CN109270138A - 检测布鲁氏菌病的电化学免疫传感器的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测布鲁氏菌抗体的电化学免疫传感器的制备方法，属于电化学生物传感器技术领域。该方法包括：将玻碳电极预处理，通过电沉积的方法将金纳米粒子修饰到玻碳电极上，然后引入谷胱甘肽做为抗污材料，与金表面自组装，再使HA通过N‑(3‑二甲基氨基丙基)‑N'‑乙基碳化二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺有效地缀合到谷胱甘肽上，最后用赤藓糖醇封闭非特异性活性位点。本发明解决了现有布鲁氏菌病检测方法的准确性差、处理过程复杂等问题。本发明免疫传感器的电极界面具有优异的亲水性，复合界面的防污性能明显提高，具有超高灵敏度，较宽的线性范围和较低的检测限，且稳定性和重复性能好，操作简便；可应用于复杂生物样品中布鲁氏菌病抗体的检测。
Description
技术领域
本发明属于电化学生物传感器技术领域，具体涉及一种用于检测布鲁氏菌病的电化学免疫传感器的制备方法及其应用。
背景技术
布鲁氏菌是一种革兰氏阴性球菌，由它导致的布鲁氏菌病是最常见的人畜共患病之一。这种疾病的最大特点是如果发现的早，并用正规方法治疗，超过90％的患者将被治愈，且终生不会复发，否则它将变成慢性疾病并且终生不可治愈。因此，该病的早期诊断尤为重要。
检测布鲁氏菌病的典型方法有虎红平板凝集试验(RBPT)，聚合酶链式反应(PCR)，酶联免疫吸附剂测定(ELISA)，环介导等温扩增技术(LAMP)和免疫层析试验。其中，RBPT方法操作简单且成本低廉最受欢迎，但假阳性率高，从而影响了它的广泛应用。对于其他方法来说，由于预处理过程复杂、对操作人员要求高，且需借助昂贵的仪器，因此限制了它们的普及。
电化学传感器由于无需标记、灵敏性高，选择性高，使用简单，检测快速以及所用仪器价格低廉等诸多特点，已经成为疾病检测的有效手段之一，但到目前为止关于成功运用电化学传感器检测布鲁氏菌病的文献报道很少。通常来说，性能优良的电化学传感器的制备跟电极修饰材料的导电性、生物相容性和抗污性密切相关，它们是影响检测灵敏度、准确度和稳定性的三个关键参数。本方案通过电沉积的方法将金纳米粒子(AuNPs)修饰到玻碳电极(GCE)上，有效提高了电极的导电性，然后引入谷胱甘肽(GSH)做为抗污材料，与金纳米粒子自组装。由于该材料富含氨基和羧基，因此赋予界面以优异的生物相容性。此外，GSH呈电中性并含有大量的酰胺键使得该界面同时具有较好的防污性能。只是在实际使用中，申请人发现血、尿和奶样品中含有大量的无机化合物、有机化合物以及各种生物大分子，而单一材料修饰的玻碳电极要想实现在复杂生物系统中高灵敏和高选择性地检测布鲁氏菌抗体是有难度的。因此将透明质酸(HA)与GSH复合形成一种新的复合抗污染界面，该界面除了保持良好生物相容性之外，其亲水性及抗污染特性都比没掺杂HA时效果要好，并实现了在1％稀释的血清中高灵敏和高选择性地测试布鲁氏菌抗体(BrAb)的目标，且该传感器还展现了较宽的检测范围，低的检测限和优良的稳定性和重现性。
本申请人发现了一种新的解决方案，在复杂的生物系统中直接检测布鲁氏菌抗体，电极界面受实际生物样品中的无机和有机化合物以及生物大分子的干扰较小，HA与GSH复合修饰的电极界面防污性能明显提高，且传感器的响应范围宽，最低检出限低于目前大多数布鲁氏菌病检测方法，实用性能强，具有良好的临床应用前景。
发明内容
针对现有布鲁氏菌病检测方法的准确性差、处理过程复杂，对操作人员的专业背景知识要求高等问题，本发明制备了一种电化学免疫传感器，能够检测复杂样品中的布鲁氏菌抗体，具有超高灵敏度，较宽的检出范围和较低的检测限；其制备方法相对简单，操作简便，适于批量生产。并且也填补了目前缺乏有效的检测布鲁氏菌病的电化学传感器的空白。
一种检测布鲁氏菌病的电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)将GCE进行预处理；
(2)将预处理好的GCE在HAuCl4溶液中电沉积，然后用超纯水洗涤，氮气干燥，得到AuNPs/GCE；
(3)将AuNPs/GCE浸入GSH溶液中，GSH修饰到AuNPs/GCE界面上，然后将该修饰电极在β-巯基乙胺中浸泡以封闭未反应的AuNPs；
(4)将HA用含有EDC和NHS的溶液活化，然后将GSH/AuNPs/GCE浸入上述溶液中浸泡得到HA/GSH/AuNPs/GCE；
(5)将HA/GSH/AuNPs/GCE浸入1,4-丁二醇二缩水甘油醚的碱性溶液中，再将该修饰电极与含有OMP31的磷酸缓冲溶液中温育，得到OMP31/HA/GSH/AuNPs/GCE，然后用赤藓糖醇封闭非特异性活性位点，即制得电化学免疫传感器。
进一步的，所述步骤(1)GCE的预处理方法为：将GCE依次用0.3μm和0.05μm的氧化铝浆料抛光成镜面状，然后在超纯水、100％乙醇和超纯水中依次进行超声处理。
进一步的，所述步骤(2)电沉积的具体方法为将电极浸入1mM-20mM的HAuCl4溶液中，通过恒电位还原HAuCl4，在电极表面生成均匀分散的金纳米粒子；恒电位-0.2V，电沉积施加30s-300s。
进一步的，所述步骤(3)GSH溶液的制备方法为：超纯水以及用于存储和使用的容器均用氮气脱氧，然后用于制备GSH溶液。
进一步的，所述步骤(3)将AuNPs/GCE浸入GSH溶液40h-56h，然后在β-巯基乙胺中温育40h-56h。
进一步的，所述步骤(4)将HA与等体积的溶度为50mg/mL EDC和50mg/mL NHS的混合溶液活化0.5h-1h，然后将修饰电极浸入上述溶液中再孵育3h-4h。
进一步的，所述步骤(5)将修饰电极浸入浓度为0.15M-0.25M的1,4-丁二醇二缩水甘油醚的碱性溶液中12h-18h，随后将电极在含有OMP31的磷酸缓冲溶液中温育12h-15h。
本发明还提供了一种检测布鲁氏菌抗体的方法：将上述制得的检测布鲁氏菌抗体的电化学免疫传感器作为工作电极，采用铂电极作为对电极，Ag/AgCl电极或者甘汞电极作为参比电极，将上述三电极体系插入铁氰化钾/亚铁氰化钾的缓冲溶液中，运用差分脉冲伏安法，测量还原峰电流，根据峰电流变化率与布鲁氏菌抗体溶液浓度对数之间的定量关系得到待测样品中布鲁氏菌抗体的准确浓度。
本发明首先通过电沉积的方法将金纳米粒子(AuNPs)修饰到玻碳电极(GCE)上，然后引入谷胱甘肽(GSH)做为抗污材料，与金表面自组装，再使HA通过N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)有效地缀合到GSH上，使得电极界面具有优异的亲水性，可有效阻止蛋白质的非特异性吸附。另外需强调的是融合HA前后，电极复合界面的防污性能明显提高。
本发明的免疫传感器的线性范围为2.08×10-15g/mL至1.04×10-12g/mL，检测限(LOD)为0.50fg/mL(S/N＝3)低于目前大多数布病检测方法的检测结果，且可直接在0.1％稀释的血清中操作，说明该免疫传感器在布病的检测中实用性能强，加之其制备工艺流程相对简单，操作简便，对操作人员的专业背景知识要求不高，适于批量生产，其潜在的商业价值巨大。
附图说明
图1为实施例5不同修饰电极的扫描电子显微镜(SEM)、傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)和能量色散谱仪(EDS)图。A：AuNPs/GCE的SEM；B：GSH/AuNPs/GCE的SEM；C：HA/GSH/AuNPs/GCE的SEM；D：GSH/AuNPs/GCE的SEM剖面图；E：HA/GSH/AuNPs/GCE的SEM剖面图；F：HA/GSH/AuNPs/GCE的FTIR图；G：HA/GSH/AuNPs的EDS图。
图2为实施例5不同的修饰电极GCE(a、a’)、AuNPs/GCE(b和b’)、GSH/AuNPs/GCE(c和c’)、HA/GSH/AuNPs/GCE(d和d’)、OMP31/HA/GSH/AuNPs/GCE(e和e’)和BrAb/OMP31/HA/GSH/AuNPs/GCE(f和f’)在5.0mM[Fe(CN)6]3-/4-电解液中对应的(A)差分脉冲伏安图和(B)电化学交流阻抗谱图。
图3为实施例6中GSH/AuNPs/GCE界面、HA/GSH/AuNPs/GCE界面在不同浓度的牛血清蛋白(BSA)或阴性血清中的DPV电流变化率图。
图4为实施例6各修饰界面的接触角，未修饰的ITO(ITO)、AuNPs/ITO(AuNPs)、GSH/AuNPs/ITO(GSH)和HA/GSH/AuNPs/ITO(HA)界面的静态水接触角，插图是不同界面的水滴剖面。
图5为实施例7免疫传感器的选择性(从第1栏到第8栏：VirB5(9.5×10-7g mL-1)、BP26(4.3×10-7g mL-1)、BSA(6.64×10-5g mL-1)、噬菌体(1.0×108pfu mL-1)、含10-7g mL-1抗大肠杆菌抗体的0.1％血清溶液、含2.08×10-12g mL-1布鲁氏菌抗体的PBS溶液和含2.08×10-11g mL-1布鲁氏菌抗体的0.1％血清溶液。
图6为实施例8免疫传感器的时间稳定性表征；
图7A为实施例9电化学免疫传感器与不同浓度的BrAb反应后的差分脉冲伏安曲线。图7B为差分脉冲伏安峰电流的变化率随PBS中布鲁氏菌抗体浓度的变化情况和该传感器的线性拟合曲线(插图)；图7C为差分脉冲伏安峰电流的变化率随0.1％血清中布鲁氏菌抗体浓度的变化情况和该传感器的线性拟合曲线(插图)；
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。
实施例1电化学免疫传感器制备
(1)将直径3.0mm的GCE依次用0.3μm和0.05μm的氧化铝浆料抛光成镜面状，然后在超纯水、100％乙醇和超纯水中依次进行超声处理；
(2)将预处理后的电极浸入5mM HAuCl4溶液中，通过恒电位还原HAuCl4，电极表面生成均匀分散的金纳米粒子，恒电位-0.2V，电沉积施加60s；
(3)将超纯水用氮气预先脱氧30min，再用于制备GSH溶液，以防止-SH基团被氧化。将AuNPs/GCE浸入上述GSH(400μl,10mM)溶液中48h，通过形成Au-S键将GSH修饰到AuNPs/GCE界面上，得到GSH/AuNPs/GCE，然后将该修饰电极在β-巯基乙胺(200μl,10mM)中温育48h以封闭未反应的AuNPs,；
(4)将等体积的HA(30μl,2mg/mL)与等体积浓度为50mg/mL EDC和50mg/mL NHS的溶液先活化0.5小时，然后将GSH/AuNPs/GCE浸入上述溶液中再孵育3.5h，得到HA/GSH/AuNPs/GCE；
(5)将HA/GSH/AuNPs/GCE浸入1,4-丁二醇二缩水甘油醚(0.2M，60μl，用10mMNaOH配置)的碱性溶液中12h；随后，将该修饰电极在含OMP31(100μl,2.08×10-6g/mL)的磷酸缓冲溶液中温育12h，得到OMP31/HA/GSH/AuNPs/GCE，再用赤藓糖醇封闭非特异性活性位点，得到电化学免疫传感器。将该免疫传感器4℃下储存在PBS中。
实施例2电化学免疫传感器的制备
(1)将直径3.0mm的GCE依次用0.3μm和0.05μm的氧化铝浆料抛光成镜面状，然后在超纯水、100％乙醇和超纯水中依次进行超声处理；
(2)将预处理后的电极浸入20mM HAuCl4溶液中，通过恒电位还原HAuCl4，电极表面生成均匀分散的金纳米粒子，恒电位-0.2V，电沉积施加30s；
(3)将超纯水用氮气预先脱氧30min，再用于制备GSH溶液，以防止-SH基团被氧化。将AuNPs/GCE浸入上述GSH(400μl,10mM)溶液中52h，通过形成Au-S键将GSH修饰到AuNPs/GCE界面上，得到GSH/AuNPs/GCE，然后将该修饰电极在β-巯基乙胺(200μl,10mM)中温育40h以封闭未反应的AuNPs,；
(4)将等体积的HA(30μl,2mg/mL)与等体积浓度为50mg/mL EDC和50mg/mL NHS的溶液先活化0.5小时，然后将GSH/AuNPs/GCE浸入上述溶液中再孵育4h，得到HA/GSH/AuNPs/GCE；
(5)将HA/GSH/AuNPs/GCE浸入1,4-丁二醇二缩水甘油醚(0.18M，100μl，用10mMNaOH配置)的碱性溶液中16h；随后，将该修饰电极在含OMP31(60μl,2.08*10-6g/mL)的磷酸缓冲溶液中温育15h，得到OMP31/HA/GSH/AuNPs/GCE，再用赤藓糖醇封闭非特异性活性位点，得到电化学免疫传感器。将该免疫传感器4℃下储存在PBS中。
实施例3电化学免疫传感器制备
(1)将直径3.0mm的GCE依次用0.3μm和0.05μm的氧化铝浆料抛光成镜面状，然后在超纯水、100％乙醇和超纯水中依次进行超声处理；
(2)将预处理后的电极浸入1mM HAuCl4溶液中，通过恒电位还原HAuCl4，电极表面生成均匀分散的金纳米粒子，恒电位-0.2V，电沉积施加300s；
(3)将超纯水用氮气预先脱氧30min，再用于制备GSH溶液，以防止-SH基团被氧化。将AuNPs/GCE浸入上述GSH(400μl,10mM)溶液中56h，通过形成Au-S键将GSH修饰到AuNPs/GCE界面上，得到GSH/AuNPs/GCE，然后将该修饰电极在β-巯基乙胺(200μl,10mM)中温育48h以封闭未反应的AuNPs,；
(4)将等体积的HA(50μl,2mg/mL)与等体积浓度为50mg/mL EDC和50mg/mL NHS的溶液先活化0.8小时，然后将GSH/AuNPs/GCE浸入上述溶液中再孵育3.5h，得到HA/GSH/AuNPs/GCE；
(5)将HA/GSH/AuNPs/GCE浸入1,4-丁二醇二缩水甘油醚(0.15M，60μl，用10mMNaOH配置)的碱性溶液中18h；随后，将该修饰电极在含OMP31(60μl,2.08×10-6g/mL)的磷酸缓冲溶液中温育14h，得到OMP31/HA/GSH/AuNPs/GCE，再用赤藓糖醇封闭非特异性活性位点，得到电化学免疫传感器。将该免疫传感器4℃下储存在PBS中。
实施例4用免疫传感器检测布鲁氏菌
用PBS缓冲溶液配制不同浓度(2.08fg/mL、10.4fg/mL、20.8fg/mL、104fg/mL)的布鲁氏菌抗体溶液，将其滴涂在实施例1制备的电化学免疫传感器上，反应1h，采用此为工作电极，铂电极作为对电极，甘汞电极作为参比电极，将上述三电极体系插入铁氰化钾/亚铁氰化钾的缓冲溶液，进行电化学测量。
实施例5电化学免疫传感器界面的表征
1、SEM、FTIR和EDS
利用SEM对AuNPs/GCE，GSH/AuNPs/GCE和HA/GSH/AuNPs/GCE的表面进行了表征。图1A表明，电化学沉积的AuNPs表现为均匀分布的颗粒。在修饰GSH后，纳米颗粒分布变得不规则(图1B)，其剖面图显示了明显的两层结构(图1D，1：金纳米粒子，2：GSH)。在HA修饰之后，SEM的剖面图(图1E)则显示出清晰的三层(图1E，3’：HA)，证明HA已成功修饰在电极表面。从其俯视图来看(图1C)HA/GSH/AuNPs/GCE的界面形态几乎没有变化，只是纳米粒子的分布比以前更密集，这对有效抵制非特异性蛋白质吸附更有利。
FTIR光谱(图1F)显示了HA/GSH/AuNPs改性表面的所有有效官能团的峰。3442、2922、1582和1581cm-1处强烈的振动峰分别对应的是-OH(羧基)，-CH，-C＝O(酰胺)和-NH2特异峰，1103cm-1则是HA的C-O-C键的伸缩振动峰。
HA/GSH/AuNPs改性表面的能量色散谱(EDS)数据显示样品中存在S，O，C，N和Au元素(图1G)。硫元素来源于GSH。综上所述，HA/GSH/AuNPs修饰电极已成功构建。
2、电化学DPV与EIS表征每步修饰过程
在免疫传感器与2.08×10-6g/mL BrAb孵育之前，使用差分脉冲伏安法(DPV)对免疫传感器制造程序的每个步骤进行电化学表征，如图2A所示。AuNP加速电子转移并增加电极表面积，所以AuNPs/GCE上的还原峰值电流(曲线b)显著大于GCE裸电极上的峰值电流(曲线a)。当GSH(曲线c)和HA(曲线d)在AuNPs/GCE上连续修饰时，峰电流持续下降，这是由于GSH和HA表面带有负电荷的官能团与负电荷的[Fe(CN)6]3-/4-探针产生排斥力导致的。由于OMP31(曲线e)属于非导电抗原，修饰之后引起峰值电流急剧下降。当免疫传感器与目标BrAb(曲线f)孵育时，DPV电流进一步下降，这种现象可能是由非导电性免疫结合物的阻碍作用引起的。使用EIS表征每步修饰过程(图2B)，所得结果与DPV一致，其进一步证实了免疫传感器的成功制备。
实施例6电极表面的抗污染性能
选择用PBS稀释的一系列浓度的牛血清蛋白(BSA)(1μM，5μM和10μM)或血清(0.1％，0.5％和1％(V/V))来评估GSH/AuNPs/GCE和HA/GSH/AuNPs/GCE改性界面的抗污性能。记录电极在上述溶液中浸泡前后的DPV还原峰值电流，并比较峰电流的变化率。
图3所示，对于各种浓度的BSA或血清来说(孵育30min)，HA/GSH/AuNPs/GCE界面的DPV响应率明显低于GSH/AuNPs/GCE界面，这表明融合HA后，能更好地改善电极表面的抗生物污染能力，同时也说明该免疫传感器可以应用于实际复杂生物介质中的疾病标记物分析工作。
图4所示：导电玻璃(ITO)的水接触角约为62.4±0.4°，在金纳米粒子修饰之后，其降低到55.0±0.9°，这可能是AuNPs/ITO界面粗糙化的结果，随后GSH修饰于AuNPs/ITO表面上，接触角降低到42.3±0.8°，主要原因可能是GSH自身的氨基和羧基和水形成有效水化层，从而增强了界面亲水性。当GSH/AuNPs/ITO表面修饰上HA后，界面显示了更加优异的亲水性能，接触角降低到约为17.1±1.0°，这充分表明融合HA后，电极界面可以更好地形成有效抵制非特异蛋白吸附的水化层，因此HA/GSH复合材料成为我们构建防污生物传感器的理想选择。
实施例7免疫传感器的选择性
将电极分别浸入60μL用PBS稀释的VirB5(9.5×10-7g/mL)、BP26(4.3×10-7g/mL)、BSA(1μM)、噬菌体(1.0×108pfu/mL)、含有大肠杆菌抗体的血清(抗体浓度为10-7g mL-1,0.1％，V/V)和含有布鲁氏菌抗体的血清(抗体浓度为2.08×10-11g mL-1，0.1％，(V/V))各种干扰溶液孵育30min，用DPV记录孵育前后电化学信号改变率，从而研究免疫传感器对其目标抗体(BrAb)的选择性。
DPV参数是：扫描范围取自-0.2V至0.6V，扫描电压的步长0.004V，幅度0.05V，脉冲宽度0.05s，采样宽度0.0167V，脉冲周期0.5s。EIS参数如下：直流电势为0.2V，频率范围为0.1至1000000Hz，并且施加的正弦波的幅度为5mV。所有电化学测量均在含有5.0mM[Fe(CN)6]3-/4-和0.1M KCl的PBS中进行。
如图5所示，尽管干扰样品VirB5、BP26、BSA和噬菌体的浓度比布鲁氏菌抗体浓度高100000倍，但与免疫传感器温育后，也仅观察到不足10％的DPV电流强度响应变化率，这表明该传感器选择性良好。为了验证该传感器在复杂生物体系也具有良好的选择性，我们选择了在0.1％血清中含有10-7g mL-1抗大肠杆菌抗体样品作为干扰样品，与0.1％血清中含2.08×10-11g mL-1的布鲁氏菌抗体样品进行比较，干扰样品的浓度仍然比布鲁氏菌抗体浓度高100000倍，并且大肠杆菌与布鲁氏菌同属于革兰氏阴性菌。但从所得结果分析，我们制备的免疫传感器仅对布鲁氏菌抗体敏感，这再次表明了该免疫传感器对其靶抗体具有极好的选择性，并且具有实际检测的价值。这个结果与抗体/抗原的强特异性结合和HA/GSH/AuNPs/GCE表面优良的防污性能是分不开的。
实施例8免疫传感器的稳定性
将制备的免疫传感器在4℃的冰箱中储存19天。如图6所示，制备的免疫传感器的DPV电流响应保留其初始响应的97.45％(3天)，91.76％(6天)和89.93％(12天)。通过19天的存储，DPV电流响应降低至88.80％。另外采用独立制备的5个免疫传感器同时检测2.08fg/mL目标抗体，计算其相对标准偏差(RSD)约为7.29％，表明重现性良好。
实施例9免疫传感器的线性
将该免疫传感器与一系列不同浓度的BrAb溶液(PBS或0.1％血清)反应60分钟,然后在含有5.0mM[Fe(CN)6]3-/4-和0.1M KCl的PBS(10mM，pH 7.4)中进行差分脉冲伏安响应的测定研究。结果显示，随着PBS或0.1％血清中BrAb浓度的增加，DPV峰值电流相应地降低，因为OMP31和BrAb之间的免疫复合物的形成抑制了电子转移。图7B或7C显示DPV峰值电流变化(-ΔIp/Ip0(％))与目标抗体浓度的对数值显示出良好的线性关系[PBS中，-ΔIp/Ip0(％)＝5.518log C(BrAb)+85.607；0.1％血清中，-ΔIp/Ip0(％)＝5.727logC(BrAb)+88.559]，且线性范围为2.08×10-15g mL-1至1.04×10-12g mL-1(PBS中，R2＝0.9946；0.1％血清中，R2＝0.9972)，该方法的最低检测限(LOD)为0.50fg mL-1(S/N＝3)。
实施例10免疫传感器的临床应用
为验证该免疫传感器在相对复杂生物样品中的实际应用，我们测试了含有不同浓度抗体的血清样品。结果如表1所示，回收率从94.23％变化到102.88％，RSD范围为证明了该传感器在临床应用的真实前景。
表1加标回收分析结果(0.1％血清)
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种检测布鲁氏菌病的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将GCE进行预处理；
(2)将预处理好的GCE电极在HAuCl4溶液中电沉积，然后用超纯水洗涤，氮气干燥，得到AuNPs/GCE；
(3)将AuNPs/GCE浸入GSH溶液中，GSH修饰到AuNPs/GCE界面上，然后将该修饰电极在β-巯基乙胺中浸泡以封闭未反应的AuNPs；
(4)将HA用含有N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的溶液活化，然后将GSH/AuNPs/GCE浸入上述溶液中得到HA/GSH/AuNPs/GCE；
(5)将HA/GSH/AuNPs/GCE浸入1,4-丁二醇二缩水甘油醚的碱性溶液中，再将该修饰电极在含有布鲁氏菌外膜蛋白OMP31的磷酸缓冲溶液中浸泡，得到OMP31/HA/GSH/AuNPs/GCE，然后用赤藓糖醇封闭非特异性活性位点，即制得电化学免疫传感器。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)GCE的预处理方法为：将GCE依次用0.3μm和0.05μm的氧化铝浆料抛光成镜面状，然后在超纯水、100％乙醇和超纯水中依次进行超声处理。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)电沉积的具体方法为将电极浸入1mM-20mM的HAuCl4溶液中，通过恒电位还原HAuCl4，在电极表面生成均匀分散的金纳米粒子；恒电位-0.2V，电沉积施加30s-300s。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)GSH溶液的制备方法为：超纯水以及用于储存及使用的容器均用氮气脱氧，然后用于制备GSH溶液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)将AuNPs/GCE浸入GSH溶液40h-56h，然后在β-巯基乙胺中温育40h-56h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)将HA与等体积的浓度为50mg/mL N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳化二亚胺和50mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液先活化0.5-0.8h，然后将修饰电极浸入上述溶液中再孵育3h-4h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)将修饰电极浸入浓度为0.15-0.25M的1,4-丁二醇二缩水甘油醚的碱性溶液中12h-18h，随后将电极与含有布鲁氏菌外膜蛋白OMP31的磷酸缓冲溶液温育12h-15h。
8.一种检测布鲁氏菌病的方法，其特征在于，将权利要求1制得的电化学免疫传感器作为工作电极，采用铂电极作为对电极，Ag/AgCl电极或者甘汞电极作为参比电极，将上述三电极体系插入铁氰化钾/亚铁氰化钾的缓冲溶液中，运用差分脉冲伏安法，测量还原峰电流，根据峰电流变化率与布鲁氏菌抗体溶液浓度对数之间的定量关系得到待测样品中布鲁氏菌抗体的准确浓度。
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