CN101458215B - 一种多联吡啶钌络合物的电化学发光适配子传感器及制法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多联吡啶钌络合物的电化学发光适配子传感器及制法。经(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷预处理的铟锡氧化物电极通过强的Au-S键固定金纳米粒子修饰的凝血酶捕获适配子到电极表面，双(2，2’-联吡啶)(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)钌琥珀酰亚胺活化酯与氨基修饰的凝血酶探针适配子反应得到该传感器的电化学发光探针，从而得到“三明治”型修饰捕获适配子的金纳米粒子/凝血酶/二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌标记的探针适配子的电化学发光传感器。其可用于分析物的电化学发光检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种多联吡啶钌络合物的电化学发光适配子传感器及制法，属于分析化学和电化学传感器技术领域。
背景技术
电化学发光，是指基态分子通过参与电化学反应获得能量后跃迁到激发态，激发态再回到基态时发光的现象(Bard，A.J.Electrogenerated Chemiluminescence，Marcel Dekker：New York，2004；Chap.1)。和其它电化学发光体系相比较，三(2，2’-联吡啶)钌电化学发光体系具有明显的优点：发光强度高、发光试剂能在水溶液和有机溶液很好地溶解、因无背景光源干扰而有很好的灵敏度、具有很好的时间和空间分辨能力、测量的线性范围宽。三(2，2’-联吡啶)钌电化学发光发展至今，已被广泛用于临床分析和生物分子的检测(Richter，M.M.，Electrochemiluminescence(ECL).Chem.Rev.2004，104，(6)，3003-3036)。
除三(2，2’-联吡啶)钌之外，人们也研究了其它含多吡啶类配体的钌配合物的电化学发光性质。例如，三(2，2’-联吡啶)钌-琥珀酰亚胺活化酯和三(2，2’-联吡啶)钌-亚磷酰胺复合物作为非放射性的电化学发光标记探针，已被用于临床诊断(Yin，X.B.；Dong，S.J.；Wang，E.，Analytical applications of the electrochemiluminescence of tris(2，2′-bipyridyl)ruthenium and its derivatives.TrAC-Trends Anal.Chem.2004，23，(6)，432-441)。
二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶N-琥珀酰胺酯)钌作为众多三(2，2’-联吡啶)钌-琥珀酰亚胺活化酯中的一种，它的电化学体系具有和三(2，2’-联吡啶)钌电化学发光体系相同的优点。而且，二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌非常容易与含有氨基的DNA，蛋白质及其多胺类物质通过酰胺键结合，从而直接检测DNA，蛋白质及其多胺类物质。
核酸适配子是针对特定靶分子通过体外筛选出来的功能化寡链DNA或RNA分子。由于核酸序列的多样性，核酸适配子的靶分子可以小到无机物、有机物，大到蛋白质、细胞。与蛋白质类抗体相比，核酸适配子具有更多的优越性，如不受免疫条件和免疫原性限制，可体外人工合成，变性与复性可逆，易进行化学修饰并适于长期保存和室温运输等。更重要的是，核酸适配子的靶分子更为广泛。核酸适配子与靶分子之间可以达到很高的亲和力，甚至高于抗体。所以核酸适配子作为一种生物识别元素，在分析领域已经得到广泛应用。至今，已有多种检测手段用于基于核酸适配子的分析方法中，这些检测手段包括圆二色谱法、电化学方法、荧光检测法、比色法、原子力显微镜等。
若将三(2，2’-联吡啶)钌的电化学发光检测手段和核酸适配子的生 物识别作用相结合，可以构建用于靶分子快速灵敏检测的新型传感器。二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌具有高稳定性、宽线性范围、宽pH适用范围以及易于多重标记等优点。利用此钌配合物作为电化学发光探针来标记蛋白质的核酸适配子，可构建基于核酸适配子的电化学发光传感器，实现蛋白质的电化学发光检测。
发明内容
本发明的目的之一是提供二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌的电化学发光适配子传感器。
如图3所示，本发明提供的二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌的电化学发光适配子传感器的构成如下：
该传感器为“三明治”型修饰捕获适配子的金纳米粒子/凝血酶/二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌标记的探针适配子的电化学发光传感器；其中，(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷功能化的铟锡氧化物电极通过强的Au-S键固定修饰捕获适配子金纳米粒子到电极表面，加入目标分子凝血酶后，它与固定在电极表面的捕获适配子产生很强的特异性相互作用，也结合到电极表面；当进一步遭遇到二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌标记的探针适配子，得到二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌的电化学发光适配子传感器。
本发明的目的之二是提供提供二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌的电化学发光适配子传感器的制备方 法，其步骤和条件如下：
(1)用参考文献a“表面活性的吡啶钌配合物在单层组装和水-固界面的制备及光化学反应”制备二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)钌(参考文献a：Preparation and Photochemical Reactivity ofSurfactant Ruthenium(II)Complexes in Monolayer Assemblies and atWater-Solid interfaces，Gerhard Sprintschnik，Hertha W.Sprintschnik，Pierre P.Kirsch，and David G.Whitten；JACS，1977，99(15)，4947-4954.)，方法如下：取700毫升新蒸馏的4-甲基吡啶和质量分数为10％的钯碳催化剂加热回流三天，加入250毫升热苯溶液，继续加热回流30分钟，热过滤，滤液浓缩至300毫升，结晶得到粗产品，用乙酸乙酯重结晶，真空干燥，得到40克4，4’-二甲基联吡啶；取16克4，4’-二甲基联吡啶和50克重铬酸钾在560毫升水中加热回流12小时，得到含有褐色沉淀的溶液，过滤除去褐色沉淀，得到黄色滤液，得到的黄色滤液经乙醚萃取，萃取液加入浓盐酸得到白色晶体4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶；取15.6克三氯化钌和18.72克联吡啶于500毫升N，N-二甲基甲酰胺中加热回流3小时，加热除去N，N-二甲基甲酰胺，冷至室温，加入500毫升丙酮，于0度过夜，得到的混合溶液，过滤，水洗，除去丙酮，得固体物质，将固体物质溶解在2500毫升乙醇/水的混合溶剂(体积比为1∶1)中，回流反应1小时，过滤，在滤液中加入300克LiCl，溶液蒸发除去乙醇后冰浴，放置过夜，过滤，真空干燥，得二氯二联吡啶钌；取0.52克二氯二联吡啶钌，0.3克4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶和0.3克碳酸氢钠于15毫升水和10毫升甲醇的混合溶液中加热回流2小时，之后加入六氟磷酸铵得到红色沉淀，冰浴过夜，过滤真空干燥得到二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’二羧基-2，2’-联吡啶)钌；
(2)取上述步骤(1)中的二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)钌，用参考文献b“合成赖氨酸的氧化还原衍生物及其赖氨酸相关的含有吩噻嗪或三联吡啶钌的多肽”制备二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶N-琥珀酰胺酯)钌(参考文献b：Synthesis of RedoxDerivatives of Lysine and Related Peptides Containing Phenothiazine orTris(2，2’-bipyridine)ruthenium(II)，Peek，B.M.，Ross，G.T.，Edwards，S.W.，Meyer，G.J.，Meyer，T.J.，Erickson，B.W.，1991.Int.J.Pept.ProteinRes.38，114-123.)，方法如下：0.675克二环己基碳亚二胺，0.263克羟基琥珀酰胺和2克二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)钌置于4.4毫升乙腈中室温搅拌5小时，反应液过滤，滤液加入200毫升异丙醇中在-10度条件下放置1小时，过滤，得到产品二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌；
利用参考文献a制备二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)钌，利用参考文献b制备二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N- 琥珀酰胺酯)钌；电化学和电化学发光性能表征如图1和图2所示。
图1，2中的数据表明，利用参考文献a制备二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)钌，利用参考文献b制备二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌；电化学和电化学发光性能良好。
(3)取上述步骤(2)所述制备的二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌溶于N，N-二甲基甲酰胺中，加入到6微摩尔/升的探针适配子的磷酸盐缓冲溶液中，室温搅拌反应12小时，向反应后的溶液中按浓度为3摩尔/升的氯化钠溶液∶冰乙醇的体积比为1∶25，分别加入浓度为3摩尔/升的氯化钠溶液和冰乙醇，置于-20℃冰箱中冷冻1小时取出，在13000转/分钟的转速下离心15分钟，
弃去上层清液，使用体积浓度为70％的冰乙醇洗涤剩余固体，之后溶解于绑定缓冲溶液中，得到二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌标记的探针适配子；
所述的二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌的质量，毫克：N，N-二甲基甲酰胺的体积，微升：6微摩尔/升的探针适配子的磷酸盐缓冲溶液的体积，微升：3摩尔/升的氯化钠溶液的体积，微升：冰乙醇的体积，毫升：体积浓度为70％的冰乙醇体积，毫升：绑定缓冲溶液的体积，微升为2∶60∶2000∶200∶5∶12∶400；所述的磷酸盐缓冲溶液的浓度为10毫摩尔/升，pH为8.5；
所述的绑定缓冲溶液的组成为20毫摩尔/升的Tris-HCl缓冲液，140毫摩尔/升的氯化钠溶液，5毫摩尔/升的氯化钾溶液，1毫摩尔/升的氯化镁溶液；所述的探针适配子的序列为5’NH2-(CH2)6-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT；
(4)将聚二甲基硅氧烷和固化剂乙烯基聚二甲基硅氧烷置于容器中，搅拌，抽气，然后将其倒入平面器皿中，80℃放置两小时，取出后用刀切成长×宽×厚为0.8厘米×0.8厘米的聚二甲基硅氧烷小块，用打孔器在该长×宽×厚为0.8厘米×0.8厘米的聚二甲基硅氧烷小块的中央打出直径为3毫米的圆孔，得到长×宽×厚为0.8厘米×0.8厘米的中央圆孔直径为3毫米的聚二甲基硅氧烷层；所述的聚二甲基硅氧烷的∶固化剂乙烯基聚二甲基硅氧烷的质量比为10∶1；
(5)铟锡氧化物电极用水和丙酮超声清洗，将清洗干净的铟锡氧化物电极浸泡在体积浓度为10％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的甲醇溶液中，过夜，用甲醇洗净，用氮气吹干，得到修饰有(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的铟锡氧化物电极；
把上述步骤(4)制备长×宽×厚为0.8厘米×0.8厘米的中央圆孔直径为3毫米的聚二甲基硅氧烷层与修饰有(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的铟锡氧化物电极贴合，制得(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷预修饰 的铟锡氧化物电极；
(6)用参考文献方法“金溶胶单层的制备与表征”合成13纳米的金纳米粒子溶液(参考文献：Preparation and Characterization goldcolloid Monolayers，Grabar，K.C.；Freeman，R.G.；Hommer，M.B.；Natan，M.J.，Preparation and Characterization of Au Colloid Monolayers.Anal.Chem.1995，67，(4)，735-743)，方法如下：50毫升38.8毫摩尔/升柠檬酸钠溶液加入沸腾的500mL 1毫摩尔/升氯金酸溶液，加热回流搅拌10min，得到酒红色胶体溶液；除去加热装置，搅拌15min，得到的胶体溶液经0.8微米的Gelman膜滤器过滤，即得粒径为13nm的金纳米；
(7)将上述步骤(6)制备的粒径为13纳米的金纳米粒子溶液与6微摩尔/升巯基化的捕获适配子溶液混合，摇匀，放置于25℃恒温箱中反应72小时，然后在13000转/分钟的转速下离心15分钟，弃去上清液，下层深红色的溶胶再溶于绑定缓冲溶液中，得到修饰捕获适配子金纳米粒子溶液；所述的绑定缓冲溶液的浓度为步骤(3)的绑定缓冲溶液的浓度再稀释10倍；
所述的粒径为13纳米的金纳米粒子溶液：6微摩尔/升巯基化的捕获适配子溶液)：稀释10倍的绑定缓冲溶液的体积比为2∶1∶2；
所述的绑定缓冲溶液的组成为2毫摩尔/升的Tris-HCl缓冲液，14毫摩尔/升的氯化钠溶液，0.5毫摩尔/升的氯化钾溶液，0.1毫摩尔/升的氯化镁溶液；所述的捕获适配子的序列为5’SH-(CH2)6-GGTTGGTGTGGTTGG；
(8)往长×宽×厚为0.8厘米×0.8厘米的聚二甲基硅氧烷层的直径为3毫米的中央圆孔中加入修饰捕获适配子的金纳米粒子溶液，用洁净的玻璃盖上，置于25℃的恒温箱中自组装10小时，用二次水冲洗，用氮气吹干，加入待测浓度的凝血酶：0.03毫克/毫升牛血清蛋白体积比为1∶1的混合溶液，37℃反应30分钟，用二次水及缓冲溶液反复冲洗长×宽×厚为0.8厘米×0.8厘米的聚二甲基硅氧烷层的直径为3毫米的中央圆孔，用氮气吹干，然后往该直径为3毫米的中央圆孔中加入二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌标记的探针适配子溶液，于37℃恒温箱中反应30分钟，取出剩余溶液，揭下可逆键合的聚二甲基硅氧烷层，用二次水冲洗铟锡氧化物电极被修饰的部分，并用氮气吹干，得到“三明治”型修饰捕获适配子的金纳米粒子/凝血酶/二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶N-琥珀酰胺酯)钌标记的探针适配子的电化学发光传感器；
所述的修饰捕获适配子的金纳米粒子溶液：待测浓度的凝血酶∶0.03毫克/毫升牛血清蛋白体积比为1∶1的混合溶液：二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌标记的探针适配子溶 液的体积比为30∶25∶20；
所述的待测凝血酶的浓度选择为56纳摩尔/升、200纳摩尔/升、300纳摩尔/升、400纳摩尔/升、500纳摩尔/升、600纳摩尔/升、800纳摩尔/升或900内摩尔/升。
利用本发明的制备方法制备的二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌电化学发光适配子传感器，其电化学和电化学发光性能表征如图4，5所示。
从图4，5中可以看出，该传感器较为稳定，可用于凝血酶等蛋白质类物质的检测，有好的电化学发光性能。
本发明的有益效果：本发明所制备的“三明治”型修饰捕获适配子的金纳米粒子/凝血酶/二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌标记的探针适配子的电化学发光传感器，电化学发光性能较好，可进一步推广检测蛋白质等其他与适配子特异结合的物质。
附图说明
图1为室温下，0.25毫摩尔/升二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌在没有加入2毫摩尔/升2-(二丁基氨基)乙醇(实线)和加入2毫摩尔/升2-(二丁基氨基)乙醇(虚线)的循环伏安曲线图。其支持电解质为：150毫摩尔/升磷酸盐缓冲溶液。
图2为室温下，0.25毫摩尔/升二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌在没有加入2毫摩尔/升2-(二丁基氨基)乙醇(实线)和加入2毫摩尔/升2-(二丁基氨基)乙醇(虚线)的电化学发光强度-时间曲线图。其支持电解质为：150毫摩尔/升磷酸盐缓冲溶液。
图3为修饰捕获适配子的金纳米粒子/凝血酶/二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌标记探针适配子的电化学发光适配子传感器示意图，图中，ITO为铟锡氧化物电极，AuNPs为粒径为13纳米的金纳米粒子，标记探针适配子为二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌标记的探针适配子。
图4为ITO修饰电极层层组装上目标分子的阻抗谱图。(a)裸铟锡氧化物电极，(b)组装(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的铟锡氧化物电极，(c)依次组装(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷和修饰捕获适配子的金纳米粒子的铟锡氧化物电极，(d)依次组装(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，修饰捕获适配子的金纳米粒子和凝血酶的铟锡氧化物电极，(e)依次组装(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，修饰捕获适配子的金纳米粒子，凝血酶和二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌标记的探针适配子的铟锡氧化物电极。检测条件：1毫摩尔/升物质的量之比为1∶1的铁氰化钾/亚铁氰化钾溶液作为氧化还原探针；绑定缓冲液(20毫摩尔/升的Tris-HCl缓冲液，140毫摩尔/升的氯化钠溶液，5 毫摩尔/升的氯化钾溶液，1毫摩尔/升的氯化镁溶液)为支持电解质；振荡电压为5毫伏；频率范围为10千赫兹-0.1赫兹。
图5为电化学发光强度对凝血酶浓度曲线。图中，凝血酶的浓度为(a)56纳摩尔/升，(b)200纳摩尔/升，(c)300纳摩尔/升，(d)400纳摩尔/升，(e)500纳摩尔/升，(f)600纳摩尔/升，(g)800纳摩尔/升，(h)900纳摩尔/升。插图为正相关关系图及拟合方程。
具体实施方式
实施例1二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶N-琥珀酰胺酯)钌的电化学发光适配子传感器的制备：
(1)用参考文献a“表面活性的吡啶钌配合物在单层组装和水-固界面的制备及光化学反应”制备二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)钌(参考文献a：Preparation and Photochemical Reactivity ofSurfactant Ruthenium(II)Complexes in Monolayer Assemblies andat Water-Solid interfaces，Gerhard Sprintschnik，Hertha W.Sprintschnik，Pierre P.Kirsch，and David G.Whitten；JACS，1977，99(15)，4947-4954.)的方法如下：取700毫升新蒸馏的4-甲基吡啶和质量分数为10％的钯碳催化剂加热回流三天，加入250毫升热苯溶液，继续加热回流30分钟，热过滤，滤液浓缩至300毫升，结晶得到粗产品，用乙酸乙酯重结晶，真空干燥，得到40克4，4’-二甲基联吡啶；取16克4，4’-二甲基联吡啶和50克重铬酸钾在560毫升水中加热回流12小时，得到含有褐色沉淀的溶液，过滤除去褐色沉淀，得到黄色滤液，得到的黄色滤液经乙醚萃取，萃取液加入浓盐酸得到白色晶体4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶；取15.6克三氯化钌和18.72克联吡啶于500毫升N，N-二甲基甲酰胺中加热回流3小时，加热除去N，N-二甲基甲酰胺，冷至室温，加入500毫升丙酮，于0度过夜，得到的混合溶液，过滤，水洗，除去丙酮，得固体物质，将固体物质溶解在2500毫升乙醇/水的混合溶剂(体积比为1∶1)中，回流反应1小时，过滤，在滤液中加入300克LiCl，溶液蒸发除去乙醇后冰浴，放置过夜，过滤，真空干燥，得二氯二联吡啶钌；取0.52克二氯二联吡啶钌，0.3克4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶和0.3克碳酸氢钠于15毫升水和10毫升甲醇的混合溶液中加热回流2小时，之后加入六氟磷酸铵得到红色沉淀，冰浴过夜，过滤真空干燥得到二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)钌；
(2)取上述步骤(1)中的二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)钌，用参考文献b“合成赖氨酸的氧化还原衍生物及其赖氨酸相关的含有吩噻嗪或三联吡啶钌的多肽”制备二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌(参考文献b：Synthesis of RedoxDerivatives of Lysine and Related Peptides Containing Phenothiazine orTris(2，2’-bipyridine)ruthenium(II)，Peek，B.M.，Ross，G.T.，Edwards， S.W.，Meyer，G.J.，Meyer，T.J.，Erickson，B.W.，1991.Int.J.Pept.ProteinRes.38，114-123.)的方法如下：0.675克二环己基碳亚二胺，0.263克羟基琥珀酰胺和2克二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)钌置于4.4毫升乙腈中室温搅拌5小时，反应液过滤，滤液加入200毫升异丙醇中在-10度条件下放置1小时，过滤，得到产品二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶N-琥珀酰胺酯)钌；
利用参考文献a制备二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)钌，利用参考文献b制备二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌；电化学和电化学发光性能表征如图1和图2所示。
图1，2中的数据表明，利用参考文献a制备二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)钌，利用参考文献b制备二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌；电化学和电化学发光性能良好。
(3)取上述步骤(2)所述制备的二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌溶于N，N-二甲基甲酰胺中，加入到6微摩尔/升的探针适配子的磷酸盐缓冲溶液中，室温搅拌反应12小时，向反应后的溶液中按浓度为3摩尔/升的氯化钠溶液∶冰乙醇的体积比为1∶25，分别加入浓度为3摩尔/升的氯化钠溶液和冰乙醇，置于-20℃冰箱中冷冻1小时取出，在13000转/分钟的转速下离心15分钟，弃去上层清液，使用体积浓度为70％的冰乙醇洗涤剩余固体，之后溶解于绑定缓冲溶液中，得到二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌标记的探针适配子；
所述的二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶N-琥珀酰胺酯)钌的质量，毫克：N，N-二甲基甲酰胺的体积，微升：6微摩尔/升的探针适配子的磷酸盐缓冲溶液的体积，微升：3摩尔/升的氯化钠溶液的体积，微升：冰乙醇的体积，毫升：体积浓度为70％的冰乙醇体积，毫升：绑定缓冲溶液的体积，微升为2∶60∶2000∶200∶5∶12∶400；所述的磷酸盐缓冲溶液的浓度为10毫摩尔/升，pH为8.5；
所述的绑定缓冲溶液的组成为20毫摩尔/升的Tris-HCl缓冲液，140毫摩尔/升的氯化钠溶液，5毫摩尔/升的氯化钾溶液，1毫摩尔/升的氯化镁溶液；所述的探针适配子的序列为5’NH2-(CH2)6-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT；
(4)将聚二甲基硅氧烷和固化剂乙烯基聚二甲基硅氧烷置于容器中，搅拌，抽气，然后将其倒入平面器皿中，80℃放置两小时，取出后用刀切成长×宽×厚为0.8厘米×0.8厘米的聚二甲基硅氧烷小块，用打孔器在该长×宽×厚为0.8厘米×0.8厘米的聚二甲基硅氧烷小块的中央打出直径为3毫米的圆孔，得到中央圆孔直径为3毫米的聚二甲基硅氧烷层；所述的聚二甲基硅氧烷的质量(克)∶固化剂乙 烯基聚二甲基硅氧烷的质量(克)为10∶1；
(5)铟锡氧化物电极用水和丙酮超声清洗，将清洗干净的铟锡氧化物电极浸泡在体积浓度为10％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的甲醇溶液中，过夜，用甲醇洗净，用氮气吹干，得到修饰有(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的铟锡氧化物电极；
把上述步骤(4)制备长×宽×厚为0.8厘米×0.8厘米的中央圆孔直径为3毫米的聚二甲基硅氧烷层与修饰有(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的铟锡氧化物电极贴合，制得(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷预修饰的铟锡氧化物电极；
(6)用参考文献方法“金溶胶单层的制备与表征”合成13纳米的金纳米粒子溶液(参考文献：Preparation and Characterization gold colloid Monolayers，Grabar，K.C，；Freeman，R.G.；Hommer，M.B，；Natan，M.J.，Preparation andCharacterization ofAu Colloid Monolayers.Anal.Chem.1995，67，(4)，735-743)的方法如下：50毫升38.8毫摩尔/升柠檬酸钠溶液加入沸腾的500mL 1毫摩尔/升氯金酸溶液，加热回流搅拌10min，得到酒红色胶体溶液；除去加热装置，搅拌15min，得到的胶体溶液经0.8微米的Gelman膜滤器过滤，即得粒径为13nm的金纳米；
(7)将上述步骤(6)制备的粒径为13纳米的金纳米粒子溶液与6微摩尔/升巯基化的捕获适配子溶液混合，摇匀，放置于25℃恒温箱中反应72小时，然后在13000转/分钟的转速下离心15分钟，弃去上清液，下层深红色的溶胶再溶于绑定缓冲溶液中，得到修饰捕获适配子金纳米粒子溶液；所述的绑定缓冲溶液的浓度为步骤(3)的绑定缓冲溶液的浓度再稀释10倍；
所述的粒径为13纳米的金纳米粒子溶液：6微摩尔/升巯基化的捕获适配子溶液：稀释10倍的绑定缓冲溶液的体积比为2∶1∶2；
所述的绑定缓冲溶液的组成为2毫摩尔/升的Tris-HCl缓冲液，14毫摩尔/升的氯化钠溶液，0.5毫摩尔/升的氯化钾溶液，0.1毫摩尔/升的氯化镁溶液；所述的捕获适配子的序列为5’SH-(CH2)6-GGTTGGTGTGGTTGG；
(8)往长×宽×厚为0.8厘米×0.8厘米的聚二甲基硅氧烷层的直径为3毫米的中央圆孔中加入修饰捕获适配子的金纳米粒子溶液，用洁净的玻璃盖上，置于25℃的恒温箱中自组装10小时，用二次水冲洗，用氮气吹干，加入待测浓度的凝血酶∶0.03毫克/毫升牛血清蛋白体积比为1∶1的混合溶液，37℃反应30分钟，用二次水及缓冲溶液反复冲洗面积为0.8厘米×0.8厘米的聚二甲基硅氧烷层的直径为3毫米的中央圆孔，用氮气吹干，然后往该直径为3毫米的中央圆孔中加入二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶N-琥珀酰胺酯)钌标记的探 针适配子溶液，于37℃恒温箱中反应30分钟，取出剩余溶液，揭下可逆键合的聚二甲基硅氧烷层，用二次水冲洗铟锡氧化物电极被修饰的部分，并用氮气吹干，得到“三明治”型修饰捕获适配子的金纳米粒子/凝血酶/二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌标记的探针适配子的电化学发光传感器；
所述的修饰捕获适配子的金纳米粒子溶液：待测浓度的凝血酶∶0.03毫克/毫升牛血清蛋白体积比为1∶1的混合溶液：二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌标记的探针适配子溶液的体积比为30∶25∶20；
所述的待测凝血酶的浓度选择为56纳摩尔/升、200纳摩尔/升、300纳摩尔/升、400纳摩尔/升、500纳摩尔/升、600纳摩尔/升、800纳摩尔/升或900纳摩尔/升。
Claims (2)
1.二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌的电化学发光适配子传感器，其特征在于构成如下：该传感器为“三明治”型修饰捕获适配子的金纳米粒子/凝血酶/二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌标记的探针适配子的电化学发光传感器；其中，(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷功能化的铟锡氧化物电极通过强的Au-S键固定修饰捕获适配子的金纳米粒子到电极表面，加入目标分子凝血酶后，它与固定在电极表面的捕获适配子产生很强的特异性相互作用，也结合到电极表面；当进一步遭遇到二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌标记的探针适配子，得到二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌的电化学发光适配子传感器。
2.如权利要求1所述的二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌的电化学发光适配子传感器的制备方法，其特征在于，步骤和条件如下：
(1)制备二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)钌，方法如下：取700毫升新蒸馏的4-甲基吡啶和质量分数为10％的钯碳催化剂加热回流三天，加入250毫升热苯溶液，继续加热回流30分钟，热过滤，滤液浓缩至300毫升，结晶得到粗产品，用乙酸乙酯重结晶，真空干燥，得到40克4，4’-二甲基联吡啶；取16克4，4’-二甲基联吡啶和50克重铬酸钾在560毫升水中加热回流12小时，得到含有褐色沉淀的溶液，过滤除去褐色沉淀，得到黄色滤液，得到的黄色滤液经乙醚萃取，萃取液加入浓盐酸得到白色晶体4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶；取15.6克三氯化钌和18.72克联吡啶于500毫升N，N-二甲基甲酰胺中加热回流3小时，加热除去N，N-二甲基甲酰胺，冷至室温，加入500毫升丙酮，于0度过夜，得到的混合溶液，过滤，水洗，除去丙酮，得固体物质，将固体物质溶解在2500毫升乙醇/水的混合溶剂(体积比为1∶1)中，回流反应1小时，过滤，在滤液中加入300克LiCl，溶液蒸发除去乙醇后冰浴，放置过夜，过滤，真空干燥，得二氯二联吡啶钌；取0.52克二氯二联吡啶钌，0.3克4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶和0.3克碳酸氢钠于15毫升水和10毫升甲醇的混合溶液中加热回流2小时，之后加入六氟磷酸铵得到红色沉淀，冰浴过夜，过滤真空干燥得到二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)钌；
(2)取上述步骤(1)中的二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)钌，制备二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌，方法如下：0.675克二环己基碳亚二胺，0.263克羟基琥珀酰胺和2克二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)钌置于 4.4毫升乙腈中室温搅拌5小时，反应液过滤，滤液加人200毫升异丙醇中在-10度条件下放置1小时，过滤，得到产品二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌；
(3)取上述步骤(2)所述制备的二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌溶于N，N-二甲基甲酰胺中，加入到6微摩尔/升的探针适配子的磷酸盐缓冲溶液中，室温搅拌反应12小时，向反应后的溶液中按浓度为3摩尔/升的氯化钠溶液：冰乙醇的体积比为1∶25，分别加入浓度为3摩尔/升的氯化钠溶液和冰乙醇，置于-20℃冰箱中冷冻1小时取出，在13000转/分钟的转速下离心15分钟，
弃去上层清液，使用体积浓度为70％的冰乙醇洗涤剩余固体，之后溶解于绑定缓冲溶液中，得到二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌标记的探针适配子；
所述的二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌的质量，毫克∶N，N-二甲基甲酰胺的体积，微升∶6微摩尔/升的探针适配子的磷酸盐缓冲溶液的体积，微升∶3摩尔/升的氯化钠溶液的体积，微升∶冰乙醇的体积，毫升∶体积浓度为70％的冰乙醇体积，毫升∶绑定缓冲溶液的体积，微升为2∶60∶2000∶200∶5∶12∶400；所述的磷酸盐缓冲溶液的浓度为10毫摩尔/升，pH为8.5；
所述的绑定缓冲溶液的组成为20毫摩尔/升的Tris-HCl缓冲液，140毫摩尔/升的氯化钠溶液，5毫摩尔/升的氯化钾溶液，1毫摩尔/升的氯化镁溶液；所述的探针适配子的序列为5’NH2-(CH2)6-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT；
(4)将聚二甲基硅氧烷和固化剂乙烯基聚二甲基硅氧烷置于容器中，搅拌，抽气，然后将其倒入平面器皿中，80℃放置两小时，取出后用刀切成长×宽×厚为0.8厘米×0.8厘米的聚二甲基硅氧烷小块，用打孔器在该长×宽×厚为0.8厘米×0.8厘米的聚二甲基硅氧烷小块的中央打出直径为3毫米的圆孔，得到长×宽×厚为0.8厘米×0.8厘米的中央圆孔直径为3毫米的聚二甲基硅氧烷层；所述的聚二甲基硅氧烷的∶固化剂乙烯基聚二甲基硅氧烷的质量比为10∶1；
(5)铟锡氧化物电极用水和丙酮超声清洗，将清洗干净的铟锡氧化物电极浸泡在体积浓度为10％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的甲醇溶液中，过夜，用甲醇洗净，用氮气吹干，得到修饰有(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的铟锡氧化物电极；
把上述步骤(4)制备长×宽×厚为0.8厘米×0.8厘米的中央圆孔直径为3毫米的聚二甲基硅氧烷层与修饰有(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的铟锡氧化物电极贴合，制得(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷预修饰的铟锡氧化物电极；
(6)合成13纳米的金纳米粒子溶液，方法如下：50毫升38.8毫 摩尔/升柠檬酸钠溶液加入沸腾的500mL 1毫摩尔/升氯金酸溶液，加热回流搅拌10min，得到酒红色胶体溶液；除去加热装置，搅拌15min，得到的胶体溶液经0.8微米的Gelman膜滤器过滤，即得粒径为13nm的金纳米；
(7)将上述步骤(6)制备的粒径为13纳米的金纳米粒子溶液与6微摩尔/升巯基化的捕获适配子溶液混合，摇匀，放置于25℃恒温箱中反应72小时，然后在13000转/分钟的转速下离心15分钟，弃去上清液，下层深红色的溶胶再溶于绑定缓冲溶液中，得到修饰捕获适配子金纳米粒子溶液；所述的绑定缓冲溶液的浓度为步骤(3)的绑定缓冲溶液的浓度再稀释10倍；
所述的粒径为13纳米的金纳米粒子溶液：6微摩尔/升巯基化的捕获适配子溶液：稀释10倍的绑定缓冲溶液的体积比为2∶1∶2；
所述的绑定缓冲溶液的组成为2毫摩尔/升的Tris-HCl缓冲液，14毫摩尔/升的氯化钠溶液，0.5毫摩尔/升的氯化钾溶液，0.1毫摩尔/升的氯化镁溶液；所述的捕获适配子的序列为5’SH-(CH2)6-GGTTGGTGTGGTTGG；
(8)往长×宽×厚为0.8厘米×0.8厘米的聚二甲基硅氧烷层的直径为3毫米的中央圆孔中加入修饰捕获适配子的金纳米粒子溶液，用洁净的玻璃盖上，置于25℃的恒温箱中自组装10小时，用二次水冲洗，用氮气吹干，加入待测浓度的凝血酶：0.03毫克/毫升牛血清蛋白体积比为1∶1的混合溶液，37℃反应30分钟，用二次水及缓冲溶液反复冲洗长×宽×厚为0.8厘米×0.8厘米的聚二甲基硅氧烷层的直径为3毫米的中央圆孔，用氮气吹干，然后往该直径为3毫米的中央圆孔中加入二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶N-琥珀酰胺酯)钌标记的探针适配子溶液，于37℃恒温箱中反应30分钟，取出剩余溶液，揭下可逆键合的聚二甲基硅氧烷层，用二次水冲洗铟锡氧化物电极被修饰的部分，并用氮气吹干，得到“三明治”型修饰捕获适配子的金纳米粒子/凝血酶/二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶N-琥珀酰胺酯)钌标记的探针适配子的电化学发光传感器；
所述的修饰捕获适配子的金纳米粒子溶液∶待测浓度的凝血酶∶0.03毫克/毫升牛血清蛋白体积比为1∶1的混合溶液∶二-(2，2’-联吡啶)-(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶-N-琥珀酰胺酯)钌标记的探针适配子溶液的体积比为30∶25∶20；
所述的待测凝血酶的浓度选择为56纳摩尔/升、200纳摩尔/升、300纳摩尔/升、400纳摩尔/升、500纳摩尔/升、600纳摩尔/升、800纳摩尔/升或900纳摩尔/升。
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