CN113699217B - 检测绵羊肺炎支原体的探针、传感器及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物传感器技术领域，针对现有的基于MOFs的传感器的容易受到干扰，特异性和选择性不理想的问题，本发明提供一种检测绵羊肺炎支原体的DNA探针、传感器及试剂盒，该方案将SEQ ID NO:1所示的发夹DNA包埋到NH2‑MIL‑53(Al)中，制备了一种新型纳米探针。实验表明，信号分子不仅可以在缓冲介质中，也可以在自然复杂介质中智能识别G4Probe与target的特定组合。此外，该传感器检测限低，且在target浓度为10‑10M～10‑6M范围内具有良好的线性响应。

Description

检测绵羊肺炎支原体的探针、传感器及试剂盒
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及检测绵羊肺炎支原体的探针、传感器及试剂盒。
背景技术
虽然基于金属有机框架(MOFs)的传感器平台由于其结构的多样性和多功能已广泛应用于病原生物标志物检测的临床应用中，但临床条件的复杂性与各种生物污染物(蛋白质、多糖和脂质)仍然是该平台在疾病标志物定量分析的主要障碍。
金属有机框架(MOFs)是一类由金属离子和有机配体组成的晶体多孔材料。其规则的孔隙可以吸收和存储大量的靶标分子，其有机配体的官能团赋予了该材料进一步化学修饰的能力。而其可调孔径、良好的化学稳定性和较大的比表面积等特性进一步增强了其在各个领域的应用优势，特别是在生物分析的生物传感器方面。如基于还原MOFs的三维催化功能检测乙肝病毒表面抗原，以及基于MOFs中荧光团的原位结合检测细菌孢子。
在现有的不同类型的基于MOFs的传感器中，MOFs通常作为信号探针或信号探针载体。对于前者，由于MOFs具有较大的比表面积和稳定的结构，可以作为纳米载体负载信号分子来促进信号。例如，基于传感探针Hemin/Ce-MOFs构建了荧光开关用于检测G4。对于后者，则是由于MOFs具有良好的将信号分子包埋在孔中进而通过智能门控控制释放信号分子的能力。例如，利用不同的DNA发夹作为探针，在MOFs中封装多种染料，实现了对多个DNA的同时检测。这些基于MOFs的传感器具有很强的选择性和灵敏度，能够实现生物传感的分子识别和信号传导。然而，一旦引入复杂的生物样本，会对信号产生强烈的干扰，基于MOFs的传感器的特异性和选择性并不像现有传感器预期的那么好。而错误的信号会导致我们对最终结果产生错误的判断，这不利于传感器的实际应用。因此，需要设计一种新的方案来应对在自然复杂介质中进一步应用的挑战。
硫黄素T(ThT)是一种水溶性荧光染料，由一个苄胺环和一个苄噻唑环组成。在缓冲液中，苄基胺环和苄基噻唑环可以围绕碳碳键自由旋转。这种分子内旋转会极大地降低它自身的荧光。反之，如果这种旋转受到限制，则会激发强荧光。天然复合介质由各种蛋白质、单链和双链DNA、有机和无机化合物组成。在这些化合物中，只有具有空腔或槽结构的G4或G3能够有效限制ThT的环旋转产生强荧光信号。
绵羊肺炎支原体(MO)是一种分布广泛的病原体，是绵羊、山羊等非典型肺炎的主要病因，给世界各国的养殖业经济造成了巨大损失。由于其疫苗免疫效果不理想，早期诊断仍是阻断该病最有效的方法。然而，传统的微生物培养技术存在操作复杂、耗时费力等问题。酶联免疫吸附试验(ELISA)因其快速、灵敏、简单、易于标准化而逐渐取代血清学检测。但不幸的是，它的特异性是有争议的。聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)具有较高的灵敏度和特异性，但所需的设备价格昂贵，且经常出现假阳性或假阴性。近年来，人们不断设计各种新的检测方案来克服上述缺点。
发明内容
针对现有的基于MOFs的传感器的容易受到干扰，特异性和选择性不理想的上述问题，本发明提供一种检测绵羊肺炎支原体的DNA探针、传感器及试剂盒，该方案将带有MO特定序列和G4片段的发夹DNA包埋到NH2-MIL-53(Al)(G4Probe/MOFs)中，制备了一种新型纳米探针。实验表明，靶标(target)才是有效触发MOFs中G4Probe释放行为的关键。并且，当靶标与G4Probe杂交后，不管溶液中是否存在其他干扰物质，都能有效激发ThT在溶液中的高强度荧光。这意味着信号分子不仅可以在缓冲介质中，也可以在自然复杂介质中智能识别G4Probe与靶标的特定组合。此外，该传感器检测限低，且在靶标浓度为10-10M～10-6M范围内具有良好的线性响应。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种检测绵羊肺炎支原体的DNA探针，所述探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的序列。
一种检测绵羊肺炎支原体的纳米传感器，所述传感器以SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为DNA探针，以MOFs为探针载体，所述DNA探针包埋到MOFs中。
上述纳米传感器的制备方法：首先将Al2Cl3和二氨基对苯二甲酸分别溶于去离子水和DMF中，然后倒入水热反应釜的聚四氟乙烯套管中，装好后置于150℃下反应24h；冷却后，通过真空过滤得到淡黄色的产品；然后在DMF中溶解，于90℃条件下回流，去除孔中的残余水和未反应的配体；最后用丙酮过滤洗涤，得到纯化的NH2-MIL-53(Al)，即MOFs；
将新制备的MOFs用去离子水稀释，然后将SEQ ID NO:1所示的探针DNA及Tris-HCl缓冲液在95℃下加热中5分钟，缓慢冷却至室温，并与MOFs在37℃下孵育12小时；接下来将上述混合液离心，去除上清液，水洗去除未吸附牢固的探针DNA，既得纳米传感器。
进一步的所述制备方法，首先将0.78g Al2Cl3和0.56g二氨基对苯二甲酸(NH2-BDC)分别溶于7.5ml去离子水和22.5mL DMF中，然后倒入容量为100ml的水热反应釜的聚四氟乙烯套管中，于150℃下反应24h；冷却后，通过真空过滤得到淡黄色的产品；然后在DMF中溶解，于90℃条件下回流8h，去除孔中的残余水和未反应的配体；最后用丙酮过滤洗涤，得到纯化的NH2-MIL-53(Al)，即MOFs；
将新制备的(MOFs)用去离子水稀释至20mg/mL，然后将SEQ ID NO:1所示的探针DNA200μL,浓度10-6mM，与Tris-HCl在95℃下加热中5分钟，缓慢冷却至室温，并与10μL MOFs在37℃下孵育12小时；接下来将上述混合液在4000rpm条件下离心3分钟，去除上清液，并多次水洗去除未吸附牢固的探针DNA，既得纳米传感器。
本发明还提供一种用于检测绵羊肺炎支原体的试剂盒，该试剂盒包括3-30μMThT，50-500mM Tris-HCl，50-500mM K+，100-1000mg/ml MOFs/G4probe，所述MOFs/G4probe为以上所述的纳米传感器。
本发明基于ThT能在G四链体(G4)的空腔结构限制下发出强荧光的特性，以多孔MOFs为支架，以MO的特异性片段和G4片段组装成的发夹DNA为探针，制备了一种新型的检测羊肺炎支原体(MO)的纳米探针。本发明仅仅通过少量具有较低ΔG的靶标就能有效地触发MOFs中G4Probe的释放行为，进而改变ThT的荧光行为。通过观察信号的变化，可以确定target的存在。此外，本发明还可以在稀释后的尿液中进行高灵敏度的DNA分析。更重要的是，无论是在缓冲液中还是在自然复杂介质中，目标DNA在10-10M～10-6M浓度范围内均表现出较低的检出限和良好的线性相关关系。
附图说明
图1 NH2-MIL-53(Al)的SEM图像(A)，FTIR(B)，TEM image(C)，EDS(D)NH2-MIL-53(Al)。
图2(A)G4Probe/MOFs的扫描电镜图(插图为局部放大),(B)FTIR of MOFs(上方线)and G4Probe/MOFs(下方线),(C)G4Probe/MOFs的透射电镜图,(D)G4Probe/MOFs的能量色散光谱图。
图3 G4Probe与ThT(A)及MOF/G4Probe与ThT混合物上清液(B)的荧光强度。
图4方案1示意图。
图5不同浓度G4Probe制备的G4Probe/MOFs的Zeta电位，其中0表示MOFs的Zeta电位。
图6(A)ThT/G4probe/target在不同K+浓度下的荧光信号强度；(B)在不同离子存在时的荧光信号强度；(C)在各种蛋白质和有机物存在时的荧光信号强度。
图7在缓冲液(A)或1％尿液(C)中添加不同浓度target的荧光光谱；生物传感器的动态响应范围和与靶标浓度以及荧光强度变化与缓冲液(B)或1％尿液(D)中target浓度之间的线性关系。
图8 ThT/G4probe/MOFs/target在不同孵育温度下的荧光信号强度。
图9 ThT/G4probe/MOFs/target在不同孵育时间下的荧光信号强度。
图10 ThT/G4probe/MOFs/target检测不同浓度稀释尿液时的荧光信号强度(0表示在缓冲液中)。
图11不同浓度尿液对ThT荧光的影响.
图12 G4Probe/MOFs的特异性检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。
实施例
一、基于MOFs的纳米传感器的制备
表1:本发明使用的寡核苷酸序列
注：G3Probe，单下划线部分为G3序列，双下划线部分为绵羊支原体互补序列。
G4Probe，单下划线部分为G4序列，双下划线部分为绵羊支原体互补序列。
本发明使用的寡核苷酸序列设计在GenBank DNA序列的BLAST搜索中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)，没有发现与其他疾病的基因有同源性。
(1)NH2-MIL-53(Al)(MOFs)的合成与表征
首先将Al2Cl3(0.78g)和二氨基对苯二甲酸(0.56g)分别溶于7.5ml去离子水和22.5mL DMF中，然后倒入容量为100ml的水热反应釜的聚四氟乙烯套管中，装好后于150℃下反应24h。冷却后，通过真空过滤得到淡黄色的产品。然后在DMF中溶解，90℃条件下回流8h，去除孔中的残余水和未反应的配体。最后用丙酮过滤洗涤，得到纯化的NH2-MIL-53(Al)。纯化后的MOFs用去离子水稀释至20mg/mL，在4℃冰箱中保存。
为了确认NH2-MIL-53(Al)的成功合成，进行了一系列表征。首先，分析合成化合物的形态。通过透射电子显微镜(图1A)，可以看出合成的MOFs是菱形的，平均粒径约为90nm。随后，研究了MOFs的红外光谱。(图1B)。3417cm-1和3500cm-1处的谱带归因于胺基的对称和不对称拉伸，1400～1600cm-1处的吸收谱带归因于羰基的对称和不对称拉伸，吸收峰在1100cm-1、900cm-1和610cm-1为的Al-O振动峰，在1620cm-1处有一个额外的吸收峰为游离的DMF。此外，C、N、O和Al元素显示在能量色散光谱(EDS)中(图1D)。所有这些都表明NH2-MIL-53(Al)已经成功合成。
(2)G4Probe/MOFs的制备和表征
将新制备的NH2-MIL-53(Al)(MOFs)用去离子水稀释至20mg/mL。然后将G4Probe(200μL,10-6mM，Tris-HCl缓冲液)在95℃下加热中5分钟，缓慢冷却至室温，并与MOFs(10μL)在37℃下孵育12小时。接下来将上述混合液4000rpm离心3分钟，去除上清液，并多次水洗出去未吸附牢固的G4Probe，最后将其定容到200μL，于4℃下保存供进一步使用。
对于G4Probe/MOFs和MOFs，如SEM和TEM图像(图2A、图2C)所示，形态和粒径彼此没有明显差异，只是规则的菱形边缘变得略微粗糙。然而，在EDS(图2D)中，除了C、O、N和Al之外，P作为DNA的构成元素也被清楚地观察到。这意味着G4Probe已成功嵌入到MOFs中。此外，代表G4Probe/MOFs特定官能团的所有红外吸收峰也显示在红外光谱中(图2B)。Al-O振动峰位于1100cm-1、900cm-1和610cm-1，羰基在1400cm-1～1600cm-1处对称和不对称拉伸，胺基在3417cm-1和3500cm-1处对称和不对称拉伸，这与之前关于NH2-MIL-53(Al)的报告一致。此外，1650cm-1、1450cm-1、2860cm-1和2900cm-1处的强带分别归因于DNA的糖苷键、发夹DNA茎中的碱基对和DNA的甲基。这些再次直接表明G4Probe/MOFs的制备成功。
二、基于MOFs的纳米传感器的性能
首先将10-6M G4Probe与3μM ThT孵育20min，然后评估G4Probe在不修饰MOFs的情况下是否会改变ThT的荧光特性。结果表明，加入G4Probe前后ThT的荧光强度波动较大(图3A)。这表明基于G4/ThT形成的动力学可以在一定程度上触发G4Probe茎环打开行为。这不利于下一步的检测。
基于这一结论，以多孔MOFs为支架，负载发夹G4Probe，构建了基于MOFs的纳米探针。整个修饰过程受分子间引力(即范德华力)、偶极矩、氢键和静电力等多种相互作用的控制。G4Probe/MOFs与3uM ThT孵育20min。接着，将混合物离心去除G4Probe/MOFs，混合液上清没有明显的荧光信号。(图3B)结果表明，MOFs在整个策略中起着关键作用。在分析物出现之前，G4Probe与MOFs紧密结合，以减少检测过程中的背景信号。
(1)ThT/G4probe/target的相互作用
首先将10-6M target与10-6M G4probe混合，然后分别在上述溶液中加入25mM、50mM、75mM和100mM，孵育2h。接下来加入3μM ThT，孵育二十分钟后测定荧光信号。分别采用Co2+、Te3+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Na+和Al3+(50mm)来代替50mM K+来研究不同离子对ThT/G4/target的影响。此外，利用有机小分子(葡萄糖，5mM；尿素，20μg/mL；和抗坏血酸，1μg/mL)和多种蛋白(DA、OMP31、BP26、BSA，3μg/mL)研究对ThT/G4/target间相互作用的干扰。
(2)ThT/G4probe/MOFs/target在缓冲液或尿液中杂交
在缓冲液中:将不同浓度的靶物(10-10M～10-6M,PH＝7.2，用含50mM KCl的Tris-HCl缓冲液稀释)分别加入含有10μL G4Probe/MOFs的5支离心管中。然后，这些混合物在37℃下孵育12小时，并在4000rpm条件下离心3分钟后，从离心管中移取出上清液，立即与ThT(3μM)混合20分钟。最后，分别测量混合物的荧光强度。实验条件的优化:研究了不同杂交时间(2h、4h、6h、12h、14h)和反应温度(25℃、37℃、45℃)对实验的影响。
在尿液中:将target(10-6M,PH＝7.2，用含50mM KCl的Tris-HCl缓冲液稀释)分别混合到不同浓度的尿液中(1％，2％，5％，用含50mM KCl的Tris-HCl缓冲液稀释)。然后将10μL G4Probe/MOFs溶液滴入上述混合物中。37℃条件下孵育12h后，4000rpm条件下离心3分钟后，从离心管中移取出上清液，加入3μM ThT再孵育20min。最后测量上清液的荧光强度。此外，仅在1％稀释尿液中进行线性检测实验，target浓度范围为10-10M～10-6M。
(3)凝胶电泳分析
PAGE的制备步骤如下：首先，将3.5mL 40％丙烯酰胺/双丙烯酰胺凝胶溶液(29:1)、4.25ml去离子水、160μL 50×TAE缓冲液、80μL 10％过硫酸铵(APS)和4μL TEMED混合，制备17.5％PAGE。在37℃条件下聚合30分钟后，将制备的凝胶浸泡在1×TAE缓冲液中。然后将5μL样品与1μL 6×甘油凝胶上样缓冲液混合，上样于凝胶上。凝胶电泳先在180V电压条件下跑3分钟,然后135V恒压150min，用溴化乙啶(EB)染色30分钟,然后用FR-980A生物电泳图像分析系统成像。样品制备:G4Probe/MOFs(10μL)分别与target(100μL,10-6M)或WB(100μL,10-6M)37℃孵育12小时。离心后取上清进行凝胶电泳。以target、WB和G4Probe(均为10- 6M)为对照样品。
(4)G4Probe/MOFs的选择性和稳定性
样品(target:完全互补序列。干扰DNA:采用单碱基错配DNA，M1；二碱基错配DNA，M2；三碱基错配DNA，M3；完全不匹配DNA，WB；上述五种DNA混合，Mix)来考察G4Probe/MOFs的特异性。样品(100L,10-6M)与G4Probe/MOFs(10μL)在37℃下杂交12h后，取上清液，与ThT混合20min后进行荧光检测。为研究G4Probe/MOFs的稳定性，把新鲜准备好的G4Probe/MOFs换成分别储存1、2、7、10和14天的G4Probe/MOFs，重复同样的实验操作步骤并进行荧光测定。此外，在Nupack网站上模拟了G4Probe与样品杂交的吉布斯自由能。
(5)传感方法的可行性
图4为方案一的过程示意图。G4Probe/MOFs的示意图(a)。G4Probe/MOFs在缓冲液(蓝色)或尿液(黄色)中检测DNA(b)。具有较低吉布斯自由能的target是高效触发G4Probe从MOFs释放行为的关键。ThT的荧光机制(c)，(蓝色闪电表示激发光，紫色闪电或灰色闪电表示发射光)。在K+的存在下，ThT的苄基胺环和苄基噻唑环的旋转在G4中受到严重限制，会激发出强烈的荧光(紫色闪电)。否则，苄基胺环和苄基噻唑环可以围绕ThT的C-C键自由旋转，其自身的荧光被降低(灰色闪电)。G4Probe/target和G4Probe/WB的吉布斯自由能和G4Probe/target和G4Probe/WB的电泳图(d)。泳道1、泳道2、泳道3、泳道4和泳道5中的条带分别代表G4Probe、target、WB、G4Probe/MOFs/target杂交后的上清液和G4Probe/MOFs/WB杂交后的上清液。
实验开始时，具有茎环结构的G4Probe被很好地锁定在MOFs腔内(图4a)。即使缓冲液中充满大量ThT，苄基胺环和苄基噻唑环的自由旋转使其荧光强度极低。一旦引入target，它们就会尝试在MOFs中与G4Probe杂交，结果G4Probe冲出MOFs腔体，其茎环结构被打开。因此，由于G4严格限制ThT的分子内旋转(图4b,c)，立即观察到来自ThT的显著增强的荧光信号。更重要的是，与其他G4结合染料不同，ThT具有良好的特异性，与单链和双链DNA或蛋白质结合时荧光不明显。因此，这种机制即使在自然复杂介质中也是可行的。并且，荧光强度与释放的G4Probe浓度成正比。
图4d所示，在1×TAE缓冲液中进行了凝胶电泳实验。泳道1、泳道2、泳道3、泳道4和泳道5中的条带分别代表G4Probe、target、WB、G4Probe/MOFs/target杂交后的上清液和G4Probe/MOFs/WB杂交后的上清液。显然，在泳道4中观察到一条新条带，其分子量约为G4Probe和target的总和。有趣的是，第5泳道没有出现新的条带。这表明只有引入target才能刺激MOFs腔内G4Probe的释放并发生杂交。
结合诱导强度与杂化产生的吉布斯自由能强度密切相关。根据图4d，G4Probe与target结合ΔG为-39.76kcal/mol,与WB仅为-7.53kcal/mol。理论上，吉布斯自由能越低，结合诱导能力越强。SDS-PAGE的结果与这一理论完全一致。也就是说，该策略的可行性得到了准确的证明。
(6)G4probe/MOFs
探针DNA序列的选择:整个策略的关键是能够高效、智能地识别目标。ThT的荧光行为很大程度上取决于其苄胺和苄基噻唑环的旋转是否受到抑制。根据目前的文献报道，ThT在G4或G3的辅助下能够获得平面性并产生强烈的荧光信号(图4c)，所以在初始阶段设计G4或G3作为探针DNA的一部分。但在杂交实验中，G4的效果明显优于G3。因此，G4最终作为发夹探针DNA的茎环结构。而发夹结构还可以防止ThT在开环前出现强烈的荧光信号，进一步提高了该策略的准确性。
G4Probe的吸附浓度:为保证探针DNA在MOFs中的过饱和，优化了G4Probe的吸附浓度。将一系列不同浓度的G4Probe(0,5 10-7M,10-6M,2.5 10-6M)加入等量MOFs(10μL)中，于37℃下放置12h。然后用去离子水去除不稳定或过量的G4Probe。最后，在室温下进行zeta电位分析，每个样品平行测量3次。从图5中可以看出，最初带有带正电荷氨基的MOFs具有+7.5mV的正电位。随着G4Probe在MOFs中的不断吸附，Zeta电位受DNA中磷酸基团所带负电荷的影响逐渐由正向负转变。当DNA浓度增加到10-6M或更高时，Zeta电位达到峰值-13mV基本保持不变。这表明G4probe已饱和。因此，本实验G4Probe浓度选择了10-6M。
G4Probe/MOFs的孔径:以多孔MOFs为支架，负载发夹探针DNA，构建了基于MOFs的纳米探针。整个过程由分子间引力(即范德华力)、偶极矩、氢键和静电力等多种相互作用控制。适当的MOFs孔径可以保证G4Probe从MOFs的进出。NH2-MIL-53(Al)是一种具有4.8nm菱形孔的介孔MOFs，采用NH2-MIL-53(Al)，避免了传统MOFs微孔的缺点，且其化学性质相对稳定，适用于PH 4～8，这也保证了G4Probe/MOFs在更复杂的环境下的进一步应用。
(7)ThT/G4probe/target的相互作用
K+浓度的影响：在K+存在下，ThT的两个环以刚性和更平面的形式支撑，同时，在G4中，由于端部堆积、沟槽绑定或插层等原因，其高度可行的扭转能力受到严重限制，因此ThT的荧光将显着增加。这表明K+对ThT/G4probe/目标荧光信号的改善具有显着影响。在本文中，使用了25mM、50mM、75mM和100mM的K+。根据图6A，ThT/G4probe/target的荧光信号在K+浓度为50mM的帮助下最强。因此，在这种情况下，选择了50mM K+。
不同离子的影响:还考察了其他离子(Co2+、Te3+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Na+、Al3+)对ThT/G4Probe/target荧光的影响(图6B)。在本实验中，使用50mM Tris-HCl缓冲液。与预期的一样，除Na+外，其他离子对ThT信号增强作用不大。显然，Na+可以诱导G4probe/target的反平行G四链体折叠。而K+存在时的G四链体结构比Na+存在时的G四链体结构更稳定。因此ThT在50mM K+辅助下的荧光信号最强。
非特异性分子偶联物影响:因为本发明的目的是不仅在缓冲液中，而且在复杂体系中实现高灵敏度高选择性检测(3d)，在尿液中非特异性偶联物的对ThT/G4probe/target荧光信号的影响不能忽略。因此这里采用了各种非特异性分子偶联物(葡萄糖、尿素、抗氧化酸、DA、OMP31、BP26、BSA)来考察对信号的影响。所用浓度与在尿液中浓度基本相同，或高于尿液浓度。如图6C所示，除尿素和抗坏血酸外，其他偶联物的影响较弱，荧光信号仅下降1％至8.8％。今后，在100％尿液中进行直接测试将是必要的，而稀释的生物环境为新的研究途径提供了一个起点。虽然尿素，特别是抗坏血酸可以使结果偏离近20％～25％，但通过实施稀释操作可以有效地避免这一缺点。最后，正如我们推测的那样，这个策略在1％稀释的尿液中成功地实施了。
(8)G4Probe/MOFs在缓冲液或尿液中进行DNA传感
为了考察基于MOFs的策略的灵敏度，将不同浓度的目标物加入缓冲溶液中检测其荧光信号。如图7A所示，485nm处的荧光强度对目标DNA浓度的变化非常敏感。这也意味着高浓度的target可以诱导更多的G4Probe与MOFs脱附与之杂交，导致探针的茎环结构被打开，进而暴露出G4序列，形成G四链体显著增强ThT的荧光强度。在10-10M～10-6M范围内，荧光强度的变化值与目标浓度的对数值呈线性关系，相应的回归方程为F＝1974+183.9lg[Ctarget]，相关系数(R2)为0.9985(图7B)。另外，目标的灵敏检测限为14pM。此外，G4Probe的释放行为与时间和温度密切相关。本文分别采用25℃、37℃、45℃、2h、4h、6h、12h和14h对杂交时间和温度进行优化研究。从图8可以看出，荧光信号在37℃时最强。从图9可以看出，随着杂交时间的增加，信号强度逐渐增加，在12h时达到最大。因此实验所用杂交时间均为12h。
来自自然复杂介质的环境远比缓冲介质复杂。根据非特异性分子偶联物影响实验的结果，我们推测该策略可能在稀释后的实际样品中成功实施。因此，我们分别加入1％、2％、5％的稀释尿液(图10)，研究G4Probe/MOFs的实际应用能力。与ThT/G4Probe/MOFs/target在缓冲液中的信号强度相比，在1％稀释尿液中仅下降9.1％，在敏感检测的可接受范围内。另外，不同浓度(10-10M～10-6M)下目标物的荧光强度呈线性关系，相应的回归方程为F＝1710+158.6lg[Ctarget]，相关系数(R2)为0.9955(图7D)。相应检出限为23pM。这明显优于以前报道的基于MOFs的纳米探针，并可实现复杂系统中标记物的定量检测。虽然该传感平台不能在100％尿液中实现高灵敏度和选择性，但稀释条件下的检测也是关键技术之一。
将ThT直接加入不同浓度的尿液中。结果表明，加入ThT前后荧光无明显变化(图11)。这表明，ThT是一个理想的染料。
(9)G4Probe/MOFs的特异性和稳定性
G4Probe/MOFs的特殊性是其具有良好应用价值的前提。其中，干扰DNA(单碱基错配DNA M1(10-6M)，二碱基错配DNA M2(10-6M)，三碱基错配DNA M3(10-6M)，完全不匹配DNAWB(10-6M)，Mix(M1(10-6M)，M2(10-6M)，M3(10-6M)，WB(10-6M)和target(10-6M)的混合物)和完全互补的DNA(target(10-6M))用于G4Probe/MOFs的特异性检测。如图12所示，target获得了显著的荧光响应，而WB几乎没有响应。当target响应定义为100％时，M1、M2、M3和Mix对应的信号分别为46％、19％、12％和122％，说明基于MOFs的纳米探针能够区分单核苷酸差异，具有较好的特异性。值得一提的是，Mix的信号要强于目标的信号。主要原因是虽然错配DNA的荧光信号相对较小，但其对荧光强度的贡献不能完全忽略。另外，间隔1天、2天和7天后，荧光响应的退行性变分别为4％、5.5％和8.3％。10天后信号下降14.2％，14天后下降近20％(图10)。这意味着最佳的使用时间是产品准备后一周内。
本发明成功构建了一种基于MOFs的结合诱导荧光传感器，用于准确检测MO。一旦引入靶标，基于DNA双螺旋的杂交可以有效地迫使G4Probe冲出MOFs孔，打开探针的茎环结构进而暴露其G4序列，由于G4对ThT在溶液中分子内旋转的高度限制，导致ThT的荧光信号明显增强，这是。总之，该传感器不仅在缓冲介质中，而且在天然复杂介质中，具有快速荧光传感、选择性好、检测限低、线性响应范围宽等优点，具有良好的应用前景。本发明还可以与其他DNA标记结合作为探针。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 青岛科技大学
<120> 检测绵羊肺炎支原体的探针、传感器及试剂盒
<141> 2021-06-28
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
agggttaggg ttagggttag ggttcaaggt ggagttcttg ctggtgaaat tagtcctaac 60
cct 63
<210> 2
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ccatgccaag gtggagttct tgctggtgaa attagtgcat gggtagggcg gg 52
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
actaatttca ccagcaagaa ctccaccttg 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
actaatgtca ccagcaagaa ctccaccttg 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
actaatgtca ccagcaataa ctccaccttg 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
actaatgtca ccagcaataa ctccactttg 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gacggccctc tagtaggtcc tgtagaacca 30

Claims (5)

1.一种检测绵羊肺炎支原体的DNA探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为SEQ IDNO:1所示的序列。
2.一种检测绵羊肺炎支原体的纳米传感器，其特征在于，所述传感器以SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为DNA探针，以MOFs为探针载体，所述DNA探针包埋到MOFs中。
3.权利要求2所述的纳米传感器的制备方法，其特征在于，首先将Al2Cl3和二氨基对苯二甲酸分别溶于去离子水和DMF中，然后倒入水热反应釜的聚四氟乙烯套管中，装好后置于150℃下反应24h；冷却后，通过真空过滤得到淡黄色的产品；然后在DMF中溶解，于90℃条件下回流，去除孔中的残余水和未反应的配体；最后用丙酮过滤洗涤，得到纯化的NH2-MIL-53(Al)，即MOFs；
将新制备的MOFs用去离子水稀释，然后将权利要求1所述的探针DNA及Tris-HCl缓冲液在95℃下加热中5分钟，缓慢冷却至室温，并与上述MOFs在37℃下孵育12小时；接下来将上述混合液离心，去除上清液，水洗去除未吸附牢固的探针DNA，既得纳米传感器。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，首先将0.78g Al2Cl3和0.56g二氨基对苯二甲酸分别溶于7.5ml去离子水和22.5mL DMF中，然后倒入容量为100ml的水热反应釜的聚四氟乙烯套管中，于150℃下反应24h；冷却后，通过真空过滤得到淡黄色的产品；然后在DMF中溶解，于90℃条件下回流8h，去除孔中的残余水和未反应的配体；最后用丙酮过滤洗涤，得到纯化的NH2-MIL-53(Al)，即MOFs；
将新制备的(MOFs)用去离子水稀释至20mg/mL，然后将权利要求1所述的探针DNA 200μL,浓度10-6mM与Tris-HCl在95℃下加热中5分钟，缓慢冷却至室温，然后与10μL MOFs在37℃下孵育12小时；接下来将上述混合液于4000rpm条件下离心3分钟，去除上清液，并水洗去除未吸附牢固的探针DNA，既得纳米传感器。
5.一种用于检测绵羊肺炎支原体的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括3-30μM硫黄素T，50-500mM Tris-HCl，50-500mM K+，100-1000mg/ml MOFs/G4probe，所述MOFs/G4probe为权利要求2的纳米传感器。
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