CN104267190B - 一种检测表皮生长因子的电化学免疫传感器及其制备方法 - Google Patents

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    • G01N2333/485—Epidermal growth factor [EGF] (urogastrone)

Abstract

本发明公开了一种检测表皮生长因子的电化学免疫传感器及其制备方法。该传感器由下至上依次由玻碳电极、修饰层a、修饰层b和修饰层c组成；其中，修饰层a为由式Ia或式Ib所示聚多巴胺构成的膜：式Ia和式Ib中，n均为1000-15000；修饰层b由表皮生长因子和谷胱甘肽构成，且所述表皮生长因子和谷胱甘肽均粘附于所述修饰层a上；修饰层c由表皮生长因子抗体修饰的纳米银溶胶制得。本发明通过表皮生长因子与其抗体的特异免疫识别反应，可构筑检测表皮生长因子的电化学免疫传感器。该传感器灵敏度良好、线性范围较宽，检出限低达0.2nmol/L，并有望用于实际样品中表皮生长因子的检测。式Ia式Ib。

Description

一种检测表皮生长因子的电化学免疫传感器及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种检测表皮生长因子的电化学免疫传感器及其制备方法。
背景技术
表皮生长因子(EGF)是由Cohen(1962)首次在小鼠的颌下腺中发现的一种多肽，由53个氨基酸残基组成，分子量为6201Da[吕文成，郭洪波等.中华器官移植杂志，1998.19(1)：7-8]。EGF能刺激外胚层和内胚层起源的各种细胞如角膜、上皮、乳腺、肝和肾上腺髓质细胞等，使其增殖。其在创面愈合，创伤性骨折，肝损伤的修复和再生，神经干细胞增殖，皮肤细胞更新等方面均有作用。因此，需要建立一种灵敏度高，快速有效的检测表皮生长因子的方法。
目前存在EGF的临床检测方法，有ESLIA检测法[吴学诗，夏勇等.国外医学临床生物化学与检验学分册，2005.26(12)：869-871]、放射免疫分析法[陆明，王玉玘.放射免疫学杂志，2011.24(6)：628-629]、比色法等。但这些方法均存在不足。ESLIA检测法虽具有灵敏度高、特异性强等特点，但该方法抗干扰性差、市场出售的ESLIA试剂盒质量参差不齐；放射免疫测定法虽具有操作简便、成本低等优点，但该法不能检测低含量物质，放射性污染严重，被测物和标准物均不能全部参与反应，因此应用范围不广；比色法虽具有灵敏度高、经济等优点，但该法操作步骤冗长，且实验中所用的有机溶剂对人体有害。
发明内容
本发明的目的是提供一种电化学免疫传感器及其制备方法。
本发明提供的电化学免疫传感器，由下至上依次由电极、修饰层a、修饰层b和修饰层c组成；
其中，所述电极为玻碳电极；
所述修饰层a为由式Ia或式Ib所示聚多巴胺构成的膜：
式Ia
式Ib
所述式Ia和式Ib中，n均为1000-15000；
所述修饰层b由表皮生长因子(EGF)和谷胱甘肽(GSH)构成，且所述表皮生长因子(EGF)和谷胱甘肽(GSH)均粘附于所述修饰层a上；
所述修饰层c由表皮生长因子抗体修饰的纳米银溶胶制得；
所述参比电极为银/氯化银电极；
所述对电极为铂丝电极。
上述传感器中，所述表皮生长因子抗体修饰的纳米银溶胶中，纳米银颗粒的粒径为50-100nm。
所述表皮生长因子抗体修饰的纳米银溶胶为按照包括如下步骤的方法制备而得：
1)将巯基乙酸和纳米银溶胶于pH值为中性的条件下反应10-30min，得到巯基乙酸修饰的纳米银溶胶；
2)于pH值为5-6的条件下，将步骤1)所得巯基乙酸修饰的纳米银溶胶、EDC的水溶液和NHS的水溶液混合搅拌10-30min，得到活化的纳米银溶胶；
3)将步骤2)所得活化的纳米银溶胶与表皮生长因子抗体于摇床中振荡1-4h，调节体系的pH值至中性，得到所述表皮生长因子抗体修饰的纳米银溶胶。
该方法步骤1)中，所述纳米银溶胶中，纳米银颗粒的粒径为20-50nm；
所述反应步骤中，时间具体为15min；
所述纳米银溶胶为按照包括如下步骤的方法制备而得：将NaBH4的水溶液与AgNO3的水溶液于冰水浴中进行反应5-20min，反应完毕而得；所述反应步骤中，时间具体为10min；所述NaBH4的水溶液的浓度为1×10-3mol/L-5×10-3mol/L，具体为2×10-3mol/L；
所述AgNO3的水溶液的浓度为0.5×10-3mol/L-3×10-3mol/L，具体为1×10-3mol/L；
所述NaBH4的水溶液与AgNO3的水溶液的体积比具体为4：1；
所述步骤2)中，EDC的水溶液和NHS的水溶液的浓度均为1×10-3mol/L-5×10-3mol/L，具体为2×10-3mol/L；EDC的水溶液和NHS的水溶液的体积比为1：1；所述纳米银溶胶中的纳米银颗粒、EDC和NHS的摩尔比为0.5mmol：0.5mmol。
本发明提供的制备所述电化学传感器的方法，包括如下步骤：
1)将所述电极浸泡于多巴胺的tris缓冲溶液中浸泡30min后，用二次水洗涤并浸泡，于空气中静置晾干8h后，在所述电极表面得到所述修饰层a；
2)将步骤1)所得电极于EGF的水溶液中浸泡30min后，再于谷胱甘肽(GSH)的PBS缓冲液中浸泡30min，即在所述修饰层a上得到所述修饰层b；
3)将步骤2)所得电极浸泡于前述表皮生长因子抗体修饰的纳米银溶胶中孵育1h，得到所述电化学传感器。
上述方法的步骤1)中，多巴胺的tris缓冲溶液的pH值为8-9，具体为8.5，浓度为0.05-0.2mg/ml，具体为0.1mg/ml；所述纳米银溶胶中，纳米银颗粒的粒径为20-50nm；
所述步骤2)中，EGF的水溶液的浓度为10μM；所述GSH的PBS缓冲液的pH值为7.0，浓度为20mg/ml；EDC的水溶液和NHS的水溶液的浓度均为2×10-3mol/L；所述纳米银溶胶中的纳米银颗粒、EDC和NHS的摩尔比为0.5mmol：0.5mmol；
所述步骤3)振荡步骤中，时间为2小时。
另外，上述本发明提供的电化学传感器在检测EGF含量中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明的优势在于：
1)通过多巴胺在碱性环境下被氧气氧化并且聚合自组装于玻碳电极表面，通过其高粘滞能力捕捉EGF，用谷胱甘肽(GSH)作为多巴胺薄膜的封闭剂，再用表皮生长因子抗体修饰的纳米银特异性识别EGF，制备了检测EGF的电化学免疫传感器；该传感器可高强度粘滞待检测的EGF，且薄膜具有优良的稳定性；
2)纳米银颗粒体积小、比表面积大，可负载大量抗体，提高抗体修饰的纳米银对EGF识别的灵敏度；
3)该电化学免疫传感器表现出良好的准确性、检测灵敏度高，检测迅速、方便。
附图说明
图1为整个实验过程关键步骤的流程图：其中，A图为制备表皮生长因子抗体修饰的纳米银的关键步骤；B图为制备PDA薄膜并用其捕捉EGF，及免疫反应用于EGF检测的相关步骤。
图2为表皮生长因子抗体修饰的纳米银识别聚多巴胺薄膜上的EGF的SEM照片：其中，(a)图为固定了PDA的薄膜与10μmol/LEGF作用后，用谷胱甘肽封闭，然后与表皮生长因子抗体修饰的纳米银作用的SEM图；(b)图为固定了PDA的薄膜直接用谷胱甘肽封闭，然后与表皮生长因子抗体修饰的纳米银作用的SEM图。
图3为在1mmol/L铁氰化钾(0.1mol/LPBS，pH7.0)的电化学探针溶液中，空白玻碳电极(a)，玻碳电极修饰聚多巴胺薄膜(b)、玻碳电极修饰聚多巴胺薄膜并且黏附EGF(c)、玻碳电极修饰聚多巴胺薄膜，黏附EGF后用谷胱甘肽封闭(d)玻碳电极修饰聚多巴胺薄膜，黏附EGF，谷胱甘肽封闭，与表皮生长因子抗体修饰的纳米银作用后(e)的循环伏安曲线。
图4为不同EGF浓度的电化学传感器以lg(ΔI/I1)对浓度的线性关系曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。
下述实施例中，所述多巴胺、氢氧化钾购自Sigma-Aldrich公司；
表皮生长因子(EGF)(1mg)购自北京博奥森生物技术有限公司；
表皮生长因子抗体(1g/L，PBSpH7.4缓冲液保护)购自北京翰谱医药生物研究所；
铁氰化钾、磷酸二氢钾、硝酸银、硼氢化钠购自天津光复试剂公司；
巯基乙酸、EDC、NHS购自上海阿拉丁试剂有限公司；
整个实验过程用的均是二次蒸馏水。
制作电化学免疫传感器工作曲线，具体包括以下步骤：
将参比电极——银/氯化银电极，对电极——铂丝电极和上述制备的工作电极正确连接于电化学工作站；
以1mmol/L铁氰化钾(0.1mol/LPBS，pH7.0)为探针，通过循环伏安法测定传感器对表皮生长因子的粘附和表皮生长因子抗体修饰的纳米银对表皮生长因子的特异性识别，绘制工作曲线。
实施例1、制备聚多巴胺粘滞层，用实施例1所得功能化纳米银识别检测EGF
一、制备纳米银溶胶
将10ml1×10-3MAgNO3的水溶液逐滴加入至用磁力搅拌器搅拌的冰水浴中的40ml2×10-3MNaBH4的水溶液中，待AgNO3的水溶液滴加完毕后，持续磁力搅拌反应10min，得到纳米银溶胶，其中，纳米银为亮黄色透明状。
二、制备表皮生长因子抗体修饰的纳米银溶胶
1)取3μl用KOH浓溶液调至pH至中性的巯基乙酸，加入至5ml纳米银溶胶，磁力搅拌反应15min，得到巯基乙酸修饰的纳米银溶胶；
2)将巯基乙酸修饰的纳米银溶胶的pH调节至5-6，将250μl2×10-3mol/LEDC的水溶液和250μl2×10-3mol/LNHS的水溶液加入至巯基乙酸修饰的纳米银溶胶中，磁力搅拌15min，得到活化的纳米银溶胶；
3)取100μl活化的纳米银溶胶与20μl表皮生长因子抗体于摇床振荡2hour，用KOH溶液调节溶胶pH至中性，得到表皮生长因子抗体修饰的纳米银溶胶。
图1中A图为制备表皮生长因子抗体修饰的纳米银的关键步骤；B图为制备PDA薄膜并用其捕捉EGF及免疫反应用于EGF检测的相关步骤。由图可知，表皮生长因子抗体通过羧基和氨基的反应修饰于纳米银表面，表皮生长因子抗体可特异性识别EGF。
三、制备电化学传感器
1)玻碳电极预处理：将玻碳电极依次用0.3μm、0.05μm的氧化铝粉在电极布上抛光至镜面后，在二次水中超声清洗两次，每次清洗2-5分钟，再烘干，再将玻碳电极在1mM的铁氰化钾溶液中，在-0.4V至0.7V区间进行循环伏安扫描，扫描速度为100mV﹒S-1，直到获得典型的循环伏安谱图，得到一个干净的玻碳电极，完成预处理；
循环伏安检测中，电位扫描范围为-0.4-0.7V；扫速为100mV﹒S-1。电极浸泡在0.1mg/ml的多巴胺tris缓冲液中(pH8.5),浸泡30min；修饰聚多巴胺薄膜的电极浸泡于10μM100μl的EGF样品，浸泡30min；固定了EGF的电极浸泡于20mg/ml100μlGSH(PBSpH7.0缓冲液)溶液中，浸泡30min；用GSH封闭了的电极浸泡于表皮生长因子抗体修饰的纳米银溶胶中，孵育1hour。
将预处理后的玻碳电极表面用二次水冲洗干净，浸泡在0.1mg/ml的多巴胺tris缓冲液中(pH8.5)，浸泡30min后用二次水冲洗电极，再用二次水浸泡电极5min，静置8hour，在玻碳电极表面得到修饰层a聚多巴胺薄膜；
2)将步骤1)所得电极浸泡于10μM100μl的EGF的水溶液中，浸泡30min后，再浸泡于20mg/ml100μlGSH的PBS(pH7.0)缓冲液中浸泡30min，即在修饰层a上得到修饰层b；
3)将步骤2)所得电极浸泡于表皮生长因子抗体修饰的纳米银溶胶中孵育1h，得到本发明提供的电化学传感器。
图2是上述步骤所述表皮生长因子抗体修饰的纳米银捕获固定于聚多巴胺薄膜的EGF的SEM图，
(a)图为PDA薄膜上粘附了EGF，并用谷胱甘肽封闭，然后与表皮生长因子修饰的纳米银作用；
(b)图作为空白对照，为PDA薄膜上未粘附EGF，只用谷胱甘肽封闭，与表皮生长因子修饰的纳米银作用。
两图比较，可看出(a)图中由于电极表面存在EGF，其可以通过免疫结合能力与抗体作用，把表皮生长因子抗体修饰的纳米银“捕获”于电极表面；而电极表面不存在EGF时，由于电极表面和表皮生长因子抗体修饰的纳米银无特异性相互作用，所以电极没有明显的纳米银的存在，所以基于(a)图可以说明该电极修饰界面可以用于EGF的检测。
图3是构筑检测表皮生长因子的免疫电化学传感器中关键步骤的循环伏安曲线图，其中：
a曲线为空白玻碳电极的循环伏安图；
b曲线为玻碳电极表面覆盖聚多巴胺薄膜以后的循环伏安图；
c曲线为b曲线中所用的电极表面粘附EGF后的循环伏安图；
d曲线为c曲线中所用的电极表面用GSH封闭后的循环伏安图；
e曲线为d曲线中所用的电极表面与皮生长因子抗体修饰的纳米银作用后的循环伏安图。
由图可知，从曲线a到曲线e，以铁氰化钾为探针表征电极表面修饰物的覆盖情况，每种物质覆盖电极后，电化学探针的氧化峰还原峰的峰电位差值均增大，峰电流依次减小，说明每步的修饰物质都成功固定于电极表面，进一步阻碍了电极表面电子的传递。
实施例2
按照实施例1的步骤，将加入AgNO3溶液后持续磁搅拌时间替换为5min；加入巯基乙酸后持续磁搅拌时间替换为10min；加入EDC、NHS溶液后磁搅拌时间替换为10min；摇床振荡时间替换为1hour。
将实施例1步骤中，NaBH4溶液浓度替换为1×10-3mol/L；AgNO3溶液浓度替换为0.5×10-3mol/L；EDC溶液浓度替换为1×10-3mol/L，NHS溶液浓度替换为1×10-3mol/L，；表皮生长因子抗体体积替换为10μl；循环伏安检测中，电位扫速为50mV﹒S-1。
将实施例1步骤中，电极浸泡在多巴胺tris缓冲液中，浸泡时间替换为20min，修饰聚多巴胺薄膜的电极浸泡EGF样品，浸泡时间替换为20min；固定了EGF的电极浸泡于GSH溶液，浸泡时间替换为20min；GSH封闭了的电极浸泡于表皮生长因子抗体修饰的纳米银溶胶中，孵育时间替换为30min。
所得聚多巴胺薄膜的表观形态为平面致密结构。
实施例3
按照实施例1的步骤，将加入AgNO3溶液后持续磁搅拌时间替换为20min；加入巯基乙酸后持续磁搅拌时间替换为30min；加入EDC、NHS溶液后磁搅拌时间替换为30min；摇床振荡时间替换为4hour。
将实施例1步骤中，NaBH4溶液浓度替换为5×10-3mol/L；AgNO3溶液浓度替换为3×10-3mol/L；EDC溶液浓度替换为5×10-3mol/L，NHS溶液浓度替换为5×10-3mol/L，；表皮生长因子抗体体积替换为40μl；循环伏安检测中，电位扫速为200mV﹒S-1。
将实施例1步骤中，电极浸泡在多巴胺tris缓冲液中，浸泡时间替换为40min，修饰聚多巴胺薄膜的电极浸泡EGF样品，浸泡时间替换为40min；固定了EGF的电极浸泡于GSH溶液，浸泡时间替换为40min；GSH封闭了的电极浸泡于表皮生长因子抗体修饰的纳米银溶胶中，孵育时间替换为2hour。
所得聚多巴胺薄膜的表观形态为平面致密结构。
实施例4、不同浓度EGF含量检测
按照实施例2的步骤，将步骤1)所得电极浸泡于如下浓度的EGF的水溶液中：0.1pM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM、100nM，其他条件不变，得到不同EGF浓度的电化学传感器。
对上述不同EGF浓度的电化学传感器进行循环伏安检测。
固定了PDA的薄膜与EGF作用后，用谷胱甘肽封闭，电极的循环伏安图上电流记为I1；然后与表皮生长因子抗体修饰的纳米银作用后，电极的循环伏安图上电流记为I2；
上述两个峰电流差值记为ΔI＝I1-I2；
对于不同EGF浓度的电化学传感器，以lg(ΔI/I1)对浓度做图，如图4所示，可见lg(ΔI/I1)对浓度成线性关系。线性方程为log(ΔI(μA)/I1(μA))＝0.0793cEGF/μM+1.0277，线性方程的R2＝0.996，检出限为0.1pM。
由图可知，本发明提供的检测表皮生长因子的电化学免疫传感器对表皮生长因子具有良好的线性检测行为和较低的检出限。该传感器有望应用于实际生物样品的表皮生长因子的检测。

Claims (9)

1.一种检测表皮生长因子的电化学免疫传感器，由下至上依次由电极、修饰层a、修饰层b和修饰层c组成；
其中，所述电极为玻碳电极；
所述修饰层a为由式Ia或式Ib所示聚多巴胺构成的膜：
所述式Ia和式Ib中，n均为1000-15000；
所述修饰层b由表皮生长因子和谷胱甘肽构成，且所述表皮生长因子和谷胱甘肽均粘附于所述修饰层a上；
所述修饰层c由表皮生长因子抗体修饰的纳米银溶胶制得。
2.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于：所述表皮生长因子抗体修饰的纳米银溶胶中，表皮生长因子抗体修饰的纳米银颗粒的粒径为50-100nm。
3.根据权利要求1或2所述的传感器，其特征在于：所述表皮生长因子抗体修饰的纳米银溶胶为按照包括如下步骤的方法制备而得：
1)将巯基乙酸和纳米银溶胶于pH值为中性的条件下反应10-30min，得到巯基乙酸修饰的纳米银溶胶；
2)于pH值为5-6的条件下，将步骤1)所得巯基乙酸修饰的纳米银溶胶、EDC的水溶液和NHS的水溶液混合搅拌10-30min，得到活化的纳米银溶胶；
3)将步骤2)所得活化的纳米银溶胶与表皮生长因子抗体于摇床中振荡1-4h，调节体系的pH值至中性，得到所述表皮生长因子抗体修饰的纳米银溶胶。
4.根据权利要求3所述的传感器，其特征在于：所述步骤1)纳米银溶胶中，纳米银颗粒的粒径为20-50nm；
所述反应步骤中，时间为15min；
所述纳米银溶胶为按照包括如下步骤的方法制备而得：将NaBH4的水溶液与AgNO3的水溶液于冰水浴中进行反应5-20min，反应完毕而得；
所述NaBH4的水溶液的浓度为1×10-3mol/L-5×10-3mol/L；
所述AgNO3的水溶液的浓度为0.5×10-3mol/L-3×10-3mol/L；
所述步骤2)中，EDC的水溶液和NHS的水溶液的浓度均为1×10-3mol/L-5×10-3mol/L；EDC的水溶液和NHS的水溶液的体积比为1：1；所述EDC和NHS的摩尔比为0.5mmol：0.5mmol；
所述步骤3)振荡步骤中，时间为2小时。
5.根据权利要求4所述的传感器，其特征在于：纳米银溶胶的制备方法中NaBH4的水溶液与AgNO3的水溶液的冰水浴反应时间为10min；
所述NaBH4的水溶液的浓度为2×10-3mol/L；
所述AgNO3的水溶液的浓度为1×10-3mol/L；
所述NaBH4的水溶液与AgNO3的水溶液的体积比为4：1；
所述步骤2)中，EDC的水溶液和NHS的水溶液的浓度均为2×10-3mol/L。
6.一种制备权利要求1-5任一所述检测表皮生长因子的电化学免疫传感器的方法，包括如下步骤：
1)将所述电极浸泡于多巴胺的tris缓冲溶液中浸泡30min后，用二次水洗涤并浸泡，于空气静置晾干8h后，在所述电极表面得到所述修饰层a；
2)将步骤1)所得电极于EGF的水溶液中浸泡30min后，再于GSH的PBS缓冲液中浸泡30min，即在所述修饰层a上得到所述修饰层b；
3)将步骤2)所得电极浸泡于权利要求3所述表皮生长因子抗体修饰的纳米银溶胶中孵育1h，得到所述检测表皮生长因子的电化学免疫传感器。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，多巴胺的tris缓冲溶液的pH值为8-9，浓度为0.05-0.2mg/ml；
所述步骤2)中，EGF的水溶液的浓度为10μM；所述GSH的PBS缓冲液的pH值为7.0，浓度为20mg/ml。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，多巴胺的tris缓冲溶液的pH值为8.5，浓度为0.1mg/ml。
9.权利要求1-5任一所述检测表皮生长因子的电化学免疫传感器在检测EGF含量中的应用。
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