CN114216943B - 一种抗污染电化学免疫传感器及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于电化学检测技术领域，公开了一种基于DNA‑多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器及其制备方法与应用。本发明公开了一种基于DNA‑多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器，该传感器首次使用DNA‑多肽偶联物作为抗污染材料，通过两类重要生物分子功能的集成优化，协同增强抗污染效果。本发明制备的传感器可有效抵挡复杂体液环境中蛋白质等生物分子的非特异性吸附，实现在复杂真实样本中对免疫球蛋白G的灵敏检测。经实验验证，DNA‑多肽偶联物确比单一的DNA或多肽具有更优异的抗污染效果和更好的实际应用潜力。

Description

一种抗污染电化学免疫传感器及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于电化学检测技术领域，具体涉及一种基于DNA-多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器的及其制备方法与应用。

背景技术

由非特异性蛋白质吸附等引起的生物污染是电化学免疫传感器面临的一个严重问题，它极大影响了传感器在真实生物样品(如人血和血清)中检测的可靠性和稳定性，限制了生物传感器在复杂生物介质中的实际应用。因此，开发能够有效减少非特异性吸附的抗污染免疫传感器是非常必要的。抗污染电化学免疫传感器是将抗污染材料与电化学生物传感技术相结合而发展起来的一种新型传感器，它既保持了电化学传感器灵敏度高、特异性好、操作简单、成本低的优点，同时抗污染材料的引入还赋予了它抵抗生物分子非特异性吸附的性能。

蛋白质在传感界面的非特异性吸附主要是通过疏水作用和电荷作用，因此，构建亲水性和电中性的抗污染界面是缓解甚至消除蛋白质等生物分子非特异性吸附的有效方法。目前较为常用的抗污染材料有聚乙二醇(PEG)及其衍生物、两性离子材料和多肽类，其中，PEG易于被氧化、水溶性差和在高温下蛋白抗性弱；两性离子材料合成工艺复杂，耗时费力，限制了其实际应用。另外，多肽这类抗污染材料虽具有天然的生物相容性且结构灵活易于合成，受到科研工作者的青睐，但其也存在无法充分覆盖基底界面，暴露活性位点造成生物污染的问题。尽管，现阶段以多肽作为抗污染材料的生物传感器得到了国内外的相关报道并取得了较大的进展。但总体而言，该类传感器离实际应用尚有差距，抗污染性能亟待进一步提高。

由此可见，开发具有抗污染性能的生物传感器，提高传感器的实际应用能力具有十分重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的第一个目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种基于DNA-多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于DNA-多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器，以玻碳电极为基底，依次修饰有植酸掺杂的3,4-乙烯二氧噻吩、金纳米颗粒以及DNA-多肽偶联物；且，

所述DNA-多肽偶联物的多肽序列为Pep1：(2-Azido)-Lys Asn Gln Glu Lys AsnGln Glu Asp His Trp Arg Gly Trp Val Ala，DNA序列为polyA₇-polyT₅：5’-AAAAA AATTTTT-(DBCO)-3’；polyA₁₅-polyT₅：5’-AAAAA AAAAA AAAAA TTTTT-(DBCO)-3’。

值得说明的是，由非特异性蛋白质吸附等引起的生物污染是电化学免疫传感器面临的一个严重问题，它极大影响了传感器在真实生物样品(如人血和血清)中检测的可靠性和稳定性，限制了生物传感器在复杂生物介质中的实际应用。本发明中构建的抗污染传感器有效解决了实际应用中生物传感器受非特异性蛋白质吸附的问题。

特别的，DNA分子不仅具有可编程性、高特异性、功能多样性等优点,特定序列还被证明对金界面具有显著的亲和力，可形成致密的单分子层，有效解决实际样品中生物分子在界面的粘附。本发明利用DNA对金界面强的亲和力和对界面的有效覆盖，将特定序列抗污染性DNA分子与多肽结合，合成DNA-多肽偶联物这一类新型自组装分子，实现两类重要生物分子功能的集成优化，解决了多肽无法良好覆盖基底界面的问题，增强了单一多肽的抗污染能力。

本发明的第二个目的在于提供一种基于DNA-多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器的制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于DNA-多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器的制备方法，包括如下步骤：

I、DNA-多肽偶联物的制备：将DBCO修饰的DNA与叠氮修饰的多肽等摩尔比混合，触发点击化学反应，在37℃下摇床中震荡过夜，即得DNA-多肽偶联物DP；

II、传感器的组装：对玻碳电极进行预处理，首先利用氧化铝粉末对界面进行抛光，然后在超声波条件下用水、无水乙醇、水清洗；将预处理后的玻碳电极浸泡于含有3,4-乙烯二氧噻吩EDOT和的植酸PA的混合溶液中，在室温下采用恒电位法制备PEDOT-PA修饰电极；将PEDOT-PA修饰电极浸泡在含有氯化钾KCl的氯金酸HAuCl₄溶液中，在室温下采用恒电位法制得AuNPs/PEDOT-PA修饰电极；将AuNPs/PEDOT-PA修饰电极浸泡在DNA-多肽偶联物DP的混合液中室温孵育过夜，即得所述基于DNA-多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器。

进一步的，所述步骤I的具体方法为：

将DBCO修饰的DNA分散于CaCl₂-TE(1M CaCl₂,1x TE(10mM Tris-HCl,1mM EDTA)缓冲液，叠氮修饰的多肽分散于去离子水中，制得终浓度不小于为2μM的溶液；然后将两种溶液等摩尔比混合，触发点击化学反应，在37℃下摇床中震荡过夜，获得终浓度不小于1μM的DNA-多肽偶联物。

更进一步的，所述步骤II的具体方法为：

对玻碳电极进行预处理，首先利用氧化铝粉末对界面进行抛光，然后在超声波条件下用水、无水乙醇、水清洗；将预处理好的玻碳电极浸泡于含有0.005～0.02M的3,4-乙烯二氧噻吩EDOT和0.005～0.02M的植酸PA溶液中，在室温下采用1.1V恒电位，沉积20～100s，得PEDOT-PA修饰电极；将所述PEDOT-PA修饰电极浸泡在含有0.1M KCl的5mM HAuCl₄溶液中，在-0.5V下沉积30～60s，制得AuNPs/PEDOT-PA修饰电极；将所述AuNPs/PEDOT-PA修饰电极在不小于1μM DP溶液中室温孵育过夜，反应结束后，用去离子水冲洗，除去未固定的DP，即得传感器。

进一步的，所述多肽的序列为Pep1：(2-Azido)-Lys Asn Gln Glu Lys Asn GlnGlu Asp His Trp Arg Gly Trp Val Ala；且，

所述抗污染DNA的序列为polyA₇-polyT₅：5’-AAAAA AATTT TT-(DBCO)-3’；polyA₁₅-polyT₅：5’-AAAAA AAAAA AAAAA TTTTT-(DBCO)-3’。

值得说明的是，本发明首次将抗污染多肽和抗污染DNA结合，设计了一种DNA-多肽偶联物。所用抗污染多肽为电中性且强亲水性的，所用DNA与金界面具有强的亲和作用，在界面上形成一层稳定致密的单分子层膜，起到良好覆盖传感界面并起到阻碍其他生物分子在界面吸附的作用。相比于单独的多肽和DNA，DNA-多肽偶联物的抗污染性能显著增强。

本发明的第三个目的在于提供一种如上所述基于DNA-多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器的应用。

所述传感器在免疫球蛋白G检测中的应用。

进一步的，所述应用包括用于定量检测免疫球蛋白G，所述的定量检测为：

将基于DNA-多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器置于不同浓度的目标物免疫球蛋白G溶液中，恒温孵育，然后使用PBS缓冲液对电极界面进行冲洗，洗去未捕获的目标物免疫球蛋白G，并对上述得到的电极进行电化学检测；并利用差分脉冲伏安法在-0.2-0.6V范围内记录传感界面在目标物溶液中孵育后的电流信号变化，来实现对目标物免疫球蛋白G的检测。

更进一步的，所述恒温孵育的温度为室温，孵育时间是90min。

更进一步的，所述的免疫球蛋白G的线性检测范围是0.1ng/mL-10μg/mL，检出限为0.037ng/mL(S/N)。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明首次公开了DNA-多肽偶联物作为抗污染材料在传感器中的使用。

(2)本发明公开的DNA-多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器集成优化了两类重要的生物分子功能，实现协同增强抗污染效果，较单一生物分子而言，具有更优异的抗污染效果，也具有更优越的应用潜力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明基于DNA-多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器的制备方法示意图。

图2为本发明实施例提供的PA的化学结构图及PEDOT-PA修饰界面的构建过程图。

图3为本发明实施例提供的不同修饰电极的扫描电子显微镜图像。

图4为本发明实施例提供的多肽带电情况的理论计算图。

图5为本发明实施例提供的不同修饰电极的接触角图。

图6为本发明实施例提供的DNA、多肽以及DNA-多肽偶联物的凝胶电泳图。

图7为本发明实施例提供的不同工作电极的DPV响应曲线。

图8为本发明实施例提供的不同修饰电极的全扫描X射线光电子能谱图。

图9为本发明实施例提供的不同修饰电极在不同浓度的人血清中抵抗非特异性吸附的抗污染测试图。

图10为本发明实施例提供的不同修饰电极在不同浓度人血清中的抗污染性能对比柱状图。

图11本发明实施例提供的不同修饰电极在0.2mg/mL的荧光蛋白中孵育2h后的激光共聚焦图片。

图12为本发明实施例提供的免疫传感器对不同浓度IgG的DPV响应图(a)及线性曲线(b)。

图13为本发明实施例提供的本方法与医院免疫比浊法分析性能对比柱状图。

图14为本发明实施例提供的免疫传感器在连续CV法测试中的稳定性曲线。

图15为本发明实施例提供的免疫传感器在PBS(10mM，pH 7.4)中的存储稳定性测试图。

图16为本发明实施例提供的免疫传感器对1.0μg/mL IgG、100μg/mL的IgM、CEA、AFP、CA125、HSA和BSA的电流响应柱状图。

图17为本发明实施例提供的不同DNA浓度优化图(修饰电极在20％FBS中的信号抑制率)。

图18本发明实施例提供的不同多肽浓度优化图(修饰电极在20％FBS中的信号抑制率)。

图19本发明实施例提供的不同IgG孵育时间优化图。

具体实施方式

下面将结合说明书附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下给出本发明某些实施方式的实施例，其目的不在于对本发明的范围进行限定。

实施例1

设备：日立S-4800扫描电子显微镜(Hitachi Co.,Japan)对界面进行扫描电子显微镜表征。ESCALAB 250Xi光谱仪(Thermo Fisher Scientific，U.K.)用于对界面进行X射线光电子能谱分析(XPS)。电极界面的润湿性通过JC2000接触角仪器(上海中辰仪器有限公司)进行表征。电化学测试在CHI 760D电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)上完成，采用传统的三电极体系：铂丝电极作为对电极、饱和甘汞电极作为参比电极和裸或修饰的玻碳电极作为工作电极。

试剂：异硫氰酸荧光素标记BSA(FITC-BSA)，1×TE buffer、50×TAE buffer、acryl/Bis(29:1)40％solution和GelRed均订购自生工生物工程(上海)股份有限公司。植酸(PA)、癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)和前列腺特异性抗原(PSA)自中国上海阿达玛斯试剂有限公司获得。人免疫球蛋白G(IgG)、人免疫球蛋白M(IgM)和碳水化合物抗原125(CA125)购自上海领潮生物科技有限公司。3,4-乙二氧基噻吩(EDOT)、、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钙、氯化钠、三水合氯化金、N,N,N'，N'-四甲基乙基二胺(TEMED)和过硫酸铵订购于阿拉丁试剂有限公司(上海，中国)。人清白蛋白(HSA)和胎牛血清(FBS)购买于北京博阳宏达科技发展有限公司(北京，中国)。超纯水(18MΩ/cm)由Milli-Q净化系统制得，用于所有水溶液的制备。

所使用的抗污染多肽序列为Pep1：(2-Azido)-Lys Asn Gln Glu Lys Asn GlnGlu Asp His Trp Arg Gly Trp Val Ala，由强耀生物有限公司(上海，中国)合成；

所使用的DNA序列为：polyA7-polyT5：5’-AAAAA AATTT TT-(DBCO)-3’，polyA15-polyT5：5’-AAAAA AAAAA AAAAA TTTTT-(DBCO)-3’，由上海生物工程有限公司(上海，中国)合成。

生物传感器的构建过程如图1A所示：

(1)电极预处理：玻碳电极(GCE)在进行界面修饰前，先用氧化铝粉末对界面进行抛光，然后在超声波条件下用水、无水乙醇、水清洗2min；

(2)AuNPs/PEDOT-PA修饰电极的制备：将预处理好的玻碳电极浸泡于含有0.02M的EDOT和0.02M的PA溶液中，超声使其均匀分散，在室温下采用恒电位1.1V进行电沉积，合成PEDOT-PA修饰电极，电位为1.1V，时间为20s；然后，将PEDOT-PA修饰电极浸泡在含有0.1MKCl的5mM HAuCl₄溶液中，在-0.5V下沉积金纳米粒子(AuNPs)30s，制得AuNPs/PEDOT-PA修饰电极；

(3)传感器的制备：将AuNPs/PEDOT-PA修饰电极在1μM DNA-多肽偶联物DP溶液中室温孵育过夜，通过DNA中的腺嘌呤序列与金之间强的亲和作用将DP固定到AuNPs/PEDOT-PA修饰电极上，反应结束后，用去离子水冲洗，除去未固定的DP，即得抗污染传感器。

DP的制备过程如图1B所示：

将DBCO修饰的DNA分散于CaCl₂-TE(1M CaCl₂,1x TE(10mM Tris-HCl,1mM EDTA)缓冲液，叠氮修饰的多肽分散于去离子水中，制得终浓度为2μM的溶液；然后将两种溶液等摩尔比混合，触发叠氮与DBCO的点击化学反应，在37℃下摇床中震荡过夜，获得终浓度为1μM的DP；

实施例2

AuNPs/PEDOT-PA和PEDOT-PA修饰电极的表征

掺杂剂PA的化学结构如图2所示。在电聚合过程中，六个磷酸基团提供了丰富的交联位点，与PEDOT掺杂形成三维结构复合材料。由图3(a、b)中PEDOT-PA复合材料的扫描电镜图可看出，当PEDOT与PA共沉积到电极表面后，在电极界面形成不规则网络结构薄膜。图3(c、d)，进一步修饰金纳米粒子后，聚合物复合材料的表面出现了许多粒径(直径约10nm)均匀的小颗粒，表明Au纳米颗粒成功地修饰到PEDOT-PA界面上，制得AuNPs/PEDOT-PA修饰电极。

实施例3

多肽和DNA-多肽偶联物(DP)的表征：

如图4，利用多肽性质模拟器计算得到在pH＝7时多肽的净电荷几乎为0，这说明该多肽接近于电中性的状态。采用静态水接触角试验评价DP修饰界面的亲水性。如图5，裸GCE、PEDOT-PA/GCE和AuNPs/PEDOT-PA/GCE的接触角分别为60.56°、28.67°和24.27°。当DP修饰后，修饰电极的接触角降低到16.18°(DP/AuNPs/PEDOT-PA/GCE/GCE)，界面的亲水性增强，主要归因于DNA-多肽偶联物的良好亲水性。为探究DNA与多肽的成功结合，采用16％的非变性凝胶电泳对DP和DNA进行分析，并用GelRed进行染色，如图6。正如预期的那样，由于DNA(polyA15-polyT5，第一泳道)具有较高的迁移率，所以其条带出现在比较靠下的位置，多肽(第二泳道)在凝胶中没有条带。对于第三泳道的DP偶联物，由于分子质量的增加导致其电泳迁移率降低，条带出现在较为靠上的位置。

实施例4

对基于DNA-多肽偶联物(DP)的抗污染电化学免疫传感器的表征

(1)免疫传感器组装过程电化学表征：

使用电化学工作站对生物传感器的组装过程进行了记录。如图7所示，在负电探针[Fe(CN)₆]^3-/4-溶液中记录了不同修饰界面的DPV曲线。显而易见，裸GCE(a)的DPV峰电流约为150μA。当PEDOT-PA(b)修饰到电极上后，由于导电聚合物修饰界面良好的导电性和明显增大的比表面积，峰电流有了一个明显的升高，增加到230μA。沉积上AuNPs后(c)，DPV峰电流进一步增加。同时，AuNPs的大量负载为后续生物分子的连接打下基础。当DP连接到电极上(d)，修饰电极的电流信号进一步降低。这归因于生物分子较差的导电性和空间位阻效应，阻碍了电极界面与溶液之间的电子传递。最后，当探针分子与目标物发生特异性结合时(e)，电流进一步降低，说明传感器的成功构建。

(2)免疫传感器组装过程XPS表征：

对组装界面进行了XPS表征，以进一步监测免疫传感器的制备过程，如图8所示。PEDOT-PA电极主要由碳(C)、氧(O)、硫(S)和磷(P)元素组成。沉积AuNPs后，出现了一个明显的金元素(Au)峰。DP修饰到界面后，出现了一个新的氮元素(N)峰，表明DP被成功地固定在电极表面。

实施例5

抗污染性能测试一：

将裸GCE、AuNPs/PEDOT-PA/GCE、DP/AuNPs/PEDOT-PA/GCE浸泡在不同浓度的复杂生物介质溶液中，对因生物分子吸附引起的电流信号的变化进行记录。电流信号的变化以信号抑制率来体现，信号抑制率＝(ΔI/I₀)×100％，ΔI＝I₀-I，I₀和I分别代表电极浸泡前后的DPV峰电流值。如图9，DP/AuNPs/PEDOT-PA修饰电极的抗污染能力是明显优于其他两种界面的，这一结果与DNA-多肽偶联物(DP)对界面的充分覆盖和优异的抗污染能力有关。浸泡于100％人血清后进行测试，裸电极的信号抑制率明高于80％，然而，该DP修饰电极的信号抑制率仅为8.52％，表明该传感器具有一个较为广阔的应用前景。另外，将DP修饰电极与仅多肽(Pep2:Cys Lys Asn Gln Glu Lys Asn Gln Glu Asp His Trp Arg Gly Trp ValAla)或DNA修饰电极进行了抗污染性能的对比，DNA-多肽修饰电极展现出更为优异的抗污染性能，如图10。

实施例6

抗污染性能测试二：

将裸GCE、AuNPs/PEDOT-PA/GCE和DP/AuNPs/PEDOT-PA/GCE孵育于含有0.2mg·mL^{- 1}FITC-BSA的PBS缓冲溶液(10mM，pH 7.4)中进行蛋白吸附，然后使用荧光显微镜对不同界面的荧光蛋白吸附情况进行记录，如图11。蛋白质在界面的吸附量通过光强度来反映，裸GCE表面(第一列)的荧光强度最强，其次是AuNPs/PEDOT-PA修饰界面(第二列)，而DP/AuNPs/PEDOT-PA修饰界面(第三列)的荧光强度最弱。

由实施例5～6可知，DP不管是对单一蛋白甚至是真实复杂生物样品都具有较为优良且稳定的抗污染能力。

实施例7

免疫球蛋白G(IgG)的定量检测：

将组装好的基于DNA-多肽偶联物(DP)的抗污染电化学免疫传感器置于不同浓度的目标物IgG溶液中室温下孵育90min，然后PBS缓冲液对电极界面进行冲洗，洗去未捕获的目标物IgG，并对上述得到的电极进行电化学检测。利用电化学工作站记录传感界面在目标物溶液中孵育后的电流信号变化，来实现对目标物的检测。如图12，在最佳实验条件下测得，电流信号与目标物浓度(0.1ng/mL-10μg/mL)的对数呈现良好的线性关系，最低检测限为0.037ng/mL(S/N)。

同时，将制备的免疫传感器用于医院真实样品中IgG的检测。将本实施例的检测结果与医院标准方法检测结果进行比较，可以看到，对6个实际血清样本进行分析，并与医院使用的法进行对比，本发明制备的免疫传感器的检测结果出与医院免疫比浊法的检测结果基本一致，差异率在2.29％-11.28％，如图13。

实施例8

基于DNA-多肽偶联物(DP)的抗污染电化学免疫传感器的稳定性

首先利用CV连续扫描对传感器的稳定性进行测试，将DP/AuNPs/PEDOT-PA/GCE放置于0.2M的PBS(pH 7.4)中连续扫描50圈并记录其CV曲线。如图14所示，该传感器在经过50圈的连续CV扫描后，峰电流和峰电位保持几乎不变，表现出良好的稳定性。同时，在十天内对传感器的电流信号进行间隔检测，信号保留率为94.6％，相对标准偏差(RSD)为1.41％(图15)。

实施例9

基于DNA-多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器的选择性

选择浓度为100μg/mL的IgM、CEA、AFP、CA125、HSA和BSA作为干扰物，测试了该传感器的选择性。实验结果显示：即使干扰物浓度是目标物浓度100倍，从电流信号中也没有观察到明显的响应，表明该传感器具有良好的选择性(图16)。

实施例10

为了获得更优异的传感性能，我们对几个重要的实验条件进行了优化。

我们对不同浓度的DNA、不同浓度多肽和目标物不同孵育时间对传感器的影响进行了详细记录。我们以修饰电极在20％FBS中的抗污染能力来进行优化，如图17，随着DNA浓度的增加(从0.25μM增加到3.0μM)，电极抗污染性能逐渐增强，随后DNA浓度继续增加，抗污染性能有减弱趋势，所以我们选择1.0μM为DNA的最佳修饰浓度。如图18，随着多肽浓度的增加(从0.1μM增加到3.0μM)，电极抗污染性能逐渐增强，随后多肽浓度继续增加，抗污染性能有减弱趋势，所以我们选择1.0μM为多肽的最佳修饰浓度。接下来，我们对目标物不同孵育时间进行了探究，如图19。随着孵育时间由30min增加到90min，电流信号变化先增加然后趋于平稳。因此，选择90min为最佳杂交时间。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种基于DNA-多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述抗污染电化学免疫传感器是以玻碳电极为基底，依次修饰有植酸掺杂的3,4-乙烯二氧噻吩、金纳米颗粒以及DNA-多肽偶联物；且，

所述DNA-多肽偶联物的多肽序列为Pep1：(2-Azido)-Lys Asn Gln Glu Lys Asn GlnGlu Asp His Trp Arg Gly Trp Val Ala；DNA序列为polyA₇-polyT₅：5’-AAAAA AATTT TT-(DBCO)-3’；polyA₁₅-polyT₅：5’-AAAAA AAAAA AAAAA TTTTT-(DBCO)-3’；

具体地，所述制备方法包括如下步骤：

I、DNA-多肽偶联物的制备：将DBCO修饰的DNA与叠氮修饰的多肽等摩尔比混合，触发点击化学反应，在37℃下摇床中震荡过夜，即得DNA-多肽偶联物DP；

II、传感器的组装：对玻碳电极进行预处理，首先利用氧化铝粉末对界面进行抛光，然后在超声波条件下用水、无水乙醇、水清洗；将预处理后的玻碳电极浸泡于含有3,4-乙烯二氧噻吩EDOT和植酸PA的混合溶液中，在室温下采用恒电位法制备PEDOT-PA修饰电极；将PEDOT-PA修饰电极浸泡在含有氯化钾KCl的氯金酸HAuCl₄溶液中，在室温下采用恒电位法制得AuNPs/PEDOT-PA修饰电极；将AuNPs/PEDOT-PA修饰电极浸泡在DNA-多肽偶联物DP的混合液中室温孵育过夜，即得所述基于DNA-多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器。

2.根据权利要求1所述的基于DNA-多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤I的具体方法为：

将DBCO修饰的DNA分散于CaCl₂-TE缓冲液，叠氮修饰的多肽分散于去离子水中，制得终浓度不小于为2 μM的溶液；然后将两种溶液等摩尔比混合，触发点击化学反应，在37℃下摇床中震荡过夜，获得终浓度不小于1 μM的DNA-多肽偶联物。

3.根据权利要求1所述的基于DNA-多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤II的具体方法为：

对玻碳电极进行预处理，首先利用氧化铝粉末对界面进行抛光，然后在超声波条件下用水、无水乙醇、水清洗；将预处理好的玻碳电极浸泡于含有0.005~0.02 M的3,4-乙烯二氧噻吩EDOT和0.005~0.02 M的植酸PA溶液中，在室温下采用1.1 V恒电位，沉积20~100 s，得PEDOT-PA修饰电极；将所述PEDOT-PA修饰电极浸泡在含有0.1 M KCl的5 mM HAuCl₄溶液中，在-0.5 V下沉积30~60 s，制得AuNPs/PEDOT-PA修饰电极；将所述AuNPs/PEDOT-PA修饰电极在不小于1 μM DP溶液中室温孵育过夜，反应结束后，用去离子水冲洗，除去未固定的DP，即得传感器。

4.如权利要求1所述方法制备的基于DNA-多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器在免疫球蛋白G检测中的应用。

5.根据权利要求4所述的基于DNA-多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器的应用，其特征在于，包括用于定量检测免疫球蛋白G，所述的定量检测为：

将基于DNA-多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器置于不同浓度的目标物免疫球蛋白G溶液中，恒温孵育，然后使用PBS缓冲液对电极界面进行冲洗，洗去未捕获的目标物免疫球蛋白G，并对上述得到的电极进行电化学检测；并利用差分脉冲伏安法-0.2-0.6 V范围内记录传感界面在目标物溶液中孵育后的电流信号变化，来实现对目标物免疫球蛋白G的检测。

6.根据权利要求5所述的基于DNA-多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器应用，其特征在于，所述恒温孵育的温度为室温，孵育时间是90 min，以保证目标物免疫球蛋白G的充分结合。

7.根据权利要求6所述的基于DNA-多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器应用，其特征在于，所述免疫球蛋白G的线性检测范围是0.1 ng/mL-10 μg/mL，检出限为0.037 ng/mL。