CN104062330A - 一种检测凝血酶的电化学发光生物传感器及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测凝血酶的电化学发光生物传感器及其制备方法，该方法包括：玻碳电极预处理；在预处理的玻碳电极上涂覆二茂铁功能化石墨烯；制备Ru(bpy)₃ ²⁺标记的凝血酶适配体溶液；将涂覆修饰后的电极在标记后的适配体溶液中培育一段时间，即得到所述生物传感器。由于二茂铁对Ru(bpy)₃ ²⁺具有信号淬灭作用，该传感器处于“光信号关闭”状态。当将其浸入凝血酶检测液中后，传感器上的适配体会与凝血酶发生特异性结合，因此发生构象变化，从二茂铁石墨烯表面脱吸附，导致二茂铁光淬灭基团与Ru(bpy)₃ ²⁺发光基团分离，淬灭效应减弱，传感器转化为“光信号开启”状态，从而实现对凝血酶的特异性检测。本发明的生物传感器检测凝血酶时稳定性好，灵敏度高，操作简单方便。

Description

一种检测凝血酶的电化学发光生物传感器及其制备方法

技术领域

本发明涉及分析化学与电化学发光传感分析领域，具体涉及一种基于二茂铁石墨烯的检测凝血酶的电化学发光生物传感器及其制备方法。

背景技术

凝血酶是由凝血酶原活化变成的丝氨酸蛋白质水解酶（由49个氨基酸残基的轻链和259个氨基酸残基的重链组成），在抗凝过程中和心血管疾病治疗中（即止血和血栓）中具有不可替代的关键作用。机体内的凝血酶浓度必须保持在一定的范围内，血液中的凝血酶浓度过高，会引起一序列的相关疾病，因为高浓度的凝血酶会引起过度凝血，使得机体内的血液无法正常流通，严重的凝血将有可能导致机体的直接死亡。因此，建立一种准确、快速、高灵敏度的凝血酶检测方法或传感器，在医学研究及疾病治疗方面具有十分重要的意义。

核酸适配体是一小段通过一个被称为“指数式富集法配体演化技术”（体外筛选SELEX技术）得到的新型的DNA或者RNA单链寡核苷酸，能够与对应的配体靶分子进行高亲和力与强特异性的结合。1998年，Potyrailo等发现将适配体作为分子识别元件固定在传感器表面，可以成功检测出纳摩尔级的蛋白质。作为一种新型分子识别元件，与传统的抗体和酶相比，适配体不仅容易合成和修饰，目标分子范围广，涵盖了包括蛋白质、核酸以及其它无机、有机等分子，而且热稳定性好、维持活性的pH值和盐浓度范围广、变性和复性可逆。因此，适配体很快成为了传感器领域炙手可热的分析工具和研究对象。到目前为止，大量采用不同种类适配体构建的传感检测技术的研究得到了大力发展，例如，荧光传感检测、比色法传感检测、石英晶体微天平传感检测、电化学传感检测和电化学发光传感检测技术。由于电化学发光传感器有效结合了电化学技术和化学发光技术的优点，如灵敏度高，易于控制等，电化学发光传感器在蛋白质检测应用方面表现出极大地优势。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种检测凝血酶的电化学发光生物传感器的制备方法。

具体地，该制备方法包括以下步骤：

（1）对玻碳电极进行预处理；

（2）将二茂铁功能化石墨烯溶液涂覆到所述预处理后的玻碳电极表面，形成二茂铁功能化石墨烯修饰玻碳电极；

（3）制备Ru(bpy)₃ ²⁺标记的凝血酶适配体溶液；

（4）将所述步骤（2）所得到修饰玻碳电极浸入所述步骤（3）得到的溶液中培育一定时间，即得到所述的电化学发光生物传感器；

其中，所述凝血酶适配体的序列为5’-NH₂-(CH₂)₆-TACATGTGG TTG GTGTGGTTGG-3’。

石墨烯是单层碳原子紧密堆积形成的流放蜂巢晶格结构的晶体，独特的结构使其具有优异的电学、热学、力学及化学性质，可以作为新型的传感器材料。特别的是，由于石墨烯和核苷酸中含氮碱基之间独特的强烈的π-π共轭作用力，石墨烯能够有效地吸附单链寡核苷酸。在本发明方法中，石墨烯可以有效地吸附所述凝血酶适配体。Ru(bpy)₃ ²⁺（三联吡啶钌）是一种稳定的、发光效率非常高的发光剂，由于其分子量和分子空间体积较酶等标记小很多，且不影响核酸的特异性和杂交活性，使得Ru(bpy)₃ ²⁺在分子水平上对核酸进行标记而成为可能。再加上Ru(bpy)₃ ²⁺可在电化学发光（ECL）反应中进行再生循环反应，使得一个标记物在每一个检测周期中会产生相当数量的光子，因而分析灵敏度很高。在本发明的方法中，利用Ru(bpy)₃ ²⁺标记凝血酶核酸适配体不仅不会影响该适配体与凝血酶结合的特异性，而且还能增强检测反应的灵敏度。二茂铁是一种具有芳香族性质的有机过渡金属化合物，当二茂铁存在时，其通过电子转移使Ru(bpy)₃ ²⁺从激发态失活回到基态，无法产生磷光，因此二茂铁可以作为Ru(bpy)₃ ²⁺的发光猝灭剂。

通过本发明方法制备的电化学发光生物传感器，由于Ru(bpy)₃ ²⁺标记的凝血酶适配体会吸附到石墨烯的表面，因此石墨烯上的二茂铁对Ru(bpy)₃ ²⁺发光剂的猝灭得以实现，使得该制备的生物传感器处于“光信号关闭”状态。当将该生物传感器浸入凝血酶检测液中一定时间后，传感器上的适配体会与凝血酶发生特异性结合，因此适配体发生构象变化，不再被石墨烯所吸附，从石墨烯表面脱吸附，导致二茂铁光淬灭基团与Ru(bpy)₃ ²⁺发光基团分离，淬灭效应减弱，该生物传感器转化为“光信号开启”状态，从而实现对凝血酶的特异性检测。 目前已报道有多种凝血酶适配体，其中最广泛使用的能够与凝血酶发生不同位点特异性结合的适配体（TBA）是由15个碱基组成的核苷酸序列SEQ No.1：5’-GGTTGGTGTGGTTGG-3’，已被用作传感器元件用于构建各种基于适配体的生物传感器。本发明人在对多种凝血酶适配体进行试验后，发现一段由22个碱基组成的核苷酸序列SEQ No.2 ：5’ -TACATGTGGTTG

GTGTGGTTGG-3’，且其5’端修饰了氨基和烷基即5’-NH₂-(CH2)₆-，氨基和烷基修饰是为了标记发光基团Ru(bpy)₃ ²⁺，构成的适配体应用于本发明时灵敏度高，特异性非常好。 在本发明的一个具体实施例中，步骤（1）中对玻碳电极进行预处理通过以下方式进行：将玻碳电极用α-A1₂O₃抛光粉抛光；洗涤；分别在去离子水和乙醇中超声10 min。因为石墨烯与玻碳电极之间的π-π共轭作用力使得石墨烯能够稳定修饰在玻碳电极表面，而其他材质的电极与石墨烯之间没有π-π作用力存在，无法在无辅助媒介条件下实现石墨烯在电极表面的固定。

作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤（2）中二茂铁功能化石墨烯溶液的浓度为1.0～2.0 mg·mL^-1。当二茂铁石墨烯溶液浓度过低时，实现二茂铁石墨烯在电极表面修饰后，二茂铁分子的数量不足，对发光基团Ru（bpy）₃ ²⁺淬灭效果不明显；当二茂铁石墨烯溶液浓度过高时，由于修饰在电极表面的二茂铁石墨烯过多，当实现对目标物凝血酶检测后，适配体无法从电极表面脱吸附，传感器信号无法恢复。

在本发明的一个具体实施例中，所述步骤（2）中二茂铁功能化石墨烯溶液的制备方法如下：

1）在氧化石墨悬浮液中加入DCC和ED，混合均匀，在室温下超声1小时，得到棕色溶液；

2）使步骤1）所得的棕色溶液在70 ℃、不断搅拌条件下反应24小时；

3）将步骤2）所得的溶液进行离心，用四氢呋喃和乙醇洗涤，干燥，得到胺化石墨氧化物；

4）将所述胺化石墨氧化物溶解于去离子水中，超声10分钟；

5）将二茂铁甲醛溶解于乙醇中形成二茂铁乙醇溶液；

6）将步骤4）所得的胺化石墨氧化物溶液加入到步骤5）所得的二茂铁甲醛溶液中，在室温、不断搅拌条件下，反应3小时后，向溶液中加入硼氢化钠，继续在室温条件下搅拌3小时，再次加入硼氢化钠；

7）将步骤6）所得的反应液在85 ℃下搅拌反应12小时；

8）对步骤7）所得的溶液进行离心，用乙醇和去离子水洗涤，干燥，即得到二茂铁石墨烯；

9）将步骤8）所得的二茂铁石墨烯溶于去离子水中超声均匀，即得到所述二茂铁石墨烯溶液。

在本发明的一个具体实施例中，作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤（3）中Ru(bpy)₃ ²⁺标记的凝血酶适配体溶液的浓度为1～10 μM，当适配体浓度过低时，电极表面修饰的二茂铁石墨烯吸附的适配体数量少，实现对目标物凝血酶检测后，传感器的信号恢复比较弱；当适配体浓度过高时，由于电极表面修饰的二茂铁石墨烯量是一定的，二茂铁分子对发光剂Ru(bpy)₃ ²⁺的淬灭效果不明显。

在本发明的一个具体实施例中，所述步骤（3）中Ru(bpy)₃ ²⁺标记的凝血酶适配体溶液的制备方法如下：

1）制备Ru(bpy)₂Cl₂；

2）利用Ru(bpy)₂Cl₂合成Ru(bpy)₂(dcbpy)(PF₆)₂ ；

3）利用Ru(bpy)₂(dcbpy)(PF₆)₂ 合成Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS；

4） 用Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS标记所述凝血酶适配体；

5）将所得的已标记适配体溶解于PBS溶液中，即得到Ru(bpy)₃ ²⁺标记的凝血酶适配体溶液。

本发明的另一个目的在于提供一种由本发明方法制备成的检测凝血酶的电化学发光生物传感器，以克服现有凝血酶检测技术中灵敏度低、特异性不强以及操作过程繁琐的缺陷。

本发明的再一个目的在于提供一种本发明制备的电化学发光生物传感器在检测凝血酶含量中的应用方法，包括以下步骤：

1）将所述电化学发光生物传感器浸入待检测的凝血酶样品溶液中35～50 min（培育时间过短，适配体无法与凝血酶分子充分结合；培育时间过长，对适配体的活性有影响），然后用磷酸盐缓冲液清洗电极；

2）将所述电化学发光生物传感器作为工作电极的三电极体系中， 以0.05～0.1 M 三正丙胺溶液作为检测液进行电化学及电化学发光检测。

与现有技术相比，本发明方法制备的检测凝血酶的电化学发光生物传感器具有如下优点：1）具有较好的稳定性、重现性，对凝血酶具有很高的特异性，不易受到检测样品中其他物质的干扰；2）利用适配体的构象变化以及淬灭剂、发光剂之间高效的应激反应，极大地增加了本发明传感器的灵敏度；3）操作简单方便，能够快速准确检测样品中的凝血酶含量。因此，本发明设计的电化学发光生物传感器在检测人体血浆样品中凝血酶的含量方面体现出良好的发展前景。

附图说明

图1为本发明的电化学发光生物传感器用于检测凝血酶的实验原理图。

图2显示本发明一个实施例的玻碳电极在不同修饰阶段的的电化学阻抗。

图3显示本发明一个实施例的生物传感器在不同pH值下的发光强度。

图4显示本发明一个实施例的生物传感器在不同温度值下的发光强度。

图5显示本发明一个实施例的生物传感器的发光强度与培育时间的关系曲线。

图6显示本发明一个实施例的生物传感器在不同修饰阶段的电化学发光信号。

图7显示本发明一个实施例的生物传感器检测不同浓度凝血酶的电化学发光信号时，电化学发光强度与凝血酶浓度的标准曲线图。

图8为本发明一个实施例的生物传感器抗干扰性测试图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。应当理解，本文所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明巧妙利用了石墨烯、二茂铁、Ru(bpy)₃ ²⁺、凝血酶适配体以及凝血酶各物质之间的相互作用关系，设计出一种能够用于检测凝血酶含量的Ru(bpy)₃ ²⁺-适配体-二茂铁功能化石墨烯修饰玻碳电极传感器，其检测凝血酶的原理如图1所示。在未接触凝血酶时，石墨烯吸附被Ru(bpy)₃ ²⁺标记的单链适配体，从而实现二茂铁对Ru(bpy)₃ ²⁺电化学光学信号的淬灭；在存在凝血酶时，由于凝血酶能够与单链适配体核酸序列发生特异性结合，从而使得适配体核酸序列发生构象变化，不再被石墨烯吸附，使得二茂铁光淬灭基因与Ru(bpy)₃ ²⁺发光基团分离，Ru(bpy)₃ ²⁺电化学光学信号得以恢复。通过电化学光学信号的淬灭和恢复，以及显示强度，可以实现对样品中凝血酶的特异性检测。

为了研究本发明的修饰玻碳电极生物传感器检测凝血酶的电极反应性质、机理和电极过程动力学等参数，预处理后的玻碳电极在进行修饰前，采用三电极系统循环伏安法进行检测。在一个实施例中，将工作电极为预处理后的玻碳电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极的三电极系统，在0.5 M 硫酸中，对玻碳电极进行循环伏安扫描，其中设置电压为-0.2～1.6 V，检测完毕后，用去离子水冲洗玻碳电极，吹干玻碳电极表面，备用。同样地，在本发明方法制备的Ru(bpy)₃ ²⁺-适配体-二茂铁功能化石墨烯修饰玻碳电极传感器完成时，也需要进行循环伏安扫描，在一个实施例中，将制备完成的修饰玻碳电极放入0.05～0.1 M三正丙胺溶液中进行循环伏安扫描，其中电压范围是0.2～1.3 V，扫描速率是50～100 mV·s^-1，光电倍增管高压设置为-800～-1000 V。

实施例 1

本发明使用电化学工作站及MPI-B型多参数化学发光分析测试系统。

1.玻碳电极预处理：玻碳电极经0.05μm的α-A1₂O₃抛光粉抛光后，用去离子水冲洗干净，并分别在去离子水和乙醇中超声10 min。采用三电极系统检测，工作电极为玻碳电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，在0.5 M硫酸中，设置电压为-0.2～1.6 V，对玻碳电极进行循环伏安扫描，检测完毕后，用去离子水冲洗电极，吹干电极表面，备用。

2. 二茂铁功能化石墨烯溶液的制备：在本发明中，氧化石墨（GO）是根据改进的Hummers理论由鳞片石墨制备，二茂铁石墨烯（Fc-GNs）的合成是根据前人的文献工作，其具体步骤如下：1）称取前面制备的氧化石墨50 mg，溶解于100 mL去离子水中形成100 mL 0.5 mg/mL的悬浮液；2）加入25 mg N,N′-二环己基碳二亚胺（DCC）和25 mL 乙二胺（ED）混合均匀，并在室温条件下超声1小时，超声后的溶液呈现出棕色；3）将棕色溶液放入恒温水浴锅中，在不断搅拌、恒温70℃的条件下，反应24小时；4）反应完成后，对溶液进行高速离心，并采用四氢呋喃和乙醇进行多次洗涤，洗涤完成后将固体放入真空干燥箱中于40℃条件下干燥24小时，得到胺化石墨氧化物；5）称取45 mg胺化石墨氧化物，溶解于15 mL去离子水中，并充分超声10分钟；6）称取210 mg二茂铁甲醛，溶解于30 mL乙醇中形成30 mL 7 mg/mL的二茂铁乙醇溶液；7）将超声后的胺化石墨氧化物溶液加入到二茂铁甲醛溶液中，在室温条件下不断搅拌，反应进行3小时后，向溶液中加入300 mg 硼氢化钠（NaBH₄），继续在室温条件下搅拌3小时，再次加入300 mg NaBH₄于反应液中，同时将反应液转入85 °C恒温水浴锅中，搅拌反应12小时；8）反应完成后，对溶液进行高速离心，并采用乙醇和去离子水多次洗涤以去除游离的二茂铁甲醛或者吸附在石墨烯表面的二茂铁甲醛，洗涤完成后将沉淀放入真空干燥箱中，于60 °C条件下干燥48小时，即得到二茂铁石墨烯。

称取所得的二茂铁石墨烯固体1 mg，溶于1 mL去离子水中超声均匀，得到1.0 mg·mL^-1的二茂铁石墨烯溶液。

3. Ru(bpy)₃ ²⁺标记的凝血酶适配体（Ru-TBA）溶液的制备:

Ru(bpy)₂Cl₂的合成：根据Sullivan等人的方法，将水合三氯化钌（RuCl₃·3H₂O，0.78 g，3.05 mM）、2,2’-联吡啶（0.936 g，6 mM）和无水氯化锂（0.84 g）混合，在10 mL的二甲基甲酰胺（DMF）中持续搅拌回流反应8小时；回流完成后，向混合液中加入50 mL丙酮对其进行降温，并终止反应体系，将混合液置于冷冻环境下静置过夜；采用有机微孔滤膜对冷冻静置后的反应液进行过滤，得到绿黑色结晶物，紧接着利用50 mL乙二醚-水溶液（体积比为3:1）冲洗结晶物，最后对结晶物进行真空干燥，得到的产物即为Ru(bpy)₂Cl₂。

Ru(bpy)₂(dcbpy)(PF₆)₂的合成：根据Sprintschnik和Terpetschnig等人的制备方法，称取前期制备的Ru(bpy)₂Cl₂（0.16 g，0.328 mM）、碳酸氢钠（0.16 g）和2,2’-联吡啶-4,4’-二羧酸（0.12 g，0.492 mM）均匀混合，加入10 mL乙醇-水溶液（体积比为4:1）后加热回流4小时；回流反应完成后，冰浴冷却7小时，冷却过程中，采用1 M盐酸溶液调节反应液pH至4.4以促进反应产生橘红色的结晶沉淀析出；将充分结晶后的反应液进行过滤，得到的结晶用甲醇再次溶解后进行过滤以除去不溶杂质，得到透亮的橘红色滤液；将14 mL的六氟磷酸钠（NaPF₆）（2 g）溶液加入到橘红色滤液中，冰浴冷却7小时，保证产物能够完全沉淀析出；采用微孔膜过滤所得的沉淀物，并对其进行真空干燥，最终得到的红色粉末状固体即为Ru(bpy)₂(dcbpy)(PF₆)₂。

Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS的合成：将N,N′-二环己基碳二亚胺（DCC，0.46 g，2.22 mM）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，0.238 g，2.08 mM）搅拌混合，在冰浴条件下加入3 mL DMF溶液使其充分溶解；将溶解液搅拌加入到1 ml含有0.38 g Ru(bpy)₂(dcbpy)(PF₆)₂的DMF溶液中，继续常温条件下搅拌5小时以最终制备得到具有活性羧基官能团Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS DMF溶液；取少量产物溶液加入到0.10 M的PBS溶液中进行紫外光谱表征，根据其在279 nm和453 nm处出现特征峰及前期实验工作，换算估计浓度为6.02 × 10^-4 M。

单链适配体（ss-TBA）的钌配合物标记：根据前人的文献工作，Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS被直接用来标记5’端胺基化的ss-TBA（由上海生物工程股份有限公司合成，其核苷酸序列为ss-TBA: 5’-NH₂-(CH₂)₆-TAC ATG TGG TTG GTG TGG TTG G-3’）。首先，取200 μL溶解Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS的PBS溶液，加入至含有200 μL ss-TBA溶液（1 OD）的5 mL的离心管中，恒温25℃条件下避光低速震荡12小时；震荡完成后，将100 μL 3 M的醋酸钠溶液和2 mL冰无水乙醇加入至反应体系终止反应，在-20℃条件下静置12小时；静置完成后，反应混合物在12000 r/min转速下低温离心30 min，小心去除上清液，再用70%的冰无水乙醇漂洗沉淀物2次，每次漂洗完后离心10 min，最终洗去未被DNA结合的Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS；冷冻干燥后的反应沉淀物即为三联吡啶钌标记后的电化学发光信标Ru-TBA。取0.155 μg Ru-TBA重新溶解于200 μL PBS溶液中，配制成浓度为1 μM的Ru(bpy)₃ ²⁺标记适配体溶液，进行紫外光谱表征，验证DNA的标记修饰效果，并于-20 °C条件下保存备用。

4. 生物传感器的构建：

1）滴加10 μL 2.0 mg·mL^-1的二茂铁石墨烯溶液于预处理后的玻碳电极表面，室温条件下自然干燥。

2）将步骤1）得到的修饰电极浸入1 μM Ru(bpy)₃ ²⁺标记的凝血酶适配体溶液中培育40min，以充分吸附Ru(bpy)₃ ²⁺标记的适配体于电极表面，即构建好凝血酶适配体传感平台。

实施例 2

1.玻碳电极预处理：玻碳电极经0.3μm的α-A1₂O₃抛光粉抛光后，用去离子水冲洗干净，并分别在去离子水和乙醇中超声10 min。采用三电极系统检测，工作电极为玻碳电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，在0.5 M硫酸中，设置电压为-0.2～1.6 V，对玻碳电极进行循环伏安扫描，检测完毕后，用去离子水冲洗电极，吹干电极表面，备用。

2. 二茂铁功能化石墨烯溶液的制备：固体二茂铁功能化石墨烯的制备步骤同实施例1，称取所得的二茂铁石墨烯固体2.0 mg，溶于1 mL 去离子水中超声均匀，得到2.0 mg·mL^-1的二茂铁石墨烯溶液。

3. Ru(bpy)₃ ²⁺标记的凝血酶适配体溶液的制备: Ru(bpy)₃ ²⁺标记的凝血酶适配体制备过程同实施例1，取1.55 μg Ru-TBA重新溶解于200 μL PBS溶液中，配制成浓度为10μM的Ru(bpy)₃ ²⁺标记适配体溶液，进行紫外光谱表征，验证DNA的标记修饰效果，并于-20 °C条件下保存备用。

4. 生物传感器的构建：

1）滴加10 μL 1.0 mg·mL-1的二茂铁石墨烯溶液于预处理后的玻碳电极表面，室温条件下自然干燥。

2）将步骤1）得到的修饰电极浸入10 μM Ru(bpy)₃ ²⁺标记的凝血酶适配体溶液中培育50 min，以充分吸附Ru(bpy)₃ ²⁺标记的适配体于电极表面，即构建好凝血酶适配体传感平台。

生物传感器的性能检测

1）电化学阻抗检测

实验采用电化学阻抗谱测试对制备的生物传感界面进行表征分析，在开路电位下，0.1 Hz至100 kHz频率范围内，震荡电压为5 mV条件下，不同制备阶段的传感界面在铁氰化钾测试体系中的奈奎斯特图谱如图2所示。在高频区，空白玻碳电极呈现出很小的弧度，其奈奎斯特曲线表现为几乎为直线，这说明在[Fe(CN)₆]^{3 − /4 −}体系中，空白玻碳电极表面的阻抗很小，体系的电子能量能够得到快速的传递。对空白电极进行二茂铁石墨烯（Fc-GNs）修饰后，电极表面的阻抗相对于空白电极有所增大。由于石墨烯与单链DNA之间强烈的π-π共轭作用力，修饰了Fc-GNs的电极表面吸附单链Ru-TBA构建了生物传感界面。由于单层Ru-TBA的绝缘作用，有效阻滞了[Fe(CN)₆]^{3 − /4 −}体系中的电子传递过程，吸附单链Ru-TBA后，可以观察到电极的电化学阻抗有了明显的增加。将传感器电极浸泡于一定浓度的凝血酶溶液中培育一段时间，凝血酶适配体与凝血酶分子发生特异性结合，从而导致Ru-TBA发生构象变化，从Fc-GNs表面脱吸附，使得电极表面的电化学阻抗有所下降。由于绝缘Ru-TBA从Fc-GNs表面脱吸附，电极表面的电化学阻抗得到了一定的恢复。

2）pH值对电化学发光强度的影响

图3 显示了pH值对本发明制备的修饰玻碳电极生物传感器发光强度的影响。由图3可以看出，在pH为7.5左右时能够实现电极传感器对凝血酶的最佳检测。这一pH范围正好是人体常规血液的pH范围，因此，本发明的传感器非常适用于检测人体血浆样品中的凝血酶含量。

3）温度对电化学发光强度的影响

图4显示了温度对本发明制备的修饰玻碳电极生物传感器发光强度的影响。由图4可以看出，在温度为37 ℃左右时能够实现电极传感器对凝血酶的最佳检测。37 ℃正好是人体正常体温，在此温度条件下，生物分子的活性能够得到最好的展现。因此，本发明的传感器非常适用于检测人体血浆样品中的凝血酶含量。

4）培育时间对电化学发光强度的影响

图5显示了传感器在凝血酶样品中培育时间不同对传感器发光强度的影响。由图5可以看出，培育时间达到40分钟时，即能够实现电极传感器对凝血酶的最佳检测。

5）循环伏安法检测

石墨烯与单链DNA之间强烈的π-π共轭作用力使得Fc-GNs能够有效地将单链Ru-TBA吸附于表面，实现二茂铁（Fc）对发光试剂Ru(bpy)₃ ²⁺的淬灭。为了探究传感器的稳定性，通过对电极进行持续的循环伏安扫描，并采用电化学发光方法记录生物传感器在0.10 M 三丙胺（TPrA）中的发光强度。传感器的电化学发光强度-电位曲线如图6所示。由曲线a可以看出，经Fc-GNs和Ru-TBA修饰的玻碳电极几乎没有电化学光强信号产生，这充分表明Ru-TBA被完全吸附在Fc-GNs表面，并且Fc有效地对发光基团Ru(bpy)₃ ²⁺产生了淬灭作用。将传感电极浸泡于一定浓度的凝血酶溶液中培育一段时间后，实现凝血酶分子与适配体特异性结合后，传感器的光强信号得到了很好的恢复（曲线b）。这是由于凝血酶分子与适配体结合后使得Ru-TBA发生了构象变化，构象变化后的Ru-TBA与石墨烯之间的π-π共轭作用力减弱，引起Ru-TBA从Fc-GNs表面脱吸附，从而使得传感器恢复了“信号开”状态。

从插图可以看出，经过连续的循环伏安扫描后，传感器展现出一个平稳的发光强度，这充分说明实验制备的生物传感器具有可接受的可靠性和稳定性。在相同的测试条件下，对20 nM凝血酶溶液进行多次平行测试来验证制备的传感器的重现性。所有的实验结果表明，实验制备的传感器具有相似的电化学发光强度，其相对标准偏差为4.67%，这表明传感器的重现性是可以接受的。

5）标准曲线绘制

检测本发明的生物传感器在不同浓度凝血酶中的电化学发光信号，绘制电化学发光强度与凝血酶浓度的标准曲线图，具体的检测步骤如下：

（1）将传感器分别浸入待检测不同浓度的凝血酶溶液中（凝血酶浓度序列为0.5 nM，1 nM，2 nM，5 nM，10 nM，20 nM和25 nM）培育40分钟时间后，然后用磷酸盐缓冲液清洗电极。

（2）将修饰玻碳电极作为工作电极，在电化学工作站上使用0.1 M三正丙胺溶液作为检测液进行电化学发光检测。（循环伏安扫描电压范围是0.2～1.25 V，扫描速率是100 mV·s^-1，光电倍增管高压设置为-800 V）。

在优化的实验条件下，将实验制备的传感器进行一系列浓度的凝血酶标准溶液测试，建立响应信号差ΔI _ECL与凝血酶浓度的关系曲线。如图7及插图所示，在0.5 nM～25 nM浓度范围内，传感器的电化学光强信号随着凝血酶溶液浓度的增大而增强，不同的测试浓度对应的发光强度具有良好的线性关系，线性回归方程为ΔI _ECL = 61.7 C_thrombin + 307.2，线性相关系数为0.9939。同时，本实验制备的传感器的检出限为0.21 nM（3次平行测定的空白样品的响应信号强度加上3倍的标准偏差后的信号作为其最低可信检出信号，3 δ方法）。

6）抗干扰性测试

为探究传感器对其他潜在干扰蛋白质的抗干扰性能，我们对血液中可能与凝血酶共存的不同蛋白质（人血清蛋白、牛血清蛋白、免疫球蛋白G、牛胰岛素、胰蛋白酶、溶解酵素）进行了平行干扰测试实验。在图8所示的检测中，凝血酶浓度为10 nM，其他蛋白质浓度为250 nM。由图8可以看出，传感器对凝血酶有强烈的信号响应（约935单位），对牛血清白蛋白等干扰物质几乎没有信号响应（约30～60单位）。实验结果表明本实验制备的传感器具有良好的抗干扰性能，具有良好的凝血酶识别特异性。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明， 对于本领域的技术人员来说， 其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种检测凝血酶的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对玻碳电极进行预处理；

（2）将二茂铁功能化石墨烯溶液涂覆到所述预处理后的玻碳电极表面，形成二茂铁功能化石墨烯修饰玻碳电极；

（3）制备Ru(bpy)₃ ²⁺标记的凝血酶适配体溶液；

（4）将所述步骤（2）所得到修饰玻碳电极浸入所述步骤（3）得到的溶液中培育40～50 min，即得到所述的电化学发光生物传感器；

其中，所述凝血酶适配体的序列为5’-NH₂-(CH₂)₆-TACATGTGG TTG GTGTGGTTGG-3’。

2.如权利要求1所述的电化学发光生物传感器的制备方法，其中所述步骤（1）的对玻碳电极进行预处理通过以下方式进行：将玻碳电极用α-A1₂O₃抛光粉抛光；洗涤；分别在去离子水和乙醇中超声10 min。

3.如权利要求1所述的电化学发光生物传感器的制备方法，其中所述步骤（2）中二茂铁功能化石墨烯溶液的浓度为1.0～2.0 mg·mL^-1。

4.如权利要求1所述的电化学发光生物传感器的制备方法，其中所述步骤（2）中二茂铁功能化石墨烯溶液的制备方法如下：

1）在氧化石墨悬浮液中加入DCC和ED，混合均匀，在室温下超声1小时，得到棕色溶液；

2）使步骤1）所得的棕色溶液在70 ℃、不断搅拌条件下反应24小时；

3）将步骤2）所得的溶液进行离心，用四氢呋喃和乙醇洗涤，干燥，得到胺化石墨氧化物；

4）将所述胺化石墨氧化物溶解于去离子水中，超声10分钟；

5）将二茂铁甲醛溶解于乙醇中形成二茂铁乙醇溶液；

6）将步骤4）所得的胺化石墨氧化物溶液加入到步骤5）所得的二茂铁甲醛溶液中，在室温、不断搅拌条件下，反应3小时后，向溶液中加入硼氢化钠，继续在室温条件下搅拌3小时，再次加入硼氢化钠；

7）将步骤6）所得的反应液在85℃下搅拌反应12小时；

8）对步骤7）所得的溶液进行离心，用乙醇和去离子水洗涤，干燥，即得到二茂铁石墨烯；

9）将步骤8）所得的二茂铁石墨烯溶于去离子水中超声均匀，即得到所述二茂铁功能化石墨烯溶液。

5.如权利要求1所述的电化学发光生物传感器的制备方法，其中所述步骤（3）中Ru(bpy)₃ ²⁺标记的凝血酶适配体溶液的浓度为1～10 μM。

6.如权利要求1所述的电化学发光生物传感器的制备方法，其中所述步骤（3）中Ru(bpy)₃ ²⁺标记的凝血酶适配体溶液的制备方法如下：

1）制备Ru(bpy)₂Cl₂；

2）利用步骤1）所得的Ru(bpy)₂Cl₂合成Ru(bpy)₂(dcbpy)(PF₆)₂ ；

3）利用步骤2）所得的Ru(bpy)₂(dcbpy)(PF₆)₂ 合成Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS；

4） 用步骤3）所得的Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS标记所述凝血酶适配体；

5）将步骤4）所得的已标记适配体溶解于PBS溶液中，即得到所述Ru(bpy)₃ ²⁺标记的凝血酶适配体溶液。

7.一种如权利要求1～4任一所述方法制备成的检测凝血酶的电化学发光生物传感器。

8.一种如权利要求5所述的电化学发光生物传感器在检测凝血酶含量中的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将所述电化学发光生物传感器浸入待检测的凝血酶样品溶液中40～50 min，然后用磷酸盐缓冲液清洗电极；

2）将所述电化学发光生物传感器作为工作电极的三电极体系中， 以0.05～0.1 M 三正丙胺溶液作为检测液进行电化学及电化学发光检测。