線）のボルタモグラムを示す。
【図１１】アセトニトリル媒体と水性媒体中での非ターゲットの存在下でのハイブリダイゼーション前（実線）と後（点線）のボルタモグラムを示す。
【図１２】水性媒体中のターゲットの存在下でインキュベートされた電極の電気化学分析を図１２に示す（実線：ハイブリダイゼーション前；点線：ハイブリダイゼーション後）。
【図１３】０．１ｎｍｏｌのＰＮｔａｒｇｅｔの存在下でインキュベートされた電極のアセトニトリル中の電気化学的反応の分析を、図１３に示す（実線：ハイブリダイゼーション前；点線：ハイブリダイゼーション後）。
【図１４】図１４は、酸化電流はデポジットされた電荷の量で減少することを示す。
【図１５】０．１ＭのＬｉＣｌＣＯ４の存在下で、アセトニトリル媒体中で行なわれた、電極の電気化学的特徴づけを図１５に示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、リガンドと特異的に相互作用することが意図されたアンチリガンドが結合されている電気活性ポリマーから作製される、有機電極に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リガンドとアンチリガンドの特異的な相互作用は、電気活性ポリマーの電気化学的特性における、実質的かつ選択的な変動、例えばそのポリマーの電気活性度の減少、を含む。この変動は、グラフト化されたリガンドの濃度に依存するもので、これは、観察、測定することが可能であり、直接、グラフト化リガンドの量に相関する。この技術の必須の応用のひとつは、したがって、生物的試料に存在するリガンドの検出、同定、及びおそらくそのアッセイにある。
【０００３】
前記変動は、電位差滴定タイプのもの、例えば、相互作用前後の電気活性ポリマーの酸化電位の変動、又は電流滴定法タイプのもの、例えば、ハイブリダイゼーションの前後のポリマーの酸化又は還元電流の変動で、規定された電位で測定されたものである。
【０００４】
前記ポリマーの電気化学的反応を特異的に特徴づけするために、これは高い電気活性を有していなければならない。
【０００５】
したがって、本発明の目的のひとつは、少なくとも一のアンチリガンドが結合した電気活性ポリマーを主体とするプローブであって、高い電気活性を有するプローブを提供することである。
【０００６】
ＷＯ−Ａ−９５／２９１９９公報は、各々、プローブポリヌクレオチドでピロール環の３位の炭素において共有結合により置換された、各々ピロール環からなるモノマーから形成されたポリピロールを教示している。
【０００７】
こうして得られたポリピロールは、検出及び、おそらくはリガンドのインビトロ又はインビボアッセイの可能性のために、適用される。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、常に、よりよい電気活性特性を有するポリマーを生産することが期待されている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、その電気活性ポリマーの感度が、ＷＯ−Ａ−９５／２９１９９公報の主題を形成するポリピロールなどの、既知の改変電気活性ポリマーより百倍高いのオーダーのものであり得る少なくとも一のアンチリガンドを有する改変された電気活性ポリマーを提供する。
【００１０】
こうして、本発明の第１の主題は、少なくとも二のモノマーのホモポリマー又はコポリマーの電気活性ポリマー、アンチリガンド、及び前記アンチリガンドと特異的に相互作用したリガンドからなる電気活性複合体であって、前記複合体は、さらに少なくとも一の電子供与基を含むものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明によれば、電子供与基が、フェロセン、キノンおよびこれらの誘導体から選ばれることが有利であり、及び／又は電気活性ポリマーが、ポリピロール、ポリアセチレン、ポリアジン、ポリ（ｐ−フェニレン）、ポリ（ｐ−フェニレンビニレン）、ポリピレン、ポリチオフェン、ポリフラン、ポリセレノフェン、ポリピリダジン、ポリカルバゾール、ポリアニリン及び二重鎖ポリヌクレオチド類から選ばれることが好ましい。
【００１２】
本発明を詳細に説明する前に、明細書及び請求項で用いる用語は以下の通りである。
【００１３】
用語「電子供与基」は、細く、速く、可逆的な酸化波を有するレドックス対、例えばフェロセン、キノン、及びそれらの誘導体、例えば、それらの置換された誘導体を意味するものと理解される。
【００１４】
用語「アンチリガンド」及び「リガンド」は、ポリヌクレオチド類又はペプチド類などの生物的分子だけを意味するのではなく、化学的分子類をも意味するものである。
【００１５】
アンチリガンドは、特異的にリガンドと相互作用して、リガンド／アンチリガンドコンジュゲートを形成することができる。コンジュゲートの例として、あらゆるペプチド／抗体対、抗体／ハプテン対、ホルモン／レセプター対、ポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド対、ポリヌクレオチド／核酸対などを挙げることができる。
【００１６】
本発明で用いられる用語「ポリヌクレオチド」は、天然又は修飾された、適当なハイブリダイゼーション条件下で、少なくとも部分的に相補するポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる、少なくとも五のヌクレオチド類（デオキシリボヌクレオチド類又はリボヌクレオチド類）の連結配列を意味する。用語「修飾されたブクレオチド」は、例えば、修飾塩基を有するヌクレオチド、及び／又は、ヌクレオチド内部の結合及び／又はバックボーンに修飾を有するヌクレオチドを意味するものと理解される。修飾塩基の例としては、イノシン、５−メチルデオキシシチジン、５−ジメチルアミノデオキシウリジン、２，６−ジアミノプリン及び５−ブロモデオキシウリジンを挙げることができる。修飾されたヌクレオチド内部の結合を示すと、ホスホロチオアート、Ｈ−ホルホナート及びアルキルホルホナート結合を挙げることができる。α−オリゴヌクレオチド、例えば、ＦＲ−Ａ−２６０７５０７号に掲載されたもの、及びＭ．Ｅｇｈｏｌｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９２），１１４，１８９５−１８９７による論文の主題を形成するＰＮＡｓを、バックボーンが修飾されているヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの例として挙げることができる。
【００１７】
用語「ペプチド」は、特に、少なくとも二のアミノ酸のあらゆる連結配列、例えば、タンパク質、タンパク質断片又はオリゴペプチドを意味し、それらは、抽出され、分離され、単離され又は合成されたものであり、例えば、化学合成により、又は組換え生物における発現により、得られるペプチドである。Ｌ系列の一以上のアミノ酸が、Ｄ系列の一以上のアミノ酸で置換されている、又はその反対の配列における、あらゆるペプチド；そのＣＯ−ＮＨ結合の少なくとも一が、ＮＨ−ＣＯ結合で置換されていて、各アミノアシル基のキラリティが、前記ＣＯ−ＮＨの一以上に含まれていてもいなくても、参照ペプチドを構成するアミノアシル基に対して、保存されあるいは反対であるあらゆるペプチド（又はイムノレトロイド類）；及びあらゆるミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）も含まれる。
【００１８】
問題となるペプチドの種々のクラスを例示すると、副腎皮質刺激ホルモン類又はその断片類、アンジオテンシンアナログ類及びそれらのインヒビター類、ナトリウム排泄増加性ペプチド類、ブラジキニン及びそのペプチド誘導体類、走化性ペプチド類、ジノルフィン及びその誘導体類、エンドルフィン類及びその誘導体類、エンケファリン類及びその誘導体類、酵素インヒビター類、フィブロネクチン断片類及びその誘導体類、胃腸のペプチド類、オピオイドペプチド類、オキシトシン、バソプレッシン、バソトシン、及びその誘導体類、キナーゼタンパク質類を挙げることができる。
【００１９】
用語「抗体」とは、あらゆるモノクローナル又はポリクローナル抗体、前記抗体のあらゆる断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’２又はＦｃ断片類、及び遺伝的に修飾又は組換えにより得られたあらゆる抗体を定義する。
【００２０】
用語「グラフト」、「結合」及び「結合する」とは、何も示されていないときは、この文脈では、その化学的性質を定義せずに、２つの物体の間のあらゆる関係を示すために用いられる。したがって、弱い結合または共有結合でもよい。
【００２１】
本発明の連結基は、活性化又は活性化可能な基により、この相互作用の目的で、少なくとも一方が前もって活性化されたか活性化され得る２つの化学的物体の相互作用の後、２つの化学的物体を、共有結合により連結する。連結基は、したがって、他の物体の反応性官能基において、一の物体の前記活性化又は活性化可能な基の反応により、又はその反対により、他の物体の他の前記活性化された又は活性化可能な基において、一方の物体の前記活性化又は活性化可能な基の反応により、得ることができる。
【００２２】
用語「活性化された基」とは、その仲介により、それが結合している物体と他の物体と相互作用させる基を意味するものと理解される。例えば、これは、−ＣＯ−［Ｏ−Ｎ−フタルイミド］基などの活性化エステル基でもよい。用語「活性化され得る基」は、例えば、ある反応条件下で、又はそれと相互作用可能な活性化された基と接触させたときに、活性化された基に転換されることができる基を意味するものと理解される。
【００２３】
上述の本発明の複合体は、下記の特性を個別に又は組み合わせて満足することが有利である。
【００２４】
前記リガンドと前記アンチリガンドは生物的分子であり、特にポリヌクレオチド類及びポリペプチド類から選ばれ、直接又は間接的に、シグナルを発生することができるトレーサーにより標識されることができる。
【００２５】
複合体は以下の構造の一つを有する：
前記電子供与基が、直接又は間接的に、一方は電気活性ポリマーに、他方はアンチリガンド又はリガンドに連結し、あるいは、
前記電子供与基が、直接又は間接的にアンチリガンドに連結し、アンチリガンド自身は、直接又は間接的に電気活性ポリマーに連結し、あるいは、
前記電子供与基が、直接又は間接的的にアンチリガンドと相互作用したリガンドに結合し、前記アンチリガンドは、直接又は間接的に電気活性ポリマーに連結する。
【００２６】
電気供与基が電気活性ポリマーに連結するとき、好ましくは第１の連結基を介して共有結合で連結される。
【００２７】
アンチリガンド又はリガンドが電子供与基に及び／又は電気活性ポリマーに連結するとき、それらは各々第２及び第３の連結基を介して、共有結合で連結することが有利である。
【００２８】
第１及び／又は第２及び／又は第３の連結基は、各々、前記電子供与基を前記電気活性ポリマーに、電子供与基をアンチリガンドまたはリガンドに、アンチリガンド又はリガンドを前記電気活性ポリマーに、結合腕を介して、連結するものである。
【００２９】
電子供与基がリガンドに連結している本発明の複合体の構造において、それは不活性支持体、例えばポリスチレンビーズ、磁気ビーズ又はガラスビーズを介して、又は生物的支持体、例えばを前記電子供与基が内在化された細胞を介して、連結されることもできる。
【００３０】
本発明の好ましい複合体によれば、電気活性ポリマーは、各々ピロール環からなる少なくとも二のモノマーから形成されるポリピロールであり、前記電気供与基がフェロセンであり、特にアンチリガンドはプローブポリヌクレオチドでありリガンドは少なくとも一部が前記アンチリガンドとハイブリダイズされるターゲットポリヌクレオチドである。
【００３１】
この好ましい複合体は、さらに以下の特性を、個別に、又は組み合わせて有する。
【００３２】
フェロセンは、一方はプローブポリヌクレオチドに、他方はポリピロールモノマーのピロール環に連結しており、この場合プローブポリヌクレオチドは、フェロセンの一のシクロペンタジエン環の１位の炭素に結合しており、フェロセンはピロール環に、他のシクロペンタジエン環の１’位の炭素を介して、結合している。あるいは、プローブポリヌクレオチドは、少なくともフェロセンと前記モノマーのピロール環に連結していて、この場合プローブポリヌクレオチドはフェロセンの一のシクロペンタジエン環の１位の炭素に結合している。
【００３３】
ピロール環は好ましくは３位の炭素において置換されている。
【００３４】
ポリピロールは、コポリマーであり、該コポリマーに含まれるモノマーは、そのピロール環が、−ＣＨ２−ＣＯＯＨ又は−ＣＨ２−ＣＨ２ＯＨ基で置換されているものである。
【００３５】
有利には、フェロセンとピロール環との間の第１の連結基は、−ＣＯＮＨ−ＣＨ２−基であり、及び／又は、フェロセンとプローブポリヌクレオチド又はターゲットポリヌクレオチドとの間の第２の連結基は−ＣＯ−基であり、及び／又は、プローブポリヌクレオチド又はターゲットポリヌクレオチドとピロール環との間の第３の連結基は−ＣＨ２−ＣＯ−基である。
【００３６】
間接的に、フェロセンをピロール環に、フェロセンをプローブポリヌクレオチド又はターゲットポリヌクレオチドに、及びピロール環をプローブポリヌクレオチド又はターゲットポリヌクレオチドに、各々連結する、第１及び／又は第２及び／又は第３の連結基は、結合腕を介して連結することができる。結合腕は、有利には、少なくとも二の炭素原子、好ましくは少なくとも２又は３の炭素原子を有する飽和炭化水素鎖である。
【００３７】
プローブポリヌクレオチド又はターゲットポリヌクレオチドは、少なくとも、各々、第２及び／又は第３の連結基を介して、およびプローブポリヌクレオチド又はターゲットポリヌクレオチドの少なくとも一のアミノ官能基を介して、フェロセン及び／又はモノマーのピロール環に結合する。
【００３８】
本発明の別の目的は、少なくとも二のモノマーのホモポリマー又はコポリマーの電気活性ポリマー、リガンドと特異的に相互作用することができるアンチリガンドからなる電気活性プローブであって、前記プローブは、さらに、少なくとも一の電子供与基を含むものである。
【００３９】
前記プローブは、以下の特徴の少なくとも一を有することが有利である。
【００４０】
電気活性ポリマーは、ポリピロール、ポリアセチレン、ポリアジン、ポリ（ｐ−フェニレン）、ポリ（ｐ−フェニレンビニレン）、ポリピレン、ポリチオフェン、ポリフラン、ポリセレノフェン、ポリピリダジン、ポリカルバゾール、ポリアニリン及び二重鎖ポリヌクレオチド類から選ばれ、及び／又は前記電子供与基がフェロセン、キノンおよびこれらの誘導体類から選ばれ、及び／又は前記アンチリガンドは生物的分子であり、特にポリヌクレオチド類及びポリペプチド類から選ばれ、任意に直接又は間接的に、シグナルを発生することができるトレーサーにより標識されている。
【００４１】
電子供与基は、直接又は間接的に、一方は電気活性ポリマーに、他方はアンチリガンドに連結されている。この場合、電子供与基は、好ましくは、第１の連結基を介して、電子活性ポリマーに、共有結合で連結されているか、あるいは電子供与基は、直接または間接的に、アンチリガンドに連結され、前記アンチリガンド自体は、直接又は間接的に、電気活性ポリマーに連結されている。
【００４２】
アンチリガンドは、第２の連結基を介して共有結合により電子供与基に連結され、及び／又は、アンチリガンドは、第３の連結基を介して共有結合により電気活性ポリマーに連結されている。
【００４３】
第１及び／又は第２及び／又は第３の連結基は、各々、結合腕を介して、電子供与基を電気活性ポリマーに、電子供与基をアンチリガンドに、及びアンチリガンドを電気活性ポリマーに、連結させる。
【００４４】
本発明の有利なプローブは、少なくとも二のモノマーから形成されたポリピロール（各モノマーはピロール環からなる）、フェロセン、及び適当なハイブリダイゼーション条件下でターゲットポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるプローブポリヌクレオチドからなる特定のアンチリガンドを含む。
【００４５】
プローブポリヌクレオチド（ＰＮｐｒｏｂｅ）は、少なくとも前記モノマーのフェロセン（Ｆｅ）及びピロール環（Ｐ）の間に結合することもでき、あるいはピロール環に結合したフェロセンに結合することもできる。
【００４６】
プローブポリヌクレオチドがフェロセンとピロール環との間に結合するとき、（Ｐ−ＰＮｐｒｏｂｅ−Ｆｅと称する）、本発明のプローブは、個別に、又は組み合わせて以下の特徴を有する：
−プローブポリヌクレオチドは、フェロセンの一のシクロペンタジエン環の１位の炭素に結合している；
−プローブポリヌクレオチドは、直接又は間接的に、第３の連結基を介してピロール環に結合している；第３の連結基は、−ＣＨ２−ＣＯ−基であることが有利である。
【００４７】
プローブポリヌクレオチドがフェロセンに結合し、フェロセンがピロール環に結合しているとき（Ｐ−Ｆｅ−ＰＮｐｒｏｂｅと称する）、本発明のプローブは、個別に、又は組み合わせて以下の特徴を有する：
−プローブポリヌクレオチドは、フェロセンの一のシクロペンタジエン環の１位の炭素に結合しており、フェロセンは他のシクロペンタジエン環の１’位の炭素を介してピロール環に結合している；
−フェロセンは、直接又は間接に、第１の連結基を介して少なくとも前記モノマーのピロール環に結合している；第１の連結基は、−ＣＯＮＨ−ＣＨ２−基であることが有利である。
【００４８】
プローブの構造に関わらず、フェロセンは、直接又は間接に、第２の連結基を介して、プローブポリヌクレオチドに結合している。第２の連結基は、好ましくは−ＣＯ−基からなる。
【００４９】
さらに、プローブポリヌクレオチドは、少なくともモノマーのピロール環に、及び／又はフェロセンに、各々第３及び／又は第２の連結基を介して、及びプローブポリヌクレオチドの少なくとも一のアミノ官能基を介して、結合している。
【００５０】
本発明のプローブの有利な構造によれば、前記第１及び／又は第２及び／又は第３の連結基が、結合腕を介して、間接的に、フェロセンをピロール環に、プローブポリヌクレオチドをピロール環に、プローブポリヌクレオチドをピロール環に連結するものである。
【００５１】
この結合腕は、好ましくは、少なくとも二の炭素、好ましくは少なくとも２又は３の炭素原子を有する飽和炭化水素鎖である。
【００５２】
本発明の修飾ポリピロールは、ホモポリマー又はコポリマーとすることができる。ピロール環は、３位の炭素において、置換されており、したがって、本発明のいかなるコポリマーも少なくとも２のモノマーを有していて、そのうちの少なくとも一つは、前記位置で置換されてないものであろう。あるいは、それは、少なくとも、前記位置で異なって置換されている２つのモノマーを有しており、ＰＮｐｒｏｂｅ置換基が異なるか、及び／又は、ＰＮｐｒｏｂｅとＦｅ置換基の組み合わせが、モノマーのピロール環で異なるか、及び／又は第１及び／又は第２及び／又は第３の連結基及び／又は結合腕が異なるものであろう。本発明の修飾モノマーに加えて、コポリマーは、そのピロール環が−ＣＨ２−ＣＯＯＨ又はＣＨ２−ＣＨ２ＯＨ基で置換されている、少なくとも一のモノマーを含むことができる。
【００５３】
ポリマーのすべてのモノマーが同様に修飾されているとき、本発明のホモポリマーポリピロールを得る。
【００５４】
本発明は、本発明のプローブを調製する方法にも関する。
【００５５】
ポリピロールの修飾モノマーがすべて、Ｐ−ＰＮｐｒｏｂｅ−Ｆｅ構造を有しているとき、方法は、以下の工程を含むものである。
（ａ）各々ピロール環からなる少なくとも二のモノマーから形成されるホモポリマー又はコポリマーポリピロールを得る工程、ここで前記ピロール環は３位の炭素において、プローブポリヌクレオチドで置換されている；
（ｂ）一のシクロペンタジエン環の１位の炭素において、少なくとも一の活性化された又は活性化され得る基を有するフェロセンを得る工程
（ｃ）プローブポリヌクレオチドで置換された前記ホモポリマー又はコポリマーポリピロールを、前記活性化された又は活性化され得る基を有するフェロセンと接触させる工程。
【００５６】
ポリピロールの修飾モノマーがすべて、Ｐ−ＦｅＰＮｐｒｏｂｅ構造を有しているとき、方法は、以下の工程を含むものである。
（ａ）少なくとも二の活性化された又は活性化され得る基を有するフェロセンを得る工程、ここで少なくとも一の基は、一のシクロペンタジエン環の１位の炭素に結合しており、他方の基は、フェロセンの他のシクロペンタジエン環の１’位の炭素に結合しているものである；
（ｂ）活性化された又は活性化され得る基で３位の炭素において置換されたピロール環からなるモノマーを得る工程；
（ｃ）活性化された又は活性化され得る基を有する過剰のフェロセンを、置換されたモノマーと反応させる工程；
（ｄ）（ｃ）で得られた化合物の電気重合を行なう工程；及び
（ｅ）工程（ｄ）で得られたポリマーをプローブポリヌクレオチドと接触させる工程。
【００５７】
本発明のプローブ調製方法は、さらに以下の特性を有することが有利である；
−前記フェロセンの活性化された又は活性化され得る基が、同一又は異なっていてもよく、好ましくは活性化された又は活性化され得るエステル基であり、好ましくは−ＣＯ−［Ｎ−ヒドロキシフタルイミド］基である；それらは結合腕を介してフェロセンに結合していることが有利である；
−ピロール環の活性化された基が、−ＣＨ２−ＮＨ２である；
−ピロール環の活性化された又は活性化され得る基が、ピロール環に結合腕を介して結合している；
−好ましい結合腕は、少なくとも二の炭素原子、好ましくは少なくとも２又は３の炭素原子を有する飽和炭化水素鎖である。
【００５８】
電気重合工程は、当業者によく知られた技術を用いて行なわれる。例えば、モノマーを、酸化及び還元により重合が続いておこるのに十分な電位変動に供することにより行なうことができる。あるいは、強制電流（クロノポテンシオメトリ）下で、又は強制電位（クロノアメトリ）下で、重合により行なうことができる。
【００５９】
本発明の別の主題は、中間体産物としてのリガンド／フェロセン化合物であって、直接又は間接的に、フェロセン、キノン、又はこれらの誘導体類などの電子供与基に連結したリガンドからなる。特に、この化合物は、本発明のＰ−ＰＮｐｒｏｂｅ−Ｆｅプローブを調製するための方法における本発明のプローブの調製における中間体としてのポリヌクレオチド／フェロセン化合物である。それは、好ましくは−ＣＯ−基である第２の連結基を介して、フェロセンの一のシクロペンタジエン環の１位の炭素に結合したポリヌクレオチドからなる。
【００６０】
この第２の連結基は、フェロセンとプローブポリヌクレオチドを、結合腕を介して間接的に、連結することができ、この結合腕は、有利には少なくとも二の炭素原子、好ましくは少なくとも２又は３の炭素原子を有する飽和炭化水素鎖からなる。
【００６１】
本発明のプローブは、診断への応用がある。かくして、本発明は、前記プローブが、適当なハイブリダイゼーション条件下で接触すること、及び接触前のプローブと接触後のプローブの間の、電位差又は電流の変動を示すか又は定量することを特徴とする、生物的試料中のターゲットポリヌクレオチドの検出方法にも関する。
【００６２】
本発明は、生物的試料中のターゲットポリヌクレオチドを検出するためのプローブの使用にも関するものであり、この使用においては、前記プローブを、適当なハイブリダイゼーション条件下で接触させ、接触前のプローブと接触後のプローブの間の、電位差又は電流の変動を示すか又は定量するものである。
【００６３】
本発明の主題は、表面の全て又は一部が前記プローブで被覆された電極にも関する。そのような電極は、当業者に知られているいかなる従来の技術を用いても、得ることができる。例えば、この調製は、白金、金、金で被覆されたクロム又はチタン、ガラス炭素、又は、酸化チタン又は酸化インジウム−スズ混合物などの導電性酸化物から作製された電極の表面上に、本発明のポリピロールを析出させることにより行なうことができる。
【００６４】
本発明は、リガンドと相互作用することができるアンチリガンドが結合する電気活性ポリマーの電気活性を増加させるための、電子供与基の使用にも関するもので、この電子供与基はアンチリガンドと同じモノマーに存在するものである。
【００６５】
【実施例】
本発明の種々の主題を、添付した図１乃至１５を参照しながら以下の実施例で示す。これらにより好適で有利な態様が明らかになるであろう。
【００６６】
実施例１：Ｐ−ＰＮｐｒｏｂｅ−Ｆｅ構造を有するモノマーと、−ＣＨ２−ＣＯＯＨ基で置換されたモノマーとからなるコポリマーポリピロールの調製
この構造体の作製は、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（ＮＨＰ）基で置換されたフェロセンの合成、プローブポリヌクレオチドのポリピロールへの結合、ついで得られた活性化されたフェロセンの、ポリピロールに結合したプローブポリヌクレオチドへの結合を必要とする。
【００６７】
１Ａ 活性化されたフェロセン：１−フェロセン−プロピル−ＮＨＰの形成
合成のスキームは以下の通りであった。
【００６８】
【化１】
こうして得られた１−フェロセン−プロピル−ＮＨＰの電気化学的反応を分析することにより、０．３Ｖ／ＳＣＥの電位で可逆性の電気化学系が示された。ＮＨＰ基で直接置換されたフェロセンの反応と比較して、この反応は、約２００ｍＶの電位で増加を示した。
【００７０】
１Ｂ−コポリマーポリピロール［ＰｙＣＯＯＨ，ＰｙＣＯＮＨ−ＮＨＰ］へのプローブポリヌクレオチドの結合
この工程は、ＷＯ−Ａ−９５／２９１９９公報に記載したものと同じ条件下で、その３’と５’末端がアミノ基により官能化された（一方の基が活性化されたポリピロールポリマーへの結合のため、他方が活性化されたフェロセンの結合のためである）プローブポリヌクレオチドを用いて、行なった。
【００７１】
１Ｃ コポリマーポリピロール ポリ［ＰｙＣＯＯＨ，Ｐｙ−ＰＮｐｒｏｂｅ］へのプローブポリヌクレオチドの結合
ポリ［ＰｙＣＯＯＨ，Ｐｙ−ＰＮｐｒｏｂｅ］電極を、１Ａで得られた１−フェロセン−プロピル−ＮＨＰを含む溶液に、室温で１時間浸漬することにより、ＰＮｐｒｏｂｅのグラフト化を行なった。ついで電極を洗浄し、０．５ＭのＮａＣｌ溶液中で電気化学的に分析した。
【００７２】
図１に示した反応（実線：Ｆｅ−（ＣＨ３）ＮＨＰ；点線：Ｆｅ−ＮＨＰ）は、ＰＮｐｒｏｂｅのグラフト化の後の、ＰＮｐｒｏｂｅにおいて置換されたフェロセンに特徴的な水性媒体中０．３５Ｖ／ＳＣＥの電位での、電気化学的シグナル出現により特徴付けられる。酸化の間に交換した電化の測定は、電気活性フェロセン部位の存在を示す。この測定は、ＰＮｐｒｏｂｅに結合したフェロセンの合計量の測定を可能にする。
【００７３】
実施例２：ターゲットポリヌクレオチド（ＰＮｔａｒｇｅｔ）にハイブリダイズするための実施例１で得られたポリピロールの使用
ハイブリダイゼーションは、実施例１で得られたポリピロールで覆われた電極を、１時間、３７℃、２５ｎｍｏｌのＰＮｔａｒｇｅｔの存在下でＰＥＧバッファー中に置くことにより行なった。電極は、ついで洗浄し、サイクリックボルタンメトリーにより分析した。
【００７４】
図２（実線：ハイブリダイゼーション前；点線；ハイブリダイゼーション後）に示された電気化学反応は、ハイブリダイゼーションの後のフェロセンからのシグナルの電気活性の大幅な減少を示す。電流は、７０μＡ減少する。この大幅な減少は、フェロセンのＰＮｔａｒｇｅｔハイブリダイゼーションに対する感度が高いことを示す。
【００７５】
このポリピロールを最適化するために、ＰＮｐｒｏｂｅへのグラフト化のための単一の部位を規定して、グラフト化されたフェロセンの位置と量を制御し、その結果を完全に再現性のあるものにすることが必要である。この最適化は実施例３の主題を構成する。
【００７６】
実施例３：Ｐ−Ｆｅ−ＰＮｐｒｏｂｅ構造を有するモノマーからなるコポリマーポリピロールの調製
この調製は、脱離基を有するフェロセンによるポリピロールの官能化からなる。ＰＮｐｒｏｂｅは、一方が［ＰｙＮＨ−Ｆｅ−ＮＨＰ］ホモポリマーに、他方が［ＰｙＮＨ−Ｆｅ−ＮＨＰ−ＰｙＣＯＯＨ］コポリマーに結合する。
【００７７】
ＰＮｐｒｏｂｅは、ＰＮｔａｒｇｅｔに対する認識特性を有しており、ＰＮｐｒｏｂｅがフェロセンに結合した後もこの認識が保持されているかをチェックし、そしてこの認識に対するフェロセンの電気化学反応の性質を調べた。
【００７８】
最初に、３位において、活性化エステル基を有するフェロセンで置換されたピロールモノマーを合成した。ついで得られたモノマーの重合を、電気化学的に行ない、ＰＮｐｒｏｂｅを、得られたポリマーにグラフト化した。
【００７９】
３Ａ ３−ピロール−フェロセン−ＮＨＰモノマーの合成
フェロセンとＮＨＰ基の両方を有するピロールの作製は数回の合成工程を必要とした。第１は、アミノブチル基で置換されたピロール、すなわち（４−アミノブチル）−３−ピロールの合成であり、第２の工程は、１，１’−ジプロパノアート−Ｎ−ヒドロキシフタルイミド−フェロセンの合成、第３の工程は３−ピロール−フェロセン−ＮＨＰの合成であった。
【００８０】
（４−アミノブチル）−３−ピロールの合成
【化２】
（４−アミノブチル）−３−ピロールは、ピロールを、縮合反応によって活性化エステル基により官能化させることができるアミノ官能基によって、合成した。このモノマーを合成するために、トシルピロールにおいてアシル化反応を行なって、（３−ブロモプロピオニル）−３−トシルピロールを、収率６３％で得た。この反応の後、カルボニル官能基の還元を行なった。（３−ブロモプロピル）−１−トシルピロールを収率７８％で得た。シアン化ナトリウムを用いて、臭素をシアン化官能基で、収率５０％で置換した。シアン化物のアミンへの転換は、リチウムアンモニウムヒドリドを用いた還元反応で行なった（収率７７％）。ＮａＯＨ塩基によるトシル基の加水分解により、（４−アミノブチル）−３−ピロールを、収率６２％で得た。
【００８２】
１，１’−フェロセン−プロピル−ＮＨＰ
合成スキームは以下の通りであった。
【００８３】
【化３】
このフェロセンは、水酸化ナトリウムとメタノールの存在下で、１，１’−（シアノプロピル）フェロセンの、１，１’−（プロピル）フェロセン酸への転換により、収率９５％で得た。フェロセンのカルボキシル基を脱離基、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（ＮＨＰ）で置換した。ＮＨＰフェロセンをフェロセン酸から、ＤＣＣ存在下でエステル化により得た。ＤＣＣは、脱水剤として作用して、ＤＣＵに転換され、こうして反応の間形成された水を捕捉した。
【００８５】
３−ピロール−フェロセン−ＮＨＰの合成
合成スキームは以下の通りであった。
【００８６】
【化４】
フェロセンの２つのＮＨＰ基においてピロール置換を避けるためにフェロセンの大過剰の条件下で、アセトニトリル中で、３−ピロール−ブチルアミンと１，１’−フェロセン−プロピル−ＮＨＰとの間の結合反応により、３−ピロール−フェロセン−ＮＨＰを得た。
【００８８】
モノマーの電気化学的特徴づけ
０．１Ｍ のＬｉＣｌＯ４支持体電極の存在下で、アセトニトリル中の溶液中で、電気化学的にモノマーを分析した。
【００８９】
図３は、得られたボルタモグラムを示す。２つの酸化−還元系を見ることができる。第１の系は、可逆特性を有し、その酸化電位は０．２６Ｖである。この系は、ピロールにおいて置換されたフェロセンの酸化−還元に相当する。第２の電気化学的系は、不可逆性であり、その酸化電位は、１．１７Ｖ／ＳＣＥである；それはピロールの酸化に相当する。
【００９０】
フェロセン基で置換されたピロールのこの酸化電位は、非置換ピロール又はカルボキシル基で置換されたピロールの酸化電位に、匹敵しており、一般的に約０．８乃至０．９Ｖ／ＳＣＥである。
【００９１】
３Ｂ ポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰ］ホモポリマーの調製
重合スキームは以下の通りであった。
【００９２】
【化５】
０．２Ｍテトラブチルアンモニウムテトラフルオロボラート（Ｎ＋Ｂｕ２ＢＦ４）を含むアセトニトリル媒体中の、モノマーポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰ］の溶液中に、白金電極を浸漬することにより、ポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰ］膜を得た。１．１Ｖ／ＳＣＥに制御された電位において、モノマーの酸化電位に基づいて、電気重合を行なった。デポジットされた電荷は、７０ｍＣであった。
【００９４】
重合の後、溶液中に沈澱が形成された。これはおそらく短鎖オリゴマーの形成のためであろう。
【００９５】
ポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰ］ホモポリマーの電気化学的特徴づけ
得られたポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰ，ＰｙＣＯＯＨ］ホモポリマーの膜を、０．１ＭのＬｉＣｌＯ４の存在下で、アセトニトリル媒体中で、電気化学的に分析した。図４は、得られたボルタモグラムを示す。このボルタモグラムは、ポリマー膜の高い電気活性を示す。酸化電位は２８８ｍＶ／ＳＣＥであり、還元電位は２３６ｍＶ／ＳＣＥである。これらの２つの値の差異と酸化ピーク電流（１３．５μＡ）の還元ピーク電流（１１μＡ）に対する比は、この電気化学的系が良好な可逆性を示すことを表している。酸化又は還元の間に交換した電荷は、０．１ｍＣである。この値は、重合の間にデポジットされた電荷にあまり匹敵していない。酸化電荷から、電極にデポジットされた電気活性フェロセンの量を決定することが可能である。その酸化プロセスの間に、フェロセンが一の電子を交換することから、ファラデーの法則を確立することができる：
ＱＯＸ＝Ｎ（Ｆｅ）＊Ｆ
【００９６】
電極上のフェロセンの、又は電気活性ピロール単位のモル数は、１０−９モルであった。
【００９７】
重合電荷からフェロセンのモル数を計算すると、約１０−７モルの非常に高い値を得る。
【００９８】
しかしながら、これらの結果は、重合収率が、非常に低いことを示す。２つの因子が、この低い収率の原因である：一方は、重合電荷のある部分が、溶液中でフェロセンを酸化するために機能することである。他方は、ピロールにおいて、置換されたフェロセン−ＮＨＰ基の立体障害が、これらの２つのピロール単位の間の結合を防止して、溶液中に沈澱する短鎖オリゴマーをもたらすことである。
【００９９】
３Ｃ ホモポリマーへのＰＮｐｒｏｂｅの結合
結合スキームは以下の通りであった。
【０１００】
【化６】
用いられたＰＮｐｒｏｂｅは、ＳＥＱＩＤＮｏ．１として示される、以下の配列を有する２５対の塩基を有する、ポリヌクレオチドであった。
５’ＴＣＡ−ＡＴＣ−ＴＣＧ−ＧＧＡ−ＡＴＣ−ＴＣＡ−ＡＴＧ−ＴＴＡ−Ｇ３’
【０１０２】
ＰＮｐｒｏｂｅは、ポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰ］前駆体ホモポリマーに結合した。この置換の化学的条件は、ポリ［ＰｙＣＣＮＨ−ＮＨＰ］ポリマーへの結合の条件と同様であった。
【０１０３】
アミノ基をその５’位に有するＰＮｐｒｏｂｅとピロール−Ｆｅ−ＮＨＰとの間の結合は、２５μｍｏｌ／ｌ酢酸塩バッファーが１０％存在するアセトニトリル溶液中に電極を浸漬することにより達成された。反応は室温で２時間行われた。
【０１０４】
得られた膜を、サイクリックボルタンメトリにより０．５ＭのＮａＣｌが存在する水中で分析した。図５は、酸化−還元系を示すもので、酸化と還元のピークが各々、２７３ｍＶと２５８ｍＶに存在している。
【０１０５】
水性媒体中のフェロセンの電気化学系は、アセトニトリルでの膜の分析ほど可逆性ではない。この電気活性の損失はおそらく、ドーピングイオンの、又は水中のポリマーマトリックスの溶媒和の問題のためであろう。
【０１０６】
実施例４：実施例３で得られたポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＰＮｐｒｏｂｅ］ホモポリマーにおけるＰＮｔａｒｇｅｔのハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションのスキームは以下の通りであった。
【０１０７】
【化７】
［Ｐｙ−Ｆｅ−ＰＮｐｒｏｂｅ］コポリマーの膜を、生物的バッファー中２５ｎｍｏｌ（２５μｍｏｌ／ｌ）のＰＮｔａｒｇｅｔの存在下で、３時間、３７℃の温度で、１ｍｌの容量でインキュベートした。
【０１０９】
ＰＮｔａｒｇｅｔは、ＰＮｐｒｏｂｅの塩基と２５対の相補を有し、ＳＥＱＩＤＮｏ．２と称する以下の配列を有する：
５’ＣＴＡ−ＡＣＡ−ＴＴＧ−ＡＧＡ−ＴＴＣ−ＣＣＧ−ＡＧＡ−ＴＴＧ−Ａ３’
【０１１０】
サケＤＮＡをハイブリダイゼーションバッファー中で、他の電極をインキュベートすることによりブランクテストを行ない、非特異的相互作用の影響を測定した。
【０１１１】
電気化学的特徴づけ
ポリマーの電気化学的反応を、０．５ＭのＮａＣｌが存在する水性媒体中のサイクリックボルタンメトリにより分析した。
【０１１２】
ブランクテスト電極
図６のボルタモグラム（実線：ハイブリダイゼーション前；点線：ハイブリダイゼーション後）は、ＰＥＧバッファーの存在下でインキュベートされた対照の電極の電気化学的反応を示す。
【０１１３】
対照電極としての電極が、酸化電位の変動と電気活性の減少を示すことがわかる。このことは、非特異的な相互作用が、フェロセンの電気化学反応にわずかな効果を有することを示す。
【０１１４】
ハイブリダイゼーションの後にテストされたポリマー
水性媒体中のＰＮｔａｒｇｅｔの存在下でインキュベートされた電極の電気化学分析を図７に示す（実線：ハイブリダイゼーション前；点線：ハイブリダイゼーション後）。
【０１１５】
インキュベーション後の電極が、高い電位に対する酸化電位におけるシフト、及び電気活性の減少を示す。酸化の間に交換された電荷は、同じく減少した還元のものである。
【０１１６】
フェロセンの電気化学反応における変動がブランク電極を上回ることもわかる。
【０１１７】
実施例５：Ｐ−Ｆｅ−ＮＨＰ構造を有するモノマーと、−ＣＨ２−ＣＯＯＨ基で置換されたモノマーからなるコポリマーポリピロールの調製
５Ａ ポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰ， ＰｙＣＯＯＨ］ポリマーの調製
合成のスキームは以下の通りであった。
【０１１８】
【化８】
３−ピロール酢酸（ＰｙＣＯＯＨ）と３−ピロール−Ｆｅ−ＮＨＰ（Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰ）との間の共重合は、この嵩高いモノマーをポリマーマトリックス中で希釈して、立体性で誘導される摂動を最小化することを可能にした。さらに、３−ピロール酢酸との共重合は、膜の多孔性を増加することを可能にした。
【０１２０】
ＰｙＣＯＯＨとＰｙ−Ｆｅ−ＮＨＰモノマーの各濃度の選択は、これらの２つのモノマーの重合電位を参照することにより決定した。ＰｙＣＯＯＨは、０．９Ｖ／ＳＣＥで酸化するが、Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰは１．１Ｖ／ＳＣＥで酸化する。Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰよりも、ＰｙＣＯＯＨの濃度が低いことが必要であった。したがってコポリマーの電気重合に用いられたこれらの２つのモノマーの濃度は、ＰｙＣＯＯＨの場合０．０２Ｍ、Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰの場合０．０８Ｍであった。
【０１２１】
コポリマーは、０．２ＭのＬｉＣｌ２の存在下で、プロピレンカーボナート媒体中で７００ｃｍ２の面積を有する白金電極上に、１．１Ｖ／ＳＣＥの強制電位で析出した。電気重合の間にデポジットされた電荷は、３５ｍＣであった。電気重合の間に測定された電荷のうちの一部を用いて、溶液中のフェロセンを酸化したので、重合電荷から膜の厚みを測定することが困難であった。
【０１２２】
得られたポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰ， ＰｙＣＯＯＨ］ポリマーの電気化学的特徴づけ
この特徴づけは、０．１ＭのＬｉＣｌＯ４の存在下のアセトニトリル媒体中で行なった。図８のボルタモグラムは、２５４ｍＶの電位において酸化ピークを、２３４ｍＶの電位で対称的還元ピークを有する可逆的電気化学系を示す。半分の高さの幅は、１５０ｍＶである。この電気化学反応は、フェロセンからのシグナルを表しており、この電気化学的プローブが高い電気活性を有することを示す。ポリマーのコンジュゲート鎖に沿った電子移動は、非常に広範囲であって、これはポリピロールが導電性であることを示す。フェロセンの酸化の間に交換された電荷は、約０．１５ｍＣであった。このフェロセン酸化電荷により、すべてのフェロセン部位が電気活性であると仮定すると、ポリマー中にフェロセン基を有するピロールのモル数を計算することができる。
【０１２３】
ファラデーの法則から、
ＱＯＸ＝Ｎ＊Ｆ
ここで、Ｎは、フェロセンのモル数であり、Ｆはファラデー定数である。
【０１２４】
電気活性フェロセンのモル数は約１０−９モルである。
【０１２５】
５Ｂ プローブポリヌクレオチドの、ポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰ，ＰｙＣＯＯＨ］コポリマーポリピロールへの結合
結合スキームは以下の通りであった。
【０１２６】
【化９】
用いられたＰＮｐｒｏｂｅは、ポリヌクレオチドＳＥＱＩＤＮｏ．１であった。
【０１２８】
１０％の酢酸塩バッファーの存在下でアセトニトリル溶液中で電極を浸漬することにより、ポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＮＨＰ，ＰｙＣＯＯＨ］前駆体コポリマーにＰＮｐｒｏｂｅ（２５μｍｏｌ／ｌ）を結合させた。
【０１２９】
得られたポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＰＮｐｒｏｂｅ，ＰｙＣＯＯＨ］ポリマーの電気化学的特徴づけ
図９は、０．５ＭのＮａＣｌの存在下で、水性媒体中にＰＮｐｒｏｂｅをグラフト化した後の、電極の電気化学的反応を示す。ボルタモグラムは、強くて細い酸化ピークと広い還元ピークによって特徴付けられる酸化還元系を示す。
【０１３０】
酸化と還元ピークの電位は、各々、３４１ｍＶと２７５ｍＶであり、半分の高さの幅は、酸化ピークが１００ｍＶ、還元ピークが２００ｍＶである。酸化又は還元の間に交換された電荷は、約０．１ｍＣであった。
【０１３１】
実施例６：実施例５で得られたポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＰＮｐｒｏｂｅ，ＰｙＣＯＯＨ］コポリマー上のＰＮｔａｒｇｅｔのハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションのスキームは以下の通りであった。
【０１３２】
【化１０】
ポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＰＮｐｒｏｂｅ，ＰｙＣＯＯＨ］コポリマーの膜を、前記と同じ条件下で、２５塩基からなるＰＮｔａｒｇｅｔの存在下で、インキュベートした。
【０１３４】
対照の電極を、ＰＮｔａｒｇｅｔを含まない同じ生物的バッファー中でインキュベートした。
【０１３５】
電気化学的特徴づけ
ターゲットと非ターゲットの存在下でインキュベートされた電極の電気化学的反応を、アセトニトリル媒体中と水性媒体中で、分析した。
【０１３６】
ブランクテスト電極
図１０及び１１は、アセトニトリル媒体と水性媒体中での非ターゲット（サケＤＮＡ）の存在下でのハイブリダイゼーション前（実線）と後（点線）のボルタモグラムを示す。
【０１３７】
アセトニトリル媒体において、フェロセンの電気化学的反応が、酸化電位が安定で、ピーク電流の変動がごくわずかであることを示すことがわかる。
【０１３８】
０．５ＭのＮａＣｌの存在下の、水性媒体中の対照電極の電気化学的反応の分析は、フェロセンの電気化学的反応における変動−酸化電位の増加とピーク電流の減少を示す。
【０１３９】
ハイブリダイゼーションの後にテストされたポリマー
水性媒体中のターゲットの存在下でインキュベートされた電極の電気化学分析を図１２に示す（実線：ハイブリダイゼーション前；点線：ハイブリダイゼーション後）。ボルタモグラムは、ハイブリダイゼーション後の電気化学的シグナルにおける大きな変動を示す。酸化電位は、より高い電位方向へシフトしていて、ハイブリダイゼーション後には、３４０ｍＶから３８７ｍＶに移っている。酸化電流は６０％減少している。酸化の間の交換された電荷は２５％減少している。
【０１４０】
０．１ｎｍｏｌのＰＮｔａｒｇｅｔの存在下でインキュベートされた電極のアセトニトリル中の電気化学的反応の分析を、図１３に示す（実線：ハイブリダイゼーション前；点線：ハイブリダイゼーション後）。インキュベーション後のボルタモグラムは、有機媒体中のフェロセンの可逆的系が保持されていることを示す。フェロセンの酸化と還元電位は低い電位の方向にシフトしている。
【０１４１】
水性媒体中と有機媒体中の電気化学的反応におけるこの変動は、フェロセンにグラフト化されたＰＮｐｒｏｂｅと、ＰＮｔａｒｇｅｔとの間に選択的で特異的なハイブリダイゼーションが存在することを表す。
【０１４２】
ターゲットの存在下でインキュベートされたこれらの電極は、電気化学的反応において大きな変動を示したが、ターゲットを含まない生物的バッファー中のインキュベーション後のフェロセンの反応における変動の起源を決定することが必要である。
【０１４３】
実施例６：電気活性に対する、重合電荷の影響
実施例５のポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＰＮｐｒｏｂｅ，ＰｙＣＯＯＨ］から重合の間にデポジットされた電荷の影響を、３つの電荷値、５，１０，１５ｍＣについて調べた。
【０１４４】
図１４は、酸化電流はデポジットされた電荷の量に伴い減少することを示す。
【０１４５】
実施例７：電極の電気化学的再現性
ポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＰＮｐｒｏｂｅ，ＰｙＣＯＯＨ］の電気化学的再現性を、６つの薄膜電極でテストした。
【０１４６】
０．１ＭのＬｉＣｌＣＯ４の存在下で、アセトニトリル媒体中で行なわれた、これらの電極の電気化学的特徴づけを図１５に示す。この図は、６つの電極について、ＰＮｐｒｏｂｅがグラフト化された後に、実質的に同じボルタモグラムが得られることを示す。
【０１４７】
実施例８：ＰＮｐｒｏｂｅに対する、ＰＮｔａｒｇｅｔハイブリダイゼーション条件の影響８Ａ ハイブリダイゼーションバッファーの効果
実施例５と同じポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＰＮｐｒｏｂｅ，ＰｙＣＯＯＨ］（Ｑ＝５ｍＣ）電極を２つの異なるバッファー中でインキュベートした：
−２時間及び３時間、３７℃のＴＥ−ＮａＣｌバッファー
−２時間及び３時間、３７℃、ＳＳＰＥＧバッファー。
【０１４８】
各々、インキュベーションの前と後で、それぞれ上記バッファーで、０．１ＭのＬｉＣｌＯ４の存在下でアセトニトリル媒体で行なわれた電気化学的特徴づけ（ボルタモグラムは示さず）は、電極がより安定であるというＳＳＰＥＧバッファーの利点を示す。
【０１４９】
８Ｂ ＰＮｔａｒｇｅｔ濃度の効果
いくつかのポリ［Ｐｙ−Ｆｅ−ＰＮｐｒｏｂｅ、ＰｙＣＯＯＨ］膜を、種々のＰＮｔａｒｇｅｔ濃度（０．０１、０．０５及び０．５ｎｍｏｌ／ｌ）の存在下で、ＳＳＰＥＧバッファーでインキュベートした。
【０１５０】
各々、ハイブリダイゼーションの前と後の、上述の種々の濃度の存在下、０．１ＭのＬｉＣｌＯ４の存在におけるアセトニトリル媒体中の電気化学的特徴づけ（ボルタモグラムは示さない）は、ハイブリダイゼーションの前と後の電気化学的反応における変動が、ＰＮｔａｒｇｅｔ濃度に伴い増加することを示す。これは、初期ピークの電位に相当する２８０ｍＶ／ＳＣＥの電位で、電流の増加がＰＮｔａｒｇｅｔ濃度に伴い変化することが観察されたためである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１に示した反応（実線：Ｆｅ−（ＣＨ３）ＮＨＰ；点線：Ｆｅ−ＮＨＰ）は、ＰＮｐｒｏｂｅのグラフト化の後の、ＰＮｐｒｏｂｅにおいて置換されたフェロセンに特徴的な水性媒体中０．３５Ｖ／ＳＣＥの電位での、電気化学的シグナル出現により特徴付けられる。
【図２】図２（実線：ハイブリダイゼーション前；点線；ハイブリダイゼーション後）に示された電気化学反応は、ハイブリダイゼーションの後のフェロセンからのシグナルの電気活性の大幅な減少を示す。
【図３】図３は、得られたボルタモグラムを示す。
【図４】図４は、得られたボルタモグラムを示す。
【図５】図５は、酸化−還元系を示す。
【図６】図６のボルタモグラム（実線：ハイブリダイゼーション前；点線：ハイブリダイゼーション後）は、ＰＥＧバッファーの存在下でインキュベートされた対照の電極の電気化学的反応を示す。
【図７】水性媒体中のＰＮｐｒｏｂｅの存在下でインキュベートされた電極の電気化学分析を図７に示す（実線：ハイブリダイゼーション前；点線：ハイブリダイゼーション後）。
【図８】図８のボルタモグラムは、２５４ｍＶの電位において酸化ピークを、２３４ｍＶの電位で対称的還元ピークを有する可逆的電気化学系を示す。
【図９】図９は、０．５ＭのＮａＣｌの存在下で、水性媒体中にＰＮｐｒｏｂｅをグラフト化した後の、電極の電気化学的反応を示す。
【図１０】アセトニトリル媒体と水性媒体中での非ターゲットの存在下でのハイブリダイゼーション前（実線）と後（点線）のボルタモグラムを示す。
【図１１】アセトニトリル媒体と水性媒体中での非ターゲットの存在下でのハイブリダイゼーション前（実線）と後（点線）のボルタモグラムを示す。
【図１２】水性媒体中のターゲットの存在下でインキュベートされた電極の電気化学分析を図１２に示す（実線：ハイブリダイゼーション前；点線：ハイブリダイゼーション後）。
【図１３】０．１ｎｍｏｌのＰＮｔａｒｇｅｔの存在下でインキュベートされた電極のアセトニトリル中の電気化学的反応の分析を、図１３に示す（実線：ハイブリダイゼーション前；点線：ハイブリダイゼーション後）。
【図１４】図１４は、酸化電流はデポジットされた電荷の量で減少することを示す。
【図１５】０．１ＭのＬｉＣｌＣＯ４の存在下で、アセトニトリル媒体中で行なわれた、電極の電気化学的特徴づけを図１５に示す。
Claims (70)
- 少なくとも二のモノマーのホモポリマー又はコポリマーの電気活性ポリマー、アンチリガンド、及び前記アンチリガンドと特異的に相互作用したリガンドからなる電気活性複合体において、前記アンチリガンドは、直接又は間接的に、電気活性ポリマーと連結しており、さらに、前記電気活性複合体は、前記アンチリガンドに直接又は間接に連結した少なくとも一の電子供与基を含むことを特徴とする、電気活性複合体。
- 前記電気活性ポリマーが、ポリピロール、ポリアセチレン、ポリアジン、ポリ（ｐ−フェニレン）、ポリ（ｐ−フェニレンビニレン）、ポリピレン、ポリチオフェン、ポリフラン、ポリセレノフェン、ポリピリダジン、ポリカルバゾール、ポリアニリン及び二重鎖ポリヌクレオチドから選ばれることを特徴とする、請求項１記載の複合体。
- 前記電子供与基がフェロセン、キノンおよびこれらの誘導体から選ばれることを特徴とする、請求項１記載の複合体。
- 前記リガンドと前記アンチリガンドが、特に、ポリヌクレオチド及びポリペプチドから選ばれる生物的分子であることを特徴とする、請求項１記載の複合体。
- 前記リガンド及び／又はアンチリガンドが、直接又は間接的に、シグナルを発生することができるトレーサーにより標識されていることを特徴とする、請求項４記載の複合体。
- 前記電子供与基が、直接又は間接的に、アンチリガンドと相互作用したリガンドに連結し、前記アンチリガンドが、直接又は間接的に、電気活性ポリマーに連結していることを特徴とする、請求項１記載の複合体。
- 前記アンチリガンド又はリガンドが、第２の連結基を介して、前記電子供与基に共有結合で連結していることを特徴とする、請求項６記載の複合体。
- 前記アンチリガンド又はリガンドが、第３の連結基を介して、前記電気活性ポリマーに共有結合で連結していることを特徴とする、請求項１記載の複合体。
- 第１及び／又は第２及び／又は第３の連結基が、各々、前記電子供与基を前記アンチリガンドに、前記アンチリガンドを前記電気活性ポリマーに、結合腕を介して、連結するものであることを特徴とする、請求項７又は８に記載の複合体。
- 前記電子供与基が、不活性又は生物的支持体を介して前記リガンドに連結されていることを特徴とする、請求項６記載の複合体。
- 前記不活性支持体が、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ又はガラスビーズであることを特徴とする、請求項１０記載の複合体。
- 前記生物的支持体が、前記電子供与基が内在化された細胞であることを特徴とする、請求項１０記載の複合体。
- 前記電気活性ポリマーが、各々ピロール環からなる少なくとも二のモノマーから形成されるポリピロールであり、かつ前記電気供与基がフェロセンであることを特徴とする、請求項１記載の複合体。
- 前記アンチリガンドがプローブポリヌクレオチドであり、前記リガンドがターゲットポリヌクレオチドであって少なくとも一部が前記アンチリガンドにハイブリダイズしているものであることを特徴とする、請求項１３記載の複合体。
- 前記プローブポリヌクレオチドが、少なくとも、前記フェロセンと、前記モノマーのピロール環に結合していることを特徴とする、請求項１４記載の複合体。
- 前記ピロール環が、３位の炭素において置換されていることを特徴とする、請求項１３記載の複合体。
- 前記プローブポリヌクレオチドが、前記フェロセンの一のシクロペンタジエン環の１位の炭素に結合していることを特徴とする、請求項１５記載の複合体。
- 前記ポリピロールがコポリマーであり、該コポリマーに含まれるモノマーは、そのピロール環が、−ＣＨ２−ＣＯＯＨ又は−ＣＨ２−ＣＨ２ＯＨ基で置換されているものであることを特徴とする、請求項１３記載の複合体。
- 前記フェロセンと前記プローブポリヌクレオチド又はターゲットポリヌクレオチドとの間の前記第２の連結基が、−ＣＯ−基であることを特徴とする、請求項１５記載の複合体。
- 前記プローブポリヌクレオチド又はターゲットポリヌクレオチドと前記ピロール環との間の第３の連結基が、−ＣＨ２−ＣＯ−基であることを特徴とする、請求項１５記載の複合体。
- 前記第１及び／又は第２及び／又は第３の連結基が、結合腕を介して、間接的に、前記フェロセンを前記プローブポリヌクレオチド又はターゲットポリヌクレオチドに、前記ピロール環を前記プローブポリヌクレオチド又はターゲットポリヌクレオチドに連結するものであることを特徴とする、請求項１９又は２０記載の複合体。
- 前記結合腕が、少なくとも二の炭素原子、好ましくは少なくとも２又は３の炭素原子を有する飽和炭化水素鎖であることを特徴とする、請求項２１記載の複合体。
- 前記プローブポリヌクレオチド又はターゲットポリヌクレオチドが、前記フェロセン及び／又は前記モノマーのピロール環に、少なくとも、各々、前記第２及び／又は第３の連結基を介して、及び前記プローブポリヌクレオチド又はターゲットポリヌクレオチドの少なくとも一のアミノ官能基を介して、結合していることを特徴とする、請求項１４乃至２２のいずれか一項に記載の複合体。
- 少なくとも二のモノマーのホモポリマー又はコポリマーの電気活性ポリマー、アンチリガンド、及び前記アンチリガンドと特異的に相互作用したリガンドからなる電気活性プローブにおいて、前記アンチリガンドは、直接又は間接的に電気活性ポリマーと連結しており、さらに、前記電気活性プローブは、前記アンチリガンドに直接又は間接的に連結した少なくとも一の電子供与基を含むことを特徴とする、電気活性プローブ。
- 前記電気活性ポリマーが、ポリピロール、ポリアセチレン、ポリアジン、ポリ（ｐ−フェニレン）、ポリ（ｐ−フェニレンビニレン）、ポリピレン、ポリチオフェン、ポリフラン、ポリセレノフェン、ポリピリダジン、ポリカルバゾール、ポリアニリン及び二重鎖ポリヌクレオチドから選ばれることを特徴とする、請求項２４記載のプローブ。
- 前記電子供与基がフェロセン、キノンおよびこれらの誘導体から選ばれることを特徴とする、請求項２４記載のプローブ。
- 前記リガンドが、特にポリヌクレオチド及びポリペプチドから選ばれる生物的分子であることを特徴とする、請求項２４記載のプローブ。
- 前記リガンドが、直接又は間接的に、シグナルを発生することができるトレーサーにより標識されていることを特徴とする、請求項２７記載のプローブ。
- 前記アンチリガンドが、第２の連結基を介して、前記電子供与基に共有結合で連結していることを特徴とする、請求項２４記載のプローブ。
- 前記アンチリガンドが、第３の結合基を介して、前記電気活性ポリマーに共有結合で連結していることを特徴とする、請求項２４記載のプローブ。
- 前記第１及び／又は第２及び／又は第３の連結基が、各々、前記電子供与基を前記アンチリガンドに、前記アンチリガンドを前記電気活性ポリマーに、結合腕を介して、連結するものであることを特徴とする、請求項３７乃至３９のいずれか一項に記載のプローブ。
- 前記電気活性ポリマーが、各々ピロール環からなる少なくとも二のモノマーから形成されるポリピロールであり、かつ前記電気供与基がフェロセンであることを特徴とする、請求項２５及び２６記載のプローブ。
- 前記アンチリガンドが、適当なハイブリダイゼーション条件下で、ターゲットポリヌクレオチドにハイブリダイズできる、プローブポリヌクレオチドである、請求項２４及び３２記載のプローブ。
- 前記プローブポリヌクレオチドが、少なくとも、フェロセンと、前記モノマーのピロール環に連結していることを特徴とする、請求項３３記載のプローブ。
- 前記ピロール環が、３位の炭素において置換されていることを特徴とする、請求項３２記載のプローブ。
- 前記プローブポリヌクレオチドが、前記フェロセンの一のシクロペンタジエン環の１位の炭素に結合していることを特徴とする、請求項３４記載のプローブ。
- 前記ポリピロールがコポリマーであり、かつ該コポリマーに含まれるモノマーは、そのピロール環が−ＣＨ２−ＣＯＯＨ又は−ＣＨ２−ＣＨ２ＯＨ基で置換されているものであることを特徴とする、請求項３２記載のプローブ。
- 前記フェロセンと前記プローブポリヌクレオチドとの間の前記第２の連結基が、−ＣＯ−基であることを特徴とする、請求項３４記載のプローブ。
- 前記プローブポリヌクレオチドと前記ピロール環との間の前記第３の連結基が、−ＣＨ２−ＣＯ−基であることを特徴とする、請求項３４記載のプローブ。
- 前記第１及び／又は第２及び／又は第３の連結基が、各々、結合腕を介して、間接的に、前記フェロセンを前記プローブポリヌクレオチドに、前記ピロール環を前記プローブポリヌクレオチドに連結するものであることを特徴とする、請求項３８又は３９に記載のプローブ。
- 前記結合腕が、少なくとも二の炭素原子、好ましくは少なくとも２又は３の炭素原子を有する飽和炭化水素鎖であることを特徴とする、請求項４０記載のプローブ。
- 前記プローブポリヌクレオチドが、少なくとも、前記フェロセン及び／又は前記モノマーのピロール環に、各々、第２及び／又は第３の連結基を介して、及び前記プローブポリヌクレオチドの少なくとも一のアミノ官能基を介して、結合していることを特徴とする、請求項３２乃至４１のいずれか一項に記載のプローブ。
- （ａ）各々ピロール環からなる少なくとも二のモノマーから形成されるホモポリマー又はコポリマーのポリピロールを得る工程、ここで前記ピロール環は３位の炭素において、プローブポリヌクレオチドにより置換されているものである；
（ｂ）一のシクロペンタジエン環の１位の炭素において、少なくとも一の活性化された又は活性化され得る基を有するフェロセンを得る工程
（ｃ）プローブポリヌクレオチドで置換された前記ホモポリマー又はコポリマーのポリピロールを、前記活性化された又は活性化され得る基を有するフェロセンと接触させる工程
を含むことを特徴とする請求項３１記載のプローブの調製方法。 - 前記フェロセンの活性化された又は活性化され得る基が、同一又は異なっていてもよく、活性化された又は活性化され得るエステル基であり、好ましくは−ＣＯ−［Ｎ−ヒドロキシフタルイミド］基であることを特徴とする、請求項４３記載の方法。
- 前記フェロセンの活性化された又は活性化され得る基が、結合腕を介して、前記フェロセンに結合していることを特徴とする請求項４３又は４４記載の方法。
- 請求項２４乃至４２のいずれか一項に記載のプローブを、特異的アンチリガンド／リガンド相互作用に適当な反応条件下で接触させること、及び接触前のプローブと接触後のプローブの間の、電位差又は電流の変動を示すか又定量することを特徴とする、生物的試料中のリガンドの検出方法。
- 前記リガンドがポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項４６記載の方法。
- 表面の全部又は一部が請求項２４乃至４２のいずれか一項記載のプローブで被覆されている電極。
- リガンドと相互作用することができるアンチリガンドが結合している電気活性ポリマーの電気活性を増加させるための、前記アンチリガンドと同じモノマーに存在する電子供与基の使用。
- 生物的試料中のリガンドの検出方法において、
・電気活性プローブを特異的アンチリガンド／リガンドに適した反応条件下で接触させること、
ここで、前記プローブは、少なくとも二のモノマーのホモポリマー又はコポリマーの電気活性ポリマー、リガンドと特異的に相互作用できるアンチリガンドしたリガンドからなるものであり、かつ前記プローブは、少なくとも一の電子供与基を含み、該電子供与基は、直接又は間接的に、一方が電気活性ポリマーに、他方がアンチリガンドに連結しているものであり、
・接触前のプローブと接触後のプローブの間の、電位差又は電流の変動を示すか又は定量すること
を特徴とする方法。 - 前記電気活性ポリマーが、ポリピロール、ポリアセチレン、ポリアジン、ポリ（ｐ−フェニレン）、ポリ（ｐ−フェニレンビニレン）、ポリピレン、ポリチオフェン、ポリフラン、ポリセレノフェン、ポリピリダジン、ポリカルバゾール、ポリアニリン及び二重鎖ポリヌクレオチドから選ばれることを特徴とする、請求項４７記載の方法。
- 前記電子供与基がフェロセン、キノンおよびこれらの誘導体から選ばれることを特徴とする、請求項４７記載の方法。
- 前記リガンドが、特にポリヌクレオチド及びポリペプチドから選ばれる生物的分子であることを特徴とする、請求項４７記載の方法。
- 前記リガンドが、直接又は間接的に、シグナルを発生することができるトレーサーにより標識されていることを特徴とする、請求項４７記載の方法。
- 前記電子供与基が、直接又は間接的に、一方は前記電気活性ポリマーに、他方は前記アンチリガンドに連結していることを特徴とする、請求項４７記載の方法。
- 前記電子供与基が、第１の連結基を介して、共有結合で、電気活性ポリマーに連結していることを特徴とする、請求項４７記載の方法。
- 前記アンチリガンドが、第２の連結基を介して、共有結合で、電子供与基に連結していることを特徴とする、請求項４７記載の方法。
- 前記第１及び／又は第２及び／又は第３の連結基が、各々、前記電子供与基を前記電気活性ポリマーに、前記電子供与基を前記アンチリガンドに、結合腕を介して、連結するものであることを特徴とする、請求項５２乃至５４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記電気活性ポリマーが、各々ピロール環からなる少なくとも二のモノマーから形成されるポリピロールであり、かつ前記電気供与基がフェロセンであることを特徴とする、請求項４９及び５０記載の方法。
- 前記アンチリガンドが、適当なハイブリダイゼーション条件下で、ターゲットポリヌクレオチドにハイブリダイズできるプローブポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項４７及び５６記載の方法。
- 前記フェロセンが、一方は前記ポリ−ブポリヌクレオチドに、他方は前記ポリピロールのモノマーのピロール環に連結していることを特徴とする、請求項４７記載の方法。
- 前記ピロール環が、３位の炭素において置換されていることを特徴とする、請求項５６記載の方法。
- 前記プローブポリヌクレオチドが、前記フェロセンの一のシクロペンタジエン環の１位の炭素に結合していることを特徴とする、請求項５８記載の方法。
- 前記プローブポリヌクレオチドが、前記フェロセンの一のシクロペンタジエン環の１位の炭素に結合しており、前記フェロセンが、他のシクロペンタジエン環の１’位の炭素を介して、前記ピロール環に結合していることを特徴とする、請求項５８記載の方法。
- 前記ポリピロールがコポリマーであり、該コポリマーに含まれるモノマーは、そのピロール環が、−ＣＨ２−ＣＯＯＨ又は−ＣＨ２−ＣＨ２ＯＨ基で置換されているものであることを特徴とする、請求項５６記載の方法。
- 前記フェロセンと前記ピロール環との間の前記第１の連結基が−ＣＯＮＨ−ＣＨ２−基であることを特徴とする、請求項５５記載の方法。
- 前記フェロセンと前記プローブポリヌクレオチドとの間の前記第２の連結基が−ＣＯ−基であることを特徴とする、請求項５５記載の方法。
- 前記第１及び／又は第２及び／又は第３の連結基が、各々、結合腕を介して、間接的に、前記フェロセンを前記ピロール環に、前記フェロセンを前記プローブポリヌクレオチドに、連結するものであることを特徴とする、請求項６３又は６４記載の方法。
- 前記結合腕が、少なくとも二の炭素原子、好ましくは少なくとも２又は３の炭素原子を有する飽和炭化水素鎖であることを特徴とする、請求項６５記載の方法。
- 前記プローブポリヌクレオチドが、前記フェロセンに、各々、前記第２及び／又は第３の連結基を介して、及び前記プローブポリヌクレオチドの少なくとも一のアミノ官能基を介して、結合していることを特徴とする、請求項５６乃至６６のいずれか一項記載の方法。
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