CN111272847A - 一种用于检测绵羊支原体肺炎的电化学生物传感器的制备及检测方法 - Google Patents

一种用于检测绵羊支原体肺炎的电化学生物传感器的制备及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111272847A
CN111272847A CN202010074747.7A CN202010074747A CN111272847A CN 111272847 A CN111272847 A CN 111272847A CN 202010074747 A CN202010074747 A CN 202010074747A CN 111272847 A CN111272847 A CN 111272847A
Authority
CN
China
Prior art keywords
electrochemical biosensor
peg
nps
solution
magnetic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010074747.7A
Other languages
English (en)
Inventor
陈丽华
赵师伊
李聪年
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kashi Jinhuitong Industrial Development Co ltd
Qingdao University of Science and Technology
Original Assignee
Kashi Jinhuitong Industrial Development Co ltd
Qingdao University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kashi Jinhuitong Industrial Development Co ltd, Qingdao University of Science and Technology filed Critical Kashi Jinhuitong Industrial Development Co ltd
Priority to CN202010074747.7A priority Critical patent/CN111272847A/zh
Publication of CN111272847A publication Critical patent/CN111272847A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/308—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells at least partially made of carbon

Abstract

本发明公开了一种用于检测绵羊支原体肺炎的电化学生物传感器的制备及检测方法，使用磁性Fe3O4@Au@PEG@CS NPs纳米颗粒修饰的磁性玻璃碳电极在100％血清中对绵羊支原体目标DNA进行检测。基于原有技术Fe3O4@Au@PEG NPs的基础上，增加了硫酸软骨素(CS)，制备了新型的金磁纳米微粒Fe3O4@Au@PEG@CS NPs，该纳米微粒因为添加了CS材料，即使是在100％血清中，也能凸显出优异的抗污效果，并将该纳米微粒运用开发了一种用于检测绵羊支原体肺炎的电化学生物传感器。该电化学生物传感器具有选择性、稳定性和重复性，宽的线性范围和超低检出限，在实际应用中有巨大前景。

Description

一种用于检测绵羊支原体肺炎的电化学生物传感器的制备及 检测方法
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种用于检测绵羊支原体肺炎的电化学生物传感器的制备及检测方法。
背景技术
绵羊支原体肺炎是一种具有高度传染性的疾病，是由肺炎支原体引起的，几乎可以在所有种群中传播，更不幸的是，其早期感染阶段的症状是非常隐蔽的，一旦发现，从经济利润的角度来看，没有任何治疗意义。到目前为止，绵羊支原体肺炎的流行已经对全球畜牧业造成巨大经济损失。因此，针对该疾病的高选择性和灵敏性的早期诊断尤为重要。
目前，已被广泛报道并应用的方法有分离培养方法、电子显微镜、血清学方法、环介导等温扩增(LAMP)、PCR和荧光方法。然而，这些传统的检测方法仍然不时受到交叉反应、假阳性或假阴性的干扰，检测耗时长、依赖于复杂而昂贵的检测设备，需要严格的实验条件和熟练的操作员进行操作，这极大地限制了这些方法在偏远山区的应用。因此，非常需要开发用于肺炎支原体病的即时、便捷和灵敏的检测。
绵羊支原体肺炎检测的困难和瓶颈是疾病早期体液中标志物的浓度非常低。并且由于体液中含有大量的有机和无机化合物，以及各种酶和蛋白质，大大增加了准确测试的难度。电化学生物传感器作为新兴和热门研究兴趣的热点，由于其低成本，响应速度快，高选择性，以及其特别出色的灵敏度(10-19M)，证明了其在未来的疾病检测中具有引人注目的潜力。因此，开发一种用于绵羊肺炎支原体病检测的新型电化学生物传感器具有很好的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中绵羊支原体肺炎早期症状不易检测的问题，提出了一种电化学生物传感器，其主要用于绵羊支原体肺炎的检测，检测效果好，并且具有很好的抗污染性能。
本发明的技术方案是：
一种用于检测绵羊支原体肺炎的电化学生物传感器，包括磁性Fe3O4@AuNPs、聚乙二醇、硫酸软骨素和磁性玻璃碳电极。
一种用于检测绵羊支原体肺炎的电化学生物传感器的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)Fe3O4@AuNPs的制备：
将Fe3O4纳米颗粒加入到柠檬酸钠溶液中，稀释并搅拌，然后将其加热至100℃，滴加到浓度为24mM的HAuCl4水溶液，恒温反应45min，利用磁力分离并用柠檬酸钠溶解，冷却至室温后逐渐加入浓度为24mM的HAuCl4以及过量的浓度为0.2M的NH2OH·HCl，共添加四次，将反应得到的产物通过磁力分离用乙醇和水洗涤，将其分散在脱氧水中，得到Fe3O4@AuNPs并在4℃下保存；
(2)Fe3O4@Au@PEG@CS NPs的制备：
将四臂氨基PEG加入到步骤(1)制备得到的Fe3O4@AuNPs中，超声处理一定时间后于4℃下静置48小时，洗涤数次去除未反应的PEG，得到Fe3O4@Au@PEGNPs溶液；称取CS溶解于水溶液中，加入一定量的EDC和NHS混合反应30min，然后滴加到上述Fe3O4@Au@PEGNPs溶液中，孵育三天后得到Fe3O4@Au@PEG@CS NPs，将其分散到脱氧水中备用；
(3)电化学生物传感器的制备：
将磁性玻碳电极进行预处理，用氮气吹干后，将Fe3O4@Au@PEG@CS NPs溶液涂到磁性玻碳电极表面并进行干燥，用水清洗后在室温下浸泡于水中备用。
进一步的，所述步骤(1)中的Fe3O4纳米颗粒由共沉淀反应制备而成。
进一步的，所述电化学生物传感器用于绵羊支原体肺炎的检测，所述检测方法为：将目标DNA溶液滴在电化学生物传感器的电极上，室温孵育45min，记录孵育前后的DPV峰电流变化。
本发明的有益效果：
基于Fe3O4@Au@PEGNPs制备了一种新型的金磁纳米微粒Fe3O4@Au@PEG@CS NPs，该纳米微粒显示出优异的抗污染效果，将该纳米微粒运用开发了一种用于检测绵羊支原体肺炎的电化学生物传感器。该电化学生物传感器具有令人满意的选择性、稳定性和重复性，宽的线性范围和超低检出限；可以进行100％血清中目标DNA的检测，这也表明了其在实际应用中的巨大前景。
附图说明
图1为电化学生物传感器检测绵羊支原体肺炎的流程示意图；
图2为高分辨率透射电镜图；
图3为循环伏安曲线图；
图4为差分脉冲伏安曲线图；
图5为有无CS材料修饰的电极在浸泡100％血清前后的电流变化图；
图6为Fe3O4@Au@PEG@CS NPs修饰的电化学生物传感器的抗污染污能力；
图7为AuNPs修饰的导电玻璃和Fe3O4@Au@PEG@CS NPs修饰的导电玻璃分别在浸泡100％山羊血清之前和浸泡之后的SEM图；
图8为未经修饰的导电玻璃(a)，Fe3O4@Au@PEG NPs修饰的导电玻璃(b)和Fe3O4@Au@PEG@CS NPs修饰的导电玻璃(c)的接触角剖面图；
图9为静态水接触角的变化曲线；
图10为电化学生物传感器浸泡在目标DNA的PBS缓冲液中其(Ip-Ip0)随时间的变化图；
图11为本发明实施例提供的电化学生物传感器对不同浓度目标DNA的DPV响应曲线；
图12为该电化学生物传感器的线性拟合曲线，内插图为响应电流与浓度的线性关系；
图13为该对于目标DNA以及完全不匹配DNA，三错配DNA，二错配DNA，一错配DNA的信号响应；
图14为该电化学生物传感器的时间稳定性柱形图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下将结合实施例和试验例，对本发明作进一步详细说明。
实施例：
1、所选用的试剂：
氯化六氨基合钌(III)(Ru(NH3)6 3+)和1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDGE)由Sigma-Aldrich提供；从阿拉丁科技(中国)有限公司(上海)购买铁氰化钾(III)、亚铁氰化钾(II)三水合物、磷酸氢二钠十二水合物、无水磷酸二氢一钠、牛血清白蛋白(BSA，MW：66.43kDa)、碳酸氢钠、无水碳酸钠、氯化钠和氯化钾；山羊奶来自山东阳春羊奶乳制品有限公司，产品在当地市场购买，每100克羊奶含有2.8克蛋白质；布鲁氏菌病外膜蛋白31(OMP31)由石河子大学动物科技学院捐赠；山羊血清购自上海生工生物工程有限公司(中国上海)。
所有溶液均用来自Milli-Q净水系统的Millipore水制备。所有试剂均为分析级，无需进一步纯化，所有实验均在室温下进行。缓冲溶液包括磷酸盐缓冲盐水(PBS，10mM，pH7.4，含有0.9％NaCl)，碳酸盐缓冲溶液(CBS，10mM，pH 10.56和pH 9.5)。
2、所选用的仪器：
在上海辰华仪器有限公司(中国)的CHI660E电化学工作站的帮助下进行电化学测量(循环伏安法(CV)，差分脉冲伏安法(DPV))。传统的三电极系统：磁性玻璃碳电极(MGCE，直径3.0mm)作工作电极，铂丝电极作对电极，饱和甘汞参比电极(SCE)作参比电极。磁性玻璃碳电极具有三个部件，即铜连接器，空心圆柱形磁体和填充有玻璃碳的聚四氟乙烯圆柱形管。使用Ru(NH3)6 3+作为探针，在-0.6V和0.2V之间记录CV和DPV。
使用JEM-2100TEM仪器(Hitachi High-Technology Co.，Ltd.Japan)进行透射电子显微镜(TEM)测试。扫描电子显微镜(SEM)图像和能量色散光谱用场发射SEM测试(JEOLJSM-7500F，日立日立高科技有限公司)。使用中晨数字技术设备有限公司(中国上海)的JC2000测角仪进行静态水接触角测试。PHSJ-3F pH计(PHSJ-3F)来自上海仪电科学仪器股份有限公司。电子天平(BSA 124S)来自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。
3、实施例所使用的DNA序列
通过HPLC在上海生工生物有限公司合成并纯化所有寡核苷酸序列。寡核苷酸的序列列于表1中；用于本研究的寡核苷酸的序列与其它疾病的基因没有同源性。
表1寡核苷酸的序列
名称 序列(5’→3’)
探针DNA NH<sub>2</sub>-C6-CAATCCAAGGTGGAGTTCTTGCTGGTGAAATTAGTGA
目标DNA TCACTAATTTCACCAGCAAGAACTCCACCTTGGATTG
一错配DNA TCACTAATGTCACCAGCAAGAACTCCACCTTGGATTG
二错配DNA TCACTAATGTCACCAGCAATAACTCCACCTTGGATTG
三错配DNA TCACTAATGTCACCAGCAATAACTCCACTTTGGATTG
完全不匹配DNA CAGACGGCCCTCTAGTAGGTCCTGTAGAACCAAGCCA
4、CS包覆的磁性纳米颗粒的制备
制备Fe3O4@AuNPs：以氯化铁和氯化亚铁为原料，NaOH为还原剂，根据共沉淀反应制备Fe3O4纳米颗粒。然后，称取制备得到的Fe3O4纳米粒子10mg加入到100mL浓度为10mM的柠檬酸钠溶液中稀释至1.1mM并搅拌12h。将上述混合溶液加热至100℃，随后滴加1.75mL浓度为24mM的HAuCl4水溶液。恒温反应45min，将上述溶液磁力分离并用等体积的浓度为0.1M的柠檬酸钠溶解。随后，冷却至室温，逐渐加入24mM浓度的HAuCl4共计15mL，加入过量的浓度为0.2M的NH2OH·HCl共计10mL，每次加入间隔时间至少30min，共计进行四次添加，通过磁力分离将得到的产物用乙醇和水洗涤几次，并再分散在50mL脱氧水中，得到浓度为1mg/mL的Fe3O4@AuNPs，于4℃下保存。
制备Fe3O4@Au@PEG@CS NPs：首先将浓度为2mM的四臂氨基PEG加入到Fe3O4@Au NPs中，超声处理30min并在4℃下静置48h；然后用水洗涤三次，除去新制备的Fe3O4@Au@PEGNPs溶液中的未反应的PEG。称取20mgCS溶解在2.5mL水中，加入80mg EDC和80mgNHS，混合反应30min，再滴加到2.5mLFe3O4@Au@PEGNPs水溶液中，孵育三天；收集合成的Fe3O4@Au@PEG@CSNPs，然后再将其分散到2.5mL脱氧水中以备进一步使用。
5、Fe3O4@Au@PEG@CS NPs修饰传感器的制备
对磁性玻碳电极进行预处理并用氮气吹干后，将10μL浓度为1mg/mL的Fe3O4@Au@PEG@CS NPs溶液滴涂到磁性玻碳电极表面；然后置于烘箱中，37℃条件下干燥3h，随后用水冲洗，得到Fe3O4@Au@PEG@CS NPs修饰传感器，室温下浸泡在水中直至使用。
6、探针DNA的固定
采用10mM CBS稀释1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶液，溶液浓度为0.6M，pH值为10.56；将Fe3O4@Au@PEG@CS NPs修饰电极浸泡在300μL稀释后的1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶液中反应18h；然后将含有1μM探针DNA的30μL CBS(10mM，pH 9.5)滴加到电极表面反应15h，制备得到探针DNA/Fe3O4@Au@PEG@CS NPs/MGCE，用PBS(10mM，pH 7.4)彻底冲洗后，于4℃条件下储存在PBS中备用。
7、DNA传感器的应用
移取30μL不同浓度的目标DNA滴在固定上探针DNA的电极上，于室温下孵育45min；测量探针DNA和目标DNA之间特异性结合完成之前和之后的DPV峰电流。通过在PBS含有5.0mM Ru(NH3)6 3+和0.1M KCl(10mM，pH 7.4)的溶液中扫描-0.6V至0.2V的电位，进行DPV测量，电位增量为4.0mV，脉冲宽度(调制时间)为50ms，脉冲幅度为50mV。
试验例1
Fe3O4@Au@PEG@CS NPs纳米粒子的表征
通过HRTEM对Fe3O4纳米颗粒(图2中的A)和Fe3O4@Au纳米颗粒(图2中的B)进行表征。Fe3O4纳米颗粒呈浅色，如图2中的A中的内插图所示，Fe3O4纳米颗粒的条纹间距为0.24nm，对应于Fe3O4的111面。Fe3O4@Au纳米颗粒较暗，条纹间距为0.14nm，对应于(440)平面(图2中的B中的内插图)。通过EDS表征Fe3O4@Au@PEGNPs(图2中的C)和Fe3O4@Au@PEG@CSNPs(图2中的D)的元素组成；图2中的C中铁、金、氧及氮元素来自Fe3O4@Au@PEGNPs；图2中的D的EDS光谱显示硫元素的存在，其证实硫酸软骨素成功包被到Fe3O4@Au@PEGNPs上。使用SEM表征Fe3O4@Au@PEGNPs(图2中的E)和Fe3O4@Au@PEG@CS NPs(图2中的F)的表面形态；两种纳米粒子都呈现球形，且没有聚集现象；其中Fe3O4@Au@PEG@CS NPs的平均直径约为169nm。
试验例2
电化学生物传感器的电化学表征
采用循环伏安法和差分脉冲伏安法对电化学生物传感器界面的逐步修饰过程进行了研究。从图3中我们可以看到，裸磁性玻碳电极呈现一个具有代表性的CV氧化还原峰。将Fe3O4@Au@PEG@CS NPs纳米粒子固定在电极表面后，导致CV峰电流明显增大(曲线b)，这可能与磁性纳米材料自身具有优异的导电性以及电极比表面积的增大有关。探针DNA的固定也提高了电流强度(曲线c)，这是因为捕获探针的带负电荷的磷酸盐骨架吸引了Ru(NH3)6 3+氧化还原探针向电极表面扩散。然后，当电化学生物传感器与目标DNA孵育后，CV峰电流有进一步增大(曲线d)，这也是因为探针DNA和目标DNA的杂交形成双链DNA，负电荷增多吸引了更多的Ru(NH3)6 3+氧化还原探针向电极表面扩散。图4的DPV结果与CV结果一致，进一步说明了电化学生物传感器的成功制备。
试验例3
Fe3O4@Au@PEG@CS NPs修饰的电化学生物传感器的抗污染性能测试
为了评估Fe3O4@Au@PEG@CS NPs在抗非特异性蛋白吸附方面的能力，首先将Fe3O4@Au@PEG@CS NPs固定在磁性玻碳电极上，然后利用DPV记录与不同干扰物孵育前后DPV电流变化。Ip0，Ip分别是与干扰物一起孵育之前和之后的DPV峰电流值。如图5所示，Fe3O4@Au@PEGNPs和Fe3O4@Au@PEG@CS NPs修饰电极分别与100％血清孵育，与没有CS的纳米材料相比，有CS的纳米材料修饰的电极表现出更小的峰电流变化。接下来，选择单蛋白质溶液(BSA和OMP31)或复杂介质(DNA混合物和100％羊奶)来测试Fe3O4@Au@PEG@CS NPs修饰的电化学生物传感器的抗污染污能力。如图6所示，在BSA(10mg mL-1)，OMP31(1μgmL-1)，DNA混合物(0.1μM)和100％山羊奶(2.8g蛋白质/100g)孵育后，由非特异性吸附引起的电化学生物传感器DPV峰电流的变化(Ip/Ip0)分别为0.99，1.03，1.02和0.98。这些结果表明含CS的纳米材料具有优异的抗污染性能，有利于未来在复杂体系中的应用。
SEM还用于表征血清中孵育前后Fe3O4@Au@PEG@CS NPs/ITO和Au NPs/ITO的表面形貌，以验证含CS的纳米材料能否抵抗非特异性蛋白质的吸附。实验发现，如图7中c和d所示，与未和血清孵育的Fe3O4@Au@PEG@CS NPs/ITO表面相比，孵育后的表面上也没有观察到血清物质。然而，如图7中a和b所示，在与血清孵育后的AuNPs/ITO表面上可以发现明显的血清物质。
静态水接触角通常用于表征表面润湿性，图8和图9显示了接触角随电极表面改变的变化。Fe3O4@Au@PEGNPs修饰ITO表面的水接触角(约57.85°)小于裸ITO(约63.62°)的接触角，表明Fe3O4@Au@PEGNPs纳米材料修饰表面的润湿性较好。Fe3O4@Au@PEG@CS NPs修饰表面的接触角为15.44°，这是因为携带大量氨基(-NH2)和羧基(-COOH)的硫酸软骨素显著的改善了亲水性，这种高亲水性同时提高了电化学生物传感器的抗污染能力，因为亲水表面可以通过水化层的空间排斥来防止非特异性蛋白质的吸附。
试验例4
电化学生物传感器的传感响应测试
为了获得最佳的电化学响应，针对探针DNA/目标DNA相互作用的孵育时间进行了优化。将电化学生物传感器在室温下浸入目标DNA(10-9M)溶液中进行不同的孵育时间，时间在15min至60min之间。如图10所示，随着孵育时间的延长，DPV峰电流响应增大，然后几乎保持不变，证明45min足以实现DNA之间的完全杂交。因此，在以下实验中选择45min作为最佳孵育时间。
使用DPV在含有不同目标DNA浓度的PBS溶液中研究探针DNA/Fe3O4@Au@PEG@C SNPs/MGCE修饰电极用于检测绵羊支原体肺炎的电化学分析性能。如图11的曲线a-h所示，电化学生物传感器的DPV峰电流随着目标DNA浓度的增加而增加，这是由于探针DNA与更多的目标DNA进行杂交使电化学生物传感器界面上的负电荷增多，由于静电吸引作用吸引了更多的Ru(NH3)6 3+氧化还原探针向电极表面扩散。DPV峰电流变化率(ΔIp/Ip0(％))与目标DNA浓度的对数值呈线性关系，线性回归方程为(ΔIp/Ip0(％))＝59.43+3.31l g C，相关系数(R2)为0.9986；线性范围从10-17M到10-11M，检测限为3.30aM(S/N＝3)，如图12所示。表2列举了不同磁性材料的检测性能，从中可以看出本实验的最低检出限远低于已被报道的磁性材料。这可归因于Fe3O4@Au@PEG@CS纳米材料完美的抗污染性能以及优异的生物相容性。
表2不同磁性材料表现的比较
Magneticmaterial Substancetobeexamined Linearrange Detectionlimit
Ag@MWCNT-IL-Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub> Glucoseoxidase 6μM-2mM 2.12μM
GOwrappedFe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>@Au nileblueA -- 0.1nM
Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>@Au MON810maizegene 0.25-2.5nM 0.15nM
Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>@Au Alzheimer'samyloid-βpeptide(Aβ) 5.0fM-5.56nM 1.2fM
Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>@Au-GSH estradiol 0.025-10.0μM 2.76nM
core-shellFe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>@Au RoundupReady(RR)soybean 0.1-10.0nM 0.02nM
Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>@Au@PEG@CSNPs Mycoplasmapneumoniae 10aM-0.1nM 3.30aM
Magneticmaterial Substancetobeexamined Linearrange Detectionlimit
试验例5
电化学生物传感器的选择性，再现性和稳定性测试
为了评估电化学生物传感器的选择性，在含有完全不匹配DNA，一错配DNA，二错配DNA，三错配DNA和目标DNA的溶液中分别孵育，然后记录电化学生物传感器的电流响应[ΔIp/Ip0(％)]。如图13所示，与目标DNA的电流响应相比，电化学生物传感器对完全不匹配DNA，一错配DNA，二错配DNA和三错配DNA的信号响应非常小，尽管完全不匹配DNA，一错配DNA，二错配DNA和三错配DNA的浓度比目标DNA的浓度还要高100倍。优异的选择性可能是由于Fe3O4@Au@PEG@CS NPs修饰的传感器的良好防污性能以及探针DNA和目标DNA之间的强生物亲和作用。
使用探针DNA修饰的五个独立电极来评估该电化学生物传感器的再现性，制备的电极用于检测0.1fM目标DNA；在相同条件下，相对标准偏差(RSD)仅为4.82％，结果表明该电化学生物传感器具有良好的重现性。
稳定性是进行实际应用前需要考虑的一个非常重要的因素。通过监测电化学生物传感器20天的DPV峰电流响应来评估探针DNA/Fe3O4@Au@PEG@CS NPs/MGCE电化学生物传感器的长期稳定性。将制备的电化学生物传感器浸泡在PBS溶液中，在4℃的冰箱中保存。如图14所示，5天后，制备的电化学生物传感器的DPV峰电流响应保持基本恒定。储存14天后，该传感器的DPV峰电流还保留了约初始响应的93.57％，而且在20天后仅下降了6.73％。电化学生物传感器的这种优异的稳定性可归因于Fe3O4@Au@PEG@CS NPs材料的良好生物相容性，其提供了友好的微环境以维持DNA生物活性。
试验例6
电化学生物传感器的分析性能检测
为了研究所开发的电化学生物传感器的潜在实际应用能力，电化学生物传感器被用于检测100％血清中的目标DNA。在检测之前，使用标准加入法将不同浓度的目标DNA添加到100％血清中；如表3的回收结果所示，获得了102.80％到106.89％的回收率，RSD在0.38％和4.49％之间；证明了所开发的电化学生物传感器在实际应用中有广阔的前景。
表3 100％血清样品中目标DNA的分析结果
Samples Added(aM) Found(aM) Recovery(％) RSD(％)
1 10 10.28 102.80 4.49
2 100 106.89 106.89 0.38
3 10000 10632.03 106.32 0.88

Claims (4)

1.一种用于检测绵羊支原体肺炎的电化学生物传感器，其特征在于，包括磁性Fe3O4@AuNPs、聚乙二醇、硫酸软骨素和磁性玻璃碳电极。
2.一种用于检测绵羊支原体肺炎的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)Fe3O4@AuNPs的制备：
将Fe3O4纳米颗粒加入到柠檬酸钠溶液中，稀释并搅拌，然后将其加热至100℃，滴加到浓度为24mM的HAuCl4水溶液，恒温反应45min，利用磁力分离并用柠檬酸钠溶解，冷却至室温后逐渐加入浓度为24mM的HAuCl4以及过量的浓度为0.2M的NH2OH·HCl，共添加四次，将反应得到的产物通过磁力分离用乙醇和水洗涤，将其分散在脱氧水中，得到Fe3O4@AuNPs并在4℃下保存；
(2)Fe3O4@Au@PEG@CS NPs的制备：
将四臂氨基PEG加入到步骤(1)制备得到的Fe3O4@AuNPs中，超声处理一定时间后于4℃下静置48h，洗涤数次去除未反应的PEG，得到Fe3O4@Au@PEGNPs溶液；称取CS溶解于水溶液中，加入一定量的EDC和NHS混合反应30min，然后滴加到上述Fe3O4@Au@PEGNPs溶液中，孵育三天后得到Fe3O4@Au@PEG@CS NPs，将其分散到脱氧水中备用；
(3)电化学生物传感器的制备：
将磁性玻碳电极进行预处理，用氮气吹干后，将Fe3O4@Au@PEG@CS NPs溶液涂到磁性玻碳电极表面并进行干燥，用水清洗后在室温下浸泡于水中备用。
3.根据权利要求2所述的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中的Fe3O4纳米颗粒由共沉淀反应制备得到。
4.根据权利要求1所述的电化学生物传感器的应用，其特征在于，所述电化学生物传感器用于绵羊支原体肺炎的检测，所述检测方法为：将目标DNA溶液滴在电化学生物传感器的电极上，室温孵育45min，记录孵育前后的DPV峰电流变化。
CN202010074747.7A 2020-01-22 2020-01-22 一种用于检测绵羊支原体肺炎的电化学生物传感器的制备及检测方法 Pending CN111272847A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010074747.7A CN111272847A (zh) 2020-01-22 2020-01-22 一种用于检测绵羊支原体肺炎的电化学生物传感器的制备及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010074747.7A CN111272847A (zh) 2020-01-22 2020-01-22 一种用于检测绵羊支原体肺炎的电化学生物传感器的制备及检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111272847A true CN111272847A (zh) 2020-06-12

Family

ID=70996945

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010074747.7A Pending CN111272847A (zh) 2020-01-22 2020-01-22 一种用于检测绵羊支原体肺炎的电化学生物传感器的制备及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111272847A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113699217A (zh) * 2021-10-15 2021-11-26 青岛科技大学 检测绵羊肺炎支原体的探针、传感器及试剂盒

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102914648A (zh) * 2012-10-09 2013-02-06 重庆医科大学 检测弓形虫IgM抗体的电化学免疫传感器及其制备方法
CN109270138A (zh) * 2018-09-03 2019-01-25 喀什金慧通实业开发有限责任公司 检测布鲁氏菌病的电化学免疫传感器的制备方法及其应用
CN109540995A (zh) * 2018-12-31 2019-03-29 合肥工业大学 检测转基因成分dna的方法及其使用的电化学传感器
CN110687182A (zh) * 2019-10-30 2020-01-14 云南大学 一种检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器的制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102914648A (zh) * 2012-10-09 2013-02-06 重庆医科大学 检测弓形虫IgM抗体的电化学免疫传感器及其制备方法
CN109270138A (zh) * 2018-09-03 2019-01-25 喀什金慧通实业开发有限责任公司 检测布鲁氏菌病的电化学免疫传感器的制备方法及其应用
CN109540995A (zh) * 2018-12-31 2019-03-29 合肥工业大学 检测转基因成分dna的方法及其使用的电化学传感器
CN110687182A (zh) * 2019-10-30 2020-01-14 云南大学 一种检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
赵师伊: "糖胺聚糖修饰的生物传感器的制备及在重大人畜共患病检测中的应用", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士） 医药卫生科技辑》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113699217A (zh) * 2021-10-15 2021-11-26 青岛科技大学 检测绵羊肺炎支原体的探针、传感器及试剂盒
CN113699217B (zh) * 2021-10-15 2023-12-26 青岛科技大学 检测绵羊肺炎支原体的探针、传感器及试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen et al. A sandwich-type electrochemical aptasensor for Mycobacterium tuberculosis MPT64 antigen detection using C60NPs decorated N-CNTs/GO nanocomposite coupled with conductive PEI-functionalized metal-organic framework
Ranjbar et al. Design and fabrication of an electrochemical aptasensor using Au nanoparticles/carbon nanoparticles/cellulose nanofibers nanocomposite for rapid and sensitive detection of Staphylococcus aureus
Jia et al. Impedimetric aptasensor for Staphylococcus aureus based on nanocomposite prepared from reduced graphene oxide and gold nanoparticles
Yin et al. Electrochemical immunosensor of tumor necrosis factor α based on alkaline phosphatase functionalized nanospheres
Zhang et al. Immobilization of uricase on ZnO nanorods for a reagentless uric acid biosensor
Zhu et al. Amperometric immunosensor for simultaneous detection of three analytes in one interface using dual functionalized graphene sheets integrated with redox-probes as tracer matrixes
Zhang et al. Optimized dendrimer-encapsulated gold nanoparticles and enhanced carbon nanotube nanoprobes for amplified electrochemical immunoassay of E. coli in dairy product based on enzymatically induced deposition of polyaniline
Liu et al. Activity analysis of the carbodiimide-mediated amine coupling reaction on self-assembled monolayers by cyclic voltammetry
Han et al. Electrochemical immunosensor based on self-assembled gold nanorods for label-free and sensitive determination of Staphylococcus aureus
Wang et al. Immunosensor based on electrodeposition of gold-nanoparticles and ionic liquid composite for detection of Salmonella pullorum
Yang et al. Hollow platinum decorated Fe3O4 nanoparticles as peroxidase mimetic couple with glucose oxidase for pseudobienzyme electrochemical immunosensor
Zhu et al. Simultaneous detection of four biomarkers with one sensing surface based on redox probe tagging strategy
CN110632160B (zh) 一种三维细胞纸芯片传感器及在细菌脂多糖检测中的应用
Mobed et al. An innovative nucleic acid based biosensor toward detection of Legionella pneumophila using DNA immobilization and hybridization: A novel genosensor
Hasanzadeh et al. A novel DNA based bioassay toward ultrasensitive detection of Brucella using gold nanoparticles supported histidine: A new platform for the assay of bacteria in the cultured and human biofluids with and without polymerase chain reactions (PCR)
Zhao et al. Low fouling strategy of electrochemical biosensor based on chondroitin sulfate functionalized gold magnetic particle for voltammetric determination of mycoplasma ovipneumonia in whole serum
Yang et al. A novel platform for high sensitivity determination of PbP2a based on gold nanoparticles composited graphitized mesoporous carbon and doxorubicin loaded hollow gold nanospheres
Song et al. Functional DNA-peptide conjugates with enhanced antifouling capabilities for electrochemical detection of proteins in complex human serum
Zhou et al. Application of metal-organic framework (MOF)-based enzymatic amplification strategy for the sensitive electrochemical detection of tuberculosis
CN104483362A (zh) 捕获探针与信号探针修饰的电极及其制备方法和应用
He et al. A label-free electrochemical DNA biosensor for kanamycin detection based on diblock DNA with poly-cytosine as a high affinity anchor on graphene oxide
Li et al. A novel renewable electrochemical biosensor based on mussel-inspired adhesive protein for the detection of Escherichia coli O157: H7 in food
CN110441380A (zh) 一种基于分子印迹电极技术的电化学传感器及其制备方法和应用
Cui et al. Electrochemical determination of NADH using a glassy carbon electrode modified with Fe 3 O 4 nanoparticles and poly-2, 6-pyridinedicarboxylic acid, and its application to the determination of antioxidant capacity
Oliveira et al. Rapid and label-free Listeria monocytogenes detection based on stimuli-responsive alginate-platinum thiomer nanobrushes

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200612

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication