CN110261451A - 一种针对农药蝇毒磷分子识别的二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物的制备方法与应用 - Google Patents

一种针对农药蝇毒磷分子识别的二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物的制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种针对农药蝇毒磷分子识别的二茂铁标记的半抗原‑聚乙烯亚胺结合物的制备方法与应用。本发明利用b‑PEI特殊的多氨基结构，通过羧基和氨基的交联，将半抗原和二茂铁电化学探针同时固定在b‑PEI上，制备出二茂铁标记的半抗原‑聚乙烯亚胺结合物((hapten)3‑bPEI‑(Fc)5)，并将这种聚合物用在免疫传感器上并制备免疫传感器，可用于农药蝇毒磷的分子识别免疫传感器。

Description

一种针对农药蝇毒磷分子识别的二茂铁标记的半抗原-聚乙 烯亚胺结合物的制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，涉及一种针对农药蝇毒磷分子识别的二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物的制备方法及其在电化学免疫传感电极中的应用。
背景技术
欧盟标准规定在地表和地下水中任何一种农药的最高允许含量(the maximumadmissible concentration，MAC)为0.1mg/L。为了满足这一检测需要，必须建立快速而灵敏的农药检测方法。基于抗原(半抗原)与抗体的特异性识别，免疫传感器具有高的灵敏度和选择性。同时结合有机过渡金属化合物良好的光学和电化学的特性，以之作为新的探针来设计免疫传感器，可有效地放大免疫反应的信号并提高免疫传感器的灵敏度。
免疫传感器的设计关键在于将生物分子接受器(蛋白质，配体，寡核酸，细胞)在传感器元件表面的固定化，以及在该过程中如何保留生物分子活性、防止非特异性吸附以及控制其在表面的浓度。ITO电极和金电极可以在表面通过修饰直接或间接固定蛋白分子，同时具备优良的导电性，是良好的传感器电极材料。
含有氨基的高聚物如分支型聚乙烯亚胺(branched poly(ethylenimine)，b-PEI)，聚乙二胺树枝状聚合物(polyamidoamine(PAMAM)dendrimer)，聚烯丙胺(poly(allylamine))和聚赖氨酸(poly-(L-lysine))都可以在裸电极或修饰电极形成单层或多层膜。b-PEI是一种水溶性的多氨基高聚物，包含有一级、二级、三级胺(比例是1∶2∶1)。迄今为止，b-PEI已被用于在金属基底上固定聚(乙二醇)链来构建防污膜。同样b-PEI也被用于免疫传感器中固定抗体。
使用b-PEI用于免疫标记物的多重标记，可放大信号，提高检测灵敏度。为使免疫传感器具有更高的灵敏度与特异性，传感电极的修饰物的制备与修饰技术是一种重要手段。本专利利用b-PEI特殊的多氨基结构，通过羧基和氨基的交联，将半抗原和二茂铁电化学探针同时固定在b-PEI上，制备出二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物((hapten)3-bPEI-(Fc)5)，并将这种聚合物用在免疫传感器上并制备免疫传感器，从而实现对农药蝇毒磷的特异灵敏检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种针对农药蝇毒磷分子识别的二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物的制备方法与应用。
本发明所提供的二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物，利用分支型聚乙烯亚胺(b-PEI)同时交联免疫半抗原和探针分子二茂铁的原理制备得到。
所述二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物是一种化合物，其分子结构式为：
(Hapten)n-bPEI-(Fc)m
所述半抗原分子结构式为：
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
针对农药蝇毒磷分子识别的二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物的制备方法：
S1：取15.0mg半抗原溶解于1000μL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后分别加入17.2mg N，N-二环己基碳酰亚胺(DCC)及9.6mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，常温下避光搅拌4h，离心后将上清液加入到4g/L的b-PEI的甲醇溶液中搅拌过夜，得到混合液A液；
S2：取13.6mg二茂铁乙酸溶解于500μL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后分别加入17.3mg N，N-二环己基碳酰亚胺(DCC)和9.6mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，常温下避光搅拌4h，离心后将上清液加入到2.5mL混合液A液中，避光搅拌4h，得到新的混合液B液；
S3：将混合液A液和混合液B液干燥后分别溶于4mL超纯水中，离心除去不溶物，所得溶液在1L超纯水中常温透析64h，获得半抗原-聚乙烯亚胺结合物和二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物。
本发明所提供的二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物，以ITO电极或金电极为基底电极并结合强弱抗原在宽谱型抗体上的竞争性，可用于检测农药蝇毒磷的电化学免疫传感器。拥有优秀的灵敏度和特异性，为农药检测提供了一种新方法。
ITO电极的修饰方法具体步骤如下：
S1：取已制备好的ITO电极，依次在丙酮，无水乙醇，纯水中超声清洗2min，室温晾干备用；
S2：将预处理后的ITO电极置于含50mmol/L邻氨基苯甲酸(o-ABA)的1mol/L硫酸溶液中，在0V～1.0V内利用循环伏安法反复扫描20圈，扫描速率为100mV/s，所得电极用PBS溶液清洗2次以除去附在电极表面的硫酸溶液，得到聚合o-ABA修饰ITO电极；
S3：在工作电极上滴加100μL EDC/NHS溶液(1mg/100μL)，活化10min，抽去反应后的EDC/NHS溶液后，再向修饰电极表面滴加50μL多克隆抗体(10μg/mL，反应20min。抽去反应后的抗体溶液，用含0.05％Tween20的PBS溶液清洗电极三次，每次60μL。所得电极用1mol/L乙醇胺溶液(pH8.5)封板30min后再用PBS溶液清洗三次，得到ITO修饰电极。
金电极的修饰方法具体步骤如下：
S1：取已制备好的金电极，在新鲜配制的Piranha溶液中(V浓硫酸∶V双氧水＝3∶1)浸泡10min，用超纯水淋洗干净后，分别在0.30及0.05μm氧化铝粉中抛光至镜面并分别用无水乙醇，纯水各超声波处理1min，浸泡在1mol/L硫酸溶液中，在0.2～1.6V电压下循环扫描20圈，然后将所得电极置于1mmol/L 11-巯基十一酸和6-巯基己醇混合溶液(体积比为1∶1)中自组装过夜，得到SAMs(11-巯基十一酸和6-巯基己醇混合自组装膜)修饰金电极。
S2：将SAMs修饰金电极分别用乙醇和超纯水清洗1分钟以除去不稳定吸附的巯醇分子，随后电极在100μL EDC/NHS溶液(1mg/100μL)中活化10min。抽去反应的EDC/NHS溶液后，电极置于50μL 10μg/mL的多克隆抗体PBS溶液中反应20min，抽去反应后的抗体溶液，电极用含0.05％Tween20的PBS溶液清洗三次，每次60μL，所得电极用1mol/L乙醇胺溶液(pH8.5)封板30min后再用PBS溶液清洗三次，得到自组装膜修饰金电极。
本发明的有益效果是：
(1)本发明依靠免疫学、免疫化学和生物化学基本原理，利用b-PEI制备了二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物((hapten)3-bPEI-(Fc)5)，在ITO电极上固定多克隆抗体及(hapten)3-bPEI-(Fc)5，制备了检测农药蝇毒磷的电化学免疫传感器。该方法充分发挥了宽谱特异性抗体免疫检测法的宽识别作用，且新的标记方法有望用于新型传感器的构建。
(2)本发明制备方法简易可行，成本较低，(hapten)3-bPEI-(Fc)5产率较高。
(3)本发明克服了现有农药检测技术中复杂、耗时等不适用于快速检测的缺点，具有检测速度快、灵敏度高、特异性强等优点。
附图说明
利用附图对发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它附图。
图1是二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物制备过程图；
图2是ITO免疫传感器的检测原理示意图；
图3是(hapten)3-bPEI-(Fc)5修饰的ITO免疫电极在含0.1mol/L KCI的PBS(10mmol/L，pH 7.0)溶液中的循环伏安图，扫描速度100mV/s；
图4(A)是(hapten)3-bPEI-(Fc)5修饰的ITO免疫电极在含0.1mol/L KCI的PBS(10mmol/L，pH7.0)溶液中随扫描速度变化的循环伏安图；
图4(B)是Fc氧化峰电流与扫描速度的关系图；
图4(C)是Fc氧化峰电量与扫描速度的关系图；
图5是(hapten)3-bPEI-(Fc)5上ITO电极(A)和金电极(B)的差分脉冲伏安图，扫描速度100mV/s；
图6是ITO电极上不同浓度的蝇毒磷农药置换(hapten)3-bPEI-(Fc)5后的差分脉冲伏安图；
图7是(hapten)3-bPEI-(Fc)5在多克隆抗体(A)和兔抗小鼠IgG(B)修饰的ITO电极上的差分脉冲伏安图，扫描速度100mV/s。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，结合以下具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
实施例1
二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物的制备：
(1)取15.0mg半抗原溶解于1000μL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后分别加入17.2mg N，N-二环己基碳酰亚胺(DCC)及9.6mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，常温下避光搅拌4h，离心后将上清液加入到4g/L的b-PEI的甲醇溶液中搅拌过夜，得到混合液A液；(2)取13.6mg二茂铁乙酸溶解于500μL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后分别加入17.3mg N，N-二环己基碳酰亚胺(DCC)和9.6mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，常温下避光搅拌4h，离心后将上清液加入到2.5mL混合液A液中，避光搅拌4h，得到新的混合液B液；
(3)将混合液A液和混合液B液干燥后分别溶于4mL超纯水中，离心除去不溶物，所得溶液在1L超纯水中常温透析64h，获得半抗原-聚乙烯亚胺结合物和二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物。
具体制备过程见附图1。
实施例2
免疫传感器修饰电极的制备与对比：
一、ITO修饰电极的制备：
(1)取已制备好的ITO电极，依次在丙酮，无水乙醇，纯水中超声清洗2min，室温晾干备用；
(2)将预处理后的ITO电极置于含50mmol/L邻氨基苯甲酸(o-ABA)的1mol/L硫酸溶液中，在0V～1.0V内利用循环伏安法反复扫描20圈，扫描速率为100mV/s，所得电极用PBS溶液清洗2次以除去附在电极表面的硫酸溶液，得到聚合o-ABA修饰ITO电极；
(3)在工作电极上滴加100μL EDC/NHS溶液(1mg/100μL)，活化10min，抽去反应后的EDC/NHS溶液后，再向修饰电极表面滴加50μL多克隆抗体(10μg/mL，反应20min。抽去反应后的抗体溶液，用含0.05％Tween20的PBS溶液清洗电极三次，每次60μL。所得电极用1mol/L乙醇胺溶液(pH8.5)封板30min后再用PBS溶液清洗三次，得到ITO修饰电极。
二、自组装膜修饰金电极的制备：
(1)取已制备好的金电极，在新鲜配制的Piranha溶液中(V浓硫酸∶V双氧水＝3∶1)浸泡10min，用超纯水淋洗干净后，分别在0.30及0.05μm氧化铝粉中抛光至镜面并分别用无水乙醇，纯水各超声波处理1min，浸泡在1mol/L硫酸溶液中，在0.2～1.6V电压下循环扫描20圈，然后将所得电极置于1mmol/L 11-巯基十一酸和6-巯基己醇混合溶液(体积比为1∶1)中自组装过夜，得到SAMs(11-巯基十一酸和6-巯基己醇混合自组装膜)修饰金电极。
(2)将SAMs修饰金电极分别用乙醇和超纯水清洗1分钟以除去不稳定吸附的巯醇分子，随后电极在100μL EDC/NHS溶液(1mg/100μL)中活化10min。抽去反应的EDC/NHS溶液后，电极置于50μL 10μg/mL的多克隆抗体PBS溶液中反应20min，抽去反应后的抗体溶液，电极用含0.05％Tween20的PBS溶液清洗三次，每次60μL，所得电极用1mol/L乙醇胺溶液(pH8.5)封板30min后再用PBS溶液清洗三次，得到自组装膜修饰金电极。
三、ITO电极与金电极作为基底电极的性能测试
取修饰好的ITO电极或金电极，滴加50μL(hapten)3-bPEI-(Fc)5溶液，反应120min，用60μL含0.05％Tween20的PBS溶液清洗电极三次。再将电极置于含0.1mol/L KCI的PBS(10mmol/L，pH7.0)溶液中采用差分脉冲伏安法检测电化学信号。电位窗口0.6V～0.2V，电位增量0.004V，振幅0.05V，脉冲周期0.5s。
测试得到差分脉冲伏安图可见附图5，结果显示修饰好的ITO电极性能更加优越。
实施例3
农药蝇毒磷的电化学检测：
一、响应特性检测
将实施例1与实施例2制备得到的(hapten)3-bPEI-(Fc)5/antibody/ITO电极中加入一定浓度的蝇毒磷农药溶液，温育2h，利用差分脉冲伏安法直接测定电极表面剩余的Fc产生的信号。
检测结果可见附图6，蝇毒磷的浓度在100～1000ng/mL的浓度范围内与峰电流下降呈现良好的线性关系，采用Δ/(％)表示峰电流下降的百分比。线性方程为Δ/(％)＝4.13+0.0921c(ng/mL)，相关系数为0.9937，检出限为9.5ng/mL，证明制备的免疫传感器电极响应时间段，反应灵敏。
二、选择性检测
在同等条件下，将实施例2中的多克隆抗体替换成兔抗小鼠IgG，进行ITO修饰电极的制备：
(1)取已制备好的ITO电极，依次在丙酮，无水乙醇，纯水中超声清洗2min，室温晾干备用；
(2)将预处理后的ITO电极置于含50mmol/L邻氨基苯甲酸(o-ABA)的1mol/L硫酸溶液中，在0V～1.0V内利用循环伏安法反复扫描20圈，扫描速率为100mV/s，所得电极用PBS溶液清洗2次以除去附在电极表面的硫酸溶液，得到聚合o-ABA修饰ITO电极；
(3)在工作电极上滴加100μL EDC/NHS溶液(1mg/100μL)，活化10min，抽去反应后的EDC/NHS溶液后，再向修饰电极表面滴加50μL兔抗小鼠IgG(10μg/mL，反应20min。抽去反应后的抗体溶液，用含0.05％Tween20的PBS溶液清洗电极三次，每次60μL。所得电极用1mol/L乙醇胺溶液(pH8.5)封板30min后再用PBS溶液清洗三次，得到ITO修饰电极。
将制备得到的ITO修饰电极与实施例1制备得到的(hapten)3-bPEI-(Fc)5/antibody/ITO电极中加入一定浓度的蝇毒磷农药溶液，温育2h，利用差分脉冲伏安法直接测定电极表面剩余的Fc产生的信号。
检测结果可见附图7，多克隆抗体修饰的ITO电极对(hapten)3-bPEI-(Fc)5具有良好的选择性，证明制备的免疫传感器电极具备优秀的选择性与特异性。
表征分析
附图2是ITO免疫传感器的检测原理示意图。在经过预处理的ITO电极上，电聚合一层o-ABA(图2a)，通过EDC/NHS活化电极表面的羧基，交联多克隆抗体，使其固定在电极表面(图2b)。清洗除去未交联的抗体后，加入(hapten)3-bPEI-(Fc)5溶液，通过半抗原和抗体的特异性结合，实现(hapten)3-bPEI-(Fc)5在电极表面的固定化。此时，(hapten)3-bPEI-(Fc)5中的二茂铁能在电极表面发生氧化还原反应，产生电流信号(图2c)。当往电极表面引入强抗——蝇毒磷农药分子时，蝇毒磷会与半抗原产生竞争，农药分子优先与抗体结合，此时(hapten)3-bPEI-(Fc)5游离到溶液中，二茂铁与电极表面的距离增大导致电信号下降(图2d)。由于二茂铁分子的电流响应受其与电极表面距离的影响较明显，当一个b-PEI分子中含有多个二茂铁分子时，这种影响因素被放大，使得该传感器具有较高的灵敏度。
附图3是(hapten)3-bPEI-(Fc)5修饰的ITO免疫电极在含0.1mol/L KCI的PBS(10mmol/L，pH 7.0)溶液中的循环伏安图，扫描速度100mV/s。从循环伏安曲线图中可以看到，在392mV处和331mV处分别出现一个氧化峰和还原峰，式电位(Eo′)为358±4mV，峰分离(ΔEp)为60±1mV(n＝5)，该氧化还原过程为可逆过程，归属于二茂铁/二茂铁离子(Fc/Fc+)的氧化还原。
附图4(A)是(hapten)3-bPEI-(Fc)5修饰的ITO免疫电极在含0.1mol/L KCI的PBS(10mmol/L，pH7.0)溶液中随扫描速度变化的循环伏安图的循环伏安图，扫描速度分别为25mV/s，50mV/s，75mV/s，100mV/s，125mV/s，150mV/s，200mV/s，250mV/s。附图4(B)是Fc氧化峰电流与扫描速度的关系图，Fc的氧化峰电流随扫描速度增加而呈线性增加，其相关系数R为0.9950，表明Fc在电极表面的氧化还原为表面控制过程。图4(C)是Fc氧化峰电量与扫描速度的关系图，表明氧化峰电量与扫描速度无关，说明电极表面的膜与电极之间进行快速电子交换。
附图5是(hapten)3-bPEI-(Fc)5上ITO电极(A)和金电极(B)的差分脉冲伏安图，扫描速度100mV/s。从图中可看出，在ITO电极上表现为良好的还原峰，峰电流较大，峰电位在408mV(A)；在金电极上得到的还原峰峰型差，基线明显漂移，峰电流较小，峰电位在420mV(B)。这可能是由于SAM膜排列较为紧密，在电极表面阻碍了二茂铁的电子传递。另外，采用11-巯基十一酸作为交联物质，增加了Fc与电极表面的距离，导致电子传递性能较差。
附图6是ITO电极上不同浓度的蝇毒磷农药置换(hapten)3-bPEI-(Fc)5后的差分脉冲伏安图。结果表明，蝇毒磷的浓度在100～1000ng/mL的浓度范围内与峰电流下降呈现良好的线性关系，采用Δ/(％)表示峰电流下降的百分比，线性方程为Δ/(％)＝4.13+0.0921c ng/mL)，相关系数为0.9937，检出限为9.5ng/mL。
附图7是(hapten)3-bPEI-(Fc)5在多克隆抗体(A)和兔抗小鼠IgG(B)修饰的ITO电极上的差分脉冲伏安图，扫描速度100mV/s。从图中可看出，曲线A为多克隆抗体修饰的ITO电极，该抗体可以与(hapten)3-bPEI-(Fc)5中的半抗原特异性识别，Fc出现明显的电流响应。而当抗体为为兔抗小鼠IgG时，电极几乎没有电流响应，表明(hapten)3-bPEI-(Fc)s并没有与抗体产生特异性识别，仅出现极少量的非特异性吸附。说明该电极对(hapten)3-bPEI-(Fc)5具有良好的选择性。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经过适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。本发明中所未详细描述的技术细节，均可通过本领域中的任一现有技术实现。特别的，本发明中所有未详细描述的技术特点均可通过任一现有技术实现。

Claims (8)

1.一种针对农药蝇毒磷分子识别的二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物的制备方法，其特征在于，所述二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物((hapten)3-bPEI-(Fc)5)的分子结构式为：
2.一种针对农药蝇毒磷分子识别的二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物的制备方法，其特征在于，所述二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物利用分支型聚乙烯亚胺(b-PEI)同时交联免疫半抗原和探针分子二茂铁的原理制备得到。
3.根据权利要求1或2所述的一种针对农药蝇毒磷分子识别的二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物的制备方法，其特征在于，该制备方法的具体步骤如下：
S1：取15.0mg半抗原溶解于1000μL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后分别加入17.2mgN，N-二环己基碳酰亚胺(DCC)及9.6mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，常温下避光搅拌4h，离心后将上清液加入到4g/L的b-PEI的甲醇溶液中搅拌过夜，得到混合液A液；
S2：取13.6mg二茂铁乙酸溶解于500μL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后分别加入17.3mg N，N-二环己基碳酰亚胺(DCC)和9.6mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，常温下避光搅拌4h，离心后将上清液加入到2.5mL混合液A液中，避光搅拌4h，得到新的混合液B液；
S3：将混合液A液和混合液B液干燥后分别溶于4mL超纯水中，离心除去不溶物，所得溶液在1L超纯水中常温透析64h，获得半抗原-聚乙烯亚胺结合物和二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物。
4.如权利要求3所述的半抗原，其特征在于，所述半抗原的分子结构式为：
5.如权利要求3所述方法制备的二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物的应用，其特征在于，所述二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物可用于免疫传感器上并制备免疫传感器。
6.根据权利要求5所述的二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物的应用，其特征在于，所述二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物，以ITO电极或金电极为基底电极并修饰多克隆抗体，可用于检测农药蝇毒磷的电化学免疫传感器。
7.如权利要求6所述的ITO电极修饰方法，其特征在于，该制备方法的具体步骤如下：
S1：取已制备好的ITO电极，依次在丙酮，无水乙醇，纯水中超声清洗2min，室温晾干备用；
S2：将预处理后的ITO电极置于含50mmol/L邻氨基苯甲酸(o-ABA)的1mol/L硫酸溶液中，在0V～1.0V内利用循环伏安法反复扫描20圈，扫描速率为100mV/s，所得电极用PBS溶液清洗2次以除去附在电极表面的硫酸溶液，得到聚合o-ABA修饰ITO电极；
S3：在工作电极上滴加100μL EDC/NHS溶液(1mg/100μL)，活化10min，抽去反应后的EDC/NHS溶液后，再向修饰电极表面滴加50μL多克隆抗体(10μg/mL，反应20min。抽去反应后的抗体溶液，用含0.05％Tween20的PBS溶液清洗电极三次，每次60μL。所得电极用1mol/L乙醇胺溶液(pH8.5)封板30min后再用PBS溶液清洗三次，得到ITO修饰电极。
8.如权利要求6所述的金电极修饰方法，其特征在于，该制备方法的具体步骤如下：
S1：取已制备好的金电极，在新鲜配制的Piranha溶液中(V浓硫酸∶V双氧水＝3∶1)浸泡10min，用超纯水淋洗干净后，分别在0.30及0.05μm氧化铝粉中抛光至镜面并分别用无水乙醇，纯水各超声波处理1min，浸泡在1mol/L硫酸溶液中，在0.2～1.6V电压下循环扫描20圈，然后将所得电极置于1mmol/L11-巯基十一酸和6-巯基己醇混合溶液(体积比为1∶1)中自组装过夜，得到SAMs(11-巯基十一酸和6-巯基己醇混合自组装膜)修饰金电极。
S2：将SAMs修饰金电极分别用乙醇和超纯水清洗1分钟以除去不稳定吸附的巯醇分子，随后电极在100μL EDC/NHS溶液(1mg/100μL)中活化10min。抽去反应的EDC/NHS溶液后，电极置于50μL 10μg/mL的多克隆抗体PBS溶液中反应20min，抽去反应后的抗体溶液，电极用含0.05％Tween20的PBS溶液清洗三次，每次60μL，所得电极用1mol/L乙醇胺溶液(pH8.5)封板30min后再用PBS溶液清洗三次，得到自组装膜修饰金电极。
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