CN105241869A - 一种基于上转换纳米材料的双酚a电致化学发光适配体传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于上转换纳米材料对于环境激素中BPA的电致化学发光检测方法,属于分析化学领域。其基本原理是利用标记上转换材料的互补链通过杂交方式与电极上的双酚A适配体捕获探针连接。然后电极在靶物质双酚A溶液中孵育,双酚A适配体捕获探针会将靶物质双酚A包裹在其三维空间结构中,同时标记有上转换材料的互补链会被竞争掉,因此电致化学发光信号值会降低,我们利用这种信号值的变化实现对双酚A的定量检测。本发明将上转换材料与适配体结合应用在电致化学发光领域,也为双酚A的检测提供了一种新的方法,同时兼具特异性强、灵敏度高、检测快速等优点。
Description
技术领域
本发明主要基于上转换纳米材料利用适配体传感器对双酚A进行电致化学发光检测,属于分析化学领域。特点在于上转换材料在电化学发光检测中的应用,以及为双酚A的超灵敏检测提供一种新方法。
背景技术
纳米材料具有很多优良的特性,如小尺寸效应、量子尺寸效应、表面效应以及宏观量子隧道和介电限域效应等,使其在很多领域得到发展和改良。镧系元素掺杂的上转换纳米材料也因其良好的光学特性和电学性质而成为研究热点,被广泛应用于各种生物分析检测中。
适配体(Aptamer),为一种特异性DNA或是RNA链,由指数富集配基的系统进化技术(SELEX)从人工合成的寡核苷酸文库中筛选获得的,能与DNA、RNA、蛋白质以及其它小分子物质发生高特异性结合。适配体的识别功能与抗体相似,但与抗体相比,具有更多的优点:(1)可在体外筛选,(2)靶目标分子范围广,无论是小分子,还是大分子,甚至是生物体等都可以筛选得到它们的适配体;(3)分子量小、结构简单、生物化学稳定性好易于长期保存;(4)具有变性和复性的可逆性;(5)容易对其修饰和改造,且不影响它的生物活性;(6)具有高特异性、高识别能力。因此适配体常被制成各种适配体传感器。
电致化学发光,也称电化学发光(ECL)是将电化学手段与化学发光方法相结合的一种技术,它是指通过电极对含有化学发光物质的体系施加一定的电压或通过一定的电流,化学发光物质发生电子转移形成激发态分子,它们之间或它们与体系中其它外加共存物质之间发生化学反应而产生化学发光,或者化学发光物质的激发态分子直接在电极上发生氧化还原反应而产生的一种光辐射的现象。是指发光物质在电极表面经由电化学和化学反应后,形成高能的激发态,再经弛豫而产生光的过程。由于发光过程是由电化学反应激发产生,由所施加的光电倍增管电压控制,无需外界激发光源,所以具有可控性,低信号背景和高灵敏度的特点。因此ECL方法将电化学分析与化学发光检测相结合,广泛用于临床检验分析及环境毒素,农药残留、病毒、免疫等科学试验的分析检测中,并逐渐发展成为分析化学的一个重要的分支。
双酚A(BisphenolA,BPA)学名2,2-二(4-羟基苯基)丙烷,主要用于制备环氧树脂(约占65%)、聚碳酸酯、聚酯树脂。BPA的钾盐或钠盐是生产聚砜的原料,少量用作橡胶防老剂,BPA还可用作聚氯乙烯稳定剂、塑料抗氧剂、紫外吸收剂、农用杀虫剂,甚至是油漆、油墨的抗氧化剂和增塑剂。BPA是工业上合成聚碳酸酯、环氧树脂、聚砜树脂、聚苯醚树脂、不饱和聚酯树脂等多种高分子材料的有机化工原料,用它加工制成食品袋、饮料罐、塑料及牙齿填充物等。从含有双酚A产品中能滤出BPA,老化的塑料等聚合物中BPA的滤出率增加了将近1000倍,这大大提高了有机生物体暴露在BPA的水平。大量的体外研究表明:BPA具有破坏甲状腺激素作用的潜在能力,引起人类前列腺癌细胞的扩散,还能在低剂量时阻止睾丸激素的合成。人类长期接触BPA或其他人工雌性激素,会降低男子的精子数和提高女子乳腺癌的可能性,接触的越多,生殖系统畸变的可能性就越大。因此对BPA的检测就显得越加重要。本发明首次将上转换纳米材料与适配体结合应用于双酚A的电致化学发光检测。
发明内容
本发明目的在于将上转换纳米材料与双酚A适配体结合应用于电致化学发光对双酚A进行快速、准确的定量检测,特别涉及上转换材料与适配体结合在电致化学发光检测中的应用。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
(1)油溶性上转换纳米材料的制备:将0.3gNaOH,1.5mL去离子水,5mL油酸和10mL乙醇加入烧杯内,快速搅拌混合。准确量取0.6mLMnCl2(0.5mol/L),1mLY(NO3)3·6H2O(0.5mol/L),0.9mLYb(NO3)3·5H2O和0.1mLEr(NO3)3·5H2O(0.2mol/L)逐滴加入到上述均匀溶液中,剧烈搅拌混合。随后,称取0.168gNaF(4mmol/L)用4mL去离子水溶解,逐滴加入到混合溶液中,保持剧烈搅拌15min,将白色胶状溶液转移到100mL带聚四氟乙烯内衬的反应釜中,200℃反应8h。反应结束后,取出反应釜让其在空气中自然冷却至室温,弃上清溶液获得底部沉淀,用乙醇清洗三遍以除去油酸,油酸钠和其他反应试剂。最后,在70℃下烘12h得到油相的Mn2+掺杂NaYF4:Yb,Er上转换纳米颗粒粉末。
(2)水溶性上转换纳米材料的制备:取30mg步骤(1)中制备的材料溶解于4mL氯仿中,随后逐滴加入到8mL含有200mg聚丙烯酸(PAA)的水溶液中,常温下搅拌24h。最后,经反复离心和超纯水清洗得到易溶于水由PAA包被的Mn2+掺杂NaYF4:Yb,Er上转换纳米颗粒。
(3)合成巯基化双酚A适配体和互补链:适配体序列为5'-SH–CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA–3',互补链序列为5'-biotin-CCCACCTGACCACCC-3'。
(4)互补链标记上转换材料:取5mg步骤(2)中制备的材料溶解于5mLPBS(10mM,pH8.0)缓冲液中,然后加入0.4mLEDC(2mg/mL)和0.2mLNHS(2mg/mL)溶液,37℃,摇床震荡2h,随后进行离心、沉淀、清洗三次。再将所得材料重新溶解于5mLPBS(10mM,pH8.0)缓冲液中,然后加入200μL亲和素(5.0mg/mL)溶液,37℃,摇床震荡2h,随后进行离心、沉淀、清洗三次。所得亲和素化的材料与生物素化的双酚A适配体互补链混合,37℃,摇床震荡2h,随后进行离心、沉淀、清洗三次得到最终标记材料。
(5)裸玻碳电极的抛光与清洗:裸电极依次用粒径为1.0μm、0.3μm、0.05μm的氧化铝粉末在麂皮上各打磨8min,每次换不同粒径粉末之前都需将电极和麂皮上的残余粉浆冲洗干净。打磨完毕后分别用超纯水、无水乙醇、超纯水对电极超声5min,最后氮气吹干备用。
(6)裸玻碳电极的测试:称取3.73gKCl及0.082gK3Fe(CN)6溶于50mL容量瓶中,配成5mMFe(CN)6 3-和1mol/LKCl溶液;打磨洗好的电极为工作电极,银/氯化银为参比电极,铂丝为对电极组成三电极体系进行循环伏安测试,工作电压为-0.2~0.6V,扫速为100mV/s,直到得到峰形稳定、形状良好、峰与峰差值小于65mV的循环伏安图。
(7)电极修饰:用计时电流的方法,在含硝酸钾为支持电解质的1%的氯金酸中恒电位沉积。工作条件如下:工作电压为-200mV,工作时间为20s。将电极用超纯水淋洗三次后,浸泡在200μL双酚A适配体(500nM)溶液中,37℃,摇床3h后得到适配体修饰的电极。超纯水淋洗三次后,37℃,0.5h进行巯基PEG封闭位点。最后将封闭后的电极与步骤(4)中的标记上转换纳米材料进行孵育0.5h,得到经上转换材料修饰的电极。
(8)将步骤(7)中处理好的电极在0.1M、pH7.4PBS(含有0.1MK2S2O8)溶液中进行检测其ECL信号值I。工作参数如下:工作电压为0~-2.5V,扫速为200mV/s,光电倍增管高压为800V。
(9)将步骤(7)中处理好的电极分别与不同浓度的靶物质双酚A进行0.5h的孵育,然后在0.1M、pH7.4PBS(含有0.1MK2S2O8)溶液中进行检测其不同的ECL信号值I。工作参数如下:工作电压为0~-2.5V,扫速为200mV/s,光电倍增管高压为800V。
本发明的优点如下:
(1)首次将上转换材料与适配体结合应用于电致化学发光检测。
(2)本实验灵敏度高,特异性强,为双酚A的快速定量检测提供了新方法。
附图说明
图1:基于上转换纳米材料的双酚A电致化学发光适配体传感器的原理图。
图2:上转换材料在反应液中的电致化学发光光谱图。
图3:纳米金对于上转换材料在反应液中的电致化学发光增强图。
图4:检测不同浓度双酚A标准液的电致化学发光值。
图5:检测不同浓度双酚A标准液的标准曲线。
具体实施方式:
为了使本发明所述内容更加便于理解,下面结合具体实施例子对本发明所述的技术方案进一步说明,但是本发明的保护范围并不限于此。
实施例1:
用超纯水依次将双酚A稀释成九个不同浓度,即100、50、10、5、1、0.5、0.2、0.1、0.05ng/L。在37℃恒温下,将标记好的工作电极与0.05ng/L浓度的双酚A孵育。30min后在三电极体系中用电致化学发光法进行测量。工作条件如下:反应液为0.1M、pH7.4的PBS(含0.1MK2S2O8)溶液,工作电压为0~-2.5V,扫速为200mV/s,光电倍增管高压为800V。同样的条件下,依次在剩余八个双酚A溶液中,浓度由低往高在37℃恒温下孵育30min后测其ECL信号值I。
根据ECL信号值I与对应的双酚A标准品浓度建立标准曲线:y=-1617x+3614,其检测线的线性范围为0.05~100ng/mL(R2=0.9963)。
实施例2:
准确称量50mg的BPA,加入500mL市售纯净水溶解,配制成0.1g/LBPA的纯净水样品,然后稀释成0.05ng/mL、5ng/mL、10ng/mL三个浓度的纯净水样品。
按发明所述,在37℃恒温下,将标记好的工作电极依次在浓度为0.05ng/mL、5ng/mL、10ng/mLBPA的纯净水样品中孵育30min,小心淋洗后置于电致化学发光分析仪中进行测量,测量条件如下:反应液为0.1M、pH7.4的PBS(含0.1MK2S2O8)溶液,工作电压为0~-2.5V,扫速为200mV/s,光电倍增管高压为800V。得出ECL信号值I,根据标准曲线算出样品中BPA的浓度,并算得回收率。
表一:制备的适配体传感器对纯净水中BPA的加标回收实验
Claims (4)
1.基于上转换纳米材料的电致化学发光适配体传感器用于双酚A的检测,其特征在于:对裸玻碳电极抛光处理,将巯基化双酚A适配体通过Au-S键固定到电极表面,再通过杂交方式连接上标记有上转换纳米材料的互补链,制成适配体传感器对双酚A标准品进行检测,并建立标准曲线,以实现对含有双酚A样品的定量检测。
2.如权利要求1所述的基于上转换纳米材料的电致化学发光适配体传感器的制备,其特征在于互补链标记的上转换材料的制备:经溶剂热法得到油相上转换材料,然后使用聚丙烯酸配体交换使上转换材料易于分散到水溶液中,经活化包被上亲和素,最终与生物素化的互补链DNA结合。
3.如权利要求1所述的基于上转换纳米材料的电致化学发光适配体传感器的制备,其特征在于裸玻碳电极的修饰:用计时电流的方法,在含硝酸钾为支持电解质的1%的氯金酸溶液中恒电位沉积,工作条件如下:工作电压为-200mv,工作时间为20s,将电极用超纯水淋洗后,浸泡在200μL双酚A适配体(500nM)溶液中得到适配体修饰的电极,超纯水淋洗三次后,37℃,0.5h进行巯基PEG封闭位点,最后将封闭后的电极与标记上转换纳米材料进行孵育,得到经上转换材料修饰的电极。
4.如权利要求1所述的基于上转换纳米材料的电致化学发光适配体传感器,其特征在于ECL仪器参数:反应液0.1M、pH7.4PBS(含有0.1MK2S2O8)溶液,工作电压为0~-2.5V,扫速为200mV/s,光电倍增管高压为800V。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160113 |