CN110108881B - 一种双功能生物传感器hrp@zif-8/dna的制备方法及其应用 - Google Patents

一种双功能生物传感器hrp@zif-8/dna的制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110108881B
CN110108881B CN201910362603.9A CN201910362603A CN110108881B CN 110108881 B CN110108881 B CN 110108881B CN 201910362603 A CN201910362603 A CN 201910362603A CN 110108881 B CN110108881 B CN 110108881B
Authority
CN
China
Prior art keywords
hrp
zif
dna
biosensor
bifunctional
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910362603.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110108881A (zh
Inventor
王蕾
兰会玲
韩娟
王赟
刘怡涵
智文静
管伟民
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu University
Original Assignee
Jiangsu University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu University filed Critical Jiangsu University
Priority to CN201910362603.9A priority Critical patent/CN110108881B/zh
Publication of CN110108881A publication Critical patent/CN110108881A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110108881B publication Critical patent/CN110108881B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6432—Quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于无机材料应用技术领域，公开了一种双功能生物传感器HRP@ZIF‑8/DNA的制备方法及其应用。本发明采用生物矿化法将辣根过氧化物酶包埋于金属有机框架ZIF‑8的孔道结构中，实现对酶的固定化；另外，富含π电子的配体和部分配位的金属离子通过π‑π堆积和静电相互作用赋予ZIF‑8对荧光团标记的单链DNA(ssDNA)的良好亲和力，使其成为优异的荧光猝灭剂。本发明首次将ZIF‑8的载体功能和荧光猝灭特性结合起来开发了HRP@ZIF‑8/DNA杂交系统，用于Hg2+的荧光检测和苯酚的可视化检测。本发明传感器对汞的检测限为0.22nM，同时，用作比色传感器，对苯酚的检测可达到微摩尔水平，是一种经济，有效，高选择性和灵敏的检测方法。

Description

一种双功能生物传感器HRP@ZIF-8/DNA的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于无机材料应用技术领域，具体涉及双功能生物传感器HRP@ZIF-8/DNA的制备方法及其应用。
背景技术
汞和苯酚是河流和食物中广泛存在的有毒污染物，对人体内的蛋白质合成，中枢神经和免疫系统有严重危害。因此，建立灵敏、经济高效且可靠的方法用于检测水中的汞和苯酚，特别是适用于两种污染物同时检测的方法具有重大意义。传统的检测汞离子的方法主要有冷原子吸收光谱法和二硫腙比色法；检测苯酚的方法有电化学法、分光光度法和色谱法。但这些检测方法存在费用高，需要复杂的仪器设备和专业的操作人员操作繁琐等问题。
金属有机骨架(MOFs)是一种特殊的多孔材料，其开放式结构和多孔隙度可以实现有效的传质，同时具有优异的化学和热稳定性，将MOFs用于酶固定化载体可以为酶提供卓越的保护。除此之外，富含π电子的配体和部分配位的金属离子通过π-π堆积和静电相互作用赋予MOFs与荧光团标记的单链DNA(ssDNA)良好的亲和力，可以作为荧光猝灭剂实现目标分子的荧光检测。因此，基于MOFs的双重功能构建生物传感器，可以实现汞和苯酚两种污染物的同时检测且具有较强的检测灵敏度，是研究领域的最新的研究方向，至今未有相关报道。
发明内容
本发明的目的在于将ZIF-8的载体功能和荧光猝灭特性相结合，开发HRP@ZIF-8/DNA杂交体系，用于Hg2+荧光检测和苯酚的可视化检测。
为达到上述技术目的，本发明采取的技术方案如下：
本发明提供了一种新型的双功能生物传感器的构建，首先，通过生物矿化法将辣根过氧化物酶包埋于金属锌离子和2-甲基咪唑形成的金属有机骨架ZIF-8中，优化一系列实验条件，最终得到性能最优的复合材料；其次，将制备所得的复合材料分散于缓冲溶液中，再与荧光标记的ssDNA溶液混合孵育，得到HRP@ZIF-8/DNA杂交体系。
本发明提供了一种新型的双功能生物传感器的制备方法，具体步骤如下：
(1)生物矿化HRP@ZIF-8：
称取辣根过氧化物酶HRP加入到六水合硝酸锌的水溶液中，再向其中加入2-甲基咪唑溶液，充分混合，将混合液置于30℃恒温水浴锅中孵育12h，反应结束后通过离心和反复清洗收集所得产物，将所得复合材料冷冻干燥并低温储存，备用，该复合材料记为HRP@ZIF-8；利用生物矿化法将辣根过氧化物酶(HRP)包埋于金属锌离子和2-甲基咪唑形成的金属有机框架材料ZIF-8的孔道结构中，所述固定化辣根过氧化物酶呈现不规则球状，平均尺寸为520±2.9nm；
(2)HRP@ZIF-8/DNA杂交体系的制备：
室温下，将步骤(1)制备的HRP@ZIF-8分散在缓冲溶液中，随后，与荧光标记的适配体溶液混合，孵育直至荧光淬火饱和，形成HRP@ZIF-8/DNA杂交体系，即双功能生物传感器HRP@ZIF-8/DNA。
步骤(1)中，所述六水合硝酸锌水溶液和2-甲基咪唑溶液的浓度均为50mM，体积比为1:1，混合液中，辣根过氧化物酶HRP浓度为1-5mg/mL。
进一步地，辣根过氧化物酶HRP浓度优选为2mg/mL。
步骤(2)中，所述缓冲溶液为Hepes缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液，pH为7.4，浓度为20mM。
进一步地，缓冲溶液优选为Hepes缓冲液。
步骤(2)中，缓冲溶液中，HRP@ZIF-8的浓度为0.01-0.08mg/mL；适配体溶液的浓度为100nM；混合时，体积比为1:1。
进一步地，缓冲溶液中，HRP@ZIF-8的浓度优选为0.07mg/mL。
步骤(2)中，孵育温度为室温，时间为6-10min。
进一步地，孵育时间优选为7min。
步骤(2)中，所述的适配体序列为：5′-FAM-TTCTTCTTGCCCCCCTTGTTGTT-3′。
将本发明制备的双功能生物传感器HRP@ZIF-8/DNA用于同时检测低浓度的Hg2+和苯酚的用途。本发明还提供了双功能生物传感器HRP@ZIF-8/DNA用于Hg2+和苯酚的同时检测，具体的，在目标Hg2+存在的条件下，其可以与HRP@ZIF-8/DNA杂交体系中的ssDNA结合，形成双链刚性结构，随后随着荧光的恢复双链的刚性结构从HRP@ZIF-8/DNA中分离。同时，从杂交体系分离后的HRP@ZIF-8可以在H2O2和显色底物的存在下催化苯酚的氧化，产生比色变化，进而对苯酚实现可视化检测。
本发明具有如下优点：
(1)综合ZIF-8的载体功能和荧光猝灭特性，构建了HRP@ZIF-8/DNA杂交体系。
(2)生物矿化HRP@ZIF-8具有良好的稳定性和可重复利用性。
本发明利用ZIF-8快速包埋HRP的生物矿化法，其包埋率高达98.4％，具有良好的化学、热稳定性和贮藏稳定性，重复利用率高，并表现出对有机溶剂的良好耐受性。
(3)新型的HRP@ZIF-8/DNA生物传感器可以同时检测低浓度的Hg2+和苯酚，具有较好的选择性。受污染水体中同时存在重金属离子和有机污染物，且毒性大，因此，同时监测Hg2+和苯酚的浓度对人体健康至关重要。常规的检测方法需要构建多个传感器，导致检测成本上升，检测效率降低。而本发明通过构建HRP@ZIF-8/DNA杂交体系来恰当地融合ZIF-8的基本功能，其对Hg2+的荧光检测检测限低至0.22nM，作为比色传感器对苯酚可实现微摩尔级的灵敏测量，是一种经济、高效、高选择性、灵敏的双功能生物传感器。
附图说明
图1为生物矿化HRP@ZIF-8的制备原理图。
图2为FITC-HRP@ZIF-8在明场(a)及荧光场(b)下激光共聚焦显微镜图。
图3为HRP，HRP@ZIF-8生物复合材料，纯ZIF-8晶体的红外图。
图4为ZIF-8(a)和HRP@ZIF-8(b)的SEM图。
图5为ZIF-8和HRP@ZIF-8的XRD图。
图6为HRP及HRP@ZIF-8的pH稳定性验证的结果图。
图7为HRP及HRP@ZIF-8的热稳定性验证的结果图。
图8为HRP及HRP@ZIF-8的贮藏稳定性验证的结果图。
图9为HRP及HRP@ZIF-8对有机溶剂耐受性的结果图。
图10为HRP@ZIF-8的循环稳定性的结果图。
图11为HRP@ZIF-8浓度对HRP@ZIF-8/DNA杂交体系荧光强度的影响图。
图12为Hg2+浓度对HRP@ZIF-8/DNA生物传感器荧光强度的影响。
图13为HRP@ZIF-8/DNA荧光生物传感器特异性结果图。
图14为矿化HRP@ZIF-8比色传感器的选择性结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图和具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明中的一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
(1)生物矿化HRP@ZIF-8的制备
准确称取2mg辣根过氧化物酶，加入到六水和硝酸锌的水溶液(50mM，500μl)中，震荡使酶溶解于溶液中；再向其中加入与六水合硝酸锌等量的2-甲基咪唑溶液，两溶液充分混合。将混合液置于30℃恒温水浴锅中孵育12h，反应结束后将产物离心分离并反复清洗，所得沉淀物即为HRP@ZIF-8。其原理如图1所示。
(2)HRP@ZIF-8/DNA杂交体系的制备：
室温下，将步骤(1)制备的HRP@ZIF-8分散在Hepes缓冲溶液中，HRP@ZIF-8的浓度为0.07mg/mL；随后，与荧光标记的适配体溶液混合，适配体溶液的浓度为100nM；体积比为1:1；室温孵育7min；直至荧光淬火饱和，形成HRP@ZIF-8/DNA杂交体系，即双功能生物传感器HRP@ZIF-8/DNA。
材料的表征
(1)激光共聚焦显微镜(LSCM)分析
为了验证辣根过氧化物酶是否被包埋于ZIF-8中，用异硫氰酸荧光素(FITC)标记辣根过氧化物酶，再通过生物矿化法将酶固定化，得到FITC-HRP@ZIF-8。用去离子水清洗所得产物至少三次，将复合材料分散在水中，取适量滴于载玻片上，用激光共聚焦显微镜在明场和荧光场下分别进行拍摄，如图2所示。
(2)傅里叶变换红外光谱图(FTIR)分析
采用傅里叶变换红外光谱仪对HRP、HRP@ZIF-8及ZIF-8的组成进行检测。首先将KBr在90℃烘箱中隔夜干燥，处理好的样品和KBr以1:100-200当量混匀，研磨后压片。以单独的KBr薄片为空白，分别测定这三种样品的红外光谱图，测得这三种样品的红外光谱图，如图3所示。
通过考察红外光谱图中特征基团吸收峰的位置及其不同程度的强度和位移情况来确定成功制备了HRP@ZIF-8。如图3所示，ZIF-8的红外光谱在1580cm-1和1390cm-1处分别表现出C＝N键和咪唑环的特征振动带。HRP@ZIF-8生物复合材料的红外光谱也出现了相同的峰。此外，HRP中1658cm-1和1537cm-1处的信号对应于其中C＝O键的拉伸振动以及NH弯曲和CN拉伸模式，该特征峰同样出现在HRP@ZIF-8生物复合材料中，表明HRP在ZIF-8中被成功包埋。同时，在HRP@ZIF-8生物复合材料的FT-IR光谱中，2-甲基咪唑的特征峰变得较弱，这是由于复合材料中ZIF-8的相对含量少于纯ZIF-8载体。进一步证实了HRP被成功包埋于ZIF-8中。
(3)扫描电镜(SEM)分析
用无水乙醇将金属有机骨架ZIF-8及生物矿化的HRP@ZIF-8再分散，取10μl样品滴加在硅片上，干燥后，用JSM-6010PLUS/LA型扫描电子显微镜(日本)观察其形貌并拍照，结果如图4所示。
图4(a)和(b)分别是ZIF-8和HRP@ZIF-8的SEM图。可以发现，HRP@ZIF-8生物复合材料呈现不规则的球形结构，平均尺寸为520±2.9nm。而ZIF-8则形成了直径为427±1.8nm的纳米球形粒子(图4a)。ZIF-8和HRP@ZIF-8生物复合材料的不同形态归因于HRP介导的聚合生长动力学，这使得不规则球体的形成成为可能。
(4)射线衍射(XRD)分析
为了进一步验证HRP的引入对ZIF-8的结晶状态是否有影响，使用X射线衍射仪对ZIF-8和HRP@ZIF-8的真空干燥样品进行研究分析。在5-60°范围内进行扫描，速度为2°/min，如图5所示。
通过对比两者图可发现，其2θ峰的位置一致，而且与模拟的ZIF-8标准样品的峰相同。结果表明，HRP@ZIF-8保持了纯ZIF-8的高结晶形态。
材料稳定性的研究
(1)游离HRP及HRP@ZIF-8复合材料的pH稳定性
本实施例考察游离HRP及HRP@ZIF-8在pH4.5-8.0范围内培养2h后，其酶活力保留情况。如图6所示，游离酶相对酶活在所选pH范围内先增大后减小，在pH7.5和8.0时，其初始活性仅保留35.2％和18.38％，而在pH值为8.0时，HRP@ZIF-8生物复合材料的活性是游离HRP的3.8倍。这些结果表明HRP@ZIF-8生物复合材料在极端pH条件下具有较强的稳定性，说明ZIF-8作为固定化载体对酶具有较好的保护作用。
(2)游离HRP及HRP@ZIF-8复合材料的热稳定性
在实际应用中，为了提高酶的催化效率酶促反应通常需要在长时间高温条件下进行，这很容易引起酶的不可逆失活，从而导致催化效率降低。本实施例对比了游离HRP和HRP@ZIF-8的热稳定性，将两种酶在30-80℃下培养2h后，测其相对酶活力。如图7所示，HRP@ZIF-8生物复合材料的热稳定性提高到了70℃。在80℃时，生物复合材料的催化活性也能保持在78％以上，而游离HRP在80℃时几乎完全失活。这些现象说明，生物矿化工艺可以将HRP包封在笼状的ZIF-8中，降低了HRP的柔韧性，使其在高温下更加稳定。
(3)游离HRP及HRP@ZIF-8复合材料的贮藏稳定性
酶的贮藏稳定性是工业化应用中须解决的一大问题。本实施例将游离HRP及HRP@ZIF-8复合材料保存在4℃的冰箱中一段时间，测其保留相对酶活，如图8所示，随着贮藏时间的延长，游离HRP的活性逐渐减小，70天后仅保留约20％的相对酶活。而HRP@ZIF-8复合材料在相同条件下酶活减小较为平缓，在90天内活性损失小于25％，说明包封后不稳定HRP的贮藏稳定性得到了有效的改善。
(4)游离HRP及HRP@ZIF-8复合材料对有机溶剂的耐受性
在实际的工业应用中，为了提高反应效率，酶促反应通常需要在有机溶剂中进行。本实施例将游离HRP及HRP@ZIF-8复合材料在甲醇、乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)等有机溶剂中培养2h，通过测量其酶活力，分析其对有机溶剂的耐受性。如图9所示，游离HRP在有机溶剂中活性几乎损失了一半，可能的原因是有机溶剂破坏了HRP表面的水分，引起了HRP构象的变化，导致酶活性有所损失。然而，HRP@ZIF-8生物复合材料的活性损失可以忽略不计，这进一步证实了ZIF-8作为固定化载体对HRP所起到的保护作用。
(5)游离HRP及HRP@ZIF-8复合材料的循坏利用稳定性
材料的循坏利用性在实际应用中具有重要的经济意义。由于无法从混合物系统中分离游离HRP，因此在1个循环后不能保持游离HRP的活性。对于HRP@ZIF-8生物复合材料，如图10所示，在重复使用6个循环后，残余活性也大于第一次运行的80％，说明生物矿化HRP@ZIF-8具有很强的操作稳定性。
基于HRP@ZIF-8/DNA的生物传感器对Hg2+和苯酚的检测应用
(1)HRP@ZIF-8/DNA杂交体系的灵敏度和特异性测试
受到ZIF-8优异的荧光猝灭能力的鼓舞，以及HRP@ZIF-8生物复合材料的高活性和稳定性，制备了用于Hg2+的荧光检测和苯酚的可视化比色传感平台—HRP@ZIF-8/DNA杂交系统。如图11所示，随着HRP@ZIF-8生物复合材料浓度的增加，FAM-ssDNA的荧光强度持续下降直至饱和，当HRP@ZIF-8的浓度为0.07mg/ml，荧光猝灭达到饱和，实现91％的猝灭效率，为了获得Hg2+的最佳检测性能，选择HRP@ZIF-8生物复合材料在0.07mg/ml的浓度进行测试。
在HRP@ZIF-8/DNA杂交体系中加入不同浓度的Hg2+以检测该传感器的灵敏度。如图12所示，随着Hg2+浓度的不断增大，溶液荧光强度逐渐恢复直至饱和，其相应的检测限降低到0.22nM，较好地满足了饮用水中Hg2+检测的要求(0.006mg/l,WHO提供)，也远低于以前报道的纳米材料。
HRP@ZIF-8/DNA生物传感器对Hg2+的特异性在实际应用中至关重要。为了验证这种特异性，在该体系中加入其他金属离子(Fe2+,Fe3+,Cd2+,Mn2+,Cr3+,Co2+,Pb2+,Cu2+)和苯酚，如图13所示，这些金属离子对荧光恢复的响应可以忽略不计；随后，将Hg2+加入上述溶液中，荧光增强明显增强。这些结果表明HRP@ZIF-8/DNA杂交体系对Hg2+具有较高的敏感性和选择性。
(2)基于HRP@ZIF-8的比色传感器对苯酚的可视化检测
从HRP@ZIF-8/DNA杂交体系中分离得到的HRP@ZIF-8生物复合材料具有高催化活性，在过氧化氢和4-氨基安替比林的存在下可以氧化苯酚，生成红色醌类物质，因此可作为一种简便、灵敏的比色传感器用于苯酚的可视化检测，检测限可达到0.7μM。为了了解HRP@ZIF-8比色传感器对苯酚的特异性，在反应体系中分别加入了苯酚、其他有机物和Hg2+，在505nm处检测吸光度的变化。如图14所示，其他有机物和Hg2+对吸光度无明显影响，而苯酚与上述溶液共孵育，吸光度增加较明显。另外，通过反应体系明显的颜色变化也可以看出该传感器对苯酚的检测较为灵敏，且不受其他物质干扰，说明HRP@ZIF-8生物复合材料可作为一种高效的比色传感器检测苯酚。

Claims (8)

1.一种双功能生物传感器HRP@ZIF-8/DNA的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)生物矿化HRP@ZIF-8：
称取辣根过氧化物酶HRP加入到六水合硝酸锌的水溶液中，再向其中加入2-甲基咪唑溶液，充分混合，将混合液置于恒温水浴锅中孵育，反应结束后通过离心和反复清洗收集所得产物，将所得复合材料冷冻干燥并低温储存，备用，该复合材料记为HRP@ZIF-8；
(2)HRP@ZIF-8/DNA杂交体系的制备：
室温下，将步骤(1)制备的HRP@ZIF-8分散在缓冲溶液中，随后，与荧光标记的适配体溶液混合，孵育直至荧光淬火饱和，形成HRP@ZIF-8/DNA杂交体系，即双功能生物传感器HRP@ZIF-8/DNA；用于同时检测Hg2+和苯酚；
所述的适配体序列为：5′-FAM-TTCTTCTTGCCCCCCTTGTTGTT-3′。
2.如权利要求1所述的双功能生物传感器HRP@ZIF-8/DNA的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述六水合硝酸锌水溶液和2-甲基咪唑溶液的浓度均为50mM，体积比为1:1；混合液中，辣根过氧化物酶HRP浓度为1-5mg/mL；恒温水浴锅中的孵育温度为30℃，孵育时间为12h。
3.如权利要求2所述的双功能生物传感器HRP@ZIF-8/DNA的制备方法，其特征在于，混合液中，辣根过氧化物酶HRP浓度为2mg/mL。
4.如权利要求1所述的双功能生物传感器HRP@ZIF-8/DNA的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述缓冲溶液为Hepes缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液，pH为7.4，浓度为20mM。
5.如权利要求4所述的双功能生物传感器HRP@ZIF-8/DNA的制备方法，其特征在于，缓冲溶液为Hepes缓冲液。
6.如权利要求1所述的双功能生物传感器HRP@ZIF-8/DNA的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，缓冲溶液中，HRP@ZIF-8的浓度为0.01-0.08mg/mL；适配体溶液的浓度为100nM；混合时，体积比为1:1；孵育温度为室温，时间为6-10min。
7.如权利要求6所述的双功能生物传感器HRP@ZIF-8/DNA的制备方法，其特征在于，缓冲溶液中，HRP@ZIF-8的浓度为0.07mg/mL；孵育时间为7min。
8.将权利要求1～7任一项所述制备方法制得的双功能生物传感器HRP@ZIF-8/DNA用于同时检测低浓度的Hg2+和苯酚的用途。
CN201910362603.9A 2019-04-30 2019-04-30 一种双功能生物传感器hrp@zif-8/dna的制备方法及其应用 Active CN110108881B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910362603.9A CN110108881B (zh) 2019-04-30 2019-04-30 一种双功能生物传感器hrp@zif-8/dna的制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910362603.9A CN110108881B (zh) 2019-04-30 2019-04-30 一种双功能生物传感器hrp@zif-8/dna的制备方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110108881A CN110108881A (zh) 2019-08-09
CN110108881B true CN110108881B (zh) 2022-03-22

Family

ID=67487927

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910362603.9A Active CN110108881B (zh) 2019-04-30 2019-04-30 一种双功能生物传感器hrp@zif-8/dna的制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110108881B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110736779B (zh) * 2019-11-07 2020-06-02 青岛大学 用于肿瘤外泌体自校准检测的双功能杂化薄膜的制备方法
CN111141710B (zh) * 2019-12-11 2020-12-01 山东农业大学 一种金属汞的快速检测方法
CN111320697A (zh) * 2020-02-13 2020-06-23 江苏大学 一种酶标二抗HRP/羊抗鼠IgG@ZIF-L及其制备方法和应用
CN112029757B (zh) * 2020-07-29 2021-12-21 江苏大学 适配体功能化辣根过氧化物酶@金属-有机骨架材料的制备方法及其应用
CN112063612B (zh) * 2020-08-12 2022-05-17 华南理工大学 一种分隔式多酶-mof微囊及其制备方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104964942B (zh) * 2015-07-01 2017-09-22 福州大学 一种可视化快速检测水环境中痕量铀酰离子的方法
WO2018094200A1 (en) * 2016-11-18 2018-05-24 Washington University In St. Louis Metal-organic frameworks as protective coatings and for enhancing sensitivity of biodiagnostic chips
WO2018195438A2 (en) * 2017-04-21 2018-10-25 Washington University Methods and systems for preparing and preserving a biological sample
CN107446915B (zh) * 2017-08-30 2020-08-28 江苏大学 磁性氧化石墨烯复合材料固定化辣根过氧化物酶及其制备方法和应用
CN109164076B (zh) * 2018-09-03 2021-01-08 中国药科大学 基于La-ZIF-8的荧光纳米探针、制备方法及其在生物荧光传感中的应用
CN109182480B (zh) * 2018-09-05 2020-11-17 华中科技大学 金属有机框架材料在聚合酶链式反应中的应用
CN109207555A (zh) * 2018-11-02 2019-01-15 南京工业大学 一种DNase I活性比色检测法
CN109187693B (zh) * 2018-11-05 2019-07-12 青岛大学 基于纳米复合物修饰电极的香草醛比率电化学适体传感器的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110108881A (zh) 2019-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110108881B (zh) 一种双功能生物传感器hrp@zif-8/dna的制备方法及其应用
Zhang et al. A smartphone-integrated ready-to-use paper-based sensor with mesoporous carbon-dispersed Pd nanoparticles as a highly active peroxidase mimic for H2O2 detection
Li et al. Integration of Fe3O4@ UiO-66-NH2@ MON core-shell structured adsorbents for specific preconcentration and sensitive determination of aflatoxins against complex sample matrix
Su et al. Prussian blue nanoparticles encapsulated inside a metal–organic framework via in situ growth as promising peroxidase mimetics for enzyme inhibitor screening
Cheng et al. Recent applications of hydrogels in food safety sensing: Role of hydrogels
Zhang et al. A point-of-care diagnostics logic detector based on glucose oxidase immobilized lanthanide functionalized metal–organic frameworks
Li et al. A practical and highly sensitive C 3 N 4-TYR fluorescent probe for convenient detection of dopamine
Khezerloo et al. Sensitive and selective detection of metal ions and small molecules in aqueous media using a hydrolytically stable amide-functionalized metal–organic framework
Zhang et al. A molecularly imprinted fluorescence sensor for sensitive detection of tetracycline using nitrogen-doped carbon dots-embedded zinc-based metal-organic frameworks as signal-amplifying tags
CN106990081A (zh) 一种基于石墨烯氧化物传感器及其对Hg2+检测的方法
CN109030802B (zh) 一种一体化颗粒型固定化酶生物传感器及其制备方法和应用
Wu et al. Plasmonic ELISA based on DNA-directed gold nanoparticle growth for Cronobacter detection in powdered infant formula samples
Liu et al. A two-dimensional zinc (II)-based metal-organic framework for fluorometric determination of ascorbic acid, chloramphenicol and ceftriaxone
Fan et al. Molecularly imprinted polymer coated Mn-doped ZnS quantum dots embedded in a metal–organic framework as a probe for selective room temperature phosphorescence detection of chlorpyrifos
CN110483746B (zh) 一种新型共价有机框架材料的合成及其在金属离子识别和染料吸附中的应用
CN110296982B (zh) 基于G4-Cu2+仿酶体系的硫化氢比色传感器
Sha et al. Host–guest-recognition-based polymer brush-functionalized mesoporous silica nanoparticles loaded with conjugated polymers: A facile FRET-based ratiometric probe for Hg2+
Zhang et al. An enzymatic reaction modulated fluorescence-on omethoate biosensor based on Fe3O4@ GO and copper nanoparticles
Dong et al. A quinoline group modified SBA-15 INHIBIT logic gate with [Cu2+ and Zn2+] or [Cu2+ and Cd2+] as inputs
Xu et al. MOF@ MnO2 nanocomposites prepared using in situ method and recyclable cholesterol oxidase–inorganic hybrid nanoflowers for cholesterol determination
Li et al. Highly selective and sensitive determination of doxycycline integrating enrichment with thermosensitive magnetic molecular imprinting nanomaterial and carbon dots based fluorescence probe
Luo et al. In-situ growth of multienzyme-inorganic hybrid nanoflowers on PVA-co-PE nanofibrous strip for colorimetric biosensor
Zhang et al. A MnO 2–[Ru (dpp) 3] Cl 2 system for colorimetric and fluorimetric dual-readout detection of H 2 O 2
CN112986361B (zh) 基于金-石墨烯量子点的电化学生物传感器在检测细胞中ctDNA中的应用
Khansili et al. Cerium oxide bentonite nanocomposite-based colorimetric paper sensor for aflatoxins detection in cereal nuts, oilseed and legumes

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Wang Lei

Inventor after: LAN Huiling

Inventor after: Han Juan

Inventor after: Wang Bin

Inventor after: Liu Yihan

Inventor after: Zhi Wenjing

Inventor after: Guan Weimin

Inventor before: Zhi Wenjing

Inventor before: Practice winter students

Inventor before: Wang Lei

Inventor before: Wang Yu

Inventor before: Wang Yi

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant