CN113416534B - 一种用于抗原检测的复合材料和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种化学发光复合材料，该复合材料包含：氨基官能化磁珠；第一金属颗粒；第二金属阳离子；以及式(I)所示的发光体及任选的其氧化衍生物；该化学发光复合材料可以用于制造试剂盒，对包括SARS‑CoV‑2抗原在内的多种抗原进行方便、快捷、灵敏而准确的检测；本发明还提供了该化学发光复合材料的制备方法和包含该化学发光复合材料的试剂盒。

Description

一种用于抗原检测的复合材料和试剂盒
技术领域
本发明涉及化学发光检测领域，具体来说，本发明提供了复合材料、该复合材料的合成方法、包含该复合材料的试剂盒以及该试剂盒中用来对各种抗原进行灵敏而快速的检测的用途。
背景技术
新冠病毒2019(COVID-19)是一种高传染性严重急性呼吸道综合征，其由SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)所引起，能够以人传人的方式传播，在过去一年多时间里，COVID-19已经造成了全世界范围内的大流行。直到目前为止，在全世界范围内的大部分国家，疫情尚无缓解的迹象。更为严峻的是在诸如英国、南非、印度、澳大利亚等地分别出现了具有更高传染性、重症和致死率以及复制能力的变异毒株，导致疫情向着越来越严重的方向发展。COVID-19的症状主要是急性呼吸窘迫综合征，并导致呼吸道感染，导致不同程度的多器官衰竭，最严重的情况下甚至导致患者死亡。COVID-19的潜伏期为1至14天，其感染者本身具有很强的传染性，并且还有相当大比例的感染者为无症状感染者，这些无症状感染者很可能在完全不知情的情况下带来严重的病毒扩散。因此人们迫切需要开发一种快速、准确且灵敏的检测技术来尽可能快速地识别被感染者，这对于防止感染的广泛传播以及为患者争取治疗时间都是有非常重要的意义的。
目前已有的SARS-CoV-2检测技术包括核酸检测、抗体检测和抗原检测，这些已有的检测技术各有其优缺点。首先，核酸检测具有灵敏度高、选择性强的优点，在全球范围内，人们广泛地采用基于核酸的实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析进行SARS-CoV-2检测，但是核酸检测无法克服的缺陷在于测试技术复杂且成本较高,耗时较长，其RNA提取、逆转录、基因扩增和数据分析步骤至少需要2小时，并且需要由专业技术人员在生物安全实验室中进行操作，最严重的一个缺陷在于,在感染晚期由于拭子样本采集不当和上呼吸道病毒剂量低，核酸检测的假阴性率约为30％-40％，这对于感染者筛查和疫情防控是极为不利的。为了克服核酸检测的上述缺陷，人们开发了许多基于抗体检测的简单而低成本的免疫检测技术。但是抗体检测最大的问题在于，人体只有在接触病毒7至15天之后才会产生抗体，因此抗体病毒并不能用于COVID-19的早期筛查和诊断。
与上述两种检测技术相比，抗原检测具有测试准确、对设备和人员要求低的优点，并且能够非常有效地用于感染人员的早期筛查和诊断。SARS-CoV-2的结构蛋白包括刺突(S)蛋白、核衣壳(N)蛋白、包膜(E)蛋白和膜(M)蛋白，其中S蛋白存在于病毒颗粒表面，与COVID-19的感染能力和发病机制密切相关，而N蛋白不仅在SARS-CoV-2的RNA合成和翻译步骤中起主要作用，而且在血清中具有高浓度，在感染仅一天后便可检测得到。此外还发现N蛋白与S蛋白相比，前者的受体结合域(RBD)具有更高的免疫原性，用作靶蛋白时具有更高的灵敏度。因此，根据迄今为止的研究报告，人们所开发的COVID-19抗原检测技术中都不约而同地选择采用N蛋白作为早期检测的靶蛋白。但是这些N蛋白检测方法多是基于标记技术(如分子标记和纳米材料标记)的免疫分析，这些基于标记技术的免疫检测存在步骤复杂、成本高、耗时费力、成本高等问题，无法满足快速临床诊断的要求。
近年来，基于抗原和抗体特异性结合引起的信号变化对目标物进行定量分析的无标记检测方法引起了广泛关注。与标记方法相比，无标记免疫分析具有速度快、成本低、步骤简单等优点。而在众多检测技术中，化学发光法具有灵敏度高、线性范围宽、成本低、操作简单等优点。化学发光官能化材料常被用作无标记免疫分析的传感界面，以实现高灵敏度检测。其中，化学发光官能化磁性材料由于具有良好磁性和发光特性备受关注，一方面，大比表面积和丰富官能团可以连接大量信号分子和抗体，实现目标传感；另一方面，免疫复合物可以在免疫反应后直接分离以去除样品基质中的干扰物。然而，长久以来一直严重困扰研究人员的问题在于，材料表面难以直接连接抗体，在使用此类材料对抗原进行化学发光分析之前通常需要非常复杂的修饰步骤。因此，人们迫切希望开发一种抗体容易连接的无标记型化学发光抗原分析技术。
为此，本申请的发明人开展了大量的研究工作，研发出了一种全新的复合材料，通过对该复合材料的组成进行精细设计，使其能够非常简便且可靠地与多种抗原蛋白——例如SARS-CoV-2的N-蛋白——相结合，并表现出极佳的特异性化学发光性能，由此可以实现本领域迫切需求而一直无法实现的化学发光检测技术，此种技术无需标记，并且对抗原蛋白的检测具有高灵敏性、高选择性、高稳定性、快捷方便等优点，满足目前严峻的新冠疫情对新型检测技术的需求。
发明内容
根据本发明的第一个方面，提供了一种化学发光复合材料，该复合材料包含：
(i)氨基官能化磁珠；
(ii)第一金属颗粒，所述第一金属以0价状态存在且选自以下元素：金、银、铂、钌、铑、钯、锇、铱、或其任意组合；
(iii)第二金属阳离子，所述第二金属选自以下元素：铬、钼、锰、锌、钴、镍、铁、钛、钒、铜、或其任意组合；
(iv)式(I)所示的发光体及任选的其氧化衍生物，
Figure GDA0004047038080000031
其中，A环表示C6-C14芳环；
R1和R2独立地表示氢、端基被氨基取代或为未取代的直链或支链(C1-C30)烷基，前提是该NR1R2具有至少一个NH2端基；
所述式(I)所示的发光体的氧化衍生物表示式(I)所示的发光体被氧化后得到的化合物。优选地，所述氧化衍生物表示式(I)中的
Figure GDA0004047038080000032
基团被氧化形成两个羧基、或者两个羧酸酯基、或者二羧酯基之后得到的化合物。
本发明的第二方面提供了一种试剂盒，该试剂盒用来通过化学发光检测抗原，所述抗原包括：新型冠状病毒N蛋白、新型冠状病毒S1、新型冠状病毒RBD、心肌肌钙蛋白、和肽素、心脏型脂肪酸结合蛋白、α-甲胎蛋白、前列腺癌标志物、肝癌标志物、结/直肠癌标志物、胰腺癌标志物、胃癌标志物、食道癌标志物、肺癌标志物、乳腺癌标志物、卵巢癌标志物、子宫癌标志物、甲亢标志物、肝炎标志物、贫血标志物、糖代谢标志物、骨代谢标志物，所述试剂盒包含以上第一方面所述的化学发光复合材料。
本发明的第三方面提供了本发明的化学发光复合材料在制备试剂盒中的用途，所示试剂盒用来通过化学发光检测抗原。优选地，所述化学发光复合材料除了包含所述的组分(i)-(iv)、一种抗体蛋白和任选的功能蛋白以外，不含其他的组分，优选不含其他的标记组分。特别优选地，所述化学发光复合材料中仅含一种抗体蛋白，而不是同时包含两种抗体蛋白。
本发明的第四方面提供了一种制备本发明的化学发光复合材料的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将氨基官能化磁珠、第一金属颗粒的离子型前体与式(I)所示的发光体混合，使得所述第一金属颗粒的离子型前体被还原而生成0价的第一金属颗粒，式(I)所示的发光体的一部分被氧化而生成式(I)所示发光体的氧化衍生物，并且所述第一金属颗粒与所述磁珠和/或发光体及任选的其氧化衍生物结合；
(b)添加所述第二金属阳离子，使其与所述磁珠和/或发光体及任选的其氧化衍生物结合；
(c)任选地，连接抗原蛋白；以及
(d)任选地，连接功能蛋白。
附图说明
在接下来的段落中结合附图对本发明的各种实施方式进行论述。但是此处需要指出的是，附图中所示和以下具体描述的实施方式仅仅是本发明的一些优选实施方式，本发明的保护范围由权利要求书来限定，而非仅限于这些优选的实施方式。
图1显示了根据本发明一个实施方式合成化学发光复合材料的过程。
图2A-J显示根据本发明一个实施方式合成的化学发光复合材料的TEM表征结果。
图3A-3C显示了根据本发明一个实施方式合成的化学发光复合材料MAA的XPS表征结果。
图4A-4D显示了根据本发明一个实施方式合成的化学发光复合材料MAA/Co2+的XPS表征结果。
图5显示了根据本发明一个实施方式合成的化学发光复合材料中Co2+离子浓度对化学发光强度的影响。
图6A显示了根据本发明一个实施方式合成的化学发光复合材料构建的传感器每一步修饰后的化学发光性能。
图6B显示了根据本发明一个实施方式合成的化学发光复合材料构建的传感器每一步修饰后的ζ电势。
图7A-7D显示了根据本发明一些实施方式，具有不同金纳米颗粒覆盖率的磁珠的TEM图。
图8显示了根据本发明一些实施方式，具有不同金纳米颗粒覆盖率的磁珠的化学发光性能。
图9A-9C显示了根据本发明一些实施方式，不同工艺参数与化学发光性能的关系。
图10显示了根据本发明一个实施方式，N蛋白浓度对数值与化学发光信号强度的关系图。
图11显示了根据本发明一个实施方式，针对不同干扰蛋白的化学发光强度图。
图12显示了根据本发明一个实施方式，本发明的技术方案实现的化学发光强度随时间推移的变化图。
图13显示了根据本发明一个实施方式，利用本发明的技术方案表征的健康人员血清和康复后患者血清的化学发光强度图。
具体实施方式
本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60-120和80-110的范围，理解为60-110和80-120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1-3、1-4、1-5、2-3、2-4和2-5。
在本发明中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。
在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。
在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有步骤可以顺序进行，也可以随机进行，但是优选是顺序进行的。例如，所述方法包括步骤(a)和(b)，表示所述方法可包括顺序进行的步骤(a)和(b)，也可以包括顺序进行的步骤(b)和(a)。例如，所述提到所述方法还可包括步骤(c)，表示步骤(c)可以任意顺序加入到所述方法，例如，所述方法可以包括步骤(a)、(b)和(c)，也可包括步骤(a)、(c)和(b)，也可以包括步骤(c)、(a)和(b)等。
在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的“包括”表示开放式，也可以是封闭式。例如，所述“包括”可以表示还可以包含没有列出的其他组分，也可以仅包括列出的组分。
根据本发明的一个优选实施方式，本发明记载的化学发光复合材料包含以下组分：
(i)氨基官能化磁珠；
(ii)第一金属颗粒，所述第一金属以0价状态存在且选自以下元素：金、银、铂、钌、铑、钯、锇、铱、或其任意组合；
(iii)第二金属阳离子，所述第二金属选自以下元素：铬、钼、锰、锌、钴、镍、铁、钛、钒、铜、或其任意组合；
(iv)式(I)所示的发光体及任选的其氧化衍生物，
Figure GDA0004047038080000071
其中，A环表示C6-C14芳环；
R1和R2独立地表示氢、端基被氨基取代或为未取代的直链或支链(C1-C30)烷基，前提是该NR1R2具有至少一个NH2端基。
根据本发明的一个实施方式，所述氨基官能化磁珠表示在表面上连接有氨基(NH2-)的磁性材料的珠粒。根据本发明的一个优选的实施方式，所述磁珠包含具有磁性的材料，例如Fe3O4、Co2O3、CoFe2O4、Ni2O3以及它们当中两种或更多种的混合物。
根据本发明的另一个优选的实施方式，所述磁珠包含上述磁性材料以及一种或多种包覆材料，所述包覆材料选自氧化硅、羟基氧化硅、硅酸盐、陶瓷材料、氧化铝、氮化铝、以及上述两种或更多种的组合。所述包覆材料至少部分地包覆所述磁性材料，优选完全包覆所述磁性材料。根据本发明的一个实施方式，所述磁珠中磁性材料与包覆材料的重量比为2:98至98:2，或者为5:95，或者为10:90，或者为20:80，或者为30:70，或者为40:60，或者为50:50，或者为60:40，或者为70:30，或者为80:20，或者为90:10。
根据本发明的另一个优选实施方式，在所述磁珠的表面具有氨基基团，所述氨基基团可以通过用氨基化试剂(例如氨水与烷基化试剂)对磁珠表面保护材料进行官能化而引入。根据使用的氨基化试剂种类的区别，连接在磁珠表面的氨基基团可以为各种不同的形式，例如连接在磁珠表面的氨基基团可以是-NH2的形式，也可以是-R0-NH2的形式，其中R0可以是C1-C12亚烷基或者进一步含有亚氨基或氨基的取代型亚烷基，例如R0可以是亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基或-CHNH-C2H4NH-C2H4-。根据本发明的一个优选的实施方式，所述磁珠表面连接的氨基的密度可以为0.01-50μmol/mg(磁珠重量)，例如可以为0.1-40μmol/mg，或者为0.15-30μmol/mg，或者为0.2-25μmol/mg，或者为0.4-20μmol/mg，或者为0.5-10μmol/mg，或者为0.8-8μmol/mg，或者为0.9-6μmol/mg，或者为1-5μmol/mg，或者为2-4μmol/mg。
根据本发明的一个优选的实施方式，所述磁珠具有光滑的外表面，还具有球形或基本呈球形的形状。根据本发明的另一个实施方式，所述磁珠的粒径为纳米级或微米级，例如为5纳米至50微米，或者为10纳米至20微米，或者为20纳米至10微米，或者为40纳米至5微米，或者为50纳米至1微米，或者为60纳米至800纳米，或者为70纳米至500纳米，或者为100纳米至300纳米，或者在以上任意两个端值相互组合得到的数值范围之内。
根据本发明一个非限制性的实施方式，所述磁珠可以通过以下方式合成：将纳米级磁性材料颗粒(例如四氧化三铁颗粒)分散在包覆材料前体(例如原硅酸四乙酯)中，通过凝胶溶胶过程获得由包覆材料包覆的磁性材料颗粒，也即尚未用氨基官能化的磁珠；然后用氨基化试剂(例如氨水和烷基化试剂的混合物)对其进行氨基官能化，得到可用于本发明的氨基官能化磁珠。上述磁珠的制备工艺是本领域已知的，并且已经商业化。在本发明的一些实施方式中，使用购自Biomag Technology Co.,Ltd.公司的氨基官能化磁珠。在本申请的全文中，用缩写MB表示未氨基官能化的“磁珠”，用MB-NH2表示氨基官能化的磁珠。
根据本发明的一个实施方式，所述第一金属颗粒中的第一金属以0价状态存在且选自以下元素：金、银、铂、钌、铑、钯、锇、铱、或其任意组合。优选所述第一金属颗粒是金颗粒，或Au颗粒。根据一个优选的实施方式，所述第一金属颗粒的粒径为2-100纳米，例如为3-90纳米，或者为4-60纳米，或者为5-50纳米，或者为6-20纳米，或者为6-10纳米，或者为7-8nm。
根据本发明的另一个实施方式，所述式(I)的化合物也被称为发光体，
Figure GDA0004047038080000081
其中，A环表示C6-C14芳环，所述芳环包括苯环、萘环、蒽环等；
R1和R2独立地表示氢、端基被氨基取代或为未取代的直链或支链(C1-C30)烷基，前提是该NR1R2具有至少一个NH2端基。
根据本发明的一个优选的实施方式，在所述式(I)的化合物中，所述A环表示C6-C10芳环，优选苯环、萘环或蒽环，所述R1和R2独立地表示氢、端基被氨基取代或为未取代的直链或支链(C1-C10)烷基，优选端基被氨基取代或为未取代的直链或支链(C1-C6)烷基，前提是该-NR1R2部分具有至少一个NH2端基。
根据本发明的一个更优选的实施方式，在所述通式(I)的化合物中，A环是苯环或萘环，且-NR1R2部分是氨基或N-(氨基C1-C6亚烷基)N-(C1-C6烷基)氨基；更优选A环是苯环，且-NR1R2部分是氨基、N-(4-氨基丁基)N-(乙基)氨基或(N-4-氨基己基)(N-乙基)氨基。
根据本发明的一个特别优选的实施方式，特别优选式(I)的化合物具有以下所示的结构：
Figure GDA0004047038080000091
根据本发明的一个实施方式，所述第一金属颗粒可以使用第一金属的可溶性前体(例如HAuCl4)在存在氨基官能化的磁珠和式(I)所示的发光体的条件下被还原，由此原位形成所述第一金属颗粒，并且使得形成的第一金属颗粒与MB-NH2相连接。
根据本发明的一个实施方式，用来使得第一金属的可溶性前体还原的材料可以是本领域常规的还原剂，也可以是式(I)所示的发光体本身。当用于制备第一金属的还原剂另外提供的情况下，作为原料加入的式(I)的发光体基本没有或者完全没有参与上述通过还原反应制备第一金属颗粒的过程，因此本发明的化学发光复合材料中不包含式(I)所示发光体的氧化衍生物，所有的发光体均保持式(I)所示的未被氧化的状态。
根据本发明的另一个实施方式，在通过还原反应制备第一金属颗粒的过程中未添加另外的还原剂，由一部分式(I)所示发光体作为还原剂，在将第一金属的可溶性前体还原为第一金属颗粒的同时，式(I)所示发光体的一部分也被氧化而形成了其氧化衍生物。为了简化期间，在下文中称为“氧化衍生物”。根据本发明的一个优选实施方式，所述氧化衍生物表示式(I)中的
Figure GDA0004047038080000101
基团被氧化形成两个羧基、或者两个羧酸酯基、或者二羧酯基之后得到的化合物。例如，对于下式所示的发光体，其氧化后会生成N-(4-氨基丁基)-N-乙基邻苯二甲酸酯。
Figure GDA0004047038080000102
根据本发明的一个实施方式，所述化学发光复合材料中仅包含式(I)的发光体而不含其氧化衍生物。
根据本发明的另一个实施方式，以所述化学发光复合材料中式(I)的发光体及任选的其氧化衍生物的总摩尔量为基准计，其中氧化衍生物的摩尔百分比可以在以下任意两个点组合得到的数值范围之内：0摩尔％、1摩尔％、3摩尔％、5摩尔％、8摩尔％、10摩尔％、12摩尔％、15摩尔％、18摩尔％、20摩尔％、22摩尔％、25摩尔％、28摩尔％、30摩尔％、32摩尔％、35摩尔％、38摩尔％、40摩尔％、42摩尔％、45摩尔％、48摩尔％、50摩尔％、52摩尔％、55摩尔％、58摩尔％、60摩尔％、62摩尔％、65摩尔％、68摩尔％、70摩尔％、72摩尔％、75摩尔％、78摩尔％、80摩尔％、82摩尔％、85摩尔％、88摩尔％、90摩尔％、92摩尔％、95摩尔％、98摩尔％、99摩尔％。
根据本发明的另一个实施方式，所述第一金属颗粒经由金属原子与磁珠表面的氨基之间的金属-N键以及静电吸附作用连接于MB-NH2。
根据本发明的另一个实施方式，式(I)的化合物以及任选的其氧化衍生物通过其-NH2基团与金属原子之间的金属-N键以及静电吸附作用连接于第一金属颗粒。
在以下的一些具体实施方式中，为了简化期间，以ABEI和金为例来描述本发明的复合材料及其制备过程，但是此处仅仅是示例的表述，本发明的保护范围不限于此。
在下文中，将与第一技术颗粒(以金颗粒为例)和式(I)所示的化合物(例如ABEI)连接之后的MB-NH2写作“MAA(即MB@ABEI-Au的首字母缩写)”。
根据本发明的另一个实施方式，本发明的化学发光复合材料还包含第二金属阳离子，所述第二金属选自以下元素：铬、钼、锰、锌、钴、镍、铁、钛、钒、铜、或其任意组合。优选地，可以在如上所述将第一金属颗粒连接于MB-NH2之后，再加入第二金属阳离子，使得第二金属阳离子基于配位键和静电吸附作用连接于MAA。在本发明中，当第二金属为钴离子的时候，将其写作MAA/Co2+。
根据本发明的另一个实施方式，在合成本发明的化学发光复合材料的方法中，所述第一金属颗粒的离子型前体与所述氨基官能化磁珠的重量比为10:1至1:1，例如为9:1至1.2:1，或者为8:1至1.4:1，或者为7:1至1.5:1，或者为6:1至1.6:1，或者为5:1至1.8:1，或者为4:1至1.8:1，或者为3:1至2:1，或者为2.5:1，或者在以上任意两个端值相互组合得到的数值范围之内。此处所述的重量比是第一金属颗粒的离子型前体的固体重量与所述氨基官能化磁珠的固体重量之比。
根据本发明的另一个实施方式，在合成本发明的化学发光复合材料的方法中，所述第一金属颗粒的离子型前体与所述第二金属阳离子的摩尔比为50:1至1:1，例如可以为45:1至2:1，或者为40:1至3:1，或者为35:1至4:1，或者为30:1至5:1，或者为25:1至8:1，或者为20:1至10:1，或者为15:1至12:1，或者在以上任意两个端值相互组合得到的数值范围之内，以上所述的摩尔比表示所述化学发光复合材料中的第一金属颗粒的离子型前体包含的第一金属的摩尔量与第二金属阳离子的摩尔量之比。根据本发明的另一个实施方式，在合成本发明的化学发光复合材料的方法中，所述第一金属颗粒的离子型前体与式(I)所示的发光体以及任选的其氧化衍生物的摩尔比为10:1至1:5，例如为9:1至1:4，或者为8:1至1:3，或者为7:1至1:2，或者为6:1至1:1，或者为5:1至2:1，或者为4:1至3.75:1，或者在以上任意两个端值相互组合得到的数值范围之内，以上所述的摩尔比表示所述化学发光复合材料中的第一金属颗粒的离子型前体包含的第一金属的摩尔量与“式(I)所示的发光体以及任选的其氧化衍生物的总摩尔量”之比。
根据本发明的另一个实施方式，本发明的化学发光复合材料在使用之前还连接一种特异性抗体蛋白。所述抗体蛋白根据作为表征对象的抗原蛋白的具体种类进行选择，例如所述抗体蛋白可以包括以下的抗体蛋白，但不限于这些抗体：新型冠状病毒S1抗体、新型冠状病毒RBD抗体、新型冠状病毒N蛋白抗体、心肌肌钙蛋白抗体、和肽素抗体、心脏型脂肪酸结合蛋白抗体、α-甲胎蛋白抗体、前列腺癌标志物抗体、肝癌标志物抗体、结/直肠癌标志物抗体、胰腺癌标志物抗体、胃癌标志物抗体、食道癌标志物抗体、肺癌标志物抗体、乳腺癌标志物抗体、卵巢癌标志物抗体、子宫癌标志物抗体、甲亢标志物抗体、肝炎标志物抗体、贫血标志物抗体、糖代谢标志物抗体、骨代谢标志物抗体。根据本发明的一个实施方式，所述抗体蛋白经由所述第一金属颗粒、所述第二金属阳离子、式(I)所示的化合物(以及任选的，其氧化衍生物)的氨基和磁珠表面氨基中的至少一种连接于所述MAA/Co2+。根据本发明的一个优选的实施方式，作为表征对象的抗原是SARS-CoV-2的N蛋白，而相应的抗体蛋白是N-抗体。通过使得所述抗体蛋白与本发明的化学发光复合材料接触，使得功能蛋白连接至所述化学发光复合材料。优选地，以连接抗体蛋白之前所述化学发光复合材料的总重量为100重量％计，例如根据本发明的一个优选的实施方式，以所述MAA/Co2+的总重量为100重量％计，所述抗体蛋白的重量比例为0.1-10重量％，例如0.5-9重量％，或者1-8.5重量％，或者1.5-6重量％，或者1.6-5重量％，或者1.8-4重量％，或者2-3重量％，或者2.1-2.5重量％，或者在以上任意两个端值相互组合得到的数值范围之内。
根据本发明的另一个实施方式，本发明的化学发光复合材料在使用之前还任选地连接一种或多种其他的功能蛋白。在本文中所述的“功能蛋白”是指出于一个或多个特定的目的结合入本发明的化学发光复合材料中的任意的蛋白，该蛋白不同于以上所述的抗原蛋白和抗体蛋白，所述目的可以包括例如用来对化学发光复合材料的活性位进行封闭(即作为封闭剂)或保护，对所述化学发光复合材料的稳定性进行调节等等。在本领域中已知有很多具有上述功能的各种蛋白，例如：血清、BSA、脱脂奶粉、酪蛋白等。根据本发明的一个实施方式，所述功能蛋白经由所述第一金属颗粒、所述第二金属阳离子、式(I)所示的化合物(以及任选的其氧化衍生物)中的氨基和磁珠表面氨基中的至少一种连接于所述MAA/Co2+。根据本发明的一个优选的实施方式，作为表征对象的抗原是SARS-CoV-2的N蛋白，而相应的抗体蛋白是N-抗体，而所述功能蛋白是BSA(牛血清白蛋白)。根据本发明的一个优选的实施方式，通过将所述功能蛋白与本发明的化学发光复合材料接触，使得功能蛋白连接至所述化学发光复合材料。优选地，以连接功能蛋白和抗体蛋白之前所述化学发光复合材料的总重量为100重量％计，例如以所述MAA/Co2+的总重量作为100重量％计，所述功能蛋白的重量比例为0.01-9重量％，例如0.02-8重量％，或者0.05-7重量％，或者0.06-6重量％，或者0.07-5重量％，或者0.08-4重量％，或者0.09-3重量％，或者1-2重量％，或者在以上任意两个端值相互组合得到的数值范围之内。
根据本发明的一个特别优选的实施方式，本发明的化学发光复合材料除了包含所述的组分(i)-(iv)、抗体蛋白和任选的功能蛋白以外，不含其他的组分，例如不含其他的标记组分。优选地，根据本发明的一个实施方式，其中仅包含一种所述抗体蛋白，并且可能任选地包含功能蛋白，而不需要使用第二种抗体。由此可以实现一些配对二抗难以获得的目标物检测，省去了用标记物、标记试剂、标记官能团等组分标记二抗的过程，也减少了标记、孵育、洗涤等反应步骤，降低了成本。根据本发明的另一个实施方式，本发明的化学发光复合材料包含所述的组分(i)-(iv)、一种所述抗体蛋白，以及任选的功能蛋白，但是除此之外，不含其他常规的标记物、标记试剂、标记官能团，所述常规的标记物、标记试剂、标记官能团等是本领域技术人员熟知的，例如可以包括其他的发光分子、酶、纳米材料、催化剂等。
图1显示了根据本发明一个实施方式用来合成本发明的化学发光复合材料的方法的示意图。如图1所示，该合成方法的过程包括以下步骤：(a)将氨基官能化磁珠(MB-NH2)、第一金属颗粒的离子型前体(例如HAuCl4)与式(I)所示的发光体(例如ABEI)混合，使得所述第一金属颗粒的离子型前体被还原生成0价的第一金属颗粒(在图1的实施方式中为金颗粒)并且其与所述磁珠和/或发光体结合，形成图1所示的MB@ABEI-Au(MAA)；(b)然后添加所述第二金属阳离子(例如CoCl2)，使其与所述磁珠和/或发光体结合，形成图1所示的MB@ABEI-Au/Co2+(MAA/Co2+)。此处有一部分ABEI作为合成所述第一金属颗粒的还原剂，同时自身的
Figure GDA0004047038080000141
基团被氧化形成相应的二羧酯基。
在图1所示的实施方式中还包括以下步骤：(c)向步骤(b)制得的MAA/Co2+中添加针对测试目标抗原的特异性抗体蛋白(例如N-抗体)，使得该特异性抗体蛋白连接至所述MAA/Co2+；(d)向步骤(c)制得的产物中添加其他功能蛋白(例如BSA，其发挥封闭剂的功能)，使得该功能蛋白连接至所述MAA/Co2+。
在上述步骤(c)和(d)之后，使得连接有N-抗体和BSA的MAA/Co2+与作为检测对象的SARS-CoV-2的N蛋白相结合，该结合体作为最终检测的对象，其可以在特定条件下(例如添加了H2O2的条件下)进行化学发光，基于其发光信号来检测SARS-CoV-2的N蛋白。
本发明还提供了基于化学发光检测，使用本发明的化学发光复合材料对抗原蛋白，例如SARS-CoV-2的N蛋白进行检测的方法。本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒用来通过化学发光检测抗原。所述抗原选自但不限于以下这些抗原：新型冠状病毒N蛋白、新型冠状病毒S1、新型冠状病毒RBD、心肌肌钙蛋白、和肽素、心脏型脂肪酸结合蛋白、α-甲胎蛋白、前列腺癌标志物、肝癌标志物、结/直肠癌标志物、胰腺癌标志物、胃癌标志物、食道癌标志物、肺癌标志物、乳腺癌标志物、卵巢癌标志物、子宫癌标志物、甲亢标志物、肝炎标志物、贫血标志物、糖代谢标志物、骨代谢标志物，尤其是可以用来检测SARS-CoV-2的N蛋白。根据本发明的一个实施方式，所述试剂盒包含本发明的化学发光复合材料。
本发明还提供了本发明的化学发光复合材料在制备试剂盒中的用途，所示试剂盒用来通过化学发光检测抗原，例如用来检测SARS-CoV-2的N蛋白。
实施例
为了更好地理解本发明，下面结合实施例以及附图对本发明进一步说明。以下实施例只用于对本发明进行进一步的阐明，不能理解为对本发明内容的限制，任何根据本发明的发明思路和技术方案作出一些非本质的改进和调整，都将涵盖在本发明的保护范围之内。
若无特别说明，以下实施例中使用的试剂均为分析纯。
在以下实施例中，如果记载了“按照与上述某实施例相同的步骤进行操作，区别仅在于……”，则表示采用随后记载的工艺条件和步骤，而其他没有提及的工艺条件和步骤按照引用的之前的实施例的记载。
试剂和仪器
以下实施例中所使用到的化学试剂和测试使用化学仪器如表1和表2所示。
表1实施例中使用到的化学试剂
Figure GDA0004047038080000151
检测技术：
使用Talos F200X电子显微镜(FEI,USA)拍摄制得的产物的TEM图像。使用Optima7300DV等离子原子发射分光光度计(PerkinElmer,USA)，通过ICP-AES检测制得的产物中Co2+的浓度。使用Thermo ESCALAB 250Xi电子分光光度计(VG Scientific,EastGrinstead,U.K.)，使用Al Kα辐射作为X射线源进行XPS测试。使用ζ电势分析仪(Nano ZS90Zetasizer,Malvern Instruments,Malvern,U.K.)测量材料的ζ电势。使用振动样品磁强计(Quantum Design Inc,USA)获得MAA/Co2+的磁滞曲线。使用centro LB960微盘式冷光仪(Berthold,Germany)检测化学发光。
实施例1：合成MAA/Co2+
在该实施例1中，通过两步法合成MAA/Co2+。首先在第一步中合成MAA，具体来说，称取1毫克MB-NH2，用乙醇洗涤两次，然后将其分散在0.5毫升乙醇。然后将1.5毫升5mM的HAuCl4水溶液加入其中，得到混合物。在振摇条件下将0.5毫升4mM的ABEI溶液(pH＝13.0)加入上述溶液中，在振荡器(该振荡器具有高、中、低三档功率)上使用最大功率剧烈振荡2小时,将该混合物转移到垂直混合器中，使得反应在室温下持续进行过夜。然后用超纯水对由此制得的MAA洗涤两次,然后将得到的MAA分散在1毫升超纯水中，在4℃条件下储存用于进一步的使用。
在第二步中，将0.1毫升各种浓度(0.1、1、5、10、100mM，其发光性能表征参见以下实施例4)的Co2+水溶液加入上述分散在1毫升超纯水中的MAA中，在室温下搅拌3小时。然后将所得的悬浮液磁性分离,用水洗涤两次，分散在1毫升水中。由此制得的MAA/Co2+在4℃的条件下进行储存。
实施例2：制备用于检测SARS-CoV-2的N蛋白的样品。
在该实施例2中，使用以上实施例1制得的MAA/Co2+与抗体蛋白和封闭蛋白结合，制备用于检测SARS-CoV-2的N蛋白的样品。具体来说，将25μL的1mg/mL兔抗体-N蛋白多克隆抗体(N-Ab)加入以上合成实施例1制得的分散在1毫升水中的MAA/Co2+，在室温下反应0.5小时，然后进行磁性分离，然后加入0.01M PBS缓冲液(pH＝7.4),将由此制得的MAA/Co2+/N-Ab分散在1％的BSA溶液中，用于封闭，再反应0.5小时。接下来将制得的MAA/Co2+/N-Ab/BSA磁性分离,用PBS洗涤,溶解在1.5mL的PBS中，在4℃储存。
在进行对于SARS-CoV-2的N蛋白的化学发光检测的时候，将200μL不同浓度(1.0×10-8-1.0×10-13g/mL)的所述N蛋白加入200μL的MAA/Co2+/N-Ab/BSA悬浮液中，在温和振摇条件下，在37℃培养20分钟，然后通过磁性分离进行洗涤，分散在200μL的PBS溶液中备用。
实施例3：产物的表征以及化学发光性能的表征
首先对实施例1的原料、中间产物和产物进行TEM、XPS、ζ电势、ICP-MS和饱和磁化强度的表征。
图2A和2I显示了实施例1的MB-NH2磁珠的TEM图像，图中显示MB-NH2磁珠具有球形结构，非常光滑的表面，并且平均颗粒直径约为150nm左右。
图2B和2J显示了在MB-NH2磁珠表面上连接金颗粒以及ABEI之后的TEM图像，可以看到ABEI-Au纳米颗粒良好地分散在MB-NH2磁珠表面上，并且与ABEI结合的Au纳米颗粒的直径约为7-8nm,由此证明生成了MAA。
图2C和2D显示了添加Co2+之后合成得到的产物的形貌，可以看到加入Co2+之后，MAA/Co2+形貌没有明显的变化。另外图2E-2H显示了元素分析图，证明MAA表面上具有Co2+，由此证明实施例成功合成了MAA/Co2+。
图3A-3C显示了MAA的XPS谱图，图4A-4D显示了MAA/Co2+的XPS谱图。这些图中的结果均显示了ABEI分子设置在纳米材料表面之上，图4D显示了Co2+以配位形式存在于MAA/Co2 +MAA/Co2+中。
ICP-MS表征结果显示MAA/Co2+中的Co元素浓度为47.2ng/mL。并且测得MB-NH2、MAA和MAA/Co2+水溶液的ζ电势分别为9.89mV、-23.32mV和-9.23mV，这表明在MB-NH2磁珠上连接ABEI-Au颗粒导致ζ电势从正变负。但是在施加Co2+之后，ζ电势又发生正向变化,这说明Co2+可能至少部分地通过静电相互作用设置在带负电荷地MAA上。另外，MAA/Co2+的饱和磁化度为55.98emu/g,表明其可以进行磁性分离。以上表征结果均证明成功制得了官能化的磁性材料MAA/Co2+。
实施例4：MAA/Co2+化学发光性能的表征
在该实施例4中，通过以下方式进行化学发光测试：将以上所述实施例中制备的MAA/Co2+各50μL以不同的浓度加入96孔板中，然后向每个孔加入50μL的浓度为1mM的H2O2水溶液(该溶液的pH值用0.01M的NaOH水溶液调节至12.0),同时记录每个孔中的化学发光动力学曲线。测量时间优化为10秒，时间间隔为0.1秒。
图5显示了实施例1使用各种不同的Co2+浓度制备的MAA/Co2+的化学发光性能。可以看到当Co2+为大约5mM的条件下实现了最高的化学发光强度。
实施例5：连接抗原之后的化学发光性能表征
通过实施例4的表征证明，本发明实施例制得的MAA/Co2+具有极佳的化学发光性能,因此在该实施例5中，使用相同的Co2+浓度5mM，按照与上文所述相同的方式表征了与不同抗体蛋白(N-Ab)、功能蛋白(BSA)和抗原蛋白(N蛋白)结合之后的化学发光性能和ζ电势，结果汇总列于图6A-6B。该实施例的化学发光可以用来在无标记的情况下进行N-蛋白的抗原免疫检测。在该实施例中，依照实施例2所述的方式连接各种蛋白。不希望受限于具体的理论，在该实施例5中，N-Ab抗体中游离的氨基端及巯基端通过Au-N键、Au-S键和疏水相互作用结合于MAA/Co2+，以形成MAA/Co2+/N-Ab；BSA同样通过其中游离的氨基端及巯基端通过Au-N键、Au-S键和疏水相互作用结合于MAA/Co2+/N-Ab，用来封闭非特异性结合位点，形成MAA/Co2+/N-Ab/BSA。此处形成的MAA/Co2+/N-Ab/BSA可以作为基于化学发光检测SARS-CoV-2抗原N蛋白的试剂。通过磁性分离，用PBS进行洗涤。在上述连接各种抗体蛋白和封闭剂蛋白过程的每一步都对产物的化学发光强度和ζ电势进行检测，结果汇总列于图6A-6B。图6A显示了MAA/Co2+/N-Ab/BSA/N蛋白有效地发生了化学发光现象，可以用于免疫检测，而图6B的ζ电势结果则证明了上述每一步都成功地连接。
实施例6：金颗粒用量对化学发光性能的影响
本实施例研究了金颗粒用量对化学发光性能的影响。具体来说，在本实施例6中重复实施例1的步骤两次，按照实施例1所述的步骤合成了MAA，区别仅在于在振荡器上振荡2小时的过程中分别使用“中”档位和“低”档位。图7A显示了使用“高”振荡档位(即实施例1)制备的MAA的TEM图像，图7B显示了使用“中”振荡档位制备的MAA的TEM图像，图7C显示了使用“低”振荡档位制备的MAA的TEM图像，图7D显示了原始的MB-NH2的TEM图像。根据这些TEM图像可以看到，图7A中金纳米颗粒的数量约为135，图7B中金纳米颗粒的数量约为34，图7C中金纳米颗粒的数量约为16，图7D中金纳米颗粒的数量则为零。
图8则显示了上述四种材料各自体现出的化学发光强度。
由此可以确定，通过改变振荡频率,随着振荡频率提高，被ABEI还原的Au纳米颗粒在磁珠表面上的量相应地增加，其各自实现的化学发光强度也随之提高。
实施例7：工艺条件对化学发光性能的影响
本实施例研究了包括H2O2溶液的pH值、H2O2溶液的浓度以及N-蛋白培育时间对化学发光性能的影响。
在本实施例中，按照实施例1、实施例2和实施例3所述的方式制备MAA/Co2+/N-Ab/BSA/N蛋白样品(Co2+浓度为5mM，N蛋白浓度1ng/mL)，区别仅在于单独改变H2O2溶液的pH值、H2O2溶液的浓度或N-蛋白培育时间，在这些条件下检测MAA/Co2+/N-Ab/BSA/N蛋白样品的发光强度,结果汇总列于图9A-9C。从图9A可以看到，H2O2溶液的pH值在12左右可以得到最佳的化学发光强度，H2O2溶液的浓度在1mM左右可以得到最佳的化学发光强度。另外如图9C所示,N蛋白的培育时间在20分钟左右为最佳。
实施例8：检测下限和选择性的研究
在本实施例中，重复以上实施例7的步骤，但是采用不同的N蛋白浓度，在以上实施例7确定的最优化条件下，研究N蛋白浓度对数值与化学发光信号强度的关系，如图10所示，在N蛋白浓度为0.1pg/mL至10ng/mL的范围内，二者之间呈现良好的线性关系，线性回归方程为ΔI＝-16287.08-11869.27logC(R2＝0.985,n＝3)。本发明用来检测N蛋白的检测下限为69fg/mL(S/N＝3),比下表所示的其他现有技术检测方法要低得多。因此本发明开发了一种无需标记的免疫检测技术，其避免了复杂的标记步骤,不仅有极佳的检测效果，能够在很宽的检测范围内进行检测，具有极低的检测下限，非常灵敏，而且检测步骤简便，成本极低。
表2.本发明的化学发光技术与现有技术已知的其他N蛋白检测技术的比较
Figure GDA0004047038080000201
对比试验1-6
另外，申请人同样使用上述最优化的表征条件实施了对比试验1-6，区别仅在于，对比试验1是空白实验，对比试验2-5使用一些干扰蛋白IgM、S1、RBD和IgG以相同的步骤表征了化学发光强度，但是所有干扰蛋白的浓度分别为1ng/mL,比N蛋白的浓度(0.1ng/mL)高一个数量级,还有一个对比试验6包含所有干扰蛋白的混合物。实验结果见图11，其中的N蛋白实验是使用0.1ng/mL N蛋白进行表征。从该图中可以看到干扰蛋白IgM、S1、RBD、IgG的发光强度都与空白实验相近,混合物的发光强度则与N蛋白实验类似，由此证明本发明的技术对N蛋白具有很高的选择性。另外如图12所示，对于本发明的技术，检测到在一个月的时间内，相邻两天之间的相对标准偏差(RSD)为2.9％,这说明本发明的技术在用于检测N蛋白的时候具有优异的重现性和可靠性。
实施例9.实际样品中的测试
在该实施例中，使用本发明的MAA/Co2+/N-Ab/BSA样品，以标准曲线法在临床应用中检测人血清和唾液中的N蛋白。健康人血清样品得自南京第一人民医院，保存于-20℃的条件下。从禁水禁食2小时的人员对象获得健康人唾液样本。这些样品分别离心10分钟，弃去沉淀物,上清液在-20℃储存备用。在进行测量之前，所有的血清样品和唾液样品都用0.01M的PBS(pH 7.4)稀释一百倍，向其中加入不同浓度的(0.5,1,10,50pg/mL)N蛋白。如表3所示,本发明的技术用于实际样品的化学发光免疫测试的时候可以实现优异的检测结果。
表3.人血清和唾液样品中N蛋白的定量检测
Figure GDA0004047038080000211
实施例10.对康复后的患者血清的实验
在该实施例中,从志愿者处收集健康人员的血清和康复后的患者血清，使用本发明的MAA/Co2+/N-Ab/BSA样品进行检测。血清在使用前用0.01M的PBS(pH 7.4)稀释一百倍，测试结果见图13。从图13可以看到，康复后患者的化学发光强度略低，这是因为康复后的患者体内仍然存在少量的SARS-CoV-2N蛋白。该实施例的结果证明本发明的检测技术能够区别正常人和康复后患者的样品。
综上所述，本发明开了一种针对抗原的全新免疫检测技术，其能够实现对SARS-CoV-2抗原的快速、方便、高效、高选择性、灵敏、低成本的检测，并且无需标记过程。

Claims (10)

1.一种化学发光复合材料，该复合材料包含：
(i)氨基官能化磁珠；
(ii)第一金属颗粒，所述第一金属以0价状态存在且选自以下元素：金、银、铂、钌、铑、钯、锇、铱、或其任意组合；
(iii)第二金属阳离子，所述第二金属选自以下元素：铬、钼、锰、锌、钴、镍、铁、钛、钒、铜、或其任意组合；
(iv)式(I)所示的发光体，及任选的其氧化衍生物，
Figure FDA0004047038070000011
其中，A环表示C6-C14芳环；
R1和R2独立地表示氢、端基被氨基取代或为未取代的直链或支链(C1-C30)烷基，前提是该NR1R2具有至少一个NH2端基；
所述磁珠通过氨基-金属配位键和/或静电吸附作用与所述第一金属颗粒和所述第二金属阳离子连接，所述式(I)所示的发光体通过氨基-金属配位键和/或静电吸附作用与所述第一金属颗粒和所述第二金属阳离子中的至少一种连接。
2.如权利要求1所述的化学发光复合材料，其特征在于，所述磁珠包含选自以下的磁性物质：Fe3O4、Co2O3、CoFe2O4和Ni2O3，所述磁珠是粒径为5纳米至50微米的珠粒；
所述第一金属颗粒是粒径为2-100纳米的颗粒。
3.如权利要求1所述的化学发光复合材料，其特征在于，在所述式(I)所示的发光体中，所述A环表示苯环、萘环或蒽环，且-NR1R2部分是氨基、N-(4-氨基丁基)N-(乙基)氨基或(N-4-氨基己基)(N-乙基)氨基。
4.如权利要求1所述的化学发光复合材料，其特征在于，
在所述式(I)所示的发光体具有以下所示的结构：
Figure FDA0004047038070000021
5.如权利要求1所述的化学发光复合材料，其特征在于，复合材料还包含抗体蛋白，所述抗体蛋白包括：新型冠状病毒S1抗体、新型冠状病毒RBD抗体、新型冠状病毒N蛋白抗体、心肌肌钙蛋白抗体、和肽素抗体、心脏型脂肪酸结合蛋白抗体、α-甲胎蛋白抗体、前列腺癌标志物抗体、肝癌标志物抗体、结/直肠癌标志物抗体、胰腺癌标志物抗体、胃癌标志物抗体、食道癌标志物抗体、肺癌标志物抗体、乳腺癌标志物抗体、卵巢癌标志物抗体、子宫癌标志物抗体、甲亢标志物抗体、肝炎标志物抗体、贫血标志物抗体、糖代谢标志物抗体、骨代谢标志物抗体；
所述复合材料还任选地包含功能蛋白。
6.如权利要求1所述的化学发光复合材料，其特征在于，所述复合材料仅含一种抗体蛋白。
7.一种试剂盒，该试剂盒用来通过化学发光检测抗原，所述抗原包括：新型冠状病毒N蛋白、新型冠状病毒S1、新型冠状病毒RBD、心肌肌钙蛋白、和肽素、心脏型脂肪酸结合蛋白、α-甲胎蛋白、前列腺癌标志物、肝癌标志物、结/直肠癌标志物、胰腺癌标志物、胃癌标志物、食道癌标志物、肺癌标志物、乳腺癌标志物、卵巢癌标志物、子宫癌标志物、甲亢标志物、肝炎标志物、贫血标志物、糖代谢标志物、骨代谢标志物；
所述试剂盒包含如权利要求1-6中任一项所述的化学发光复合材料。
8.如权利要求1-6中任一项所述的化学发光复合材料在制备试剂盒中的用途，所示试剂盒用来通过化学发光检测抗原。
9.一种制备如权利要求1-6中任一项所述的化学发光复合材料的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将氨基官能化磁珠、第一金属颗粒的离子型前体与式(I)所示的发光体混合，使得所述第一金属颗粒的离子型前体被还原而生成0价的第一金属颗粒，式(I)所示的发光体的一部分被氧化而生成式(I)所示发光体的氧化衍生物，并且所述第一金属颗粒与所述磁珠和/或发光体及任选的其氧化衍生物结合；
(b)添加所述第二金属阳离子，使其与所述磁珠和/或发光体及任选的其氧化衍生物结合；
(c)任选地，连接抗原蛋白；以及
(d)任选地，连接功能蛋白。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：
所述第一金属颗粒的离子型前体与所述氨基官能化磁珠的重量比为10:1至1:1；
所述第一金属颗粒的离子型前体与所述第二金属阳离子的摩尔比为50:1至1:1；
所述第一金属颗粒的离子型前体与所述式(I)所示的发光体以及任选的其氧化衍生物的摩尔比为10:1至1:2。
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