CN102021226B - 鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针及其化学发光分析新方法。其一是鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针,该分析探针是由鲁米诺直接键合的纳米金标记的核酸所组成。其中,鲁米诺直接键合的纳米金是由鲁米诺一步还原氯金酸得到的。其二是基于该鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针的化学发光分析方法。其三是实施该分析方法的试剂盒。本发明的基于核酸分析探针的化学发光分析方法具有灵敏度高(如测定特定序列的单链DNA检测限可达1.9×10-16mol/L)、线性范围宽、重现性好、操作简单、成本低廉等优点,可用于各种样品中的DNA、RNA、适配体对应配体的测定。在临床诊断与治疗、药物分析、食品安全检测、环境监测等领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针及利用该分析探针进行化学发光分析的方法。
背景技术
化学发光分析是根椐化学反应中所产生的辐射光强度,确定待测物含量的分析方法。由于其灵敏度高、线性范围宽,且仪器简单、操作方便、分析快速,已经成为金属离子、小分子有机物、氨基酸、蛋白质和核酸等多种物质分析中极为有力的工具。其中利用化学发光分析,以核酸和标记物形成分析探针来对特定物质进行检测的分析方法发展迅速,是近年来化学发光分析方法研究的热点之一(Li,T.;Li,B.L.;Dong,S.J.Anal.Bioanal.Chem.2007,389,887;Wang,X.Y.;Zhou,J.M.;Yun,W.;Fang,Y.Z.Anal.Chim.Acta.2007,598,242;Li,H.G.;He,Z.K.Analyst 2009,134,800;Wang,X.Y.;Yun,W.;Dong,P.;Zhou,J.M.;He,P.G.;Fang,Y.Z.Langmuir 2008,24,2200;Miao,J.R.;Cao,Z.J.;Zhou,Y.;Lau,C.W.;Lu J.Z.Anal.Chem.2008,80,1606)。
核酸探针是一段有特定序列、具有一定长度(15-近千个核苷酸)的、带有合适标记物、对靶分子有特异性识别能力的单链核酸片段,通常以研究和临床诊断与治疗为目的,用来检测特定序列DNA、RNA或适配体对应的配体。核酸探针按其功能不同,分为DNA探针、RNA探针、适配体探针。DNA探针或RNA探针主要是指一段DNA或RNA单链分子,利用DNA或RNA杂交技术对与探针链互补的DNA或RNA进行检测(Zhang,J.;Qi,H.L.;Li,Y.;Yang,J.;Gao,Q.;Zhang,C.X.Anal.Chem.2008,80,2888;Cissell,K.A.;Rahimi,Y.;Shrestha,S.;Hunt,E.A.;Deo,S.K.Anal.Chem.2008,80,2319)。适配体探针是通过指数富集系统进化技术体外筛选得到的能与靶分子高亲和、高特异性结合的核酸分子,是一段短的单链寡核苷酸序列,即单链DNA或RNA分子。适配体与靶分子之间分子识别功能与抗原抗体作用极为相似,其可检测靶分子范围很广,如金属离子、有机物、氨基酸、肽、核酸、蛋白质、细胞等(Jones,L.A.;Clancy,L.E.;Rawlinson,W.D.Antimicrob.Agents.Chemother.2006,50,30)。
由于核酸不具有高灵敏检测的固有物理化学特性,因此许多基于核酸探针的分析需要 标记技术。标记技术的原理是采用具有特殊物理化学性质的标记物与特定序列的核酸片段进行偶联,通过对标记物的测定达到对目标分析物进行测定的目的。由于核酸分析技术主要利用碱基配对或适配体特异性识别形成的核酸双链或适配体复合物的高度稳定性,在此基础上构建夹心方法进行检测,其分析灵敏度取决于所采用的标记物,因此制备由核酸和标记物构成的、特异、灵敏的核酸分析探针是这一技术成功的关键。在基于核酸分析探针的化学发光分析中,常用的标记物有:(1)参与化学发光反应的分子或离子标记物,包括吖啶酯衍生物、联吡啶钌衍生物、异鲁米诺及其衍生物。采用此类标记物一般首先需要用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)对标记物进行活化,即EDC-NHS反应,然后再与分析探针所用的核酸进行缩合反应(Li,Y.;Qi,H.L.;Peng,Y.G.;Zhang,C.X.Electro.Commu.2007,9,2571)。由于缩合反应过程复杂且需对反应后产物进行纯化分离,导致了较高的分析成本。(2)酶类,如DNA酶、碱性磷酸酯酶和过氧化物酶、地高辛等,大都利用酶对特定化学发光反应的催化作用,但由于酶的化学修饰对其反应活性有所影响,因而存在容易失活,分析稳定性不佳的问题。
随着纳米生物技术的发展,纳米标记物已经受到了人们的关注。由于纳米粒子稳定性好、易于制备、表面积大、吸附量高、生物相容性好,是一种很有前途的新兴的标记物。金属纳米粒子如纳米金、纳米银等已经作为标记物被用于核酸分析探针,显示出了较好的效果。2008年,Lu研究小组建立了以纳米金为标记物的特定序列DNA的化学发光分析方法(Fan,A.P.;Lau,C.W.;Lu,J.Z.Analyst 2008,133,219),其原理是以磁性微珠为反应平台,先将捕获探针连接于磁微珠,经杂交反应使目标DNA偶联于捕获探针后,再将标记有纳米金的分析探针DNA结合于目标DNA,再采用“溶出法”,将纳米金氧化溶解为三价金离子Au(III),然后利用Au(III)对鲁米诺化学发光体系的催化或氧化作用进行检测,其检测限为1pmol/L。这种方法的主要缺陷在于溶解氧化纳米金需要十分苛刻的实验条件,如高浓度的HNO3-HCl,或者有毒的HBr-Br2,导致较高的背景化学发光。同样采用溶出法检测的还有Zhang等人(Zhang,S.S.;Zhong,H.;Ding,C.F.;Anal.Chem.2008,80,7206)所报道的用纳米金和CuS纳米粒子分别标记单链DNA的两个端基作为分析探针,该方法是在金片上固载捕获探针后,再与目标DNA和分析探针形成“夹心式”DNA复合物,采用“溶出法”将纳米CuS溶解为Cu(II),用luminol-H2O2-Cu2+体系测定了特定序列的目标DNA。这种方法虽然灵敏度较高,线性范围下限为10-14mol/L,但实验中采用两种纳米粒子对核酸进行标记,需采用双基团修饰的DNA探针,增加了分析成本;两种纳米粒子需分步标记,非常 耗时且步骤复杂;同时“溶出法”实验条件苛刻,需要高浓度强酸,限制了该方法在实际分析中的应用。而Wang等人(Wang,H.;Zhang,C.X.;Li,Y.;Qi,H.L.Anal.Chim.Acta 2006,575,205)应用纳米金胶作为标记有Ru[(bpy)2NHS]的单链DNA探针的载体,对靶单链DNA进行了杂交分析,因为纳米金胶体在一定程度上提高了杂交效率,使得修饰电极的电致化学发光信号得到了放大,最终对靶ssDNA的检测限为5.0×10-12mol/L。此分析方法虽然避免了“溶出法”,但也需采用EDC-NHS反应,且需要对分析探针进行纳米金标记和发光分子标记的双步骤标记,因此存在操作复杂、步骤繁多、需多次进行分离、成本高昂的缺陷。因此,发展新型的高灵敏度、简单、价廉的核酸分析探针具有重要意义。
鲁米诺(luminol),又名发光氨。化学名称为3-氨基邻苯二甲酰肼,化学式为C8H7N3O2。常温下是一种黄色晶体或者米黄色粉末,是一种比较稳定的人工合成的有机化合物。它结构简单、易于合成、水溶性好,是目前应用最广泛的化学发光试剂之一。鲁米诺因其芳香胺基团的惰性而难以进行标记,不适合直接作为核酸分析探针中的标记物。但鲁米诺常作为发光底物,应用于酶标记的化学发光核酸分析中。
最近,文献报道可将鲁米诺通过化学反应键合到纳米金的表面形成鲁米诺功能化的纳米金(Cui,H.;Wang,W.;Duan,C.F.;Dong,Y.P.;Guo,J.Z.Chem.Eur.J.2007,13,6975;Roux,S.;Garcia,B.;Bridot,J.L.;Salom,M.C.Langmuir.2005,21,2526),并发现这些鲁米诺功能化的纳米金具有电致化学发光活性,但其在生物分析中的应用尚未研究。2005年,S.Roux(Roux,S.;Garcia,B.;Bridot,J.L.;Salom,Marquette,C.Langmuir 2005,21,2526)等人用二氢硫辛酸作为保护试剂,硼氢化钠(NaBH4)还原氯金酸(HAuCl4.3H2O)合成了二氢硫辛酸保护的纳米金。利用EDC和NHS活化纳米金表面的二氢硫辛酸的羧基,然后通过鲁米诺的-NH2和二氢硫辛酸的-COOH进行缩合反应将鲁米诺嫁接到纳米金的表面。这个过程需要多步反应、沉淀洗涤、减压蒸馏、过滤、分散等多个步骤才能完成,非常麻烦、耗时。研究结果表明通过二氢硫辛酸键合到纳米金表面的鲁米诺仍具有较好电致化学发光活性。但是其是否能连接到生物分子如核酸分子上,以及连接生物分子后其复合物的化学发光与电致化学发光活性尚未进行研究。用该方法所得到的鲁米诺功能化的纳米金,其表面大部分被二氢硫辛酸分子和鲁米诺分子所覆盖,我们推测通过纳米金表面和鲁米诺分子直接连接核酸分子将是困难的。而通过二氢硫辛酸连接核酸分子的量将是非常有限的。因为大部分二氢硫辛酸活性位点已被鲁米诺和纳米金占据,而且连接后很难保证鲁米诺仍有高的发光活性。2007年,本课题组直接利用鲁米诺还原氯金酸一步合成得到了鲁米诺功能化 的纳米金(Cui,H.;Wang,W.;Duan,C.F.;Dong,Y.P.;Guo,J.Z.Chem.Eur.J.2007,13,6975),表征的结果显示鲁米诺以弱的Au-N键直接连接到纳米金的表面。通过半胱氨酸桥联分子的静电相互作用,将该鲁米诺功能化的纳米金组装到金电极的表面,发现该修饰电极在碱性溶液中具有电致化学发光活性且强度随H2O2浓度的增加而增强,就此发展了一个H2O2电致化学发光传感器。但是测定H2O2的灵敏度较低,其检测限仅为1×10-7mol/LH2O2。此外该传感器的稳定性也不理想,难以用于实际样品的测定。在此项工作中,鲁米诺直接键合的纳米金在生物分析如基于核酸分析探针的化学发光分析中的应用没有进行研究。
发明内容
在本发明中,发明人发现用鲁米诺直接还原氯金酸一步合成的鲁米诺直接键合的纳米金可有效地与端基经修饰的核酸单链分子连接,且其复合物保持了良好的发光活性、稳定性和高度选择性。在此基础上本发明提供了一种鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针及其分析应用。具体内容包括以下几个方面:
第一是提供一种鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针。
本发明所提供的核酸分析探针是由鲁米诺直接键合的纳米金标记核酸分子形成的。
所述核酸分析探针中的鲁米诺直接键合的纳米金是利用鲁米诺还原氯金酸得到的。
所述核酸分析探针中的核酸分子具体可为DNA分子、RNA分子、适配体分子或其他核酸分子。
所述核酸分析探针标记的方法具体可为下述1)或2)的方法:
1)将所述核酸分子端基修饰生物素,然后通过链霉亲和素与所述鲁米诺直接键合的纳米金连接;
2)将所述核酸分子端基修饰巯基,然后与所述鲁米诺直接键合的纳米金连接。
所述核酸分析探针的制备包括如下步骤:
(1)用鲁米诺还原氯金酸合成鲁米诺直接键合的纳米金;
(2)孵育鲁米诺直接键合的纳米金与链霉亲和素,得到连接链霉亲和素的鲁米诺直接键合的纳米金;
(3)孵育连接链霉亲和素的鲁米诺直接键合的纳米金与端基修饰有生物素的核酸分子,得到鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针。
进一步地,所述核酸分析探针为化学发光核酸分析探针,特别是电致化学发光核酸分析探针。
第二是提供一种基于上述任一种鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针的化学发光分析方法,可包括如下步骤:
A、合成上述的鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针;
B、在固相载体上修饰具有连接功能的修饰层,形成修饰层/固相载体;
C、孵育捕获探针与步骤B得到的修饰层/固相载体,使捕获探针连接到修饰层/固相载体上,形成捕获探针/修饰层/固相载体复合物;
D、孵育目标分析物与步骤C所得到的捕获探针/修饰层/固相载体复合物,使捕获探针/修饰层/固相载体与目标分析物结合,形成目标分析物/捕获探针/修饰层/固相载体复合物;
E、孵育步骤A所得到的纳米金核酸分析探针与步骤D所得到的目标分析物/捕获探针/修饰层/固相载体复合物,形成纳米金核酸分析探针/目标分析物/捕获探针/修饰层/固相载体“夹心式”核酸复合物;
F、将步骤E所得到的纳米金核酸分析探针/目标分析物/捕获探针/修饰层/固相载体“夹心式”核酸复合物放入化学发光池中,加入底液,产生化学发光,用发光仪进行检测。
上述化学发光分析方法中,所述的捕获探针可为端基修饰有基团的核酸分子;所述核酸分子为DNA、RNA或适配体分子;所述基团可为生物素或巯基。
上述化学发光分析方法中的所述固相载体可为磁微珠、微孔板、尼龙、玻璃和电极之一。
上述磁微珠可为常规磁微珠或组装有修饰层的磁微珠。其中,所述常规磁微珠可为聚苯乙烯包裹的四氧化三铁的磁性纳米颗粒。上述微孔板可为常规微孔板或组装有修饰层的微孔板。其中,所述常规微孔板可为聚苯乙烯微孔板。上述尼龙可为常规尼龙或组装有修饰层的尼龙。其中,所述常规尼龙可为聚酰胺类的尼龙。上述玻璃可为常规玻璃或组装有修饰层的玻璃。其中,所述常规玻璃可为醛基化玻璃、氨基化玻璃或巯基化的玻璃。所述组装有修饰层的玻璃中的玻璃可为镀有金或银的玻璃。
上述化学发光分析方法中的所述修饰层由下述1)和2)的物质组成:1)具有连接功能的桥连分子或具有连接功能的桥连基团;2)连接有链霉亲和素的纳米金;所述连接有链霉亲和素的纳米金通过所述桥连分子或所述桥连基团连接到所述固相载体上。
上述鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针的化学发光分析方法步骤B中在固相载体上组装具有连接功能的修饰层的方法为下述a)或b):
a).所述固相载体为电极,所述修饰层中的连接有链霉亲和素的纳米金通过所述桥连分子连接到所述电极上;所述电极为金电极时,所述桥连分子为双巯基化合物或同时具有氨基和巯基的化合物,所述双巯基化合物优选为1,3′-丙二硫醇;所述电极为氧化铟锡电极时,所述桥连分子为3-巯丙基-三甲氧基硅烷;
b).所述固相载体为磁微珠或尼龙,所述修饰层中连接有链霉亲和素的纳米金通过所述桥连基团连接到氨基化磁微珠或尼龙上,所述桥连基团为氨基;所述固相载体为微孔板或玻璃时,所述修饰层中的连接有链霉亲和素的纳米金通过所述桥连基团连接到巯基或氨基化的微孔板或玻璃上,所述桥连基团为巯基或氨基。
上述步骤B中的修饰层中的连接有链霉亲和素的纳米金的粒径可为10-38nm,优选为16nm。
进一步地,本发明所述化学发光分析方法为电致化学发光分析方法。此时,所述固相载体为电极。
进一步地,所述电极可为金电极或氧化铟锡电极。
上述基于核酸分析探针的化学发光分析方法为电致化学发光分析方法时,其中,步骤F中所述化学发光池为电致化学发光池,在加入底液和施加电压的条件下,可以使得所述“夹心式”核酸复合物产生化学发光。
所述底液可为含有过氧化氢的碳酸盐缓冲液。
所述施加的工作电压可为脉冲电压、循环伏安或线性伏安。其中,所述脉冲电压可为双阶脉冲电压。
根据现有技术,上述基于核酸探针的电致化学发光分析方法中所述固相载体也可以为连接磁微珠的电极。
上述化学发光分析方法中,所述目标分析物可为DNA、RNA或适配体对应配体。所述目标分析物的样品可为临床样品、药物、水样品、生物样品、空气样品、食品样品或饮料样品之一。
第三是提供实施上述化学发光分析方法的试剂盒,所述试剂盒包括:
a、上述任一种鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针;
b、捕获探针;
c、固相载体;
d、组装在固相载体上的修饰层;
e、底液;
f、洗液。
所述鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针为鲁米诺直接键合的纳米金标记的核酸分子,如DNA、RNA或适配体分子。所述分析探针中的鲁米诺直接键合的纳米金的粒径可为14-25nm,优选为25nm。
所述捕获探针可为修饰有生物素或巯基的核酸分子;所述核酸分子具体可为DNA、RNA或适配体分子。
所述固相载体可为金电极。
所述修饰层为具有连接功能的桥连分子和连接有链霉亲和素的纳米金。该连接有链霉亲和素的纳米金的粒径可为10-38nm,优选为16nm。
所述修饰层通过所述修饰层中的桥连分子组装在所述金电极上;所述桥连分子可为双巯基化合物或同时具有氨基和巯基的化合物;所述双巯基化合物优选为1,3′-丙二硫醇。
所述底液包括能与鲁米诺发生反应的任何试剂、缓冲溶液和任何能增强化学发光的物质。所述底液具体可为含有过氧化氢的碳酸盐缓冲液,其中碳酸盐是由碳酸钠和碳酸氢钠所组成。所述过氧化氢浓度为1mmol/L。所述碳酸钠和碳酸氢钠浓度均为0.02mol/L。所述含有过氧化氢的碳酸盐缓冲液pH可为9-10,如9.8。
所述洗液为含0.17mol/L氯化钠的Tris(三羟甲基氨基甲烷)-HCl缓冲液,其浓度为0.007mol/L,pH可为7.5-8.5,如8.0。该缓冲液是由三羟甲基氨基甲烷、盐酸、氯化钠所组成,其中三羟甲基氨基甲烷浓度为0.85g/L、盐酸浓度为0.26g/L、氯化钠浓度为9.945g/L。
本发明的鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针、分析方法和试剂盒可用于各种样品中的多种分析物的测定,适用于临床分析、药物分析、食品安全检测、环境监测等领域。所述的分析物包括但不限于DNA、RNA、蛋白质、金属离子、有机物、氨基酸、肽、生物毒素、化学毒素或细胞。所述的样品包括但不限于临床样品、药物、水样品、生物样品、空气样品、食品样品或饮料样品。
与现有技术相比,本发明具有如下的优点:
(1)首次将鲁米诺直接键合的纳米金用于核酸分析探针,提出了新一代核酸分析探针技术。
(2)利用鲁米诺还原氯金酸一步合成就能得到鲁米诺直接键合的纳米金,将其作为 发光标记物标记核酸分子的方法简单、快捷、操作简便、结合效果好,克服了现有的以发光试剂和酶为标记物的标记技术操作麻烦、费时、分析成本高等重要缺陷。
(3)由于纳米金具有良好的生物兼容性,利用纳米金作为标记物,可在最大程度上保持核酸分子的生物反应活性。
(4)鲁米诺分子本身并不适合直接作为核酸分析的探针,因为利用其芳香胺基团标记核酸分子后,空间位阻增大,发光效率降低。本发明显示当鲁米诺键合到纳米金表面可以直接标记核酸分子构建核酸分析探针,且其具有优良的标记特性、化学发光活性、稳定性以及高度的选择性。由于鲁米诺价格比常用的化学发光标记试剂4-氨基丁基乙基异鲁米诺(ABEI)、吖啶酯和联吡啶钌等便宜许多,且标记方法简单、易行,因此本发明的鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针具有重要的商业价值。
(5)所采用的核酸探针均为单端基修饰的核酸,且目标分析物不需要标记,避免了核酸的双基团修饰和目标物的标记修饰,一定程度上降低了分析成本。
(6)基于鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针所发明的化学发光分析方法,一方面,由于一个核酸分子结合的纳米金表面连接了多个鲁米诺分子,相当于对鲁米诺分子的富集作用,使标记分析的信号得到大大放大;另一方面,通过纳米金和链霉亲和素-生物素系统的放大作用使得目标分析物的检测限进一步降低。实验证明,测定某随机选择的40碱基数的特定序列DNA的检测限可达到1.9×10-16mol/L,其检测限比现行以纳米金和以发光试剂为标记物、采用“夹心式”化学发光核酸分析低约1-4个数量级,且方法简单、重现性好、成本低廉。
附图说明
图1为本发明化学发光分析方法涉及的通过修饰层连接在固相载体的捕获探针与目标分析物和分析探针形成的“夹心式”核酸复合物示意图;
图2为本发明所提供的基于鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针的电致化学发光分析方法涉及的修饰电极制备过程示意图;
图3为实施例3中裸金电极、1,3′-丙二硫醇修饰的金电极、链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极、目标DNA/捕获探针中的DNA/生物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇和鲁米诺直接键合的纳米金DNA分析探针/目标物DNA/捕获探针中的DNA/生物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极的电致化学发光信号对比;
图中标号含义如下:
a.裸金电极;
b.1,3′-丙二硫醇修饰的金电极;
c.链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极;
d.目标DNA/捕获探针中的DNA/生物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极;
e.实施例2中鲁米诺直接键合的纳米金DNA分析探针/目标DNA/捕获探针中的DNA/生物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极。
图4为实施例3中的电致化学发光DNA分析方法测定实施例2中的目标DNA的工作曲线。图中横坐标标题中的对数是以10为底的对数,即log10。需要指出的是,该序列为随机选择,本发明所述方法测定DNA序列并不局限于此序列。
图5为根据实施例3中的电致化学发光DNA分析方法所得目标DNA、单碱基错配DNA序列、两碱基错配DNA序列、随机序列以及空白的电致化学发光信号对比图。图中标号含义如下:
a.目标DNA;
b.单碱基错配序列;
c.两碱基错配序列;
d.随机序列;
e.空白;
具体实施方式
下面分别阐述鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针和含有鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针的化学发光分析方法、相应试剂盒及其应用。
1.鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针。所述的鲁米诺直接键合的纳米金是用鲁米诺还原氯金酸得到的。所述核酸分析探针是鲁米诺直接键合的纳米金标记的核酸单链,如任一序列的单链DNA、单链RNA(序列、碱基数并无特殊限制)或适配体单链。所述核酸分析探针标记的方法具体可为下述1)或2)的方法:1)将所述核酸分子端基修饰生物素,然后通过链霉亲和素与所述鲁米诺直接键合的纳米金连接;2)将所述核酸分子端基修饰巯基,然后与所述鲁米诺直接键合的纳米金连接。所述核酸分析探针为化学发 光核酸分析探针,如电致化学发光核酸分析探针。
以核酸分析探针标记的方法1)为例,本发明的鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针的制备方法包括以下步骤:
(1)将0.01%(重量)的HAuCl4溶液加热至沸,在冷凝回流并充分搅拌的条件下,加入1.5-2.0mL含有0.01mol/L的鲁米诺和0.01mol/L的氢氧化钠的溶液,保持沸腾并继续搅拌回流反应30分钟,然后除去加热源继续搅拌15分钟以上,得到颗粒直径为14-25nm的纳米金溶液。将合成的纳米金溶液在常温下渗析2天,每8小时换一次超纯水渗析液,即得到鲁米诺直接键合的纳米金。
(2)在步骤(1)渗析过的纳米金溶胶中加入链霉亲和素(北京博奥森生物有限公司),使其终浓度为1μg/mL。混合均匀后在室温下培育30分钟,再把5%(w/w)的牛血清白蛋白加到溶液中不断搅拌5分钟,使其最终浓度为1%。最后在17120*g下离心20分钟,以除去未反应试剂和纳米金表面弱结合的鲁米诺分子,然后将沉淀用含有0.3mol/L的氯化钠的0.05mol/LpH=8.0Tris-HCl缓冲液分散,得到连接链霉亲和素的鲁米诺直接键合的纳米金。
(3)在步骤(2)所得到的连接链霉亲和素的鲁米诺直接键合的纳米金中加入端基经生物素修饰的核酸溶液,在37℃下孵育1小时,在17120*g下离心10分钟,以除去未与纳米金连接的核酸分子,将所得沉淀分散于含有0.3mol/L的氯化钠的0.05mol/L pH=8.0Tris-HCl缓冲液。即得到鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针。
这里所述的连接鲁米诺直接键合的纳米金与核酸分子的方式是以生物素-链霉亲和素的亲和反应将核酸与纳米金结合的方法为例,但并不局限于此,可包括任何能使纳米金与核酸连接的方法,如以下文献所报道的方法:Zhou,X.M.;Xing,D.;Zhu,D.B.;Li,J.Anal.Chem.2009,81,255;Li,B.L.;Wang,Y.L.;Wei,H.;Dong,S.J.Anal.Chem.2009,81,255;Hazarika,P.;Ceyhan,B.;Niemeyer,C.M.Angew.Chem.Int.Ed.2004,43,6469;Li,M.;Mann,S.J.Mater.Chem.2004,14,2260;Steel,A.B.;Herne,T.M.;Tarlov,M.J.Anal.Chem.1998,70,4670;Zhang,J.;Song,S.P.;Wang,L.H.;Pan,D.;Fan C.H.Nature Protocols 2007,2,2888;Fan,A.P.;Lau,C.W.;Lu,J.Z.Analyst 2008,133,219。具体可利用端基巯基化的核酸分子通过巯基与纳米金表面形成Au-S键而将核酸分子自组装在纳米金表面,从而制备鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针
2.本发明的化学发光分析方法包括如下步骤:
A、合成鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针;
B、在固相载体上组装具有连接功能的修饰层,形成修饰层/固相载体;
C、孵育捕获探针与步骤B得到的含修饰层的固相载体,使捕获探针连接到修饰层/固相载体上,形成捕获探针/修饰层/固相载体复合物;
D、孵育目标分析物与步骤C所得到的捕获探针/修饰层/固相载体复合物,使捕获探针/修饰层/固相载体复合物与目标分析物结合,形成目标分析物/捕获探针/修饰层/固相载体复合物;
E、孵育步骤A所得到的纳米金核酸分析探针与步骤D所得到的目标分析物/捕获探针/修饰层/固相载体复合物分析探针,形成如图1所示纳米金核酸分析探针/目标分析物/捕获探针/修饰层/固相载体“夹心式”核酸复合物;
F、将步骤E得到的纳米金核酸分析探针/目标分析物/捕获探针/修饰层/固相载体“夹心式”核酸复合物放入化学发光池中,加入底液,产生化学发光,用发光仪进行检测。
这里所述固相载体包括但不局限于电极材料、磁微珠、微孔板、尼龙、玻璃、聚合物微珠等。这里所述的捕获探针是针对目标分析物的端基修饰有桥连分子的核酸分子。所述捕获探针可通过任何现有方法连接到固相载体上。这些现有方法包括但不限于下面例举的文献报道:Livache,T.;Roget,A.;Dejean,E.Nucleic Acids Res.1994,22,2915;Zhao Y.D.;etal.Talanta 1999,49,751;Liu,G.;Wan,Y.;Fan,C.H J.Am.Chem.Soc.2008,130,6820;Pavlov,V.;Xiao,Y.;Shlyahovsky,B.;Willner,I.J.Am.Chem.Soc.2004,126,11768;Fan,A.P.;Lau,C.W.;Lu,J.Z.Analyst,2008,133,219;Zhu,D.B.;Tang,Y.B.;Xing,D.;Chen,W.R.Anal.Chem.2008,80,3566;Kawde,A.N.;Wang,J.Electroanalysis 2004,16,1;Radice,A.;Sinic,R.A.Autoimunity 2006,39,113;Li,J.L.;Chen,H.M.;Li,M.L.;Hua,D.;Lu,Z.H.;Wang,J.K.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces 2007,55,31;Yang,W.J.;Li,X.B.;Xu,S.Q.Anal.Biochem.2008,376,183。可利用端基巯基或氨基化的核酸分子同固相载体表面的氨基或羧基等形成共价键从而将核酸连接于固相载体表面。或利用生物素与链霉亲和素或中性亲和素的亲和作用,将生物素化的核酸分子连接于表面链霉亲和素或中性亲和素化的固相载体上。
所述固相载体也可组装有修饰层。所述修饰层由下述1)和2)的物质组成:1)具有连接功能的桥连分子或具有连接功能的桥连基团;2)连接有链霉亲和素的纳米金;所述连接有链霉亲和素的纳米金通过所述桥连分子或所述桥连基团连接到所述固相载体上。
上述化学发光分析方法步骤B中在固相载体上组装具有连接功能的修饰层的方法为 下述a)或b):
a).所述固相载体为电极,所述修饰层中的连接有链霉亲和素的纳米金通过所述桥连分子连接到所述电极上;所述电极为金电极时,所述桥连分子为双巯基化合物或同时具有氨基和巯基的化合物,所述双巯基化合物优选为1,3′-丙二硫醇;所述电极为氧化铟锡电极时,桥连分子为3-巯丙基-三甲氧基硅烷,桥连分子可通过文献Fang,L.Y.;Lu,Z.Z;Wei,H.;Wang,E.K.Anal.Chimi.Acta,2008,628,80所述方法连接到氧化铟锡电极上;
b).所述固相载体为磁微珠或尼龙,根据文献Weizmann,Y.;Patolsky,F.;Katz,E.;Willner,I.J.Am.Chem.Soc.2003,125,3452或Nan,C.F.;Zhang,Y.;Zhang,G.M.;Dong,C.;Shuang,S.M.;Choi,M.M-F.Enz.Microb.Technol.2009,44,249所述方法,所述修饰层中连接有链霉亲和素的纳米金通过所述桥连基团连接到氨基化磁微珠或尼龙上,所述桥连基团为氨基;所述固相载体为微孔板或玻璃时,所述修饰层中的连接有链霉亲和素的纳米金通过所述桥连基团连接到巯基或氨基化的微孔板或玻璃上,所述桥连基团为巯基或氨基,所述巯基或氨基化的微孔板或玻璃可直接从商业渠道购买。
上述步骤B中的修饰层中的连接有链霉亲和素的纳米金的粒径可为10-38nm,优选为16nm;所述纳米金为柠檬酸盐保护的纳米金。
所述捕获探针通过任何现有连接核酸与纳米金的方法连接到固相载体上。这些现有方法包括但不局限于下面例举的文献报道:Li,Y.;Qi,H.L.;Yang,J.;Zhang,C.X.Microchim.Acta.2009,164,69;Zhang,Z.Y.;Cheng,Q.;Feng,P.Y.Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,118;Fang,L.Y.;Lüa,Z.Z.;Wei,H.;Wang,E.K.Anal.Chim.Acta 2008,628,80;Zhang,S.S.;Zhong,H.;Ding,C.F.Anal.Chem.2008,80,7206;Wang,L.H.;Pan,D.;Fan C.H.NatureProtocols 2007,2,2888;Fan,A.P.;Lau,C.W.;Lu,J.Z.Analyst 2008,133,219;Yang,W.J.;Li,X.B.;Li,Y.Y.;Zhao,L.F.;He,W.L.;Gao,Y.Q.;Wan,Y.J.;Xia,W.;Xu,S.Q.Anal.Biochem.2008,376,183。可将捕获探针中的核酸分子端基巯基化,通过巯基与纳米金表面形成Au-S键而将核酸分子自组装在纳米金表面,此纳米金可与巯基化的固相载体进行自组装,将捕获探针中的核酸分子连接到纳米金修饰的固相载体上。也可将捕获探针中的核酸分子端基生物素化,通过链霉亲和素与生物素的特异性相互作用将捕获探针中的核酸分子连接于纳米金修饰的固相载体上。即捕获探针可为端基生物素化的核酸分子或端基巯基化的核酸分子。本发明优选端基生物素化的核酸分子为捕获探针,通过链霉亲和素将捕获探针连接于纳米金修饰的固相载体上。
进一步地,本发明所述化学发光分析方法为电致化学发光分析方法。此时,所述固相载体为电极。含有修饰层的电极本发明优选为纳米金修饰的电极,所述纳米金修饰的电极可为纳米金修饰的金电极或纳米金修饰的氧化铟锡电极。本发明优选为纳米金修饰的金电极;纳米金修饰金电极中的纳米金可通过桥连分子连接到金电极上,可选用的桥连分子包括但不限于双巯基化合物、同时具有氨基和巯基的化合物等。
这里所述的纳米金修饰的金电极,其中纳米金为连接有链霉亲和素的纳米金。可以从任何商业渠道购买或用文献方法合成。所述纳米金为柠檬酸盐保护的纳米金,其粒径为10-38nm,本发明优选为16nm。
以优选条件端基修饰生物素的核酸分子为捕获探针,纳米金修饰的金电极为组装有修饰层的固相载体为例,本发明所述的电致化学发光分析方法包括以下步骤:
a、合成上述任一种鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针;
b、在洁净的纯金电极上修饰桥联分子,通过桥联分子的连接作用,将表面连接有链霉亲和素的纳米金组装在金电极上,得到链霉亲和素/纳米金/桥连分子/金电极;
c、孵育捕获探针(端基修饰有生物素的核酸分子)与步骤b得到的链霉亲和素/纳米金/桥连分子/金电极,得到捕获探针中的核酸分子/生物素/链霉亲和素/纳米金/桥连分子/金电极;
d、孵育含有目标分析物的样品与步骤c所得到的捕获探针中的核酸分子/生物素/链霉亲和素/纳米金/桥连分子/金电极,使目标分析物连接到捕获探针上,得到目标分析物/捕获探针中的核酸分子/生物素/链霉亲和素/纳米金/桥连分子/金电极;
e、孵育步骤a所得到的纳米金核酸分析探针与步骤d所得到的目标分析物/捕获探针/生物素/链霉亲和素/纳米金/桥连分子/金电极,得到如图2所示的纳米金核酸分析探针/目标分析物/捕获探针中的核酸分子/生物素/链霉亲和素/纳米金/桥连分子/金电极;
f、将步骤e所得到的纳米金核酸分析探针/目标分析物/捕获探针中的核酸分子/生物素/链霉亲和素/纳米金/桥连分子/金电极放入电致化学发光池中,加入底液,施加电压,产生化学发光,用发光仪进行检测。
所述步骤b中的桥连分子为双巯基化合物,连接有链霉亲和素的纳米金通过双巯基化合物修饰在金电极的表面。所述的双巯基化合物优选为1,3′-丙二硫醇。
所述步骤f中的底液可为含有过氧化氢的碳酸盐缓冲液。
所述步骤f中所施加的工作电压可为脉冲电压、循环伏安或线性伏安。本发明优选为 脉冲电压,所述脉冲电压可为双阶脉冲电压。
下面以金电极为固相载体、纳米金修饰的金电极为组装有修饰层的固相载体、端基修饰有生物素的核酸分子为捕获探针、以电化学方法诱导化学发光为例,具体说明本发明的可用于多种分析物测定的电致化学发光分析方法的步骤。
1)制备鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针
a-1.将0.01%(重量)的HAuCl4溶液加热至沸,在冷凝回流并充分搅拌的条件下,加入1.5-2.0mL含有0.01mol/L的鲁米诺和0.01mol/L的氢氧化钠的溶液,保持沸腾并继续搅拌回流反应30分钟,然后除去加热源继续搅拌15分钟以上,得到颗粒直径为14-25nm的纳米金溶液。将合成的纳米金溶液在常温下渗析2天,每8小时换一次超纯水渗析液,即得到鲁米诺直接键合的纳米金;
b-1.在步骤a-1所得的纳米金溶胶中加入链霉亲和素(北京博奥森生物有限公司),使其终浓度为1μg/mL。混合均匀后在室温下培育30分钟,再把5%(w/w)的牛血清白蛋白加到溶液中不断搅拌5分钟,使其最终浓度为1%。最后在17120*g下离心20分钟,以除去未反应试剂和纳米金表面弱结合的鲁米诺分子,然后将沉淀用含有0.3mol/L的氯化钠的0.05mol/L pH=8.0Tris-HCl缓冲液分散,得到连接链霉亲和素的鲁米诺直接键合的纳米金;
c-1.在步骤b-1中所得的连接链霉亲和素的鲁米诺直接键合的纳米金中加入端基经生物素修饰的核酸溶液,在37℃下孵育1小时,在17120*g下离心10分钟,以除去未与纳米金连接的核酸分子,将所得沉淀分散于250μL含有0.3mol/L的氯化钠的0.05mol/L pH=8.0Tris-HCl缓冲液。即得到鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针;
2)纳米金修饰电极的制备
a-2.将表面打磨为镜面并经超纯水、乙醇超声清洗后的裸金电极放入2mmol/L的1,3′-丙二硫醇中,在常温下浸泡20小时,取出后用乙醇和超纯水清洗,获得1,3′-丙二硫醇修饰的金电极;
b-2.将连接链霉亲和素的纳米金滴在步骤a-2制得的1,3′-丙二硫醇修饰电极上,在4℃暗处中放置4小时,取出后用超纯水清洗,得到链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极;
其中,连接链霉亲和素的纳米金按照如下方法制备:
i).将0.01%(重量)的HAuCl4溶液加热至沸,在冷凝回流并充分搅拌的条件下,加入2.0-5.0mL含有1%(重量)柠檬酸三钠的溶液,保持沸腾并继续搅拌回流反应45分钟, 然后除去加热源继续搅拌30分钟以上,得到颗粒直径为10-38nm的纳米金溶液;
ii).在步骤i)所得的纳米金溶胶中加入链霉亲和素(北京博奥森生物有限公司),使其终浓度为1μg/mL。混合均匀后在室温下培育30分钟,再把5%(w/w)的牛血清白蛋白加到溶液中不断搅拌5分钟,使其最终浓度为1%。最后在17120*g下离心45分钟,以除去未反应试剂,然后将沉淀用含有0.3mol/L的氯化钠的0.05mol/LpH=8.0Tris-HCl缓冲液分散,得到连接链霉亲和素的纳米金。
3)“夹心式”复合物在纳米金修饰电极上的固载
a-3.将捕获探针即端基生物素化的核酸分子溶液滴加步骤2)所得的修饰电极上,在37℃下作用60分钟后,用含0.17mol/L氯化钠的0.007mol/L pH=8.0Tris-HCl缓冲溶液清洗,得到捕获探针中的核酸分子/生物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极;然后将1%(w/w)的牛血清白蛋白滴加在捕获探针中的核酸分子/生物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极,在37℃下作用40分钟,再用含0.17mol/L氯化钠的0.007mol/L pH=8.0Tris-HCl缓冲溶液清洗;
b-3.将目标分析物滴加到步骤a-3得到的捕获探针中的核酸分子/生物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极表面,在37℃下作用60分钟,再用含0.17mol/L氯化钠的0.007mol/L pH=8.0Tris-HCl缓冲溶液清洗,得到连接目标分析物和捕获探针的修饰电极,即目标分析物/捕获探针中的核酸分子/生物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极;
c-3.将步骤1)得到的鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针滴加在步骤b-3得到的目标分析物/捕获探针中的核酸分子/生物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极上,在37℃下作用60分钟后,用含0.17mol/L氯化钠的0.007mol/L pH=8.0Tris-HCl缓冲溶液清洗,得到鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针和待测分析物经杂交或适配体特异性反应结合的修饰电极,即如图2所示的鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针/目标分析物/捕获探针中的核酸分子/生物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极;
4)电致化学发光测定
将3)中所得的修饰电极,即鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针/目标分析物/捕获探针中的核酸分子/生物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极放入电致化学发光池中,加入含有1mmol/L过氧化氢的0.02mol/L pH=9.8的碳酸盐底液,施加脉冲电压0.8V、脉冲周期30s、脉冲时间0.1s、起始电压0V的双阶脉冲电压,产生化学发光, 用发光仪检测电致化学发光信号。
所述步骤3)中所述目标分析物为某一特定序列DNA、RNA或适配体分子对应配体。
所述步骤1)和3)中所述鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针中的核酸分子,以及所述步骤3)中所述捕获探针中的核酸分子均可为DNA、RNA或适配体分子。当目标分析物为DNA或RNA时,所述核酸分析探针中所述的DNA或RNA的序列与目标DNA或RNA的一部分序列互补,所述捕获探针中所述的DNA或RNA的序列与目标DNA或RNA的另一部分序列互补。当目标分析物为适配体分子对应配体时,所述核酸分析探针和所述捕获探针中的所述适配体分子均与适配体分子对应配体具有特异性相互作用。
3.本发明还涉及2所述方法对应的试剂盒。所述试剂盒包括:
A、上述任一种鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针;
B、捕获探针;
C、固相载体;
D、组装在固相载体上的修饰层;
E、底液;
F、洗液。
所述鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针可为鲁米诺直接键合的纳米金标记的DNA、RNA或适配体分子。所述核酸分析探针中的纳米金粒径可为14-25nm,优选为25nm。
所述捕获探针可为修饰有生物素或巯基的核酸分子。所述核酸分子可为DNA、RNA或适配体分子。
所述固相载体可为金电极。所述组装有修饰层的固相载体可为纳米金修饰的金电极。所述纳米金修饰的金电极是通过1,3′-丙二硫醇将纳米金组装在金电极表面。所述纳米金可为连接有链霉亲和素的纳米金。所述纳米金的粒径可为10-38nm,优选为16nm。
所述底液包括能与鲁米诺发生反应的任何试剂缓冲溶液和任何能增强化学发光的物质。所述底液具体可为含有过氧化氢的碳酸盐缓冲液,其中碳酸盐是由碳酸钠和碳酸氢钠所组成。所述过氧化氢浓度为1mmol/L。所述碳酸钠和碳酸氢钠浓度均为0.02mol/L。
所述洗液为含0.17mol/L氯化钠的pH=8.0Tris-HCl缓冲液缓冲液,浓度为0.007mol/L,该缓冲液是由三羟甲基氨基甲烷、盐酸、氯化钠所组成,其中三羟甲基氨基甲烷浓度为0.85g/L、盐酸浓度为0.26g/L、氯化钠浓度为9.945g/L。
本发明的分析方法和试剂盒可用于各种样品中多种分析物的测定,适用于临床分析、 药物分析、食品安全检测、环境监测等领域。
所述的分析物包括但不限于DNA、RNA、蛋白质、金属离子、有机物、氨基酸、肽、生物毒素、化学毒素、细胞等。
所述的样品包括但不限于临床样品、药物、水样品、生物样品、空气样品、食品样品、饮料样品等。
下面实施例1~3以金电极为固相载体、连接链霉亲和素的纳米金修饰的金电极为含有修饰层的固相载体、连接生物素的DNA分子为捕获探针、某一特定序列DNA为分析物、电致化学发光为检测手段为例,阐明本发明的鲁米诺直接键合的纳米金DNA分析探针和电致化学发光分析方法的检测效果。
实施例4以RNA分子为捕获探针中的核酸分子和目标分析物为例,阐述本发明的鲁米诺直接键合的纳米金RNA分析探针和化学发光分析方法的具体实施过程。
实施例5以适配体分子为捕获探针中的核酸分子、适配体对应配体为目标分析物为例,阐述本发明的鲁米诺直接键合的纳米金适配体分析探针和化学发光分析方法的具体实施过程。
实施例1.本发明的鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针的制备
(1)将100mL 0.01%(w/w)的HAuCl4溶液加热至沸,在冷凝回流并充分搅拌的条件下,快速加入1.5mL含有0.01mol/L鲁米诺和0.01mol/L氢氧化钠的溶液,保持沸腾并继续搅拌回流反应30分钟,然后除去加热源继续搅拌15分钟以上,得到颗粒直径为25nm纳米金溶液,冷却到室温。将合成的纳米金溶液在常温下渗析2天,每8小时换一次超纯水渗析液,通过渗析操作可以充分去除游离的鲁米诺及其氧化产物,这样在纳米金中的鲁米诺分子只以和纳米金表面键合的形式存在,即得到鲁米诺直接键合的纳米金;
(2)在1mL步骤(1)中渗析过的金溶胶中加入25μL浓度为1mg/ml的链霉亲和素,混合均匀后在室温下培育30分钟,再把5%(w/w)的牛血清白蛋白加到溶液中不断搅拌5分钟,使其最终浓度为1%。最后在17120*g下离心20分钟,以除去未反应试剂和纳米金表面弱结合的鲁米诺分子,然后将沉淀用200μL含有0.3mol/L的氯化钠的0.05mol/L pH=8.0Tris-HCl缓冲液分散,得到连接链霉亲和素的鲁米诺直接键合的纳米金;
(3)在步骤(2)所得的连接链霉亲和素的鲁米诺直接键合的纳米金中加入23μL浓度为4×10-7mol/L端基经生物素修饰的DNA(如表1)溶液,所述DNA为实施例2的目 标DNA(如表1所示)的部分互补序列,在37℃下孵育1小时,在17120*g下离心10分钟,以除去未与纳米金连接的DNA分子,将所得沉淀分散于250μL含有0.3mol/L的氯化钠的0.05mol/L pH=8.0Tris-HCl缓冲液,即得到鲁米诺直接键合的纳米金DNA分析探针。
实施例2.“夹心式”核酸复合物在纳米金修饰电极上的固载
如图2所示,本发明的化学发光方法涉及的“夹心式”核酸复合物在纳米金修饰电极上的固载包括以下步骤:
(1)纳米金修饰电极的制备
a.将表面打磨为镜面并经超纯水、乙醇超声清洗后的裸金电极放入2mmol/L的1,3′-丙二硫醇中,在常温下浸泡20小时,取出后用乙醇和超纯水清洗,获得1,3′-丙二硫醇修饰的金电极;
b.将50μL连接链霉亲和素的纳米金滴在步骤a制得的1,3′-丙二硫醇修饰电极上,在4℃暗处中放置4小时,取出后用超纯水清洗,得到链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极;
其中,连接链霉亲和素的纳米金按照如下方法制备:
i)将100mL0.01%(重量)的HAuCl4溶液加热至沸,在冷凝回流并充分搅拌的条件下,加入3.8mL含有1%(重量)柠檬酸三钠的溶液,保持沸腾并继续搅拌回流反应45分钟,然后除去加热源继续搅拌30分钟以上,得到颗粒直径为16nm的纳米金溶液;
ii).在1mL步骤i)所得的纳米金溶胶中加入25μL浓度为1mg/mL链霉亲和素(北京博奥森生物有限公司)。混合均匀后在室温下培育30分钟,再把5%(w/w)的牛血清白蛋白加到溶液中不断搅拌5分钟,使其最终浓度为1%。最后在17120*g下离心45分钟,以除去未反应试剂,然后将沉淀用200μL含有0.3mol/L的氯化钠的0.05mol/L pH=8.0Tris-HCl缓冲液分散,得到连接链霉亲和素的纳米金。
(2)“夹心式”核酸复合物在纳米金修饰电极上的固载
a.将50μL 4×10-6mol/L捕获探针即端基生物素化的DNA分子(如表1所示)滴加步骤(1)所得的修饰电极上,捕获探针中的DNA为目标DNA(如表1所示)的另一部分互补序列,在37℃下作用60分钟后,用含0.17mol/L氯化钠的0.007mol/L pH=8.0Tris-HCl缓冲溶液清洗,得到捕获探针中的DNA/生物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极;然后将50μl 1%(w/w)的牛血清白蛋白滴加在捕获探针中的DNA/生 物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极,在37℃下作用40分钟,再用含0.17mol/L氯化钠的0.007mol/L pH=8.0Tris-HCl缓冲溶液清洗;
b.将60μL目标DNA(如表1所示)滴加到步骤a得到的捕获探针中的DNA/生物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极表面,在37℃下作用60分钟,再用含0.17mol/L氯化钠的0.007mol/LpH=8.0Tris-HCl缓冲溶液清洗,得到连接目标DNA和捕获探针的修饰电极,即目标DNA/捕获探针中的DNA/生物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极;
c.将60μL实施例1制备的鲁米诺直接键合的纳米金DNA分析探针,滴加在步骤b得到的目标DNA/捕获探针中的DNA/生物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极上,在37℃下作用60分钟后,用含0.17mol/L氯化钠的0.007mol/L pH=8.0Tris-HCl缓冲溶液清洗,得到鲁米诺直接键合的纳米金DNA分析探针和待测分析物经杂交反应结合的修饰电极,即鲁米诺直接键合的纳米金DNA分析探针/目标DNA/捕获探针中的DNA/生物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极。
实施例3.电致化学发光测定DNA
将实施例2中得到鲁米诺直接键合的纳米金DNA分析探针/目标DNA/捕获探针中的DNA/生物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极放入电致化学发光池中,加入含有1mmol/L过氧化氢的0.02mol/L pH=9.8的碳酸盐底液(碳酸钠和碳酸氢钠浓度均为0.02mol/L),施加脉冲电压为0.8V、脉冲周期为30s、脉冲时间为0.1s、起始电压为0V的双阶脉冲电压,产生化学发光,用发光仪检测电致化学发光信号。图3分别为在裸金电极、1,3′-丙二硫醇修饰的金电极、链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极、目标DNA/捕获探针中的DNA/生物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极、鲁米诺直接键合的纳米金DNA分析探针/目标DNA/捕获探针中的DNA/生物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极上施加双阶脉冲电压得到的化学发光随时间变化的曲线,其中目标DNA的浓度为1×10-12mol/L。实验结果表明只有含有鲁米诺直接键合的纳米金DNA分析探针的修饰电极上才会产生电致化学发光信号,而裸金电极、1,3′-丙二硫醇修饰的金电极、链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极、目标DNA/捕获探针中的DNA/生物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极无信号产生。
用本发明的电致化学发光分析方法测定实施例2中的目标DNA(如表1所示)的工作曲线如图4所示,所述方法测定该单链DNA的线性范围是3.1×10-15-3.1×10-11mol/L, 检测限为1.9×10-16mol/L。图4中的数据为9次测量信号的平均值±标准差。
本发明电致化学发光分析方法测定特定序列目标DNA的特异性实验结果如图5所示,图中所示DNA的浓度条件均为1×10-12mol/L,其它条件均相同,可见相同浓度下,单碱基错配序列(如表1所示)、两碱基错配序列(如表1所示)、随机序列(如表1所示)的信号响应均远远低于目标DNA响应信号,说明该方法测定DNA具有良好的特异性。其中e所示信号为空白信号,即噪音信号。图4中的数据为9次测量信号的平均值±标准差。
表1实施例1-3中所采用DNA的序列
序列名称 | 碱基序列(5`-3`) |
实施例1分析探针中端基 生物素化的DNA | GGGTTTATGAAAAACACTTT-biotin |
实施例2捕获探针 | biotin-AAAAAAAAAAGACCTAGTCCTTCCAACAGC |
实施例2目标DNA | AAAGTGTTTTTCATAAACCCGCTGTTGGAAGGACTAGGTC |
实施例3单碱基错配DNA | AAAGTGTTTTTCATAAACCCTCTGTTGGAAGGACTAGGTC |
实施例3两碱基错配DNA | AAAGTGTTTTTCATAAACCATCTGTTGGAAGGACTAGGTC |
实施例3随机序列 | AAAGTGTTTTTCATAAACCCACTGCTAGAGATTTTCACTA |
实施例4.基于RNA分析探针的化学发光分析方法测定RNA
本发明的基于鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针的化学发光分析方法也可用于测定RNA。所述方法原理和步骤与实施例1-3中所述测定DNA方法类似,不同之处在于,测定RNA时所采用捕获探针中的核酸分子、目标分析物均为RNA分子,分析探针为鲁米诺直接键合的纳米金RNA分析探针。
RNA分析探针与鲁米诺直接键合的纳米金的连接可通过但不局限于以下文献所报道的方法来实现:Giljohann,D.A.;Seferos,D.S.;Prigodich,A.E.;Patel,P.C.;Mirkin,C.A.J.Am.Chem.Soc.2009,131,2072;Li,H.X,;Liang,R.T.;Turner,D.H.;Rothberg,L.J.;Duan,S.H.RNA 2007,13,2034;Yang,W.J.;Li,X.B.;Li,Y.Y.;Zhao,L.F.;He,W.L.;Gao,Y.Q.;Wan,Ya.J.;Xia,W.;Xu,S.Q.Anal.Biochem.2008,376,183;Zhao,W.A.;Lam,J.C.F.;Chiuman,W.;Brook,M.A.;Li Y.F.Small 2008,4,810。例如通过实施例1中所述的方法制备鲁米诺直接键合的纳米金RNA分析探针,即通过端基生物素化的RNA分子与结合有链霉亲和素的鲁 米诺直接键合的纳米金作用而形成鲁米诺直接键合的纳米金RNA分析探针。或通过文献Yang,W.J.;Li,X.B.;Li,Y.Y.;Zhao,L.F.;He,W.L.;Gao,Y.Q.;Wan,Ya.J.;Xia,W.;Xu,S.Q.Anal.Biochem.2008,376,183所述纳米金与端基巯基化RNA分子连接的方法,通过巯基与纳米金表面形成Au-S键而将RNA分子连接在纳米金表面;同样鲁米诺直接键合的纳米金也可与RNA分子端基上的巯基作用形成共价键,从而制备鲁米诺直接键合的纳米金RNA分析探针。
类似于实施例1-3,以纳米金修饰的金电极为含有修饰层的固相载体。通过实施例2中步骤(1)所述方法制备链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极,再将端基生物素化的捕获探针通过生物素-链霉亲和素相互作用连接到修饰电极表面,得到捕获探针中的RNA/生物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极。最后将此修饰电极进一步与目标分析物RNA和鲁米诺直接键合的纳米金RNA分析探针结合形成“夹心式”复合物,得到鲁米诺直接键合的纳米金RNA分析探针/目标RNA/捕获探针中的RNA/生物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极,用电致化学发光进行检测。
捕获探针也可以通过任何现有其它方法将RNA连接到电极上。这些现有方法包括但不局限于以下列举的文献报道:Kralj,J.G.;Player,A.;Sedrick,H.;Munson,M.S.;Petersen,D.;Forry,S.P.;Meltzer,P.;Kawasaki,E.;Locascio,L.E.Lab Chip,2009,9,917;Yang,W.J.;Li,X.B.;Li,Y.Y.;Zhao,L.F.;Xu,S.Q.Anal.Biochem.2008,376,183;Cissell,K.A.;Rahimi,Y.;Shrestha,S.;Hunt,E.A.;Deo,S.K.Anal.Chem.2008,80,2319;Ferapontova,E.E.;Olsen,E.M.;Gothelf,K.V.J.Am.Chem.Soc.2008,130,4256。例如以文献Ferapontova,E.E.;Olsen,E.M.;Gothelf,K.V.J.Am.Chem.Soc.2008,130,4256所述方法,通过端基巯基化的捕获探针与金电极表面形成自组装单分子层从而将捕获探针固载。再通过杂交反应连接目标RNA和鲁米诺直接键合的纳米金RNA分析探针,形成“夹心式”RNA复合物,再用电致化学发光进行检测。
实施例5.基于适配体分析探针的化学发光分析方法测定适配体对应配体
本发明的基于鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针的化学发光分析方法也可以适配体分子探针作为核酸分析探针,用于测定适配体对应配体。所述配体可为凝血酶、血小板源生长因子、蛋白质二聚体等,此类配体结构中含有两个能与适配体特异性结合的位点,因此能通过适配体与配体特异性作用形成“夹心式”适配体-配体复合物,文献报道如下:Fang,L.Y.;Lüa,Z.Z.;Wei,H.;Wang,E.K.Anal.Chim.Acta.2008,628,80;Higuchi,A.;Siao, Y.D.;Yang,S.T.;Hsieh,P.V.;Fukushima,H.;Chang,Y.;Ruaan,R.C.;Chen,W.Y.Anal.Chem.2008,80,6580;Pavlov,V.;Xiao,Y.;Shlyahovsky,Be.;Willner,I.J.Am Chem.Soc.2004,126,11768;Li,Y.Y.;Zhang,C.;Li,B.S.;Zhao,L.F.;Li,X.B.;Yang,W.J.;Xu,S.Q.;Clin.Chem.2007,53,1061。所述测定配体方法的步骤与实施例1-3中所述测定DNA方法类似,不同之处在于所采用捕获探针中的核酸分子为适配体DNA或RNA分子,目标分析物为适配体对应配体,分析探针为鲁米诺直接键合的纳米金适配体分析探针。
分析探针中的适配体核酸分子与鲁米诺直接键合的纳米金的连接可以通过但不限于以下文献报道的方法来实现:Zhou,X.M.;Xing,D.;Zhu,D.B.;Li,J.Anal.Chem.2009,81,255;Li,L.;Wang,Y.L.;Wei,H.;Dong,S.J.Anal.Chem.2009,81,255;Hazarika,P.;Ceyhan,B.;Niemeyer,C.M.Angew.Chem.Int.Ed.2004,43,6469;Li,M.;Mann,S.J.Mater.Chem.2004,14,2260;Steel,A.B.;Herne,T.M.;Tarlov,M.J.Anal.Chem.1998,70,4670;Zhang,J.;Song,S.P.;Wang,L.H.;Pan,D.;Fan C.H Nature Protocols 2007,2,2888;Fan,A.P.;Lau,C.W.;Lu,J.Z.Analyst 2008,133,219。例如通过实施例1中所述的方法制备鲁米诺直接键合的纳米金适配体分析探针,即通过端基生物素化的适配体分子与结合有链霉亲和素的鲁米诺直接键合的纳米金作用而形成鲁米诺直接键合的纳米金适配体分析探针。或通过文献Li,L.;Wang,Y.L.;Wei,H.;Dong,S.J.Anal.Chem.2009,81,255所述纳米金与端基巯基化适配体分子连接的方法,通过巯基与纳米金表面形成Au-S键而将适配体分子连接在纳米金表面;同样鲁米诺直接键合的纳米金也可与适配体分子端基上的巯基作用形成共价键,从而制备鲁米诺直接键合的纳米金适配体分析探针。
类似于实施例1-3,以纳米金修饰的金电极为含有修饰层的固相载体。通过实施例2中步骤(1)所述方法制备链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极,再将端基生物素化的捕获探针通过生物素-链霉亲和素相互作用连接到修饰电极表面,得到捕获探针适配体/生物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极。最后将此修饰电极进一步与目标分析物和鲁米诺直接键合的纳米金适配体分析探针结合形成“夹心式”复合物,得到鲁米诺直接键合的纳米金适配体分析探针/目标配体/捕获探针适配体/生物素/链霉亲和素/纳米金/1,3′-丙二硫醇修饰的金电极,用电致化学发光进行检测。
捕获探针也可以通过任何现有其它方法将适配体分子连接到电极上。这些现有方法包括但不局限于以下列举的文献报道:Livache,T.;Roget,A.;Dejean,E.Nucleic Acids Res.1994,22,2915;Zhao,Y.D.;Pang,D.W.;Hu,S.;Wang,Z.L.;Cheng,J.K;Dai,H.P.Talanta 1999,49,751;Liu,G.;Wan,Y.;Fan,C.H J.Am.Chem.Soc.2008,130,6820;Pavlov,V.;Xiao,Y.;Shlyahovsky,B.;Willner;I.J.Am.Chem.Soc.2004,126,11768;Fan,A.P.;Lau,C.W.;Lu,J.Z. Analyst,2008,133,219;Zhu,D.B.;Tang,Y.B.;Xing,D.;Chen,W.R.Anal.Chem.2008,80,3566,Kawde,A.N.;Wang,J.Electroanalysis 2004,16,1;Radice,A.;Sinic,R.A.Autoimunity2006,39,113。例如通过端基巯基化的捕获探针与金电极表面形成自组装单分子层从而将捕获探针固载。结合了捕获探针的金电极可与配体、鲁米诺直接键合的纳米金适配体分析探针形成“夹心式”适配体-配体复合物,用电致化学发光进行测定。
实施例6.以微孔板为固相载体的化学发光分析方法
本发明的化学发光分析方法也可以微孔板为固相载体,常见的微孔板主要为聚苯乙烯材料。捕获探针可以通过任何现有的连接核酸与微孔板的方法结合到微孔板上。这些方法包括但不限于下面列举的文献报道:Shimada,J.;Maruyama,T.;Hosogi,T.;Tominaga,J.;Kamiya,N.;Goto,M.Biotechnol.Lett.2008,30,2001;Lee,A.C.;Dai,Z.Y.;Chen,B.W.;Wu,H.;Wang,J.;Zhang,A.G.;Zhang,L.R.;Lim,T.M.;Lin,Y.H.Anal.Chem.2008,80,9402;Gao,H.W.;Zhong,J.H.;Qin,P.;Lin,C.;Sun,W.;Jiao,K.Microchim.Acta.2009,165,173;Doleman,L.;Davies,L.;Rowe,L.;Moschou,E.A.;Deo,S.;Daunert,S.Anal.Chem.2007,79,4149。例如,端基生物素化的核酸分子即捕获探针可以连接到表面链霉亲和素或中性亲和素化的微孔板上,连接了捕获探针的微孔板进一步与目标分析物和核酸分析探针结合形成“夹心式”核酸复合物,用化学发光进行检测。
也可以用纳米金修饰的微孔板为含有修饰层的固相载体。在表面巯基或氨基化的微孔板上通过纳米金和巯基或氨基的共价作用将纳米金结合到微孔板上。纳米金与捕获探针的结合可以通过任何现有连接核酸与纳米金的方法进行连接:Li,Y.;Qi,H.L.;Yang,J.;Zhang,C.X.Microchim.Acta 2009,164,69;Zhang,Z.Y.;Cheng,Q.;Feng,P.Y.;Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,118;Fang,L.Y.;Lüa,Z.Z.;Wei,H.;Wang,E.K.Anal.Chim.Acta.2008,628,80;Zhang,S.S.;Zhong,H.;Ding,C.F.Anal.Chem.2008,80,7206;Wang,L.H.;Pan,D.;FanC.H.Nature Protocols 2007,2,2888;Fan,A.P.;Lau,C.W.;Lu,J.Z.Analyst 2008,133,219;Yang,W.J.;Li,X.B.;Li,Y.Y.;Zhao,L.F.;He,W.L.;Gao,Y.Q.;Wan,Y.J.;Xia,W.;Xu,S.Q.Anal.Biochem.2008,376,183。例如通过链霉亲和素和生物素的作用,将端基生物素化的核酸分子即捕获探针连接于表面包裹了链霉亲和素的纳米金修饰的微孔板,进一步与目标分析物和核酸分析探针形成“夹心式”复合物,用化学发光进行测定。或通过巯基与Au作用形成Au-S键将端基巯基化的核酸分子即捕获探针连接到纳米金上,形成捕获探针连接的纳米金,此纳米金通过纳米金和氨基的弱共价作用连接到表面氨基化的微孔板上,进一 步与目标分析物和核酸分析探针形成“夹心式”复合物,用化学发光进行测定。
实施例7.以磁微珠为固相载体的化学发光分析方法
本发明的化学发光分析方法也可以磁微珠为固相载体,常规的磁微珠主要为聚苯乙烯包裹的四氧化三铁的磁纳米颗粒。捕获探针可以通过任何现有连接核酸与磁微珠的方法连接到磁微珠上。这些现有方法包括但不限于以下列举的文献报道:Wang;J.;Xi,D.;Kawde,A.N.;Polsky,R.Anal.Chem.2001,73,5576;Weizmann,Y.;Patolsky,F.;Katz,E.;Willner,I.J.Am.Chem.Soc.2003,125,3452;Miao,J.;Cao,Z.J.;Zhou,Y.;Lau,C.W.;Lu,J.Z.Anal.Chem.2008,80,1606;Kawde,A.;Li,H.G.;He Z.K.Analyst 2009,134,800;Zhu,D.B.;Tang,Y.B.;Xing,D.;Chen;W.R.Anal.Chem.2008,80,3566。例如,可以通过巯基与氨基的反应将端基巯基化的核酸分子即捕获探针连接于氨基修饰的磁性微球表面,或通过链霉亲和素和生物素作用将生物素化核酸分子即捕获探针结合到链霉亲和素化的磁微珠表面。结合有捕获探针的磁微珠再进一步与目标分析物和核酸分析探针结合形成“夹心式”核酸复合物,用化学发光进行检测。
也可以用纳米金修饰的磁微珠为含有修饰层的固相载体。首先可在在磁微珠表面修饰氨基(Weizmann,Y.;Patolsky,F.;Katz,E.;Willner,I.J.Am.Chem.Soc.2003,125,3452),通过氨基可以和纳米金形成弱的共价键方式,将纳米金结合到磁微珠表面。纳米金与捕获探针的结合可以通过任何现有连接核酸与纳米金的方法进行连接:Li,Y.;Qi,H.L.;Yang,J.;Zhang,C.X.Microchim.Acta 2009,164,69;Zhang,Z.Y.;Cheng,Q.;Feng,P.Y.;Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,118;Fang,L.Y.;Lüa,Z.Z.;Wei,H.;Wang,E.K.Anal.Chim.Acta.2008,628,80;Zhang,S.S.;Zhong,H.;Ding,C.F.Anal.Chem.2008,80,7206;Wang,L.H.;Pan,D.;Fan C.H.Nature Protocols 2007,2,2888;Fan,A.P.;Lau,C.W.;Lu,J.Z.Analyst 2008,133,219;Yang,W.J.;Li,X.B.;Li,Y.Y.;Zhao,L.F.;He,W.L.;Gao,Y.Q.;Wan,Y.J.;Xia,W.;Xu,S.Q.Anal.Biochem.2008,376,183。例如通过链霉亲和素和生物素的作用,将端基生物素化的核酸分子即捕获探针连接于表面包裹了链霉亲和素的纳米金修饰的磁微珠,进一步与目标分析物和核酸分析探针形成“夹心式”复合物,用化学发光进行测定。或通过巯基与Au作用形成Au-S键将端基巯基化的核酸分子即捕获探针连接到纳米金上,形成捕获探针连接的纳米金,此纳米金通过纳米金和氨基的弱共价作用连接到表面氨基化的磁微珠上,进一步与目标分析物和核酸分析探针形成“夹心式”复合物,用化学发光进行测定。
实施例8.以玻璃为固相载体的化学发光核酸分析方法
本发明的化学发光分析方法也可以玻璃为固相载体,常规的玻璃以在玻璃表面醛基化、氨基化和巯基化的基片为主。捕获探针可以通过任何现有连接核酸与玻璃的方法结合到玻璃上。这些现有方法包括但不限于下面例举的文献报道:Ho,D.;Falter,K.;Severin,P.;Gaub,H.E.Anal.Chem.2009,81,3159;Kurita,H.;Yasuda,H.;Takashima,K.;Katsura,S.;Mizuno,A.J.Magnet.Magnet.Mater.2009,321,655;Go,J.;Wa,C.;Isaksson,M.;Howell,W.M.;Nilsson,J.J.M.Nucleic Acids Res.2009,37,2;Kamisetty,N.K.;Pack,S.P.;Nonogawa,M,;Yamada,K.;Yoshida,Y.;Kodaki,T.;Makino,K.J.Biotech.2009,140,242;Hansen,R.R.;Johnson,L.M.;Bowman,C.N.Anal.Biochem.2008,386,285。例如,在玻璃表面通过有机硅烷引入氨基或羧基等,再通过EDC反应将端基羧基化或氨基化的核酸分子即捕获探针连接于玻璃表面,结合有捕获探针的玻璃再进一步与目标分析物和核酸分析探针结合形成“夹心式”核酸复合物,用化学发光进行检测。
也可以用纳米金修饰的玻璃为含有修饰层的固相载体。在表面巯基或氨基化的玻璃基上通过纳米金和巯基或氨基的共价作用将纳米金结合到玻璃上。也可在镀有金膜的玻璃表面修饰一层双巯基化合物(Wang,Z.P.;Hu,J.Q.;Jin,Y.;Yao,X.;Li,J.H.Clin.Chem.2006,52,1958),通过巯基可以和纳米金形成共价键方式,将纳米金结合到玻璃表面。纳米金与捕获探针可通过任何现有连接核酸与纳米金的方法进行连接:Li,Y.;Qi,H.L.;Yang,J.;Zhang,C.X.Microchim.Acta 2009,164,69;Zhang,Z.Y.;Cheng,Q.;Feng,P.Y.;Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,11;Fang,L.Y.;Lüa,Z.Z.;Wei,H.;Wang,E.K.Anal.Chim.Acta.2008,628,80;Zhang,S.S.;Zhong,H.;Ding,C.F.Anal.Chem.2008,80,7206;Wang,L.H.;Pan,D.;Fan C.H.Nature Protocols 2007,2,2888;Fan,A.P.;Lau,C.W.;Lu,J.Z.Analyst 2008,133,219;Yang,W.J.;Li,X.B.;Li,Y.Y.;Zhao,L.F.;He,W.L.;Gao,Y.Q.;Wan,Ya.J.;Xia,W.;Xu,S.Q.Anal.Biochem.2008,376,183。例如通过链霉亲和素和生物素的作用,将端基生物素化的核酸分子即捕获探针连接于表面包裹了链霉亲和素的纳米金,进一步与目标分析物和核酸分析探针形成“夹心式”复合物,用化学发光进行测定。或通过巯基与Au作用形成Au-S键将端基巯基化的核酸分子即捕获探针连接到纳米金上,形成捕获探针连接的纳米金,此纳米金通过纳米金和巯基的共价作用连接到表面巯基化的镀金玻璃上,进一步与目标分析物和核酸分析探针形成“夹心式”复合物,用化学发光进行测定。
实施例9.以尼龙为固相载体的化学发光分析方法;
本发明的化学发光分析方法也可以尼龙为固相载体,常规的尼龙主要为聚酰胺类的尼龙。捕获探针可以通过任何现有连接核酸与尼龙的方法结合到尼龙上。这些现有方法包括但不限于下面例举的文献报道:Zhou,D.R.;Qiao,W.Q.;Yang,L.G.;Lu,Z.H.Anal.Biochem.2006,351,26;Kim,S.;Lim,G.S.;Lee,S.E.;Lee,J.G.;Yun,K.;Park,J.K.Biomol.Engin.2006,23,129;.Wang,Y.;Zheng,W.L.;Luo,J.F.;Zhang,D.D.;Lu,Z.H.Anal.Biochem.2006,359,183;Liu,Y.;Wang,R.S.;Ding,L.;Sha,R.J.;Lukeman,P.S.;Canary,J.W.;Seeman,N.C.Chem.Bio.Chem.2008,9,1641。例如带正电荷的尼龙膜具有高强度、不易破损、DNA结合容量较大的特点,它能够吸附变性DNA,核酸分子以共价结合方式不可逆的结合在尼龙膜上,从而可将捕获探针连接到尼龙膜上。结合有捕获探针的尼龙再进一步与目标分析物和核酸分析探针结合形成“夹心式”核酸复合物,用化学发光进行检测。
也可以用纳米金修饰的尼龙为含有修饰层的固相载体。首先如文献所述使尼龙氨基功能化(Nan,C.F.;Zhang,Y.;Zhang,G.M.;Dong,C.;Shuang,S.M.;Choi,M.M-F.Enz.Microb.Technol.2009,44,249),以氨基和纳米金形成弱的共价键的方式,将纳米金结合到尼龙表面。纳米金与捕获探针的结合可以通过任何现有连接核酸与纳米金的方法进行连接:Li,Y.;Qi,H.L.;Yang,J.;Zhang,C.X.Microchim.Acta 2009,164,69;Zhang,Z.Y.;Cheng,Q.;Feng,P.Y.Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,118;Fang,L.Y.;Lüa,Z.Z.;Wei,H.;Wang,E.K.Anal.Chim.Acta 2008,628,80;Zhang,S.S.;Zhong,H.;Ding,C.F.Anal.Chem.2008,80,7206;Wang,L.H.;Pan,D.;Fan C.H.Nature Protocols 2007,2,2888;Fan,A.P.;Lau,C.W.;Lu,J.Z.Analyst 2008,133,219;Yang,W.J.;Li,X.B.;Li,Y.Y.;Zhao,L.F.;He,W.L.;Gao,Y.Q.;Wan,Ya.J.;Xia,W.;Xu,S.Q.Anal.Biochem.2008,376,183。例如通过链霉亲和素和生物素的作用,将端基生物素化的核酸分子即捕获探针连接于表面包裹了链霉亲和素的纳米金修饰的尼龙,进一步与目标分析物和核酸分析探针形成“夹心式”复合物,用化学发光进行测定。或通过巯基与Au作用形成Au-S键将端基巯基化的核酸分子即捕获探针连接到纳米金上,形成捕获探针连接的纳米金,此纳米金通过纳米金和氨基的弱共价作用连接到表面氨基化的尼龙上,进一步与目标分析物和核酸分析探针形成“夹心式”复合物,用化学发光进行测定。
本发明专利并不局限于上述的具体实施方式,此种原理可用于多种分析物的测定。任何基于鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针的化学发光分析方法均属于本发明的保护范围,比如改变目标分析物、捕获探针、核酸分析探针连接方式、更换纳米金粒径和形状、改变电极材料、将固相支持物变换为磁珠或微孔板等均属于对本专利实质相同的变通或替换。
序列表
<110>中国科学技术大学
<120>鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针及其应用
<130>CGGNAR92529
<140>200910092053.X
<141>2009-09-11
<160>5
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Claims (32)
1.一种基于核酸分析探针的化学发光分析方法,包括如下步骤:
A、合成核酸分析探针;所述核酸分析探针,是由鲁米诺直接键合的纳米金标记核酸分子形成的,其中所述鲁米诺直接键合的纳米金作为标记物;
B、在固相载体上组装具有连接功能的修饰层,形成修饰层/固相载体;
C、孵育捕获探针与步骤B得到的修饰层/固相载体,使捕获探针连接到修饰层/固相载体上,形成捕获探针/修饰层/固相载体复合物;
D、孵育目标分析物与步骤C所得到的捕获探针/修饰层/固相载体复合物,使捕获探针/修饰层/固相载体复合物与目标分析物结合,形成目标分析物/捕获探针/修饰层/固相载体复合物;
E、孵育步骤D所得到的目标分析物/捕获探针/修饰层/固相载体复合物与步骤A所得到的核酸分析探针,形成核酸分析探针/目标分析物/捕获探针/修饰层/固相载体夹心式核酸复合物;
F、将步骤E所得到的核酸分析探针/目标分析物/捕获探针/修饰层/固相载体夹心式核酸复合物放入化学发光池中,加入底液,产生化学发光,用发光仪进行检测;
所述目标分析物来自药物、水样品、生物样品、空气样品、食品样品和饮料样品之一;
所述基于核酸分析探针的化学发光分析方法为非疾病诊断和治疗方法;
所述的捕获探针为端基修饰有基团的核酸分子;所述基团为生物素或巯基;
所述核酸分子为DNA或RNA;
所述修饰层由下述1)和2)的物质组成:1)具有连接功能的桥连分子或具有连接功能的桥连基团;2)连接有链霉亲和素的纳米金;所述连接有链霉亲和素的纳米金通过所述桥连分子或所述桥连基团连接到所述固相载体上;
所述鲁米诺直接键合的纳米金是利用鲁米诺还原氯金酸得到的;
所述标记的方法为下述1)或2)的方法:
1)将所述核酸分子端基修饰生物素,然后通过链霉亲和素与所述鲁米诺直接键合的纳米金连接;
2)将所述核酸分子端基修饰巯基,然后与所述鲁米诺直接键合的纳米金连接;
所述核酸分析探针为化学发光核酸分析探针。
2.根据权利要求1所述的化学发光分析方法,其特征在于,所述固相载体为电极、磁微珠、微孔板、尼龙或玻璃。
3.根据权利要求1或2所述的化学发光分析方法,其特征在于,所述步骤B中在固相载体上组装具有连接功能的修饰层的方法为下述a)或b):
a).所述固相载体为电极,所述修饰层中的连接有链霉亲和素的纳米金通过所述桥连分子连接到所述电极上;所述电极为金电极时,所述桥连分子为双巯基化合物或同时具有氨基和巯基的化合物;所述电极为氧化铟锡电极时,所述桥连分子为3-巯丙基-三甲氧基硅烷;
b).所述固相载体为磁微珠或尼龙,所述修饰层中连接有链霉亲和素的纳米金通过所述桥连基团连接到氨基化磁微珠或尼龙上,所述桥连基团为氨基;所述固相载体为微孔板或玻璃时,所述修饰层中的连接有链霉亲和素的纳米金通过所述桥连基团连接到巯基或氨基化的微孔板或玻璃上,所述桥连基团为巯基或氨基。
4.根据权利要求3所述的化学发光分析方法,其特征在于,所述双巯基化合物为1,3′-丙二硫醇。
5.如权利要求1或2所述的化学发光分析方法,其特征在于,所述修饰层中的连接有链霉亲和素的纳米金的粒径为10-38nm。
6.如权利要求5所述的化学发光分析方法,其特征在于,所述修饰层中的连接有链霉亲和素的纳米金的粒径为16nm。
7.如权利要求1或2所述的化学发光分析方法,其特征在于,所述的化学发光分析方法为电致化学发光分析方法。
8.如权利要求7所述的化学发光分析方法,其特征在于,所述固相载体为电极;所述电极为金电极或氧化铟锡电极。
9.根据权利要求1或2所述的化学发光分析方法,其中,步骤F所述化学发光池为电致化学发光池,在加入底液和施加电压的条件下,使得所述夹心式核酸复合物产生化学发光。
10.根据权利要求9所述的化学发光分析方法,其特征在于,所述步骤F中的底液为含有过氧化氢的碳酸盐缓冲液。
11.根据权利要求10所述的化学发光分析方法,其特征在于,所述步骤F中施加电压为脉冲电压、循环伏安或线性伏安。
12.根据权利要求11所述的化学发光分析方法,其中所述脉冲电压为双阶脉冲电压。
13.根据权利要求1或2所述的化学发光分析方法,其特征在于,所述目标分析物为DNA、RNA、蛋白质、金属离子、氨基酸、肽、生物毒素、化学毒素或细胞。
14.根据权利要求1或2所述的化学发光分析方法,其特征在于,所述核酸分析探针的制备包括以下步骤:
(1)用鲁米诺还原氯金酸合成鲁米诺直接键合的纳米金;
(2)孵育鲁米诺直接键合的纳米金与链霉亲和素,得到连接链霉亲和素的鲁米诺直接键合的纳米金;
(3)孵育连接链霉亲和素的鲁米诺直接键合的纳米金与端基修饰有生物素的核酸分子,得到鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针。
15.根据权利要求1或2所述的化学发光分析方法,其特征在于,所述化学发光核酸分析探针为电致化学发光核酸分析探针。
16.一种实施权利要求1-15任一所述的化学发光分析方法的试剂盒,包括:
a、核酸分析探针;所述核酸分析探针,是由鲁米诺直接键合的纳米金标记核酸分子形成的,其中所述鲁米诺直接键合的纳米金作为标记物;
b、捕获探针;
c、固相载体;
d、组装在固相载体上的修饰层;
e、底液;
f、洗液;
所述捕获探针为端基修饰生物素的核酸分子;
所述核酸分子为DNA或RNA;
所述修饰层为具有连接功能的桥连分子和连接有链霉亲和素的纳米金;
所述鲁米诺直接键合的纳米金是利用鲁米诺还原氯金酸得到的;
所述标记的方法为下述1)或2)的方法:
1)将所述核酸分子端基修饰生物素,然后通过链霉亲和素与所述鲁米诺直接键合的纳米金连接;
2)将所述核酸分子端基修饰巯基,然后与所述鲁米诺直接键合的纳米金连接;
所述核酸分析探针为化学发光核酸分析探针。
17.如权利要求16所述的试剂盒,其特征在于,所述核酸分析探针中所述的鲁米诺直接键合的纳米金的粒径为14-25nm。
18.如权利要求17所述的试剂盒,其特征在于,所述核酸分析探针中所述的鲁米诺直接键合的纳米金的粒径为25nm。
19.如权利要求16所述的试剂盒,其特征在于,所述固相载体为金电极。
20.如权利要求16所述的试剂盒,其特征在于,所述修饰层通过所述修饰层中的桥连分子组装在所述金电极上;所述桥连分子为双巯基化合物或同时具有氨基和巯基的化合物。
21.如权利要求20所述的试剂盒,其特征在于,所述双巯基化合物为1,3′-丙二硫醇。
22.如权利要求16所述的试剂盒,其特征在于,所述连接有链霉亲和素的纳米金的粒径为10-38nm。
23.如权利要求22所述的试剂盒,其特征在于,所述连接有链霉亲和素的纳米金的粒径为16nm。
24.如权利要求16或17所述的试剂盒,其特征在于,所述底液为含有过氧化氢的碳酸盐缓冲液;其中碳酸盐是由碳酸钠和碳酸氢钠所组成。
25.如权利要求24所述的试剂盒,其特征在于,所述过氧化氢浓度为1mmol/L。
26.如权利要求24所述的试剂盒,其特征在于,所述碳酸钠和碳酸氢钠浓度均为0.02mol/L,所述含有过氧化氢的碳酸盐缓冲液的pH为9-10。
27.如权利要求24所述的试剂盒,其特征在于,所述含有过氧化氢的碳酸盐缓冲液的pH为9.8。
28.如权利要求16所述的试剂盒,其特征在于,所述洗液为含有氯化钠的Tris-HCl缓冲液,该缓冲液是由三羟甲基氨基甲烷、盐酸和氯化钠所组成。
29.如权利要求28所述的试剂盒,其特征在于,所述含氯化钠的Tris-HCl缓冲液的浓度为0.007mol/L,pH为7.5-8.5,其中三羟甲基氨基甲烷浓度为0.85g/L、盐酸浓度为0.26g/L、氯化钠浓度为9.945g/L。
30.如权利要求29所述的试剂盒,其特征在于,所述pH为8.0。
31.如权利要求16所述的试剂盒,其特征在于,所述核酸分析探针的制备包括以下步骤:
(1)用鲁米诺还原氯金酸合成鲁米诺直接键合的纳米金;
(2)孵育鲁米诺直接键合的纳米金与链霉亲和素,得到连接链霉亲和素的鲁米诺直接键合的纳米金;
(3)孵育连接链霉亲和素的鲁米诺直接键合的纳米金与端基修饰有生物素的核酸分子,得到鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针。
32.如权利要求16所述的试剂盒,其特征在于,所述化学发光核酸分析探针为电致化学发光核酸分析探针。
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