ES2348905T3 - Complejo electroactivo, sonda electroactiva y procedimiento de preparacion. - Google Patents
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Abstract
Complejo electroactivo, constituido por un polímero homopolímero o copolímero electroactivo de por lo menos dos monómeros, un anti-ligando y un ligando que ha interactuado específicamente con dicho anti-ligando, caracterizado porque comprende además por lo menos un grupo electro-donante, y porque presenta una de las tres estructuras siguientes: - el grupo electro-donante está unido de manera covalente por un lado al polímero electroactivo y, por otro lado al anti-ligando que interactúa específicamente con el ligando o al ligando que interactúa específicamente con el anti-ligando, - el grupo electro-donante está unido de manera covalente al anti-ligando que interactúa específicamente con el ligando, estando el anti-ligando unido a su vez de manera covalente al polímero electroactivo, - el grupo electro-donante está unido de manera covalente al ligando que interactúa específicamente con el antiligando, estando el anti-ligando unido de manera covalente al polímero electroactivo, estando excluidos los complejos electroactivos para los cuales dicho polímero electroactivo es un polipirrol unido de manera covalente, por medio de un grupo (CH2)mCONH(CH2)m '' en el que m y m'' son idénticos o diferentes y son un número entero comprendido entre 1 y 3, a un grupo electro-donante que consiste en un ferroceno, una quinona, un ferroceno o una quinona activado(a) por un éster seleccionado de entre el grupo constituido por COONhidroxiftalamida, COON-hidroxísuccinimida y COO-pentafluorofenol, estando dicho grupo electro-donante unido a su vez de manera covalente a un anti-ligando que interactúa específicamente con un ligando.
Description
Complejo electroactivo, sonda electroactiva y
procedimiento de preparación.
La presente invención se refiere a los
electrodos orgánicos elaborados a partir de polímeros electroactivos
en los que se unen unos anti-ligandos destinados a
interactuar específicamente con unos ligandos.
La interacción específica del
anti-ligando con el ligando provoca una variación
sensible y selectiva de las propiedades electroquímicas del polímero
electroactivo, tal como una disminución de la electroactividad de
dicho polímero. Esta variación, que depende de la concentración en
ligando injertado, se observa, eventualmente se mide, y se
correlaciona directamente con la cantidad de ligando injertado. Una
de las aplicaciones esenciales de esta técnica se basa por lo tanto
en la detección, la identificación, y eventualmente la dosificación,
de un ligando, presente en una muestra biológica.
La variación citada anteriormente es de tipo
potenciométrica, tal como una variación del potencial de oxidación
del polímero electroactivo antes y después de la interacción, o de
tipo amperométrica, tal como una variación de la corriente de
oxidación o de reducción del polímero
\hbox{antes y después de
la hibridación determinada a un potencial determinado.}
Para caracterizar precisamente la respuesta
electroquímica del polímero, éste debe presentar una
electroactividad fuerte.
Por tanto, uno de los objetivos de la invención
es aportar una sonda a base de polímero electroactivo sobre el cual
se fija por lo menos un anti-ligando, presentando
esta sonda una electroactividad fuerte.
Según el documento
WO-A-95/29199, se conoce un
polipirrol, constituido por unos monómeros que consisten cada uno en
un núcleo pirrol sustituido de manera covalente sobre el carbono en
posición 3 del núcleo pirrol, por un polinucleótido sonda.
Según el documento WO 00/31750 A1, se conocen
unos complejos electroactivos para los cuales el polímero
electroactivo es un polipirrol unido de manera covalente, por medio
de un grupo
(CH_{2})_{m}CONH(CH_{2})_{m''} en el
que m y m'' son idénticos o diferentes y son un número entero
comprendido entre 1 y 3, a un grupo electro-donante
que consiste en un ferroceno, una quinona, un ferroceno o una
quinona activado(a) por un éster seleccionado de entre el
grupo constituido por COON-hidroxiftalamida,
COON-hidroxisuccinimida y
COO-pentafluorofenol, estando dicho grupo
electro-donante unido
\hbox{a su vez de manera
covalente a un anti-ligando que interactúa
específicamente con un ligando.}
El polipirrol así obtenido se aplica a la
detección, y eventualmente a la dosificación, de ligandos, in
vitro o in vivo.
Sin embargo, se espera todavía la elaboración de
polímeros que presenten mejores propiedades
electro-activas.
Según la invención, se aporta un polímero
electroactivo, modificado, portador de por lo menos un
anti-ligando, y cuya sensibilidad puede ser del
orden de cien veces superior a la de un polímero electroactivo
modificado conocido, tal como un polipirrol que ha constituido el
objeto del documento
WO-A-95/29199.
Así, un primer objeto de la invención es un
complejo electroactivo, constituido por un polímero homopolímero o
copolímero electroactivo de por lo menos dos monómeros, un
anti-ligando y un ligando que ha interactuado
específicamente con dicho anti-ligando,
comprendiendo dicho complejo además por lo menos un grupo
electro-donante, siendo dicho complejo electroactivo
tal como se reivindica en la reivindicación 1.
Según la invención, el grupo
electro-donante se selecciona ventajosamente de
entre el ferroceno, la quinona y los derivados de éstos, y/o el
polímero electroactivo se selecciona preferentemente de entre el
polipirrol, el poliacetileno, la poliazina, el
poli(p-fenileno), el
poli(p-fenilen-vinileno), el
polipireno, el politiofeno, el polifurano, el poliselenofeno, la
polipiridazina, el policarbazol, la polianilina, los polinucleótidos
bicatenarios.
Antes de detallar la invención, se definen a
continuación algunos términos utilizados en la descripción y en las
reivindicaciones.
Mediante la expresión "grupo
electro-donante" se entiende un par redox que
presenta una onda de oxidación estrecha, rápida y reversible, tal
como el ferroceno, la quinona y sus derivados, por ejemplo sus
derivados sustituidos.
Por los términos
"anti-ligando" y "ligando" se hace
referencia indiferentemente a unas moléculas biológicas tales como
unos polinucleótidos o unos péptidos, pero también a unas moléculas
químicas.
El anti-ligando es susceptible
de interactuar específicamente con el ligando para formar un
conjugado ligando/anti-ligando. A título de ejemplos
de conjugados, se puede citar cualquier par péptido/anticuerpo,
anticuerpo/hapteno, hormona/receptor, polinucleótido/polinucleótido,
polinucleótido/ácido nucleico, y análogos.
El término "polinucleótido" tal como se
utiliza según la invención designa una cadena de por lo menos cinco
nucleótidos (desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos), naturales o
modificados, susceptibles de hibridarse, en unas condiciones
apropiadas de hibridación, con un polinucleótido por lo menos
parcialmente complementario. Mediante la expresión "nucleótidos
modificados", se entiende por ejemplo un nucleótido que comprende
una base modificada y/o que comprende una modificación a nivel del
enlace internucleotídico y/o a nivel del esqueleto. A título de
ejemplo de bases modificadas, se puede citar la inosina, la
metil-5-desoxicitidina, la
dimetilamino-5-desoxiuridina, la
diamino-2,6-purina y la
bromo-5-desoxiuridina. Para ilustrar
un enlace internucleotídico modificado, se pueden mencionar los
enlaces fosforotioato, H-fosfonato y
alquil-fosfonato. Los
alfa-oligonucleótidos tales como los descritos en el
documento FR-A-2 607 507 y los PNA
que constituyen el objeto del artículo de M. Egholm et al.,
J. Am. Chem. Soc. (1992) 114, 1895-1897, son unos
ejemplos de
\hbox{polinucleótidos constituidos por nucleótidos
cuyo esqueleto está modificado.}
El término "péptido" significa en
particular cualquier cadena de por lo menos dos aminoácidos, tales
como proteína, fragmento de proteína, oligopéptido, que ha sido
extraído, separado, aislado o sintetizado, tal como un péptido
obtenido mediante síntesis química o mediante expresión en un
organismo recombinante. Están asimismo incluidos cualquier péptido
en cuya secuencia uno o varios aminoácidos de la serie L están
sustituidos con uno o varios aminoácidos de la serie D, y viceversa;
cualquier péptido de los cuales por lo menos uno de los enlaces
CO-NH está sustituido por un enlace
NH-CO; cualquier péptido de los cuales por lo menos
uno de los enlaces CO-NH está sustituido por un
enlace NH-CO, estando la quiralidad de cada residuo
aminoacilo, ya esté implicado o no en uno o varios de dichos enlaces
CO-NH, o bien conservada, o bien invertida con
relación a los residuos aminoacilos que constituyen un péptido de
referencia (o inmunorretroides); y cualquier mimotopo.
Para ilustrar las diversas clases de los
péptidos en cuestión, se pueden mencionar las hormonas
adrenocorticotrópicas o sus fragmentos, los análogos de angiotensina
y sus inhibidores, los péptidos natriuréticos, la bradiquinina y sus
derivados peptídicos, los péptidos quimiotácticos, la dinorfina y
sus derivados, las endorfinas y sus derivados, las encefalinas y sus
derivados, los inhibidores de enzimas, los fragmentos de
fibronectina y sus derivados, los péptidos
gastro-intestinales, los péptidos opioides,
\hbox{la oxitocina, la vasopresina, la vasotocina y sus
derivados, y las proteínas quinasas.}
Por el término "anticuerpo" se define
cualquier anticuerpo monoclonal o policlonal, cualquier fragmento de
dicho anticuerpo tal como los fragmentos Fab, Fab'2 o Fe, así como
cualquier anticuerpo obtenido mediante modificación o recombinación
genética.
Por los términos "injertar", "unir" y
"fijar" en ausencia de cualquier otra indicación, se utilizan
indiferentemente en la presente memoria para designar una relación
entre dos entidades, sin definir su naturaleza química. Así, puede
tratarse de un enlace débil o de un enlace covalente.
Un grupo de enlace según la invención une,
mediante enlace covalente, dos entidades químicas, después de la
interacción de dichas dos entidades, habiendo sido una por lo menos
previamente activada o activable, con vistas a esta interacción,
mediante un grupo activado o activable. El grupo de enlace puede,
por lo tanto, resultar de la reacción de dicho un grupo activado o
activable de una entidad sobre una función reactiva de la otra
entidad, y viceversa, o de la reacción de dicho un grupo activado o
activable de una entidad sobre dicho otro grupo activado o activable
de la otra entidad.
Mediante la expresión "grupo activado" se
entiende un grupo que permite, mediante su intermedio, la
interacción de la entidad sobre la cual está fijado con otra
entidad. A título de ejemplo, se puede tratar de un grupo éster
activado tal como el grupo
-CO-[O-N-ftalimida]. Mediante la
expresión "grupo activable" se entiende un grupo que puede ser
transformado en un grupo activado, por ejemplo en ciertas
condiciones de reacción o durante la puesta en contacto con un grupo
activado susceptible de interactuar con él.
El complejo de la invención tal como se ha
definido anteriormente responde ventajosamente a las características
siguientes consideradas solas o en combinación.
El ligando y el anti-ligando son
unas moléculas biológicas, seleccionadas en particular de entre los
polinucleótidos y los polipéptidos, que pueden ser marcados por un
marcador susceptible de generar directa o indirectamente una
señal.
El complejo presenta una de las estructuras
siguientes: el grupo electro-donante se une, directa
o indirectamente, por un lado al polímero electroactivo y, por otro
lado al anti-ligando o al ligando, o bien el grupo
electro-donante se une, directa o indirectamente, al
anti-ligando, estando dicho
anti-ligando unido a su vez, directa o
indirectamente al polímero electroactivo, o bien el grupo
electro-donante está unido, directa o
indirectamente, al ligando que ha interactuado con el
anti-ligando, estando dicho
anti-ligando unido, directa o indirectamente, al
polímero electroactivo.
Cuando el grupo electro-donante
está unido al polímero electroactivo, lo es preferentemente de
manera covalente, por medio de un primer grupo de enlace.
Cuando el anti-ligando o el
ligando están unidos al grupo electro-donante y/o al
polímero electroactivo, lo son ventajosamente de manera covalente,
por medio respectivamente de un segundo y de un tercer grupos de
enlace.
Los primer y/o segundo y/o tercer grupos de
enlace unen respectivamente el grupo electro-donante
al polímero electroactivo, el grupo electro-donante
al anti-ligando o al ligando, y el
anti-ligando o el ligando al polímero electroactivo,
por medio de un brazo de acoplamiento.
\newpage
\global\parskip0.920000\baselineskip
En la estructura del complejo de la invención,
según la cual el grupo electro-donante está unido al
ligando, también puede serlo por medio de un soporte inerte, por
ejemplo una bola de poliestireno, una bola magnética o una bola de
vidrio, o de un soporte biológico, tal como una célula, en la que el
grupo electro-donante ha sido internalizado.
Según un complejo preferido de la invención, el
polímero electroactivo es un polipirrol constituido por lo menos por
dos monómeros que consisten cada uno en un núcleo pirrol, y el grupo
electro-donante es el ferroceno y, en particular, el
anti-ligando es un polinucleótido sonda y el ligando
es un polinucleótido diana, por lo menos parcialmente hibridado a
dicho anti-ligando.
Este complejo preferido presenta además las
características siguientes, consideradas solas o en combinación.
El ferroceno está unido, por un lado, al
polinucleótido sonda y, por otro lado al núcleo pirrol de un
monómero del polipirrol, en cuyo caso el polinucleótido sonda está
fijado sobre el carbono en posición 1 de uno de los núcleos
ciclopentadieno del ferroceno, y el ferroceno está fijado sobre el
núcleo pirrol por medio del carbono en posición 1' del otro núcleo
del ciclopentadieno, o bien el polinucleótido sonda está unido por
lo menos al ferroceno y al núcleo pirrol de dicho monómero, en cuyo
caso el polinucleótido sonda está fijado sobre el carbono en
posición 1 de uno de los núcleos ciclopentadieno del ferroceno.
El núcleo pirrol está preferentemente sustituido
sobre el carbono en posición 3.
El polipirrol es un copolímero y comprende un
monómero cuyo núcleo pirrol está sustituido con un grupo
-CH_{2}-COOH o
-CH_{2}-CH_{2}OH.
Ventajosamente, el primer grupo de enlace entre
el ferroceno y el núcleo pirrol es el grupo
-CONH-CH_{2}- y/o el segundo grupo de enlace,
entre el ferroceno y el polinucleótido sonda o el polinucleótido
diana es el grupo -CO- y/o el tercer grupo de enlace entre el
polinucleótido sonda o el polinucleótido
\hbox{diana y el
núcleo pirrol, es el grupo -CH _{2} -CO-.}
Los primer y/o segundo y/o tercer grupos de
enlace que unen, indirectamente, de forma respectiva el ferroceno al
núcleo pirrol, el ferroceno al polinucleótido sonda o al
polinucleótido diana y el núcleo pirrol al polinucleótido sonda o al
polinucleótido diana, pueden hacerlo por medio de un brazo de
acoplamiento. Éste es ventajosamente una cadena hidrocarbonada
saturada que tiene por lo menos dos átomos de carbono,
preferentemente por lo menos 2 ó 3 átomos de carbono.
El polinucleótido sonda o el polinucleótido
diana está fijado al ferroceno y/o al núcleo pirrol del monómero por
lo menos, por medio respectivamente del segundo y/o del tercer grupo
de enlace y de por lo menos una de las funciones aminadas del
polinucleótido sonda o del polinucleótido diana.
Otro objeto de la invención es una sonda
electro-activa, tal como se reivindica en la
reivindicación 23, constituida por un polímero homopolímero o
copolímero, electroactivo, y por lo menos por dos monómeros, un
anti-ligando susceptible de interactuar
específicamente con un ligando, comprendiendo dicha sonda además por
lo menos un grupo electro-donante.
Presenta ventajosamente por lo menos cualquiera
de las características siguientes.
El polímero electroactivo se selecciona de entre
el polipirrol, el poliacetileno, la poliazina, el
poli(p-fenileno), el
poli(p-fenileno vinileno), el polipireno, el
politiofeno, el polifurano, el poliselenofeno, la polipiridazina, el
policarbazol, la polianilina, los polinucleótidos bicaternarios y/o
el grupo electro-donante se selecciona de entre el
ferroceno, la quinona y los derivados de éstos, es una molécula
biológica seleccionada en particular de entre los polinucleótidos y
los polipéptidos, y está eventualmente marcado por un marcador
susceptible de generar directa o indirectamente una señal.
El grupo electro-donante está
unido, directa o indirectamente, por un lado al polímero
electroactivo y, por otro lado al anti-ligando. En
este caso, el grupo electro-donante está
preferentemente unido de manera covalente al polímero electroactivo,
por medio de un primer grupo de enlace, o bien el grupo
electro-donante está unido, directa o indirectamente
al anti-ligando, estando dicho
anti-ligando unido a su vez, directa o
indirectamente, al polímero electroactivo.
El anti-ligando está unido de
manera covalente al grupo electro-donante, por medio
de un segundo grupo de enlace y/o el anti-ligando
está unido de manera covalente al polímero electroactivo, por medio
de un tercer grupo de enlace.
Los primer y/o segundo y/o tercer grupos de
enlace unen respectivamente, el grupo
electro-donante al polímero electroactivo, el grupo
electro-donante al anti-ligando y el
anti-ligando al polímero electroactivo, por medio de
un brazo de acoplamiento.
Una sonda ventajosa de la invención comprende un
polipirrol constituido por lo menos por dos monómeros que consisten
cada uno en un núcleo pirrol, el ferroceno, y un
anti-ligando particular que consiste en un
polinucleótido sonda, susceptible de hibridar un polinucleótido
diana, en unas condiciones de hibridación apropiadas.
El polinucleótido sonda (PN_{sonda}) puede ser
fijado entre el ferroceno (Fe) y el núcleo pirrol (P) de dicho
monómero por lo menos, o bien ser fijado sobre el ferroceno, siendo
éste fijado sobre el núcleo pirrol.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Cuando el polinucleótido sonda está fijado entre
el ferroceno y el núcleo pirrol, según una estructura que se
designará mediante
P-PN_{sonda}-Fe, la sonda de la
invención responde a las características siguientes consideradas
solas o combinadas:
- el polinucleótido sonda está fijado sobre el carbono en posición 1 de uno de los núcleos ciclopentadieno del ferroceno;
- el polinucleótido sonda está, directa o indirectamente, fijado al núcleo pirrol, por medio de un tercer grupo de enlace; éste es ventajosamente el grupo -CH_{2}-CO-,
Cuando el polinucleótido sonda está fijado sobre
el ferroceno, estando fijado a su vez sobre el núcleo pirrol, según
una estructura que se denominará mediante
P-Fe-PN_{sonda}, la sonda de la
invención responde a las características siguientes consideradas
solas o combinadas:
- el polinucleótido sonda se fija sobre el carbono en posición 1 de uno de los núcleos ciclopentadieno del ferroceno, y el ferroceno se fija sobre el núcleo por medio del carbono en posición 1' del otro núcleo del ciclopentadieno;
- el ferroceno está, directa o indirectamente, fijado al núcleo pirrol de dicho monómero por lo menos, por medio de un primer grupo de enlace; éste es ventajosamente el grupo -CONH-CH_{2}-.
Sea cual sea la estructura de la sonda, el
ferroceno está, directa o indirectamente, fijado al polinucleótido
sonda, por medio de un segundo grupo de enlace que consiste
preferentemente en el grupo -CO-.
Por otro lado, el polinucleótido sonda está
fijado al núcleo pirrol del monómero y/o al ferroceno por lo menos,
por medio respectivamente del tercer y/o del segundo grupo de
enlace, y por medio de por lo menos una de las funciones aminadas
del polinucleótido sonda.
Según una estructura ventajosa de una sonda de
la invención, los primer y/o segundo y/o tercer grupos de enlace
citados anteriormente, unen, indirectamente, de forma respectiva el
ferroceno al núcleo pirrol, el polinucleótido sonda al núcleo pirrol
y el polinucleótido sonda al núcleo pirrol, por medio de un brazo de
acoplamiento.
Este brazo de acoplamiento es preferentemente
una cadena hidrocarbonada saturada que tiene por lo menos dos átomos
de carbono, preferentemente por lo menos 2 ó 3 átomos de
carbono.
El polipirrol modificado según la invención
puede ser un homopolímero o un copolímero. El núcleo pirrol está
sustituido sobre el carbono en posición 3, por lo tanto, cualquier
copolímero de la invención presentará por lo menos dos monómeros de
los cuales uno por lo menos no está sustituido sobre dicha posición,
o bien presentará por lo menos dos monómeros sustituidos de forma
diferente sobre dicha posición, siendo los sustituyentes
PN_{sonda} diferentes y/o siendo el ensamblaje de los
sustituyentes PN_{sonda} y Fe diferentes sobre el núcleo de los
monómeros y/o siendo los primer y/o segundo y/o tercer grupos de
enlace y/o los brazos de acoplamiento diferentes. Además de los
monómeros modificados según la invención, un copolímero puede
comprender por lo menos un monómero cuyo núcleo pirrol está
sustituido con un grupo -CH_{2}-COOH o
-CH_{2}-CH_{2}OH.
Cuando todos los monómeros del polímero están
modificados de forma idéntica, se obtiene un polipirrol homopolímero
de la invención.
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento para preparar una sonda de la invención.
Si todos los monómeros modificados del
polipirrol tienen la estructura
P-PN_{sonda}-Fe, el procedimiento
comprende entonces las etapas siguientes:
- (a)
- disponer de un polipirrol homopolímero o copolímero constituido por lo menos por dos monómeros que consisten cada uno en un núcleo pirrol, de los cuales por lo menos uno está sustituido en el carbono en posición 3 con un polinucleótido sonda,
- (b)
- obtener el ferroceno que comprende en el carbono en posición 1 de uno de los núcleos ciclopentadieno, por lo menos un grupo activado o activable, y
- (c)
- poner en contacto el polipirrol homopolímero o copolímero, sustituido con un polinucleótido sonda, con el ferroceno que comprende dicho grupo activado o activable.
Si todos los monómeros modificados del
polipirrol tienen la estructura
P-Fe-PN_{sonda}, el procedimiento
comprende entonces las etapas siguientes:
- (a)
- disponer de un ferroceno que comprende por lo menos dos grupos activados o activables, siendo por lo menos uno fijado en el carbono en posición 1 de uno de los núcleos ciclopentadieno y siendo el otro fijado en el carbono en posición 1' del otro núcleo ciclopentadieno del ferroceno,
- (b)
- disponer de un monómero que consiste en un núcleo pirrol sustituido en el carbono en la posición 3, con un grupo activado o activable,
- (c)
- hacer reaccionar un exceso del ferroceno que comprende unos grupos activados o activables con el monómero sustituido,
- (d)
- efectuar una electropolimerización del compuesto obtenido en (c), y
- (e)
- poner en contacto el polímero obtenido en la etapa (d) con un polinucleótido sonda.
Los procedimientos de preparación de la sonda de
la invención se caracterizan además de forma ventajosa como
sigue:
El o los grupos activados o activables del
ferroceno, idénticos o diferentes, son preferentemente un grupo
éster activado o activable, y preferentemente el grupo
-CO-[N-hidroxi-ftalimida]; están
ventajosamente fijados sobre el ferroceno por medio de un brazo de
acoplamiento.
El grupo activado del núcleo pirrol es
-CH_{2}-NH_{2}.
El grupo activado o activable del núcleo pirrol
está fijado sobre éste por medio de un brazo de acoplamiento.
Un brazo de acoplamiento preferido es una cadena
hidrocarbonada saturada que tiene por lo menos dos átomos de
carbono, preferentemente por lo menos 2 ó 3 átomos de carbono.
La etapa de electropolimerización se lleva a
cabo utilizando unas técnicas bien conocidas por el experto en la
materia. Por ejemplo, se puede llevar a cabo sometiendo los
monómeros a unas variaciones de potencial eléctrico suficientes para
provocar la polimerización mediante una oxidación y una reducción
sucesivas; o bien mediante polimerización a corriente
(cronopotenciometría) o a potencial (cronoamperometría)
impuestas.
Otro objeto de la invención es un compuesto
ligando/ferroceno, como producto intermedio, que consiste en un
ligando unido, directa o indirectamente, a un grupo electro- donante
tal como el ferroceno, la quinona o los derivados de éstos. En
particular, este compuesto es un compuesto polinucleótido/ferroceno,
como intermedio de preparación de una sonda de la invención en el
procedimiento de preparación de una sonda
P-PN_{sonda}-Fe de la invención.
Consiste en un polinucleótido fijado sobre el carbono en posición 1
de uno de los núcleos ciclopentadieno del ferroceno, por medio de un
segundo grupo de enlace que es preferentemente el grupo -CO-.
Este segundo grupo de enlace puede unir
indirectamente el ferroceno y el polinucleótido sonda, por medio de
un brazo de acoplamiento que consiste ventajosamente en una cadena
hidrocarbonada saturada que tiene por lo menos dos átomos de
carbono, preferentemente por lo menos 2 ó 3 átomos de carbono.
Una sonda de la invención presenta unas
aplicaciones de diagnóstico. Así, la invención se refiere asimismo a
un procedimiento de detección de un polinucleótido diana en una
muestra biológica, según el cual se pone en contacto dicha sonda, en
unas condiciones de hibridación apropiadas, y se demuestra o se
cuantifica una diferencia de potencial o una variación de corriente
entre la sonda antes de la puesta en contacto y la sonda después de
la puesta en contacto. Dicho procedimiento de detección es tal como
se reivindica en la reivindicación 45.
La invención se refiere asimismo a la
utilización para la detección de un polinucleótido diana en una
muestra biológica de una sonda, utilización según la cual se pone en
contacto dicha sonda, en unas condiciones de hibridación apropiadas,
y se demuestra o se cuantifica una diferencia de potencial o una
variación de corriente entre la sonda antes de la puesta en contacto
y la sonda después de la puesta en contacto.
La presente invención tiene asimismo por objeto
un electrodo del que la totalidad o parte de la superficie está
revestida de una sonda definida anteriormente. Dicho electrodo se
puede obtener mediante cualquier técnica habitual bien conocida por
el experto en la materia. A título de ejemplo, se puede proceder a
esta preparación depositando un polipirrol de la invención en la
superficie de un electrodo de platino, de oro, de cromo o de titanio
recubierto de oro, de carbono vítreo o de un óxido conductor tal
como el óxido de estaño y de indio.
La invención se refiere asimismo a la
utilización de un grupo electro-donante para
aumentar la electroactividad de un polímero electroactivo sobre el
cual se fija un anti-ligando susceptible de
interactuar con un ligando, encontrándose dicho grupo
electro-donante sobre el mismo monómero que el
anti-ligando.
Los diferentes objetos de la invención se
¡lustran en los ejemplos siguientes que hacen referencia a las
figuras 1 a 15 adjuntas y de las cuales se desprenderán sus
características preferidas y ventajas.
\newpage
Ejemplo
1
La elaboración de esta estructura ha necesitado
la síntesis de un ferroceno sustituido por un grupo
N-hidroxiftalimida (abreviado NHP), y la fijación
del polinucleótido sonda sobre un polipirrol, y después la fijación
del ferroceno activado obtenido sobre el polinucleótido sonda fijado
sobre el polipirrol.
El esquema de síntesis es el siguiente:
El análisis de la respuesta electroquímica del
1-ferroceno-propil-NHP
así obtenido demuestra un sistema electroquímico reversible situado
a un potencial de 0,3 V/ECS. Esta respuesta comparada con la de un
ferroceno sustituido directamente por un grupo NHP muestra una
ganancia en potencial del orden de 200 mV.
Esta etapa se realiza en las mismas condiciones
que las descritas en el documento
WO-A-95/29199, utilizando un
polinucleótido sonda funcionalizado en sus extremos 3' y 5' por unos
grupos aminados, sirviendo uno de los grupos para la fijación sobre
el polímero polipirrol activado y el otro para la fijación sobre el
ferroceno activado.
El injerto del PN_{sonda} ha sido efectuado
sumergiendo un electrodo de poli[PyCOOH,
Py-PN_{sonda}] en una disolución que contiene
1-ferroceno-propil-NHP
obtenido en 1A, durante 1 hora a temperatura ambiente. El electrodo
se aclara después y se analiza electroquímicamente en una disolución
de 0,5 M NaCl.
La respuesta representada en la figura 1 (en
trazo continuo, Fe-(CH_{3})NHP, en trazo de puntos,
Fe-NHP) está caracterizada porque aparece una señal
electroquímica después del injerto del PN_{sonda} a un potencial
de 0,35 V/ECS en medio acuoso característico del ferroceno
sustituido en el PN_{sonda}. La medición de la carga intercambiada
durante la oxidación muestra la presencia de sitios de ferroceno
electroactivo. Esta medición permite determinar la cantidad total de
ferroceno fijado sobre el PN_{sonda}.
Ejemplo
2
La hibridación se efectúa disponiendo el
electrodo recubierto del polipirrol obtenido en el ejemplo 1,
durante 1 hora en un tampón PEG en presencia de 25 nmoles de
PN_{diana} a 27ºC. El electrodo se aclara después y se analiza por
voltametría cíclica.
La respuesta electroquímica representada por la
figura 2 (en trazo continuo, antes de la hibridación, en trazo de
puntos, después de la hibridación) muestra una fuerte disminución de
la electroactividad de la señal del ferroceno después de la
hibridación. La corriente disminuye 70 \muA. Esta fuerte
disminución demuestra la fuerte sensibilidad del ferroceno a la
hibridación de PN_{diana}.
Para optimizar este polipirrol, es necesario
definir un único sitio de injerto sobre el PN_{sonda} para
controlar la posición y la cantidad del ferroceno injertado, para
llegar a una perfecta reproducibilidad de los resultados. Esta
optimización constituye el objeto del ejemplo 3.
\newpage
\global\parskip0.950000\baselineskip
Ejemplo
3
Esta preparación consistió en la
funcionalización del polipirrol por un ferroceno que contiene un
grupo saliente. Un PN_{sonda} ha sido fijado por un lado sobre el
homopolímero [PyNH-Fe-NHP] y, por
otro lado, sobre el copolímero
[PyNH-Fe-NHP-PyCOOH].
El PN_{sonda} presenta unas propiedades de
reconocimiento frente a un PN_{diana} y se ha verificado si este
reconocimiento se conservaba después de la fijación del PN_{sonda}
sobre el ferroceno, y después se ha buscado la naturaleza de la
respuesta electroquímica del ferroceno a este reconocimiento.
En primer lugar, se ha efectuado la síntesis de
un monómero pirrol sustituido en posición 3 por un ferroceno que
contiene un grupo éster activado. Después, se ha realizado una
polimerización por vía electroquímica del monómero obtenido, y se ha
injertado el PN_{sonda} sobre el polímero resultante.
La elaboración de un pirrol que contiene al
mismo tiempo un ferroceno y un grupo NHP ha necesitado varias etapas
de síntesis. La primera es la síntesis de pirrol sustituido con un
grupo butil-amina, es decir, el
(4-aminobutil)-3-pirrol,
la segunda es la síntesis de
1,1'-dipropanoato-N-hidroxiftalamida-ferroceno,
y la tercera etapa es la síntesis del
3-pirrol-ferroceno-NHP.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se sintetiza el
(4-aminobutil)-3-pirrol
cuya función amina permite la funcionalización del pirrol por unos
grupos éster activado gracias a las reacciones de condensación. Para
sintetizar este monómero, se efectúa una reacción de acilación en el
pirrol-tosilo para obtener el
(3-bromo-propionil)-3-tosil-1-pirrol
con un rendimiento de 63%. Esta reacción está seguida de una
reducción de la función carbonilo. Se obtiene el
1-tosil-pirrol-3-bromopropilo
con un rendimiento de 78%. Utilizando el cianuro de sodio, el bromo
se sustituye con una función cianuro con un rendimiento de 50%. La
transformación del cianuro en amina se lleva a cabo mediante la
reacción de reducción utilizando el hidruro de aluminio y de litio
(rendimiento 77%). La hidrólisis del grupo tosilo por una base NaOH
conduce al
(4-amino-butil)-3-pirrol
con un rendimiento de 62%.
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El esquema de síntesis es el siguiente:
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Este ferroceno se obtiene mediante la
transformación de
1,1'-ferroceno-propil-ciano
en 1,1'-ferroceno-propil-ácido en
presencia de hidróxido de sodio y de metanol con un rendimiento de
95%. Los grupos carboxílicos del ferroceno están sustituidos por un
grupo saliente, el N-hidroxiftalimida (NHP). El
ferroceno NHP se obtiene a partir del ferroceno ácido, mediante
esterificación y en presencia de DCC. El DCC desempeña un papel de
deshidratante, se transforma en DCU captando así el agua formada
durante la reacción.
\newpage
El esquema de síntesis es el siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El
3-pirrol-ferroceno-NHP
se obtiene mediante una reacción de acoplamiento entre el
3-pirrol-butilamina y el
1,1'-ferroceno-propil-NHP
en el acetonitrilo, en unas condiciones de exceso amplio en
ferroceno para evitar una sustitución del pirrol sobre los dos
grupos NHP del ferroceno.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis electroquímico del monómero en
disolución se lleva a cabo en el acetonitrilo en presencia de
electrolito de soporte 0,1 M LiClO_{4}.
La figura 3 muestra el voltamograma obtenido. Se
observan dos sistemas de oxidorreducción. El primer sistema presenta
unas características reversibles cuyo potencial de oxidación se
sitúa a 0,26 V. Este sistema corresponde a la oxidorreducción del
ferroceno sustituido sobre el pirrol. El segundo sistema
electroquímico es irreversible, su potencial de oxidación se sitúa a
1,17 V/ECS, y corresponde a la oxidación del pirrol.
Este potencial de oxidación del pirrol
sustituido con el grupo ferroceno es elevado en comparación con el
potencial de oxidación de pirrol no sustituido o sustituido con el
grupo carboxílico que es generalmente del orden de 0,8 a 0,9
V/ECS.
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El esquema de polimerización es el
siguiente:
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Las películas de
poli[Py-Fe-NHP] se obtienen
sumergiendo los electrodos de platino en una disolución del monómero
poli[Py-Fe-NHP] en medio
acetonitrilo que contiene 0,2 M de tetrafluoroborato de
tetrabutilamonio, (N+Bu_{2}
BF_{4}). La electropolimerización se lleva a cabo a un potencial controlado de 1,1 V/ECS basándose en el potencial de oxidación del monómero. La carga depositada es de 70 MC.
BF_{4}). La electropolimerización se lleva a cabo a un potencial controlado de 1,1 V/ECS basándose en el potencial de oxidación del monómero. La carga depositada es de 70 MC.
Después de la polimerización, se forma un
precipitado en la disolución que se debe probablemente a la
formación de los oligómeros de cadenas cortas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las películas obtenidas de homopolímero
poli[Py-Fe-NHP, PyCOOH] se
analizan electroquímicamente en un medio acetonitrilo en presencia
de 0,1 M de LiClO_{4}. La figura 4 representa el voltamograma
obtenido. Este voltamograma muestra una gran electroactividad de la
película de polímero. El potencial de oxidación es de 288 mV/ECS y
el de la reducción es de 236 mV/ECS. La diferencia entre estos dos
valores y la relación de las corrientes de los picos de oxidación
(13,5 \muA) y de reducción (11 \muA) muestran que este sistema
electroquímico presenta una buena reversibilidad. La carga
intercambiada durante la oxidación o durante la reducción es de 0,1
MC. Este valor es muy bajo en comparación con la carga depositada
durante la polimerización. A partir de la carga de oxidación, se
puede determinar la cantidad de ferroceno electroactivo depositada
sobre el electrodo. Sabiendo que el ferroceno intercambia un
electrón durante su proceso de oxidación, se puede establecer la ley
de Faraday:
Q_{ox} =
N(Fe)*F
El número de moles de ferroceno o de unidades
pirrol electroactivas sobre el electrodo es de 10^{-9} moles.
El cálculo del número de moles de ferroceno a
partir de la carga de polimerización muestra unos valores muy
elevados, del orden de 10^{-7} moles.
Sin embargo, estos resultados muestran que el
rendimiento de polimerización es muy bajo. Dos factores están en el
origen de este rendimiento bajo, por un lado, una parte de la carga
de polimerización sirve para la oxidación del ferroceno en
disolución y, por otro lado, el volumen estérico del grupo
ferroceno-NHP sustituido en el pirrol impide el
acoplamiento entre estas dos unidades pirrol y conduce a unos
oligómeros de cadenas cortas que precipitan en disolución.
\vskip1.000000\baselineskip
El esquema de fijación es el siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El PN_{sonda} utilizado es un polinucleótido
de 25 pares de bases que tiene la secuencia siguiente identificada
por SEC ID nº 1:
^{5'}TCA-ATC-TCG-GGA-ATC-TCA-ATG-TTA-G^{3'}.
La fijación del PN_{sonda} se lleva a cabo
sobre el homopolímero precursor
poli[Py-Fe-NHP]. Las
condiciones químicas de esta sustitución son similares a las de la
fijación sobre el polímero
poli[PyCCNH-NHP].
El acoplamiento entre el pirrol
Fe-NHP y el PN_{sonda} que contiene el grupo amina
en su posición 5' se lleva a cabo sumergiendo el electrodo en una
disolución de acetonitrilo en presencia de 10% de un tampón de
acetato y de 25 \mumoles/l. La reacción se desarrolla a
temperatura ambiente durante 2 horas.
Las películas obtenidas se analizan mediante
voltametría cíclica en agua en presencia de 0,5 M de NaCl. La figura
5 muestra un sistema de oxidorreducción cuyos picos de oxidación y
de reducción están situados respectivamente a 273 mV y 258 mV.
El sistema electroquímico del ferroceno en medio
acuoso no es tan reversible en comparación con el análisis de la
película en el acetonitrilo. Esta pérdida de electroactividad está
probablemente relacionada con unos problemas de solvatación o bien
del ión dopante o de la matriz de polímero en el agua.
\newpage
Ejemplo
4
El esquema de hibridación es el siguiente:
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Unas películas de copolímero
poli[Py-Fe-PN_{sonda}] han
sido incubadas en presencia de 25 nmoles (25 \mumoles/l) de
PN_{diana} en un tampón biológico, durante 3 horas, a una
temperatura de 37ºC, en un volumen de 1 ml.
El PN_{diana} comprende 25 bases
complementarias de las bases del PN_{sonda} y responde a la
secuencia siguiente, identificada por SEC ID nº 2:
^{5'}CTA-ACA-TTG-AGA-TTC-CCG-AGA-TTG-A^{3'}.
Un ensayo en blanco se efectúa incubando otro
electrodo en el tampón de hibridación que contiene ADN de salmón
para determinar los efectos de las interacciones no específicas.
\vskip1.000000\baselineskip
La respuesta electroquímica de los polímeros ha
sido analizada mediante voltametría cíclica en medio acuoso en
presencia de 0,5M de NaCl.
\vskip1.000000\baselineskip
El voltamograma que aparece en la figura 6 (en
trazo continuo, antes de la hibridación, en trazos de puntos,
después de la hibridación) muestra la respuesta electroquímica del
electrodo de referencia incubado en presencia de tampón PEG.
Se observa que el electrodo que sirve de
referencia muestra una variación del potencial de oxidación y una
disminución de la electroactividad. Esto indica que las
interacciones no específicas tienen un ligero efecto sobre la
respuesta electroquímica del ferroceno.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis electroquímico del electrodo
incubado en presencia del PN_{diana} en medio acuoso se representa
en la figura 7 (en trazo continuo, antes de la hibridación, en trazo
de puntos, después de la hibridación).
El electrodo después de la incubación muestra un
desplazamiento del potencial de oxidación hacia los potenciales
elevados y una disminución de la electroactividad. La carga
intercambiada durante la oxidación y la reducción también
disminuye.
Se observa que la variación de la respuesta
electroquímica del ferroceno es más importante comparada con el
electrodo en blanco.
\newpage
Ejemplo
5
El esquema de síntesis es el siguiente:
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La copolimerización entre el
3-pirrol-ácido acético (PyCOOH) y el
3-pirrol-Fe-NHP
(Py-Fe-NHP) permite diluir este
monómero voluminoso en la matriz de polímero con el fin de minimizar
las perturbaciones de orígenes estéricos. Además, la
copolimerización con el 3-pirrol-ácido acético
permite aumentar la porosidad de las películas.
La elección de las concentraciones respectivas
de los monómeros PyCOOH y Py-Fe-NHP
se determina refiriéndose a los potenciales de polimerización de
estos dos monómeros. El PyCOOH se oxida a 0,9 V/ECS, el
Py-Fe-NHP se oxida a 1,1 V/ECS. Es
necesario seleccionar una concentración baja de PyCOOH con relación
al Py-Fe-NHP. Las concentraciones de
estos dos monómeros utilizados para la electropolimerización del
copolímero son por lo tanto 0,02 M para el PyCOOH y 0,08 M para el
Py-Fe-NHP.
El copolímero ha sido depositado a un potencial
impuesto de 1,1 V/ECS sobre un electrodo de platino de superficie de
700 cm^{2} en medio de carbonato de propileno en presencia de 0,2
M de LiCl_{2}. La carga depositada durante la
electropolimerización es de 35 MC. Es difícil determinar el grosor
de la película a partir de la carga de polimerización, puesto que
una parte de la carga medida durante la electropolimerización ha
servido para la oxidación del ferroceno en disolución.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta caracterización se ha efectuado en medio
acetonitrilo en presencia de 0,1 M de LiClO_{4}. El voltamograma
en la figura 8 muestra un sistema electroquímico reversible con un
pico de oxidación situado a un potencial de 254 mV y un pico de
reducción simétrico situado a un potencial de 234 mV. La anchura a
media altura es de 150 mV. Esta respuesta electroquímica presenta la
señal del ferroceno y muestra una electroactividad importante de
esta sonda electroquímica. La transferencia electrónica a través de
la cadena conjugada del polímero es muy importante, lo que demuestra
que el polipirrol es conductor. La carga intercambiada durante la
oxidación del ferroceno es del orden de 0,15 mC. Esta carga de
oxidación del ferroceno permite calcular el número de moles de
pirroles que contienen el grupo ferroceno en el polímero suponiendo
que todos los sitios ferroceno son electroactivos.
A partir de la ley de Faraday se obtiene:
Q_{ox} =
N*F
siendo N el número de moles de
ferroceno y F la constante de
Faraday.
El número de moles de ferroceno electroactivo es
del orden de 10^{-9} moles.
\newpage
El esquema de fijación es el siguiente:
El PN_{sonda} utilizado es el polinucleótido
SEC ID nº 1.
La fijación del PN_{sonda} (25 \mumoles) se
lleva a cabo sobre el copolímero precursor
poli[Py-Fe-NHP, PyCOOH]
sumergiendo el electrodo en una disolución de acetonitrilo en
presencia de 10% de tampón acetato.
La figura 9 muestra la respuesta electroquímica
del electrodo después del injerto del PN_{sonda} en medio acuoso
en presencia de 0,5 M de NaCl. El voltamograma presenta un sistema
de oxidorreducción caracterizado por un pico de oxidación intenso y
delgado y un pico de reducción ancho.
Los potenciales de los picos de oxidación y de
reducción son respectivamente de 341 mV y 275 mV, y la anchura a
media altura es de 100 mV para el pico de oxidación y de 200 mV para
el pico de reducción. La carga intercambiada durante la oxidación o
durante la reducción es del orden de 0,1 mC.
Ejemplo
6
El esquema de hibridación es el siguiente:
Unas películas de copolímero
poli[Py-Fe-PN_{sonda},
PyCOOH] han sido incubadas en presencia de PN_{diana} de 25 bases
en las mismas condiciones que anteriormente.
Un electrodo de referencia se incuba en el mismo
tampón biológico sin PN_{diana}.
Se ha analizado la respuesta electroquímica de
los electrodos incubados en presencia de la diana y de la
no-diana en medio acetonitrilo y en medio
acuoso.
Las figuras 10 y 11 representan los
voltamogramas antes (trazo continuo) y después (trazo en puntos) de
la hibridación en presencia de la no-diana (ADN de
salmón) en medio acetonitrilo y en medio acuoso.
Se observa que en medio acetonitrilo, la
respuesta electroquímica del ferroceno muestra una estabilidad del
potencial de oxidación con una variación muy ligera de las
corrientes de picos.
El análisis de la respuesta electroquímica del
electrodo de referencia en medio acuoso en presencia de 0,5 M NaCl
muestra una variación de la respuesta electroquímica del ferroceno,
un aumento del potencial de oxidación y una disminución de la
corriente de los picos.
El análisis electroquímico del electrodo
incubado en presencia de la diana en medio acuoso se representa en
la figura 12 (en trazo continuo: antes de la hibridación, en trazo
en puntos: después de la hibridación). El voltamograma muestra una
fuerte variación de la señal electroquímica después de la
hibridación. El potencial de oxidación se desplaza hacia los
potenciales más elevados; pasa de 340 mV a 387 mV después de la
hibridación. La corriente de oxidación disminuye 60%. La carga
intercambiada durante la oxidación disminuye 25%.
El análisis de la respuesta electroquímica en el
acetonitrilo del electrodo incubado en presencia de 0,1 nmoles de
PN_{diana} se representa en la figura 13 (en trazo continuo: antes
de la hibridación, en trazo en puntos: después de la hibridación).
El voltamograma después de la hibridación muestra la salvaguardia
del sistema reversible del ferroceno en medio orgánico. El potencial
de oxidación y de reducción del ferroceno se desplaza hacia los
bajos potenciales.
Esta variación de la respuesta electroquímica en
medio acuoso y en medio orgánico permite demostrar que existe una
hibridación selectiva y específica entre el PN_{sonda} injertado
sobre el ferroceno y el PN_{diana}.
A pesar de que estos electrodos incubados en
presencia de la diana hayan mostrado unas variaciones significativas
de la respuesta electroquímica, es necesario determinar el origen de
la variación de la respuesta del ferroceno después de la incubación
en un tampón biológico sin la diana.
Ejemplo
6
Se ha estudiado la influencia de la carga
depositada durante la polimerización sobre la variación de la señal
electroquímica del
poli[py-Fe-PM_{sonda},
PyCOOH] del ejemplo 5 para tres valores de cargas, 5, 10 y 15
mC.
La figura 14 demuestra que la corriente de
oxidación disminuye con la cantidad de la carga depositada.
Ejemplo
7
La reprodutibilidad electroquímica del
poli[Py-Fe-PN_{sonda},
PyCOOH] del ejemplo 5 ha sido ensayada sobre seis electrodos de
películas de bajo grosor.
La caracterización electroquímica de estos
electrodos realizada en medio acetonitrilo en presencia de 0,1 M de
LiClO_{4} se ilustra en la figura 15 que muestra que se obtienen
sustancialmente los mismos voltamogramas después del injerto del
PN_{sonda} para los seis electrodos.
Ejemplo
8
El mismo electrodo
poli[Py-Fe-PN_{sonda},
PyCOOH] (Q = 5 mC) del ejemplo 5 ha sido incubado en dos tampones
diferentes:
- -
- Tampón TE-NaCl a 37ºC durante 2 horas y 3 horas,
- -
- Tampón SSPEG a 37ºC durante 2 horas y 3 horas.
La caracterización electroquímica
(voltramogramas no representados) llevada a cabo en medio
acetonitrilo en presencia de 0,1 M de LiClO_{4} respectivamente,
antes y después de la incubación para cada uno de los tampones
demuestra el interés del tampón SSPEG en el que el electrodo es más
estable.
Varias películas de
Poly[Py-Fe-PN_{sonda},
PyCOOH] del ejemplo 5 han sido incubadas en un tampón SSPEG en
presencia de diferentes concentraciones de PN_{diana} (0,01, 0,05
y 0,5 nmoles/l).
La caracterización electroquímica (voltamogramas
no representados) llevada a cabo en un medio acetonitrilo en
presencia de 0,1 M de LiClO_{4} respectivamente, antes y después
de la incubación en presencia de las diferentes concentraciones
anteriores, muestra que la variación de la respuesta electroquímica
antes y después de la hibridación aumenta con la concentración del
PN_{diana}. Se observa en efecto que, al potencial de 280 mV/ECS
que corresponde al potencial del pico inicial, la disminución de la
corriente varía con la concentración del PN_{diana}.
Claims (60)
1. Complejo electroactivo, constituido por un
polímero homopolímero o copolímero electroactivo de por lo menos dos
monómeros, un anti-ligando y un ligando que ha
interactuado específicamente con dicho anti-ligando,
caracterizado porque comprende además por lo menos un grupo
electro-donante, y porque presenta una de las tres
estructuras siguientes:
- -
- el grupo electro-donante está unido de manera covalente por un lado al polímero electroactivo y, por otro lado al anti-ligando que interactúa específicamente con el ligando o al ligando que interactúa específicamente con el anti-ligando,
- -
- el grupo electro-donante está unido de manera covalente al anti-ligando que interactúa específicamente con el ligando, estando el anti-ligando unido a su vez de manera covalente al polímero electroactivo,
- -
- el grupo electro-donante está unido de manera covalente al ligando que interactúa específicamente con el anti-ligando, estando el anti-ligando unido de manera covalente al polímero electroactivo,
estando excluidos los complejos electroactivos
para los cuales dicho polímero electroactivo es un polipirrol unido
de manera covalente, por medio de un grupo
(CH_{2})_{m}CONH(CH_{2})_{m''} en el
que m y m'' son idénticos o diferentes y son un número entero
comprendido entre 1 y 3, a un grupo electro-donante
que consiste en un ferroceno, una quinona, un ferroceno o una
quinona activado(a) por un éster seleccionado de entre el
grupo constituido por COON-hidroxiftalamida,
COON-hidroxísuccinimida y
COO-pentafluorofenol, estando dicho grupo
electro-donante unido a su vez de manera covalente a
un anti-ligando que interactúa específicamente con
un ligando.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Complejo según la reivindicación 1,
caracterizado porque el polímero electroactivo se selecciona
de entre el polipirrol, el poliacetileno, la poliazina, el
poli(p-fenileno), el
poli(p-fenileno vinileno), el polipireno, el
politiofeno, el polifurano, el poliselenofeno, la polipiridazina, el
policarbazol, la polianilina, y los polinucleótidos
bicatenarios.
3. Complejo según la reivindicación 1,
caracterizado porque el grupo electro-donante
se selecciona de entre el ferroceno, la quinona y los derivados de
éstos.
4. Complejo según la reivindicación 1,
caracterizado porque el ligando y el
anti-ligando son unas moléculas biológicas
seleccionadas en particular de entre los polinucleótidos y los
polipéptidos.
5. Complejo según la reivindicación 4,
caracterizado porque el ligando y/o el
anti-ligando están marcados por un marcador
susceptible de generar directa o indirectamente una señal.
6. Complejo según la reivindicación 1,
caracterizado porque el anti-ligando o el
ligando están unidos de manera covalente al grupo
electro-donante, por medio de un segundo grupo de
enlace.
7. Complejo según la reivindicación 1,
caracterizado porque el anti-ligando o el
ligando están unidos de manera covalente al polímero electroactivo,
por medio de un tercer grupo de enlace.
8. Complejo según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 7, caracterizado porque los segundo y/o
tercer grupos de enlace unen respectivamente el grupo
electro-donante al anti-ligando y el
anti-ligando al polímero electroactivo, por medio de
un brazo de acoplamiento.
9. Complejo según la reivindicación 1,
caracterizado porque el grupo electro-donante
está unido al ligando por medio de un soporte inerte o
biológico.
10. Complejo según la reivindicación 9,
caracterizado porque el soporte inerte es una bola de
poliestireno, una bola magnética o una bola de vidrio.
11. Complejo según la reivindicación 9,
caracterizado porque el soporte biológico es una célula, en
la que el grupo electro-donante ha sido
internalizado.
12. Complejo según la reivindicación 1,
caracterizado porque el polímero electroactivo es un
polipirrol constituido por lo menos por dos monómeros que consisten
cada uno en un núcleo pirrol, y porque el grupo
electro-donante es el ferroceno.
13. Complejo según la reivindicación 12,
caracterizado porque el anti-ligando es un
polinucleótido sonda y el ligando es un polinucleótido diana, por lo
menos parcialmente hibridado a dicho
anti-ligando.
14. Complejo según la reivindicación 13,
caracterizado porque el polinucleótido sonda está unido al
ferroceno y al núcleo pirrol de dicho monómero por lo menos.
15. Complejo según la reivindicación 12,
caracterizado porque el núcleo pirrol está sustituido sobre
el carbono en posición 3.
16. Complejo según la reivindicación 14,
caracterizado porque el polinucleótido sonda está fijado
sobre el carbono en la posición 1 de uno de los núcleos
ciclopentadieno del ferroceno.
17. Complejo según la reivindicación 12,
caracterizado porque el polipirrol es un copolímero y
comprende un monómero cuyo núcleo pirrol está sustituido con un
grupo -CH_{2}-COOH o
-CH_{2}-CH_{2}OH.
18. Complejo según la reivindicación 14,
caracterizado porque el segundo grupo de enlace, entre el
ferroceno y el polinucleótido sonda o el polinucleótido diana es el
grupo -CO-.
19. Complejo según la reivindicación 14,
caracterizado porque el tercer grupo de enlace entre el
polinucleótido sonda o el polinucleótido diana y el núcleo pirrol es
el grupo -CH_{2}-CO-.
20. Complejo según cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 19, caracterizado porque los segundo
y/o tercer grupos de enlace unen, indirectamente, el ferroceno al
polinucleótido sonda o al polinucleótido diana y el núcleo pirrol al
polinucleótido sonda o al polinucleótido diana, por medio de un
brazo de acoplamiento.
21. Complejo según la reivindicación 20,
caracterizado porque el brazo de acoplamiento es una cadena
hidrocarbonada saturada que tiene por lo menos dos átomos de
carbono, preferentemente por lo menos 2 ó 3 átomos de carbono.
22. Complejo según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 21, caracterizado porque el
polinucleótido sonda o el polinucleótido diana está fijado al
ferroceno y/o al núcleo pirrol del monómero por lo menos, por medio
respectivamente del segundo y/o del tercer grupos de enlace y de por
lo menos una de las funciones aminadas del polinucleótido sonda o
del polinucleótido diana.
23. Sonda electro-activa para la
detección y/o la identificación de un ligando, constituida por un
polímero homopolímero o copolímero electroactivo de por lo menos dos
monómeros y un anti-ligando, caracterizada
porque comprende además por lo menos un grupo
electro-donante y porque presenta una de las dos
estructuras siguientes:
- -
- el grupo electro-donante está unido de manera covalente por un lado al polímero electroactivo y, por otro lado al anti-ligando,
- -
- el grupo electro-donante está unido de manera covalente al anti-ligando, estando dicho anti-ligando unido a su vez de manera covalente al polímero electroactivo,
estando excluidos los complejos electroactivos
para los cuales dicho polímero electroactivo es un polipirrol unido
de manera covalente, por medio de un grupo
(CH_{2})_{m}CONH(CH_{2})_{m''} en el
que m y m'' son idénticos o diferentes y son un número entero
comprendido entre 1 y 3, a un grupo electro-donante
que consiste en un ferroceno, una quinona, un ferroceno o una
quinona activado(a) por un éster seleccionado de entre el
grupo constituido por COON-hidroxiftalamida,
COON-hidroxisuccinimida y
COO-pentafluorofenol, estando dicho grupo
electro-donante unido a su vez de manera covalente a
un anti-ligando.
24. Sonda según la reivindicación 23,
caracterizada porque el polímero electroactivo se selecciona
de entre el polipirrol, el poliacetileno, la poliazina, el
poli(p-fenileno), el
poli(p-fenileno vinileno), el polipireno, el
politiofeno, el polifurano, el poliselenofeno, la polipiridazina, el
policarbazol, la polianilina, y los polinucleótidos
bicatenarios.
25. Sonda según la reivindicación 23,
caracterizada porque el grupo electro-donante
se selecciona de entre el ferroceno, la quinona y los derivados de
éstos.
26. Sonda según la reivindicación 23,
caracterizada porque el anti-ligando está
unido de manera covalente al grupo electro-donante,
por medio de un segundo grupo de enlace.
27. Sonda según la reivindicación 23,
caracterizada porque el anti-ligando está
unido de manera covalente al polímero electroactivo, por medio de un
tercer grupo de enlace.
28. Sonda según cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 26, caracterizada porque los segundo
y/o tercer grupos de enlace unen respectivamente el grupo
electro-donante al anti-ligando y el
anti-ligando al polímero electroactivo, por medio de
un brazo de acoplamiento.
29. Sonda según las reivindicaciones 24 y 25,
caracterizada porque el polímero electroactivo es el
polipirrol constituido por lo menos por dos monómeros que consisten
cada uno en un núcleo pirrol, y porque el grupo
electro-donante es el ferroceno.
30. Sonda según las reivindicaciones 23 y 29,
caracterizada porque el anti-ligando es un
polinucleótido sonda, susceptible de hibridar un polinucleótido
diana, en unas condiciones de hibridación apropiadas.
31. Sonda según la reivindicación 30,
caracterizada porque el polinucleótido sonda está unido al
ferroceno y al núcleo pirrol de dicho monómero por lo menos.
32. Sonda según la reivindicación 29,
caracterizada porque el núcleo pirrol está sustituido sobre
el carbono en posición 3.
33. Sonda según la reivindicación 31,
caracterizada porque el polinucleótido sonda está unido sobre
el carbono en posición 1 de uno de los núcleos ciclopentadieno del
ferroceno.
34. Sonda según la reivindicación 29,
caracterizada porque el polipirrol es un copolímero y
comprende un monómero cuyo núcleo pirrol está sustituido por un
grupo -CH_{2}-COOH o -CH_{2}CH_{2}OH.
35. Sonda según la reivindicación 31,
caracterizada porque el segundo grupo de enlace, entre el
ferroceno y el polinucleótido sonda es el grupo -CO-.
36. Sonda según la reivindicación 31,
caracterizada porque el tercer grupo de enlace entre el
polinucleótido sonda y el núcleo pirrol es el grupo
-CH_{2}-CO-.
37. Sonda según cualquiera de las
reivindicaciones 35 a 36, caracterizada porque los segundo
y/o tercer grupos de enlace unen, indirectamente, de forma
respectiva, el ferroceno al polinucleótido sonda y el núcleo pirrol
al polinucleótido sonda, por medio de un brazo de acoplamiento.
38. Sonda según la reivindicación 37,
caracterizada porque el brazo de acoplamiento es una cadena
hidrocarbonada saturada que tiene por lo menos dos átomos de
carbono, preferentemente por lo menos 2 ó 3 átomos de carbono.
39. Sonda según cualquiera de las
reivindicaciones 29 a 38, caracterizada porque el
polinucleótido sonda está fijado al ferroceno y/o al núcleo pirrol
del monómero por lo menos, por medio respectivamente del segundo y/o
del tercer grupo de enlace y de por lo menos una de las funciones
aminadas del polinucleótido sonda.
40. Procedimiento para preparar una sonda según
la reivindicación 28, caracterizado porque comprende las
etapas siguientes:
- (a)
- disponer de un polipirrol homopolímero o copolímero constituido por lo menos por dos monómeros que consisten cada uno en un núcleo pirrol, de los cuales por lo menos uno está sustituido en el carbono en posición 3 por un polinucleótido sonda,
- (b)
- obtener el ferroceno que comprende en el carbono en posición 1 de uno de los núcleos ciclopentadieno, por lo menos un grupo activado o activable, y
- (c)
- poner en contacto el polipirrol homopolímero o copolímero, sustituido por un polinucleótido sonda, con el ferroceno que comprende dicho grupo activado o activable.
41. Procedimiento según la reivindicación 40,
caracterizado porque el o los grupos activados o activables
del ferroceno, idénticos o diferentes, son un grupo éster activado o
activable, y preferentemente el grupo
-CO-[N-hidroxi-ftalimida].
42. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 40 ó 41, caracterizado porque el o los
grupos activados o activables del ferroceno están fijados sobre éste
por medio de un brazo de acoplamiento.
43. Electrodo del que la totalidad o parte de la
superficie está revestida de una sonda según cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 39.
44. Utilización de un grupo
electro-donante para aumentar la electroactividad de
un polímero electroactivo sobre el cual se fija un
anti-ligando susceptible de interactuar con un
ligando, encontrándose dicho grupo electro-donante
sobre el mismo monómero que el anti-ligando.
45. Procedimiento de detección de un ligando en
una muestra biológica, que comprende las etapas que consisten en
poner en contacto, en unas condiciones de reacción apropiadas para
la interacción específica anti-ligando/ligando, una
sonda electro- activa para la detección y/o la identificación de
dicho ligando, y demostrar o cuantificar una diferencia de potencial
o una variación de corriente entre la sonda antes de la puesta en
contacto y la sonda después de la puesta en contacto,
caracterizado porque dicha sonda está constituida por un
polímero homopolímero o copolímero electroactivo de por lo menos dos
monómeros y un anti-ligando, estando dicho
anti-ligando unido de manera covalente al polímero
electroactivo, y dicha sonda comprende además por lo menos un grupo
electro-donante unido de manera covalente al
anti-ligando, y porque presenta una de las
estructuras siguientes:
- -
- el grupo electro-donante está unido de manera covalente por un lado al polímero electroactivo y, por otro lado al anti-ligando,
- -
- el grupo electro-donante está unido de manera covalente al anti-ligando, estando dicho anti-ligando unido a su vez de manera covalente al polímero electroactivo,
estando excluidas las sondas
electro-activas para las cuales dicho polímero
electroactivo es un polipirrol unido de manera covalente, por medio
de un grupo
(CH_{2})_{m}CONH(CH_{2})_{m''} en el
que m y m'' son idénticos o diferentes y son un número entero
comprendido entre 1 y 3, a un grupo electro-donante
que consiste en un ferroceno, una quinona, un ferroceno o una
quinona activado(a) por un éster seleccionado de entre el
grupo constituido por COON-hidroxiftalamida,
COON-hidroxisuccinimida y
COO-pentafluorofenol, estando dicho grupo
electro-donante unido a su vez de manera covalente a
un anti-ligando.
46. Procedimiento según la reivindicación 45,
caracterizado porque el polímero electroactivo se selecciona
de entre el polipirrol, el poliacetileno, la poliazina, el
poli(p-fenileno), el
poli(p-fenileno vinileno), el polipireno, el
politiofeno, el polifurano, el poliselenofeno, la polipiridazina, el
policarbazol, la polianilina, y los polinucleótidos
bicatenarios.
47. Procedimiento según la reivindicación 45,
caracterizado porque el grupo electro-donante
se selecciona de entre el ferroceno, la quinona y los derivados de
éstos.
48. Procedimiento según la reivindicación 45,
caracterizado porque el ligando es una molécula biológica
seleccionada en particular de entre los polinucleótidos y los
polipéptidos.
49. Procedimiento según la reivindicación 45,
caracterizado porque el ligando es un polinucleótido.
50. Procedimiento según la reivindicación 45,
caracterizado porque el ligando está marcado mediante un
marcador susceptible de generar directa o indirectamente una
señal.
51. Procedimiento según la reivindicación 45,
caracterizado porque el anti-ligando está
unido de manera covalente al grupo electro-donante
por medio de un segundo grupo de enlace.
52. Procedimiento según la reivindicación 51,
caracterizado porque el segundo grupo de enlace une el grupo
electro-donante al anti-ligando por
medio de un brazo de acoplamiento.
53. Procedimiento según las reivindicaciones 47
y 48, caracterizado porque el polímero electroactivo es el
polipirrol constituido por lo menos por dos monómeros que consisten
cada uno en un núcleo pirrol, y porque el grupo
electro-donante es el ferroceno.
54. Procedimiento según las reivindicaciones 45
y 53, caracterizado porque el anti-ligando es
un polinucleótido sonda, susceptible de hibridar un polinucleótido
diana, en unas condiciones de hibridación apropiadas.
55. Procedimiento según la reivindicación 53,
caracterizado porque el núcleo pirrol está sustituido sobre
el carbono en posición 3.
56. Procedimiento según la reivindicación 53,
caracterizado porque el polipirrol es un copolímero y
comprende un monómero cuyo núcleo pirrol está sustituido por un
grupo -CH_{2}-COOH o
-CH_{2}-CH_{2}OH.
57. Procedimiento según la reivindicación 51,
caracterizado porque el segundo grupo de enlace, entre el
ferroceno y el polinucleótido sonda es el grupo -CO-.
58. Procedimiento según la reivindicación 57,
caracterizado porque el segundo grupo de enlace une el
ferroceno al polinucleótido sonda por medio de un brazo de
acoplamiento.
59. Procedimiento según la reivindicación 58,
caracterizado porque el brazo de acoplamiento es una cadena
hidrocarbonada saturada que tiene por lo menos dos átomos de
carbono, preferentemente por lo menos 2 ó 3 átomos de carbono.
60. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 53 a 59, caracterizado porque el
polinucleótido sonda está fijado al ferroceno por medio
respectivamente del segundo y/o del tercer grupo de enlace y de por
lo menos una de las funciones aminadas del polinucleótido sonda.
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