CN112029757B - 适配体功能化辣根过氧化物酶@金属-有机骨架材料的制备方法及其应用 - Google Patents

适配体功能化辣根过氧化物酶@金属-有机骨架材料的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供适配体功能化辣根过氧化物酶@金属‑有机骨架材料的制备方法及其应用。先制备了适配体基MOFs固定化酶材料，用于环境中酚类污染物(双酚A)的高效催化降解。然后，基于碱基互补配对原理，利用磁性适配体材料达到适配体功能化辣根过氧化物酶@金属‑有机骨架材料的回收和循环使用。本发明涉及的适配体功能化酶@金属‑有机骨架材料利用双酚A适配体的高效识别特性，达到双酚A的自富集。同时利用可碱基互补配对的磁性适配体材料回收固定化酶材料。具有较高的催化效率及便于操作、固定化酶材料易于回收的特点。

Description

适配体功能化辣根过氧化物酶@金属-有机骨架材料的制备方 法及其应用
技术领域
本发明属于新材料技术领域，涉及适配体功能化辣根过氧化物酶@金属-有机骨架材料的制备，及其自富集双酚A提高降解效率，同时降解完成后自动与磁控互补链杂交以及优先结合双酚A实现适配体功能化辣根过氧化物酶@金属-有机骨架材料的磁控完全回收和循环连续用于双酚A降解。
背景技术
环境中含酚废水是当今世界上危害大、污染范围广的工业废水之一，是环境中水污染的重要来源。在许多工业领域诸如冶金、机械制造、石油化工、化学有机合成工业、医药等工业排出的废水中均含有酚类化合物。双酚A(BPA)作为酚类化合物的一种，是最著名的内分泌干扰物之一，可导致人类的生殖功能障碍和生理异常。根据研究报道，BPA对性激素功能、免疫功能、肝功能具有不良影响。此外，BPA被认为是一种诱变和致癌剂，接触BPA会增加患糖尿病，肥胖和心脏病的风险。由于BPA的广泛使用且难以分解，其对海洋、地下水、食品、动物以及人类已经造成了严重的危害。
辣根过氧化物酶(HRP)广泛分布于植物界，辣根中含量高，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要的作用。在过氧化氢的存在下，具有极强的催化苯酚及其衍生化合物的氧化能力，而游离辣根过氧化物酶在实际催化环境中具有脆弱性和难以回收等缺点。目前，仿生矿化技术能提高酶在恶劣的操作条件下的稳定性，并且能保持接近游离酶酶活，是一种理想的固定化酶技术。因此，采用仿生矿化技术制备的辣根过氧化物酶@金属-有机骨架材料能提高辣根过氧化物酶的稳定性以及保留高酶活。然而，对于实际工业应用，辣根过氧化物酶@金属-有机骨架材料在提高酶稳定性的同时增加活性、实现可控完全回收，才能使辣根过氧化物酶@金属-有机骨架材料具有成本效益和高效应用。适配体具有单链核酸序列结构和空间构象的多样性，表现出广泛的特定靶标结合特征。近几十年来，为了有效地捕获靶标，适配体已成为广泛开发的适配体传感平台的识别工具，这有望为辣根过氧化物酶@金属-有机骨架材料的稳定性、活性的提高和可控完全循环利用提供一种新的可能性。在辣根过氧化物酶@金属-有机骨架材料表面修饰适配体，可基于适配体的特异性捕获功能触发双酚A底物在辣根过氧化物酶 @金属-有机骨架材料周围的自富集以提高酶活性。除了增加酶活外，适配体还可与磁控互补 DNA序列杂交以及优先捕获双酚A底物竞争诱导杂交的适配体功能化辣根过氧化物酶@金属-有机骨架释放，从而实现适配体功能化辣根过氧化物酶@金属-有机骨架材料的磁控完全回收以及循环连续使用。
发明内容
本发明采用了针对底物双酚A具有强特异性捕获的适配体功能化辣根过氧化物酶@金属 -有机骨架材料，基于适配体对底物双酚A的强特异性捕获实现底物的自富集，达到高效催化降解底物双酚A的目的。同时，基于碱基互补配对以及优先结合底物的原理，实现适配体功能化辣根过氧化物酶@金属-有机骨架材料的磁控完全回收和连续循环使用。
本发明的目的在于提供适配体功能化酶@金属-有机骨架材料的制备方法及其应用。
适配体P碱基序列：5′-CCGCCGTTGGTGTGGGCCTAGGGCCGGGGCACAGCTGTTATAGACGTCTCCAGC-3′。
适配体P1碱基序列：5′-Biotin-CCGCCGTTGGTGTGGGCCTAGGGCCGGGGCACAGCTGTTATAGACGTCTCCAGC-3′；
适配体P2碱基序列：5′-NH2-(C)6–GCTGGAGACGTCTATAA CAGCTGTGCCCCGGCCCTAGGCCCACACCAACGGCGG-3′。
适配体功能化辣根过氧化物酶@金属-有机骨架材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)向六水合硝酸锌溶液中加入链霉亲和素(SA)溶液和HRP溶液，混合反应15min，得到溶液A；
(2)向溶液A中加入2-甲基咪唑溶液，充分混合，将混合液置于30℃恒温水浴锅中静置16h，离心收集固体产物并用去离子水洗涤，得到固体B；
(3)将步骤(2)所得固体B分散于适配体(P1)溶液中静置2h，离心分离固体材料，并用去离子水洗涤，最终得到的固体产物适配体功能化辣根过氧化物酶@金属-有机骨架材料，即为SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1。
步骤(1)中，所述六水合硝酸锌溶液、链霉亲和素(SA)溶液、HRP溶液的用量比为250μL： 15μL：60μL；其中，六水合硝酸锌溶液的浓度为50mM，链霉亲和素(SA)溶液的浓度为5 mg/mL，HRP溶液的浓度为2mg/mL。
步骤(2)中，所述2-甲基咪唑溶液和六水合硝酸锌溶液的体积比为1：1，其中，2-甲基咪唑溶液的浓度为50mM。
步骤(3)中，所述适配体(P1)溶液和步骤(1)中HRP溶液的体积比为1：1，其中，适配体P1溶液的浓度为100μM。
对比材料P&HRP@ZIF-8材料的制备
A、向六水合硝酸锌溶液中加入HRP溶液和适配体P溶液，混合反应15min，得到溶液A；
B、向溶液A中加入2-甲基咪唑溶液，充分混合，将混合液置于30℃恒温水浴锅中静置 16h，离心收集固体产物并用去离子水洗涤，离心分离固体材料，并用去离子水洗涤；最终得到的固体产物即为P&HRP@ZIF-8。
步骤A中，所述六水合硝酸锌溶液、HRP溶液、适配体(P)溶液的用量比为250μL：60μL： 60μL；其中，六水合硝酸锌溶液的浓度为50mM、HRP溶液的浓度为2mg/mL、适配体P 溶液的浓度为100μM。
步骤B中，所述2-甲基咪唑溶液用量为50mM，250μL。
用相同浓度和体积的六水合硝酸锌、2-甲基咪唑和HRP制备HRP@ZIF-8作为对照实验。
将本发明制备的SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1材料用于催化降解环境中酚类污染物的用途，具体步骤为：
S1：在双酚A(BPA)溶液(500μL，0.07mg/mL)中加入浓度为0.33mg/mL的 SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1，再加入100μL H2O2(0.3％w/w)溶液，室温下反应5min；
S2：在步骤S1所得的反应液中加入Fe3O4-P2，用滤膜过滤，去离子水洗涤固体材料。
S3：在波长为277nm处测量步骤S2所得滤液的吸光度值。
步骤S2中，所述的Fe3O4-P2的制备步骤为：将羧基化Fe3O4分散于NaAc-HAc缓冲溶液中，向其中加入EDC和NHS，振荡反应40min，磁性分离黑色固体，并用缓冲溶液洗涤三次；最后，加入适配体P2溶液，振荡使其充分混匀后静置2h，得到产物Fe3O4-P2。
其中，所述EDC、NHS、适配体P2溶液、pH7.0NaAc-HAc缓冲溶液用量比为6.7mg：5.2mg：50μL：1mL；其中，适配体P2溶液的浓度为100μM，NaAc-HAc缓冲溶液的浓度为 0.2M，pH为7。
本发明的有益效果：
本发明构建的适配体功能化辣根过氧化物酶@金属-有机骨架材料基于适配体的特异性捕获性能，实现底物在辣根过氧化物酶@金属-有机骨架材料周围的自富集，提高辣根过氧化物酶的催化活性，解决了传统固定化酶催化活性低的问题。同时，针对纳米尺寸的固定化酶材料难以回收循环利用的问题，基于适配体与磁控互补DNA序列杂交以及优先结合底物性能，通过简单的磁分离实现适配体功能化辣根过氧化物酶@金属-有机骨架材料的磁控完全回收和连续循环使用
附图说明
图1:(a)HRP，(b)为实施例1所制备的SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1，(c)P1的红外光谱图；
图2：(a)为实施例1所制备的SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1降解双酚A后溶液的紫外光谱，(b)为P&HRP@ZIF-8降解双酚A后溶液的紫外光谱，(c)为空白对照组即纯双酚A溶液的紫外光谱；
图3：实施例1所制备的(a)HRP@ZIF-8和(b)SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1的X射线衍射图；
图4：实施例1所制备的SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1的扫描电子显微镜图；
图5：实施例1所制备的SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1的透射电子显微镜图；
图6：实施例1所制备的SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1的选择性实验；
图7:实施例1所制备的SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1的米氏常数；
图8:实施例1所制备的SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P的热稳定性实验；
图9：实施例1所制备的SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1的pH稳定性实验；
图10：实施例1所制备的SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1的贮藏稳定性实验；
图11：实施例1所制备的SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1的循环回收实验。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图说明对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
(1)SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1材料制备
向六水合硝酸锌溶液(50mM，250μL)中加入SA溶液(5mg/mL，15μL)和HRP溶液(2mg/mL，60μL)，混合溶液15min；随后向该混合溶液中加入2-甲基咪唑溶液(50mM，250μL)，充分混合，将混合液置于30℃恒温水浴锅中静置16h，离心收集固体产物并用去离子水洗涤 3次；将上述所得固体分散于P1溶液(100μM，60μL)中，离心分离固体材料，并用去离子水洗涤3次，最终得到的固体产物即为SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1。
(2)P&HRP@ZIF-8材料制备
向六水合硝酸锌溶液(50mM，250μL)中加入HRP溶液(2mg/mL，60μL)和适配体(P)溶液(100μM，60mL)，混合反应15min；随后向该混合溶液中加入2-甲基咪唑溶液(50mM，250 μL)，充分混合，将混合液置于30℃恒温水浴锅中静置16h，离心收集固体产物并用去离子水洗涤3次，离心分离固体材料，并用去离子水洗涤；最终得到的固体产物即为P&HRP@ZIF-8。
用相同浓度和体积的六水合硝酸锌、2-甲基咪唑和HRP制备HRP@ZIF-8作为对照实验。
(3)Fe3O4-P2纳米颗粒的制备
将羧基化Fe3O4分散于pH7.0NaAc-HAc缓冲溶液(1mL,0.2M)中，向其中加入6.7mgEDC 和5.2mg NHS，振荡反应40min，磁性分离黑色固体，并用缓冲溶液洗涤三次。最后，加入适配体P2溶液(50μL,100μM)，振荡使其充分混匀后静置2h，得到产物Fe3O4-P2。
如图1所示：为实施例1所述的HRP、SA&HRP@ZIF-8/P1、P1的红外光谱图数据：辣根过氧化物酶(HRP)：FTIR(KBr,cm-1):1660、1537cm-1；SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1：FTIR (KBr,cm-1):3353、1650、1520cm-1；P1：FTIR(KBr,cm-1)：3420、1697、1653cm-1。
如图2所示：为实施例1所制备的SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1和P&HRP@ZIF-8降解双酚A后溶液的紫外光谱。双酚A适配体P包埋在HRP@ZIF-8材料内部的杂化材料 P&HRP@ZIF-8和基于链霉亲和素-生物素强结合力吸附于HRP@ZIF-8材料表面杂化材料 SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1，采用紫外可见光谱分析了两种杂化材料对BPA的降解能力。由图2可以看出，SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1的紫外吸光度明显比P&HRP@ZIF-8低，这是由于在P&HRP@ZIF-8中，适配体P被包埋在材料内部，因受ZIF-8孔道限制BPA底物，无法有效富集BPA于HRP附近，从而导致降解效率低。
如图3所示：为实施例1所述的HRP@ZIF-8、SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1的X射线衍射数据。SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1的所有衍射峰与HRP@ZIF-8材料几乎相同，表明 SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1材料的晶体结构没有受到SA和BIOTIN-P1的影响。
如图4所示：为实施例1所述的SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1的扫描电子显微镜图。通过扫描电子显微镜(SEM)测定了SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1的形貌。如图4所示， SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1的颗粒形状和大小较为均匀，平均直径约为500nm。
如图5所示：为实施例1所述的SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1的透射电子显微镜图。通过透射电子显微镜(TEM)测定了SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1的形貌。图5可清晰地表明P1 吸附于SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1杂化材料的表面，使材料表面带有网状结构。
实施例2：
SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1的选择性实验
用pH 7.0的NaAc-HAc(0.2M)缓冲溶液配制浓度0.07mg/mL的双酚A(BPA)、苯酚和对氯苯酚，向三份相同体积的溶液中加入等量的SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1(100μL，0.33mg/mL) 和100μL H2O2(0.3％w/w)，室温下反应5min后，用滤膜过滤反应后的体系，随后分别测定所得液体在波长277nm处的紫外吸光度值。如图6所示，在相同反应条件下，HRP@ZIF-8和SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1对BPA、苯酚和对氯苯酚均有一定的降解性能。对比三种底物反应后吸光度值的变化，发现SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1对BPA的降解能力明显高于苯酚和对氯苯酚。
实施例3：
SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1的酶学性能实验
用pH7.0的NaAc-HAc(0.2M)缓冲溶液将20mg/mL BPA溶液稀释到浓度为0.29mM，0.28mM，0.26mM，0.25mM，0.23mM，取500μL稀释后的BPA溶液，向其中加入100μL SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1(0.33mg/mL)和100μL H2O2(0.3％w/w)溶液，使其充分反应5min，用滤膜过滤反应后的混合液，在277nm处测定所得液体的紫外吸光度值，通过测定溶液的紫外吸光度确定BPA的初始降解速率，随后绘制并拟合动力学曲线；利用Michaelis-Menten方程拟合数据来获得Vmax和Km。在对照实验中用HRP@ZIF-8进行相同的实验。如图7所示，在对照实验中，HRP@ZIF-8的Km值为18.2mM，而SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1的Km值为6.7mM，表明适配体P1提高了HRP附近BPA底物的有效浓度，进而增强了其与BPA的亲和力。
实施例4：
SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1材料的酶学性能实验
(1)材料的热稳定性实验
在H2O2存在下，向相同浓度的BPA溶液(0.07mg/ml)中加入等量的HRP@ZIF-8和 SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1材料，并在60℃条件下孵育，每隔20min对二者进行酶的活性测试，总的测试时间为120min。如图8所示，HRP@ZIF-8和SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1 在60℃条件下的剩余酶活随着孵育时间的延长而减小，孵育120min后， SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1保留89.5％的初始酶活，HRP@ZIF-8保留86％的初始酶活。
(2)材料的pH稳定性实验
在H2O2存在下，向相同浓度的BPA溶液中加入等量的HRP@ZIF-8和 SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1材料，并在pH7.0的NaAc-HAc(0.2M)缓冲溶液中孵育，每隔 20min对二者进行酶的活性测试，总的测试时间为120min。如图9所示，在pH7.0的NaAc-HAc (0.2M)中孵育120min小时后，SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1保留了91.2％的初始酶活， HRP@ZIF-8保留了86.5％的初始酶活。
(3)贮藏稳定性实验
将HRP@ZIF-8和SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1在4℃条件下贮藏20天，每隔4天加入到BPA液体底物中进行反应。实验中定义材料的初始活性为100％，酶活以剩余酶活表示。如图10所示，SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1的活性损失小于17％，而HRP@ZIF-8的活性损失为31％。
SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1的酶学性能包括：热稳定性、pH稳定性以及贮藏稳定性均优于HRP@ZIF-8的原因是适配体的引入进一步保护了游离酶的催化环境，达到双重保护的目的。
实施例5：
SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1的循环回收实验
在双酚A(BPA)溶液(500μL,0.07mg/mL)中加入浓度为0.33mg/mL的 SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1材料，再加入100μLH2O2(0.3％w/w)溶液，室温下反应5min。向反应体系中加入0.5mg的Fe3O4-P2，混合均匀反应10mim后，通过磁性分离回收固体杂化材料，将所得液体用滤膜过滤，然后测定其在波长为277nm处的紫外吸光度值。用去离子水洗涤固体材料三次，再进行上述相同的循环实验。如图11所示，8次循环后， SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1对BPA降解效率降低了5％左右，而相同反应条件下的 HRP@ZIF-8降低了75％左右。

Claims (4)

1.适配体功能化辣根过氧化物酶@金属-有机骨架材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）向六水合硝酸锌溶液中加入链霉亲和素(SA)溶液和HRP溶液，混合反应，得到溶液A；
所述六水合硝酸锌溶液、链霉亲和素(SA)溶液、HRP溶液的用量比为250 μL：15 μL：60μL；其中，六水合硝酸锌溶液的浓度为50 mM，链霉亲和素(SA)溶液的浓度为5 mg/mL，HRP溶液的浓度为2 mg/mL，混合反应时间为15min；
（2）向溶液A中加入2-甲基咪唑溶液，充分混合，将混合液置于恒温水浴锅中静置，离心收集固体产物并用去离子水洗涤，得到固体B；
所述2-甲基咪唑溶液和六水合硝酸锌溶液的体积比为1：1，其中，2-甲基咪唑溶液的浓度为50 mM；其中恒温水浴锅温度为30℃，反应时间为16h；
（3）将步骤（2）所得固体B分散于适配体P1溶液中静置，离心分离固体材料，并用去离子水洗涤，最终得到的固体产物适配体功能化辣根过氧化物酶@金属-有机骨架材料，即为SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1；
所述适配体P1溶液和步骤（1）中HRP溶液的体积比为1：1，其中，适配体P1溶液的浓度为100 μM，静置时间为2h；
所述适配体P1的碱基序列为：
5´-Biotin-CCGCCGTTGGTGTGGGCCTAGGGCCGGGGCACAGCTGTTATAGACGTCTCCAGC-3´。
2.将权利要求1所述制备方法制备的SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1材料用于催化降解环境中酚类污染物的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，具体步骤为：
S1：在500μL，浓度为0.07mg/mL双酚A溶液中加入浓度为0.33mg/mL的权利要求1所述方法制备的SA&HRP@ZIF-8/BIOTIN-P1，再加入100μL H2O2溶液，室温下反应5min；H2O2溶液的质量百分浓度为0.3% ；
S2：在步骤S1所得的反应液中加入Fe3O4-P2纳米颗粒，用滤膜过滤，去离子水洗涤固体材料；
所述的Fe3O4-P2纳米颗粒的制备步骤为：
将羧基化Fe3O4分散于NaAc-HAc缓冲溶液中，向其中加入EDC和NHS，振荡反应，磁性分离黑色固体，并用缓冲溶液洗涤三次；最后，加入适配体P2溶液，振荡使其充分混匀后静置，得到产物Fe3O4-P2；
所述适配体P2的碱基序列为：5´-NH2-(C)6–GCTGGAGACGTCTATAA CAGCTGTGCCCCGGCCCTAGGCCCACACCAACGGCGG-3´；
S3:在波长为277nm处测量步骤S2所得滤液的吸光度值。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述EDC、NHS、适配体P2溶液、NaAc-HAc缓冲溶液用量比为6.7mg：5.2mg：50μL：1mL，其中，适配体P2溶液的浓度为100μM，NaAc-HAc缓冲溶液的浓度为0.2M，pH为7；其中振荡反应40min，混匀后静置2h。
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