JP4911639B2 - バイオセンシング方法及び固定化方法 - Google Patents
バイオセンシング方法及び固定化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4911639B2 JP4911639B2 JP2008307030A JP2008307030A JP4911639B2 JP 4911639 B2 JP4911639 B2 JP 4911639B2 JP 2008307030 A JP2008307030 A JP 2008307030A JP 2008307030 A JP2008307030 A JP 2008307030A JP 4911639 B2 JP4911639 B2 JP 4911639B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- molecule
- silicon oxide
- oxide film
- substrate
- immobilized
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
(1)ターゲット分子とキャプチャー分子との生体分子間相互作用を検出するバイオセンシング方法であって、
シリコン基板を酸化処理してその表面にシリコン酸化膜を形成した基板、又は金属基板若しくは樹脂基板を表面処理してシリコン酸化膜を形成した基板の、該シリコン酸化膜上に、ターゲット分子及びキャプチャー分子に対して反応性を有さないアルコキシシランの有機単分子膜が被覆されたテンプレート領域と、上記シリコン酸化膜が露出した生体分子固定領域とを、上記テンプレート領域が上記生体分子固定領域を取り囲むように形成し、
上記生体分子固定領域のシリコン酸化膜に、ターゲット分子を、アミノ系又はカルボキシル系の官能基を少なくとも1個含有し、炭素数3〜20の直鎖状炭化水素基を有するアルコキシシランであり、上記有機単分子膜とは反応せず、上記シリコン酸化膜と反応して該シリコン酸化膜と上記ターゲット分子とを連結する連結分子を介して上記シリコン酸化膜に結合させて固定化し、次いで、上記生体分子固定領域に固定化されたターゲット分子に選択的に結合するキャプチャー分子を、表面に該表面と上記キャプチャー分子とを連結する連結分子を介して又は介さずに固定化した磁性微粒子を、上記ターゲット分子とキャプチャー分子とを結合させることによって上記シリコン酸化膜上に固定化して、或いは
上記生体分子固定領域のシリコン酸化膜に、ターゲット分子に選択的に結合するキャプチャー分子を、アミノ系又はカルボキシル系の官能基を少なくとも1個含有し、炭素数3〜20の直鎖状炭化水素基を有するアルコキシシランであり、上記有機単分子膜とは反応せず、上記シリコン酸化膜と反応して該シリコン酸化膜と上記キャプチャー分子とを連結する連結分子を介して上記シリコン酸化膜に結合させて固定化し、次いで、上記生体分子固定領域に固定化されたキャプチャー分子と結合させるターゲット分子を、表面に該表面と上記ターゲット分子とを連結する連結分子を介して又は介さずに固定化した磁性微粒子を、上記ターゲット分子とキャプチャー分子とを結合させることによって上記シリコン酸化膜上に固定化して、
上記固定化された磁性微粒子の磁気をシグナルとして上記基板上に固定化されたターゲット分子を検出することを特徴とするバイオセンシング方法、及び
(2)ターゲット分子とキャプチャー分子との生体分子間相互作用を検出するバイオセンシングにおいて、ターゲット分子又はキャプチャー分子を基板上に固定化する方法であって、
シリコン基板を酸化処理してその表面にシリコン酸化膜を形成した基板、又は金属基板若しくは樹脂基板を表面処理してシリコン酸化膜を形成した基板の、該シリコン酸化膜上に、ターゲット分子及びキャプチャー分子に対して反応性を有さないアルコキシシランの有機単分子膜が被覆されたテンプレート領域と、上記シリコン酸化膜が露出した生体分子固定領域とを、上記テンプレート領域が上記生体分子固定領域を取り囲むように形成し、
上記生体分子固定領域のシリコン酸化膜に、ターゲット分子を、アミノ系又はカルボキシル系の官能基を少なくとも1個含有し、炭素数3〜20の直鎖状炭化水素基を有するアルコキシシランであり、上記有機単分子膜とは反応せず、上記シリコン酸化膜と反応して該シリコン酸化膜と上記ターゲット分子とを連結する連結分子を介して結合させて、或いは
上記生体分子固定領域のシリコン酸化膜に、ターゲット分子に選択的に結合するキャプチャー分子を、アミノ系又はカルボキシル系の官能基を少なくとも1個含有し、炭素数3〜20の直鎖状炭化水素基を有するアルコキシシランであり、上記有機単分子膜とは反応せず、上記シリコン酸化膜と反応して該シリコン酸化膜と上記キャプチャー分子とを連結する連結分子を介して結合させて固定化することを特徴とする固定化方法
を提供する。
本発明においては、基板上にバイオセンシングにより検出する生体分子であるターゲット分子又はターゲット分子に選択的に結合するキャプチャー分子を固定化する。そのために、まず、基板上にバイオセンシングにより検出する生体分子であるターゲット分子及びターゲット分子に選択的に結合するキャプチャー分子に対して反応性を有さない単分子膜が被覆されたテンプレート領域と基板面が露出した生体分子固定領域とを、上記テンプレート領域が上記生体分子固定領域を取り囲むように形成する。
本発明においては、生体分子固定領域に固定化されたターゲット分子に選択的に結合するキャプチャー分子を、表面に該表面とキャプチャー分子とを連結する連結分子を介して又は介さずに固定化した磁性微粒子を用い、これを上述したように基板上の生体分子固定領域に固定化したターゲット分子と結合させる。或いは、生体分子固定領域に固定化されたキャプチャー分子と結合させるターゲット分子を表面に該表面とターゲット分子とを連結する連結分子を介して又は介さずに固定化した磁性微粒子を用い、これを上述したように基板上の生体分子固定領域に固定化したキャプチャー分子と結合させる。
生体分子固定化
基板として、シリコンウェハーの表面にシリコン酸化膜を950℃のドライ酸化によって形成したものを用いた。これを、硫酸過水(硫酸:過酸化水素=4:1)で10分間、120℃、続いてアンモニア過水(アンモニア:過酸化水素:水=1:1:5)で10分間、80℃の条件で洗浄し、ドライ窒素で乾燥後、疎水性単分子膜(ODMS:n−オクタデシルトリメトキシシラン)をシリコン酸化膜上に成膜した。成膜は、0.2mlのODMSを含む20cm3のテフロン(登録商標)容器に基板を封入し、露点−80℃のドライルーム中で110℃にて3〜5時間以上気相化学反応させる方法で行った。ODMSの膜厚は、エリプソメーターによって測定され、1.7〜2.1nmであることが確認された。この結果は、ODMSが単分子膜であることを示している。
10%APTESを含むトルエン溶液中に粒径が約200nmの磁性微粒子(Fe3O4:マグネタイト)を加え、分散させながら、60℃にて30分間反応した。次に、メタノール及び水を用いて十分洗浄し、得られたAPTESを導入した磁性微粒子を、7.5mmol/lSulfo−NHS−LC−LC−ビオチンを含むTris buffer(10mmol/l,pH7.4)中で分散させながら1時間反応した。次に、ビオチン固定化磁性微粒子を50μmol/lアビジン溶液に分散させながら1時間反応してアビジン固定化磁性微粒子を得た。反応後、磁性微粒子は繰り返し洗浄することで精製した。
ビオチン固定化基板に対するアビジン固定化磁性微粒子の反応は、20μlのTris buffer(10mmol/l,pH7.4)中に分散した1〜100μg/mlの粒子を含む溶液を基板ドット上に滴下し、10〜30分間、室温にて静置することで行った。反応後、基板を洗浄することで非特異的に吸着した粒子を除去した。
アビジン固定化磁性微粒子のビオチン固定化基板に対する反応について、各種顕微鏡を用いた詳細な観察を行った。光学顕微鏡観察から、ビオチン−アビジン反応による磁性微粒子の基板上への固定化が確認された(図3(A))。また、基板ドット内に固定化された磁性微粒子の詳細を観察するため、透過型電子顕微鏡(SEM)による評価を行った(図3(B))。ドット内には粒径約200nmの磁性微粒子の存在が確認された。この結果から、生体分子間相互作用により粒子はドット内部にのみ、選択的に固定化されていることが確認された。
ビオチン固定化基板に対してアビジン固定化磁性微粒子を固定化した基板を、原子間力顕微鏡(AFM)及び磁気力間顕微鏡(MFM)により観察した。図4(A)に基板ドット内部のAFM写真、図4(B)にMFM写真を示す。AFM観察から得られた凹凸像に対応する明瞭な磁場像がMFMによって観察された。一方、蛍光顕微鏡により、ドットパターンに対応する粒子に標識されたCy2由来の蛍光像も観察された(図4(C))。
生体分子固定化
実施例1と同様の方法でAPTESを導入した基板を得、この基板に、10mmol/lのSulfo−LC−LC−SPDP溶液を基板表面に滴下し、1時間反応後、基板を洗浄し、続いて25μmol/lのターゲットDNA(オリゴヌクレオチド:5’SH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’FITC)溶液25μlを滴下し、1時間静置することで固定化を行った。洗浄後、蛍光顕微鏡を用いて固定化したターゲットDNAを確認したところ、FITC由来の蛍光像が観察された(図5(A))。
10%APTESを含むトルエン溶液中に粒径が約200nmの磁性微粒子(Fe3O4:マグネタイト)を加え、分散させながら、60℃にて30分間反応した。次に、メタノール及び水を用いて十分洗浄し、得られたAPTESを導入した磁性微粒子を、7.5mmol/lSulfo−NHS−LC−LC−ビオチンを含むTris buffer(10mmol/l,pH7.4)中で分散させながら1時間反応した。次に、ビオチン固定化磁性微粒子を50μmol/lアビジン溶液に分散させながら1時間反応し、更に、これに25μmol/lのRhodamine標識検出プローブ(オリゴヌクレオチド:5’biotin-AAAAAAAAAAAAAAA-3’Rhodamine)を加え、1時間反応を行った後、洗浄してDNA検出プローブ固定化磁性微粒子を得た。
DNA固定化基板に対するDNA検出プローブ固定化磁性微粒子の反応は、20μlのTris buffer(10mmol/l,pH7.4)中に分散した1〜100μg/mlの粒子を含む溶液を基板ドット上に滴下し、10〜30分間、室温にて静置することで行った。反応後、基板を洗浄することで非特異的に吸着した粒子を除去した。
DNA検出プローブ固定化磁性微粒子のDNA固定化基板に対する反応について、各種顕微鏡を用いた詳細な観察を行った。光学顕微鏡観察から、DNA検出プローブとDNAとの反応による磁性微粒子の基板上への固定化が確認された。また、基板ドット内に固定化された磁性微粒子の詳細を観察するため、透過型電子顕微鏡(SEM)による評価を行った。ドット内には粒径約200nmの磁性微粒子の存在が確認された。この結果から、生体分子間相互作用により粒子はドット内部にのみ、選択的に固定化されていることが確認された。
DNA固定化基板に対してDNA検出プローブ固定化磁性微粒子を固定化した基板を、原子間力顕微鏡(AFM)及び磁気力間顕微鏡(MFM)により観察した。AFM観察から得られた凹凸像に対応する明瞭な磁場像がMFMによって観察された。一方、蛍光スキャナにより、ドットパターンに対応する粒子に標識されたRhodamine由来の蛍光像も観察された(図6)。
ディスク状基板を用いて実施例1と同様の方法で、ビオチン固定化基板に対してアビジン固定化磁性微粒子を固定化した基板を得た(図7)。次に、ドット部位の磁性微粒子について振動試料型磁力計(VSM)を用いて磁気の検出を行ったところ、図8に示すように良好なヒステリシスループが得られた。この時の保磁力、残留磁化は175Oe、0.062emu/dotであった。また、ドット以外の部位においては、図9に示すように磁気は全く検出されなかった。このように、ドット部位のみにおいて磁気信号が検出されることから、ドット部位以外には、磁性微粒子の付着がないことが確認され、また、ドット部位における磁力を磁力検出機器により検出することが可能であることも確認された。
2 シリコン酸化膜
3 有機単分子膜
4 レジスト
5 テンプレート領域
6 生体分子固定領域
Claims (2)
- ターゲット分子とキャプチャー分子との生体分子間相互作用を検出するバイオセンシング方法であって、
シリコン基板を酸化処理してその表面にシリコン酸化膜を形成した基板、又は金属基板若しくは樹脂基板を表面処理してシリコン酸化膜を形成した基板の、該シリコン酸化膜上に、ターゲット分子及びキャプチャー分子に対して反応性を有さないアルコキシシランの有機単分子膜が被覆されたテンプレート領域と、上記シリコン酸化膜が露出した生体分子固定領域とを、上記テンプレート領域が上記生体分子固定領域を取り囲むように形成し、
上記生体分子固定領域のシリコン酸化膜に、ターゲット分子を、アミノ系又はカルボキシル系の官能基を少なくとも1個含有し、炭素数3〜20の直鎖状炭化水素基を有するアルコキシシランであり、上記有機単分子膜とは反応せず、上記シリコン酸化膜と反応して該シリコン酸化膜と上記ターゲット分子とを連結する連結分子を介して上記シリコン酸化膜に結合させて固定化し、次いで、上記生体分子固定領域に固定化されたターゲット分子に選択的に結合するキャプチャー分子を、表面に該表面と上記キャプチャー分子とを連結する連結分子を介して又は介さずに固定化した磁性微粒子を、上記ターゲット分子とキャプチャー分子とを結合させることによって上記シリコン酸化膜上に固定化して、或いは
上記生体分子固定領域のシリコン酸化膜に、ターゲット分子に選択的に結合するキャプチャー分子を、アミノ系又はカルボキシル系の官能基を少なくとも1個含有し、炭素数3〜20の直鎖状炭化水素基を有するアルコキシシランであり、上記有機単分子膜とは反応せず、上記シリコン酸化膜と反応して該シリコン酸化膜と上記キャプチャー分子とを連結する連結分子を介して上記シリコン酸化膜に結合させて固定化し、次いで、上記生体分子固定領域に固定化されたキャプチャー分子と結合させるターゲット分子を、表面に該表面と上記ターゲット分子とを連結する連結分子を介して又は介さずに固定化した磁性微粒子を、上記ターゲット分子とキャプチャー分子とを結合させることによって上記シリコン酸化膜上に固定化して、
上記固定化された磁性微粒子の磁気をシグナルとして上記基板上に固定化されたターゲット分子を検出することを特徴とするバイオセンシング方法。 - ターゲット分子とキャプチャー分子との生体分子間相互作用を検出するバイオセンシングにおいて、ターゲット分子又はキャプチャー分子を基板上に固定化する方法であって、
シリコン基板を酸化処理してその表面にシリコン酸化膜を形成した基板、又は金属基板若しくは樹脂基板を表面処理してシリコン酸化膜を形成した基板の、該シリコン酸化膜上に、ターゲット分子及びキャプチャー分子に対して反応性を有さないアルコキシシランの有機単分子膜が被覆されたテンプレート領域と、上記シリコン酸化膜が露出した生体分子固定領域とを、上記テンプレート領域が上記生体分子固定領域を取り囲むように形成し、
上記生体分子固定領域のシリコン酸化膜に、ターゲット分子を、アミノ系又はカルボキシル系の官能基を少なくとも1個含有し、炭素数3〜20の直鎖状炭化水素基を有するアルコキシシランであり、上記有機単分子膜とは反応せず、上記シリコン酸化膜と反応して該シリコン酸化膜と上記ターゲット分子とを連結する連結分子を介して結合させて、或いは
上記生体分子固定領域のシリコン酸化膜に、ターゲット分子に選択的に結合するキャプチャー分子を、アミノ系又はカルボキシル系の官能基を少なくとも1個含有し、炭素数3〜20の直鎖状炭化水素基を有するアルコキシシランであり、上記有機単分子膜とは反応せず、上記シリコン酸化膜と反応して該シリコン酸化膜と上記キャプチャー分子とを連結する連結分子を介して結合させて固定化することを特徴とする固定化方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008307030A JP4911639B2 (ja) | 2008-12-02 | 2008-12-02 | バイオセンシング方法及び固定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008307030A JP4911639B2 (ja) | 2008-12-02 | 2008-12-02 | バイオセンシング方法及び固定化方法 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003321535A Division JP4257513B2 (ja) | 2003-09-12 | 2003-09-12 | バイオセンシング方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009103703A JP2009103703A (ja) | 2009-05-14 |
JP4911639B2 true JP4911639B2 (ja) | 2012-04-04 |
Family
ID=40705484
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008307030A Expired - Fee Related JP4911639B2 (ja) | 2008-12-02 | 2008-12-02 | バイオセンシング方法及び固定化方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4911639B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104971671A (zh) * | 2014-04-01 | 2015-10-14 | 上海师范大学 | 单分散磁性二氧化硅复合微球及其制备工艺 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5193078B2 (ja) * | 2009-01-19 | 2013-05-08 | 株式会社アルバック | 表面修飾基板の解析方法及び製造方法 |
CN106769162B (zh) * | 2017-02-20 | 2023-06-06 | 广西大学 | 一种透射电镜磁性样品预处理器 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6406921B1 (en) * | 1998-07-14 | 2002-06-18 | Zyomyx, Incorporated | Protein arrays for high-throughput screening |
JP2001147230A (ja) * | 1999-11-19 | 2001-05-29 | Hitachi Software Eng Co Ltd | バイオチップ読取装置及び標識試薬 |
JP2001324816A (ja) * | 2000-05-16 | 2001-11-22 | Nikon Corp | パターン形成方法及び露光装置 |
JP4502167B2 (ja) * | 2001-07-06 | 2010-07-14 | 大日本印刷株式会社 | マイクロアレイチップ |
-
2008
- 2008-12-02 JP JP2008307030A patent/JP4911639B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104971671A (zh) * | 2014-04-01 | 2015-10-14 | 上海师范大学 | 单分散磁性二氧化硅复合微球及其制备工艺 |
CN104971671B (zh) * | 2014-04-01 | 2017-08-11 | 上海师范大学 | 单分散磁性二氧化硅复合微球及其制备工艺 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2009103703A (ja) | 2009-05-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Llandro et al. | Magnetic biosensor technologies for medical applications: a review | |
Wang et al. | Magnetoresistive performance and comparison of supermagnetic nanoparticles on giant magnetoresistive sensor-based detection system | |
Osaka et al. | Synthesis of magnetic nanoparticles and their application to bioassays | |
US8456157B2 (en) | Nanomagnetic detector array for biomolecular recognition | |
Amemiya et al. | Novel detection system for biomolecules using nano-sized bacterial magnetic particles and magnetic force microscopy | |
Dittmer et al. | Sensitive and rapid immunoassay for parathyroid hormone using magnetic particle labels and magnetic actuation | |
US20130122485A1 (en) | Method of analyzing biomaterials using a magnetic bead | |
US20090309588A1 (en) | System and methods for actuation on magnetoresistive sensors | |
Arakaki et al. | Detection of biomolecular interaction between biotin and streptavidin on a self‐assembled monolayer using magnetic nanoparticles | |
US9733315B2 (en) | Nanomagnetic detector array for biomolecular recognition | |
JPWO2009072457A1 (ja) | 被覆磁性微粒子を用いたバイオセンシング方法及び該方法に用いるバイオセンシング装置 | |
KR20140094035A (ko) | Dna 라벨 형광 자성 코어/쉘 나노입자를 이용하는 바이오액티브 물질의 검출방법 | |
US20080309323A1 (en) | Method for biochemical analysis | |
TW202215051A (zh) | 使用磁性奈米顆粒偵測及定量一或多種分析物 | |
Manandhar et al. | The detection of specific biomolecular interactions with micro-Hall magnetic sensors | |
JP4911639B2 (ja) | バイオセンシング方法及び固定化方法 | |
Freitas et al. | Magnetoresistive DNA chips | |
Campanile et al. | Multifunctional Core@ Satellite Magnetic Particles for Magnetoresistive Biosensors | |
Kim et al. | Magnetic supercluster particles for highly sensitive magnetic biosensing of proteins | |
JP4257513B2 (ja) | バイオセンシング方法 | |
JP2009128169A (ja) | 標的物質の検出方法、検出カートリッジ、検出キット | |
Brückl et al. | Magnetic particles as markers and carriers of biomolecules | |
Tran et al. | FRET detection of Octamer-4 on a protein nanoarray made by size-dependent self-assembly | |
CN115867786A (zh) | 具有纳米级磁场传感器的单分子实时无标记动态生物感测 | |
Ma et al. | Detecting protein adsorption and binding using magnetic nanoparticle probes |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20101224 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110112 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110218 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120105 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120112 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4911639 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150127 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |